NO771860L - P}visning av kreft. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for bestem-melse av melanomata og andre tumorer hos mennesker ved måling av antigen-indusert leukecytfestehemming, utløst av tumorspe-sifik, celleformidlet immunitet.

Celleformidlet tumorimmunitet er blitt påvist i forsøk med transplanterte tumorer hos mus og rotter. Eksempelvis brakte Halliday et al., Int. J. Cancer, bind 9, side 477 - 483 (1972)

et enkelt forsøk på celleformidlet immunitet betegnet som leuko-cytfestehemming. Dette forsøket berodde på oppdagelsen at festet av peritoneale leukcyter til glass inhiberes spesifikt ved tilsetting av tumorekstrakter når de peritoneale leukocytene tas fre mus som er blitt presensibilisert ovenfor den spesielle tumoren. Hoan et al., Cellular Immunology, bind 13, side 107 - 116 (1974) viste med anvendelsen av transplanterte tumorer hos rotter, mus og marsvin også det sammen fenomenet med makrofage-celler. Grofter et al., Cancer Research, bind 35, side 2571 -

2579 (1975)fastslo at brystkreft hos mennesker kan påvises ved at den antigen-induserte leukocytfestehemmingen, utløst av tumorspesifikt celleformidler immunitet, kan måles. Ved for-søke med:- anvendelse av immunologiske prinsipper for stadfestelse og mulig behandling eller heling av forskjellige krepsfenomener hos mennesker er det gjort et omfattende forskningsarbeid. En viss pekepinn på eksistensen av en gjesteimmunreaksjon på ondartet melanomata foreligger nylig fra Lewis et al., British Medical Journal, bind 3, side 547 - 552 (1969). Oren et al., Clin. Exp. Immunol., bind 9, side 45 - 46 (1971), Cochran et

al., Lancet, bind 1, side 1340 - 1341 )1972), de Vries et al., Int. J. Canser, bind 9 side 567 - 576 (1972), Hellstron et al., Int. J. Cancer, bind 11. side 280 - 292 (1973), Heppner et al., Int. J. Cancer, bind 11, side 245 - 260 (1973) og Hollinshead et

al., Cancer, bind 34, side 1235 - 1243 (1974).

Skjønt et vist resultat var oppnådd ved dyremodeller med transplanterte tumorer, var immulogoske metoder som var utviklet for påvirkning av melanomata ikke vellykkede for den brede påvisning. Skjønt det var almen kjent at en immunolosisk forsvarsmekanisme består i de første trinnene ved ondartede sykdommer og slike forsvarsmekanismer var påvist med ondartet melanomata hos mennesker, har ingen forsøk som anvender dette prinsippet blitt •" utviklet som egner seg for undersøkelser innen en bred ramme.

I idelle tilfeller viTle en ønskelig påvisning av ondartet melanomata hos mennesker være en blodpåvisning, som var enkel, spesifik og reproduserbar og vise sykdommen i et tilstrekkelig tidlig stadium slik at den ennå er helbredbar.

Det ble nå funnet at produktet fra den immunologiske forsvarsmekanismen til det mennesklige legemet overfor aodartede tumorer, for eksempel karzinomer, sarkomer og melanomata kan påvises i et sykdomsstadium som er tidlig nok, slik at sykdommen ennå

er helbredbar. Den anvendte metoden for påvisning av produktet fra den immunologiske forsvarsmekanismen er en blodprøve som er enkel å gjennomføre, spesifik ovenfor ondartede tumorer,

for eksempel melanom, og gir reproduserbare resultater. De her anvendte begrepet "ondartet melanom" betyr en ondartet tumor som består av svarte cellemasser med en utpreget tendens til metastaser.

