NO820683L - Fremgangsmaate for fremstilling av antitumor-midler. - Google Patents

Description

Gjennom mange år har man foretatt undersøkelser av aldehydenes betydning i biologiske systemer. Bakgrunnen for en stor del av disse undersøkelser var Albert Szént-Gyorgyis hypotese at disse stoffer, og særlig metylglyoksal og glyoksal, har en regulerende virkning på proteiners elektrontilstand og dermed på celledeling. Det er videre påvist at lipidperoksydasjon, som fører til den naturlige dannelse av betydelige mengder aldehyder, er en grunnleggende mekanisme i cellepatologi.

Albert Szent-Gyorgyis bioelektroniske teori for protein-vekselvirkninger (Szent-Gyorgyi, Electronic Biology and Cancer, M. Dekker, Inc., New York,, 1978) forklarer betydningen av aldehyder, særlig glyoksal og metylglyoksal, ved regulering av celledeling. I korte trekk går denne teori ut på at cancer er en forstyrrelse av elektronkonfigurasjonen i proteiner i cancerceller. Aldehyder, så som glyoksal og metylglyoksal gjenoppretter den riktige elektronkonfigurasjon og bevirker at cancerceller vender tilbake til den normale "hviletilstand"

fra den anormale tilstand med hurtig celledeling.

Selv om den nøyaktige mekanisme ikke er viktig for utførelsen av oppfinnelsen, antas det at disse aldehyder,

som er sterke elektronakseptorer, kan angripe proteiner ved

hjelp av sin aldehydgruppe -C=0 som reagerer med en aminogruppe i et protein. Proteiner har frie aminogrupper i sine lysinrester. (Aminogruppen i argininrester utgjør en del av en

guanidingruppe, og aminogruppene i asparagin- og glutamin-rester utgjør deler av amidgrupper. Disse har andre reaktiviteter.). Det antas at aldehydmolekylene danner Schiff-baser med e-aminogruppene i lysinrester, og at disse Schiff-baser derefter danner et■ladningsoverføringskompleks med en nabostilt peptid-..enhet, jfr. Bone et al., "Electronic and dielectric properties of protein-methylglyoxal complexes", IN Submolecular Biology and Cancer (Wolstenhome, Fitzsimons og Whelan, utgivere), Excerpta Mediea, New York, side 83-106 (1979).

Som følge av dannelsen av dette ladningsoverføringskompleks blir energinivåene i grunntilstanden i proteinet delvis umettet med elektronladning. De således dannede "eiektrorihuil" har stor bevegelighet innenfor proteinstrukturen. En slik transformasjon bibringer proteiner en submolekylær spesiell oppførsel som ikke er mulig hos de elektronmettede gjenparter, .og som ifølge Szent-

Gyorgyis teori tillater korreksjon av cellemangler som er for-bundet med cancer og andre sykdommer.

Det finnes en annen teori som også kan forklare visse aldehyders antitumorvirkning. Det er f.eks. beskrevet at forbindelsen 4-hydroksypentenal (HPE) bare er lettere toksisk overfor celler fra normalt vev, men er sterkt toksisk overfor tumorceller. Forbindelsen er en spesifikk sulfhydryl (-SH)-inhibitor som blokkerer DNA-, RNA- og proteinsyntese såvel som glykolyse og respirasjon i tumorceller, jfr. f.eks. Ti'Ili an et al., Europ. J-. Cancer, 12: 989-993 (1976).

Det ejr således på denne bakgrunn at det er foretatt under-søkelser over aldehyders innvirkning på celledeling og celle- ' patologi og særlig deres anvendelighet ved behandling av etablerte tumorer. Det er imidlertid blitt vist at aldehyders generelle biokjemiske reaktiviteter og toksisiteter er slik at sjansene for å kunne behandle tumorer i den dyriske organisme ved parenteral administrering av aldehyder så som metylgyoksal eller glyoksal som sådanne, er små som følge av de nødvendige høye doser og disse forbindelsers generelle toksisitet., jfr. Dianzani, "Biologlcål activity of methylglyoxal and related aldehydes", IN Submolecular Biology and Cancer (Wolstenhome, Fitzsimons og Whelan, utgivere), Excerpta Medica, New York, side 245-265 (1979). Det er blitt foreslått at såfremt disse aldehyder skulle være virksomme mot tumorer måtte de dannes intracellulært og ikke administreres til dyreorganismen, eller at de eventuelt skulle transporteres til tumoren i form av et dissoslerbart, mindre toksisk addukt.