Ved fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen samles leukocytene fra heparinisert venøst blod fra pasienten, suspenderes så med en utmålt mengde leukocyter i en puffret løsning hvorpå leukocytene blandes med ekstrakter fra ondartede melanomtumorer, mens vevs-ekstrakter fra personer med godartet brystsykdom, bryst-adenokarzinom, anvendes for kontroll, hvorved forskjellige godartede sykdommer eller ondartede tumorer ikke kan påvises. Ifølge egnede inkubasjonsmetoder telles i hvert tilfelle det tall celler som ikke henger eller hefter til sidene av forsøksrøret, og leukocythemmingen måles som ikke-heftig-indeks (NHI). Dette bestemmes om det foreligger ondartet melanom eller ikke.

Ikke-hefte-indeksen beregnet etter den følgende formel:

Leukosytene samles -etter vanlige metoder og telles, for eksempel

i hemocytometer. Den hepariniserte blodprøven inkuberes ved ca 37°C ca. 1 time oe plasmafraksjonen oppsamles. Plasmafraksjonen er rik på leukocyter. Leukocytene adskilles ved sentrifugering og suspenderes i en isotoniske puffer. Eventuelle.'tilbakeværende erytrocyter lyseres fra leukocytsuspensjonen.

Leukocytene frasentrifugeres så og suspenderes i et egnet vandig medium ved en cellekonsentrasjon på 1 x 10 7/ml.

Tumorekstraktene fremstilles ved homogenisering av tumorprøvene (eller normale vevsprøver) i en iskald puffret saltløsning med

pH på ca. 7.3, sentrifugering av homogenisatet og oppsamling av den erholdte ovenstående væsken. Den anvendte puffer er fortrinnsvis en fosfatpuffret saltløsning (PPS). Det må anvendes en basisk pH-verdi, da en sur pH ødlegger antigenaktiviteten.

For anvendelse for prøven bør ekstraktene fortynnes med et egnet vandig medium, fortrinnsvis medium 119 (Microbiologival Associ-ates) . Den optimale fortynningen for anvendelsen i prøven bestemmes for hvert ekstrakt ved bestemmelser av konsentrasjonen av:tumorantigen, som fremkaller den største tilvekts mellom den spesifike og ikke-spesifike'inhibering av leukocytfestet.

Tumorekstraktet fra ondartet melanom er det antigenmateriale

som gir opphav til celleformidler immunitet. Antigenene som er egnet for anvendelse som ikke-spesifike kontrollprøver er vevsekstrak fra brystkreft, adenokarzinom fra tarmen, eggstokken, urinblæren og lungekreft osv. Antigenene som anvendes for ikke-spesifike kontroller slik det er beskrevet kan også påvises ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen under anvendelse av de egnede ikke-spesifikerte kontroller. Således kan også egg-

stokk, urinblære, hals- og lungekreft påvises.

Forsøket utføres ved blanding av andelsmengder av en liten

7

mengde blodleukocytsuspensjon med ca. 1 x 10 leukocyter pr.

ml med avsondrede små mengder puffer, ondartet melanom-antigen eller ikke-beslektet antigen i adskilte glassbeholdere. Hver blanding bringes så opp til et forutbestemt volum. Hver blanding inkuberes så i glassbeholder som er sådann anordnet at innholdet i det minste dekker 3/4 av beholderens innsideflate, Inkubasjonen skjer ved ca. 37°C ved en tilstrekkelig tid for fullstendig for-løp av reaksjonen, når den inntrer under en fuktet 5% CC^/luftatmosfære. Er inkubasjonen avsluttet beveges innholdet og tallet på ikke-krevende celler telles.

Mengden av leukocytsuspensjon er med fordel meget liten, normalt ca. 0.1 ml. Leukocytkonsentrasjonen er slik at tallet på celler i et tydelig resultat og reaksjonen kan lett analyseres med antigenmateriale. Pufferen som anvendes for fortynning er medium 199 med en pH på 7.2 til 7.4. Den anvendte mengden antigenekstrakt ligger med fordel på ca. 0.1 ml av det fortynnede ekstraktet. Vanligvis med medium 199. Fortynnings.graden til det konsentrerte antigenekstraktet på volumbasis kan ligge mellom 1 del antigenekstrakt pr. 4 til 16 deler fortynningsmiddel. Foretrukket anvendes en 1 : 4-fortynning.

Sluttvolumet til prøveblandingen av leukocyter og antigenene

er med fordel ca. 0.5 ml. Det middel som anvendes for fortynning til dette volumet er medium 199.

Egnede glassbeholdere kan være av enhver passende størrelse og form. På grunn av bekvem anvendelse og tilgjengelighet er 20 ml pyreks eller kimaks-prøverør foretrukket. Inkubasjonen skjer med prøverørene i vannrett stilling i en holder som for-hindrer at de beveger seg. Dette er avgjørende da en bevegelse under inkubasjonen kan påvirke forsøksresultatene uheldig. Inkubasjonen skjer fortrinnvis ca. 2 timer. Lengere tider

kan også finne anvendelse, men øker ikke forsøkets nøyaktighet eller reaksjonens fullstendighet. Også kortere tider kan anvendes, men er ikke optimale.'Således er inkubasjonstider på

ca. 1 til 3 timer brukbare.

De ikke-klebende cellene telles på hvilken som egnet måte,

for eksempel under anvendelse av et hemocytometer.

Ifølge fremgangsmåten ved oppfinnelsen ble det funnet at reaksjonen av en pasients leukocyter på ondartet melanomekstrakt ikke avhang av ekstraktets kilde. Ekstrakter fra en pasient ■ som undersøkes eller ekstrakter fra ondartet melanomater fra •" en annen pasient gir likeverdige resultater. Dette viser at leukocytene til en pasient med ondartet melanom utvikler celleformidlet immunitet, som er spesifik ovenfor alle ondartede melanomata av samme type og ikke påvirkes av antigen kilden.

De følgende eksempler anskueliggjør oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Tumorekstrakter

Prøver på ondartet melanomtumorer ble tatt operativt og brakt

i en steril beholder. Fett og fibervev ble skåret vekk, og prøven ble fint oppskåret med skarpe sakser i iskald, fosfat-puffret saltløsning (PPS, 0.15 m forfatpuffer, 0.15 m salt-løsning) ved pH 7.3. Det erholdte materiale ble homogenisert 10 til 15 minutter i 5 volumdeler PPS ved 40 000 omdreininger pr. minutt i en VirTis 45-homogenisator. Homogensiatet ble sentrifuger med 20 000 g 30 minutter og den ovenforstående væsken ble samlet og oppbevart ved -40°C i små mengder (2 ml). Ekstraktet fra brystkreft, biærekreft og andre tumorer som eggstokk- og lungekreft ble fremstilt på samme måte og anvendt som kontroller for fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen. Protein-konsentrasjonen i forholdsekstraktene var 6 - 8.5 mg pr. ml. For anvendelsen i forsøket ble ekstraktene opptint og fortyn-net med medium 119 til 1 : 4 på volumbasis. Medium 119 er et vanlig handelsprodukt (Microbiological Assiciates, Bethesda, Maryland) og består av:

fylt i og oppbevart ved pH 7.2 - 7.4

EKSEMPEL 2

Fremstilling av leukocytreagens

Pasienter med ondartet melanom samt kontrollpersoner ble tappet

for blod og dette ble straks oppbevart ved 4°C. Etter retrak-sjonen av faste bestanddeler natten over ble serumet avskilt og oppbevart ved -40°C. Disse blodprøvene var hepariniserte blod-prøver fra pasienter med ondartet melanom samt kontrollpersoner med blære- eller brystkreft og en rekke ikke-ondartede sykdommer eller andre ikke-beslektede onder. Diagnosen på ondartet melanom i de således betegnede pasienter ble bekreftet histologisk. Den kliniske diagnosen fra alle kontrollpersoner og ikke-beslektede onder ble bekreftet ved histologisk granskning av en operativ prøve. 20 ml-prøver av det hepariniserte blodet, dvs. venøse blodet, ble anbrakt i 2 10 ml-rør og stilt loddrett i de univerasleglass-flasker i 1 time ved 37°C. Den dannede leukocytrike plasmafraksjonen ble frafiltrert og sentrifugert 15 miumtter ved 200 g. Det cellefrie plasmaet ble fjernet og kastet. De til-bakeblivende ellelegemene ble suspendert i en iskald isotonisk, tris-puffret ammoniumkloridløsning ved gjentatt pipetering og latt stå 15 miummter ved 4°C for å lysere fremdeles tilbake-blevne erytrocyter. Denne prosedyren ble avsluttet ved tilsetting.av 3 ml medium 199 og cellene ble sentrifugert 15 minutter ved 200 g. Supernantanten ble fjernet og kastet og de til-bakeblevne cellene ble så 2 ganger vasket med 10 ml medium 199. Delmengder av leukocyter ble fremstilt med en konsentrasjon på 1 X 10 celler pr. ml under anvendelse av medium 199 som fortynningsmiddel.