Foruten aldehydenes toksisitet er det en annen grunn til at aldehyder, f.eks. metylgyoksal, ikke vil være virksomme mot tumorer ved administrering. Det er påvist at metylgyoksal og beslektede forbindelser er særdeies labile in vivo som følge av et glyoksalaseenzymsystém som omdanner dem til D-melkesyre i nærvær av redusert glutatiom Som følge av dette ville en ih vivo test av metylglyoksalvirkning på celledeling sannsynligvis være negativ som følge av virkningen av glyoksalase som finnes i alle dyrevev. Anvendelsen av et addukt av et aldehyd kan derfor forhindre hydrolyse av aldehydet på grunn av glyoksylase og tilveiebringe effektiv transport av aldehydet til tumorcellen.

En ytterligere forklaring på ineffektiviteten ved administrering av frie aldehyder er at umiddelbart efter intravenøs injeksjon kan slike aldehyder bindes til serum-proteiner og til glutationet som forekommer i stor mengde i erytrocytter, slik at det ikke konstateres noen virkning,

jfr. Esterbauer, "Discussion", IN Submolecular Biology and Cancer (Wolstenhome, Fitzsimons og Whelan, utgivere), Excerpta Medica, New York, side 242 (1979).

Det er forsøkt å utvikle nye cancerostatiske forbindelser eller komplekser inneholdende en aldehydbestanddel som i forbindelses- eller kompleksform er beskyttet mot innvirkning av glyoksalase, og som frigjør aldehydet på tumorstedet. En slik type dissosierbare addukter er kjent fra beskrivelsen til US-patent 4.238.500. Disse kjente forbindelser dannes ved omsetning a<y>et dialdehyd, a-ketoaldehyd elier dikéton med en acyloin-- eller endio.lf orbihde Ise, så som askorbinsyre. Disse forbindelser,' og særlig metylgyoksalaskorbinsyreforbindelsen,

har vist seg å være virksomme mot forskjellige tumorer i dyr •og mennesker. Det antas at disse forbindelser er virksomme mot tumorceller som følge av deres transport til cancerceller,"dissosiasjon på'tumorstedet under dannelse av et aldehyd og efterfølgende reaksjon med proteiner i tumoren, som fører til stansing av celledelingen.

Det er foretatt andre undersøkelser vedrørende addukter av forskjellige a,ø-umettede aldehyder med cystein, jfr. Esterbauer et al., Tetrahedron, .32:- 285-289 (1976). Cystein omsettes med akrolein og med krotonaldehyd for å danne mono-

og diaddukter ifølge nedenstående reaksjonsskjema:

En annen reaksjon er påvist for omsetningen med 4-hydroksy-pentenal:

diaddukt

Alle adduktene viste seg i- oppløsning å være i likevekt med cystein og utgangsaldehydene.• Reaksjonen med cystein resulterer i en kraftig minskning av aldehydenes toksisitet. Addukter av cystein-HPE 1:1 og cystein-krotonal 1:2 hindrer eller hemmer ved intraperitoneal administrering, veksten av Ehrlich ascites tumorer i mus, jfr. Tillian et al., Europ. J. Cancer 12: 989-993

(1976).

Videre er cysteinaddukter av forskjellige mettede aldehyder kjent, jfr. Schmolka et al., J. Org. Chem. 22:943-946 (1957). Reaksjonen fører til 2-substituerte tiazolidin-4-karboksylsyrer ifølge nedenstående reaksjonsskjema:

Det er ikke rapportert noen antitumorvirkning for disse 2-substituerte tiazolidin-4-karboksylsyrer.

Dessuten kjennes et metylglyoksal-N-acetyl-L-cystein-addukt, men strukturen er ikke klarlagt, jfr. Cdnroy, "Cancerostatic activity of methylgVoxal and related substances in tumor-bearing mice", IN Submolecular Biology and Cancer (Wolstenhome, Fitzsimons og Whalen, utgivere), Excerpta Medica, New York, side 271-298 (1379). Adduktet har en fire ganger så lav toksisitet som metylglyoksal alene (på en dose-ekvivalént-basis), men er litt mindre virksom mot Ehrlich ascites carcinom enn metylgyoksal. Det er ingen vesentlig forskjell på resultatene oppnådd med 1:1- og 1:2-adduktene. Adduktene fremstilles ved å sette N-acetyl-L-cystein til en metylglyoksaloppløsning, hvorefter det skylles med'nitrogen i 10 minutter før det inkuberes i en lukket beholder i to timer ved 37°C. Andre oppløsninger er ikke angitt.

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av hittil ukjente kjemiske addukter som kan anvendes i forskjellige sammen-setninger og anvendes som cytostatika.

Kort beskrevet blandes vandige oppløsninger av glyoksal og cystein for å danne et kompleks•som med oksygen danner et fri-radikal addukt. Ved pH-verdier i det sure. område dannes et 1:2-glyoksal-cystein-kompleks, og ved nøytrale pH-verdier dannes et 1:1-glyoksal-cystein-kompleks (molforhold).

Forbindelsene administreres til dyr eller mennesker som

har cancerceller.

Det er formålet med oppfinnelsen å fremstille hittil ukjente addukter eller forbindelser som har cytostatisk virkning i dyr og mennesker.

Farmasøyitske preparater kan inneholde det eller de fremstilte addukter sammen med et farmasøytisk bærestoff eller for-tynningsmiddel, hvilke preparater er effektive til behandling av cancer.

Det er.ytterligere formålet medOppfinnelsen å fremstille addukter av glyoksal-og cystein som dissosierer in vivo.

under frigjørelse av glyoksal på tumorstedet.

Andre formål, fordeler og trekk ved den foreliggende oppfinnelse fremgår av den følgende detaljerte beskrivelse og av eksemplene.

De nye addukter fremstilles ved å blande en vandig opp-løsning av cystein og en vandig oppløsning av glyoksal., hvorved omsetning finner sted. Eksempelvis blandes like store mengder av en 0,1 molar vandig oppløsning av cystein og en 0,i molar vandig oppløsning av glyoksal. Før blandingen mettes hver opp- løsning med oksygen. Blandingen innstilles på pH 5,5 med natriumkarbonat, og det ledes kontinuerlig oksygen gjennom blandingen ved romtemperatur. Et l:2-addukt av glyoksal og cystein dannes ved pH-verdier i det sure område.

Eventuelt kan reaksjonen gjennomføres ved en pH-verdi omkring nøytral-punktet, hvorved det fås et l:l-addukt av glyoksal og cystein.

De ovenfor beskrevne blandinger resulterer i paramagnetiske oppløsninger som gir et kraftig elektronspinn-resonanssignal, hvilket indikerer tilstedeværelse av frie radikaler. Skjønt disse frie radikaler ikke er identifisert med sikkerhet, antas det at de er addukter ay glyoksal og cystein.

De nye forbindelsene kan f.eks. også fremstilles ved å blande 5,8 g av en oksygenmettet, 40%ig oppløsning av glyoksal i vann med 100 ml av en oksygenmettet vandig oppløsning inneholdende 5 g cystein. pH-verdien innstilles til en verdi omkring nøytral-punktet, dvs. ca. 6,5 til ca. 7,5, hvis man ønsker 1:1-adduktet, eller til en verdi i det sure. område, dvs. fra ca. 3 til ca. 6,5, fortrinnsvis- ca. 5,5, for fremstilling av 1:2-adduktet. Det ledes oksygen gjennom blandingen ved romtemperatur, og efter 50 minutters forløp isoleres bunnfallet.

De fremstilte addukters antitumorvirkning og lave■ toksisitet illustreres i de følgende-eksempler.

i

Eksempel 1

30 voksne hvite hunnmus (Swiss) inokuleres bak høyre forpote på den ventrale side med ca. 5 x 10 Ehrlich ascites celler i 0,2 ml fysiologisk saltoppløsning. Musene fordeles tilfeldig og deles i 3 grupper med 10 i hver gruppe. ' Alle dyrene får drikke vann første og annen dag. Tredje dag byttes vannet i den ene gruppe (gruppe B) med en 0,05M glyoksal-oppløsning, og-i den andre gruppen (gruppe C) byttes vannet med en 0,05M glyoksal- og cysteinoppløsning. Den tredje gruppe (gruppe A) .eller kontrollgruppen, får fortsatt vann. I alle gruppene har dyrene adgang til å drikke ad libitum. Efter 7 dagers forløp har alle dyrene et friskt utseende. Det er ingen toksiske symptomer og intet vekttap. Ved visuell be-dømmelse konstateres ingen vesentlig minskning i størrelsen eller formen av tumoren i kontrollgruppen og gruppen som fikk 0,05M .glyoksaloppløsning som drikkevann. Tumorene'i gruppen som fikk 0,05M glyoksal- og cystein<q>ppløsning som drikkevann, syntes å være ca. halvparten så store som tumorene i. kontrollgruppen. Intet vekttap ble konstatert.

Alle. dyrene narkotiseres, og tumorene skjæres ut og renses for omgivende vev. De utskårne tumorers vekt er angitt i den følgende tabell I..

Gjennomsnittstumorvekten for gruppe A er.1200, for gruppe B 985 og. for gruppe C 450. Dette svarer til en hemning på 63%.

De fremstilte addukter utprøves mot forskjellige transplanterbare musetumorer, og resultatene av disse forsøk

■er angitt nedenfor i eksemplene 2-4.. Den anvendte generelle metodikk følger forskriftene fra National Cancer Institute for lymfatisk leukemi P-388 og P-1210 og Lewis lunge-carcinom,

jfr. f.eks. Cancer Chemotherapy Rep. _50: 79-84 (1966) og Cancer Chemotherapy Rep. Part 3. 3:1-103 (1972). De vesentlige forsøks-detaljer er angitt i hvert eksempel, og resultatene er sammen-fattet nedenfor.

Uttrykket "diaddukt" refererer til glyoksal-cystein-1:2-, reaks jonsproduktet, og uttrykket "mo.noaddukt" refererer til glyoksal-cystein-1:1-reaksjonsproduktet.

Eksempel 2

Virkning av addukt på P- 388 musele. ukemi.

Tumor inoeulum: 10 ascitesceller implantert, intraperitonealt.

Vert: CDF1hannmus med P-388

Behandling: En gang daglig i 9 dager, begynte første dag.

Eksempel 3

Virkning av addukt på Lewis lunge-carci nom

Tumor inoeulum: 10^ celler fra finhakket tumorgrøt implantert

intraperitonealt.

Vert: .BDF^hannmus

Behandling: En gang daglig i 11 dager begynnende den første dag.

Eksempel 4

Virkning av addukter på L-1210 leukemi

Tumor inoeulum: 10 6 ascites celler implantert intraperitonealt Vert: BDF^ hannmus

Behandling: En gang daglig i 9 dager begynnende den første dag.

Resultatene oppnådd i forsøkene beskrevet i de enkelte eksempler angis i det følgende.

Eksempel 2: Diadduktet og monoadduktet utprøves på P-388 lymfatisk leukemi og de er ytterst virksomme.

Eksempel 3: Monoadduktet og diadduktet utprøves på.Lewis' lungé-carcinom. Monoadduktet har særdeles god antitumorvirkning og resulterer i lange overlevelsestider ved disse doser. Diadduktet er virksomt til å øke den gjennomsnittlige overlevelsestid.

Eksempel 4:. Monoadduktet og diadduktet utprøves, på L-1210 leukemi. Ved det anvendte daglige doseskjema gir begge sammen-lignbare resultater, og det oppnås en statistisk signifikant økning av gjennomsnitts byerlevelséstider og langtids overlevelses-tall....

De fremstilte addukter har et bredt virkningsområde mot forskjellige eksperimentelle tumorsystemer, f.eks. P-388

lymfatisk leukemi, Lewis lunge-carcinom og L-1210 leukemi,,

med lav toksisitet. De kan administreres enten alene eller i kombinasjon med andre tumormidler. Vanligvis administreres de parenteralt i form av farmasøytiske preparater, dvs. blandinger av de aktive bestanddeler med passende farmasøytiske

■bærestoffer eller fortynnihgsmidler, men de kan også administreres oralt.

Vanligvis er preparatene egnet til injeksjon eller orai administrering, f.eks. i form av ampuller, kapsler, tabletter, pulvere, granulater etc.

Adduktene fremstilt ifølge foreliggende 'oppfinnelse kan anvendes til terapeutisk behandling av leukemi og tumor-

sykdommer hos dyr og mennesker, ved hvilke det med pass.ende mellomrom administreres en terapeutisk virksom mengde av de fremstilte addukter. Det er klart at den aktuelle anvendte mengde addukt vil avhenge av det bestemte addukt som anvendes,

det spesifikke preparat, administreringsmåten, administrerings-veien og andre forhold. Mange faktorer som har innflytelse på midlets virkning, skal tas i betraktning, herunder f.eks. alder, legemsvekt, kjønn, føde, administrerings-tidspunkt, administreringsvei, metabolisme- eller utskillelseshastigheten, kombinasjon med andre midler, følsomhet og sykdommens alvorlighets-grad eller tilstand. Den optimale dose kan i et gitt tilfelle fastlegges av en fagmann under anvendelse av konvensjonelle tester for dosebestemmeIse på grunnlag av ovennevnte retnings-linjer .

En dose til et voksent menneske kan f.eks. være

0,3-5 mg/kg/dag. Disse verdier er kun illustrerende.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et addukt av glyoksal og cystein,karakterisert vedat man omsetter glyoksal og cystein i en vandig oppløsning i nærvær av oksygen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at den vandige oppløsning har en pH-verdi på fra ca. 6,5 til ca. 7,5.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert, ved at. den vandige oppløsning har en pH-verdi.på fra ca. 3 til ca. 6,5.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at glyoksal og cystein omsettes i molforholdet 2:1.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at glyoksal og cystein omsettes i molforholdet 1:1.