EKSEMPEL 3

LHI- forsøk

0.1 ml mengder av blodleukocytsuspensjoner med 1 x 10 7 celler pr. ml ble anbrakt i 20 ml-glass-prøverør på 16 x 150 mm. Disse leukocytene ble tilsatt 0.1 ml-ekstrakter av preparater av ikke-beslektede tomorceller eller 0.1 ml-ekstrakter av ond-artede melanomatumorer. Forskjellige tumorekstrakskonsentrasjoner ble anvendt for å bestemme den optimale konsentrasjonen. Blandingen av leukocyter og forsøksceller ble brakt til et sluttvolum på 0.5 ml ved tilsetting av medium 119. Blandingen ble så rørt for å bringe glassene i en vannrett stilling•slik at innholdet deres dekket 3/4 av glassets overflate. De vann-rette glassene ble så inkubert 2 timer i en fuktet 5% CC^/luftatmosfære ved 37°C. Under inkubasjonstiden ble glassene ikke rørt eller beveget. Etter inkubasjonen ble glassene stilt loddrett og innholdet rørt om med en Pasteurpipette. Antallet ikke-klebende celler pr. ml ble bestemt i et hemocytometer. Alle forsøkene ble gjennomført 3 ganger. Resultatene som er uttrykt som ikke-hefte-indeks (NHI) befinner seg i tabellen I.

Resultatene i tabell I viser at pasientene med ondartet melanom viser en betraktelig høyrer -NHI i sammenlikning med andre pasienter når fortynningen av melanomtumorekstraktet er 1 : 8. Perifere blodleukocyter fra pasienter med ondartet melanom inkubert med melanomtumorekstrak hadde leukocyt-ikke-hefte i området fra 35 til 65% mens de samme cellene inkubert med brystkreftekstrakt hadde et leukocyt-ikke-hefte på 15 til 39%. Kontrollpersonene viste en leukocyt-ikke-hefte i området på 15 til 39%, og rekasjonene på ekstraket fra ondartet melanom og kontrolltumor var de sammen. NHI for kontrollpersoner var under 30 og for pasienter med ondartet melanom over 30.

Inkuberes blodleukocyter fra pasienter med ondartet melanom eller fra kontrollpersoner i glassrør uten antigentilsetting i 2 timer, finner man ca. 10% ikke-heftende celler. Tilsettingen av hvilket som helst tumorekstrakt til ikke-sensibiliserte perifere blodleukocyter hemmet heftingen fra 18 til 38% av leukocyten.

For å oppnå de optimale forsøksbetingelsene, dvs. den maksimale spesifisk hemmingen av leykocytheftet med den minste ikke-spesifike hemning, ble antigenekstraktene prøvet ved forskjellige konsentrasjoner med leukocyter fra kontrollpersoner, og så med leukocyter fra pasienter med ondartet melanom. Som vist i tabell II, synker NHI med tiltakende fortynning. Dog i dette tilfellet førte en 1/8 fortynning av brystkreftekstra-kter og ekstrakter fra ondartet melanom til en høyere prosentverdi for leukocyt-ikke-hefte for pasienter med ondartet melanom og en liten prosentverdi av leukocyt-ikke-hefte overfor ondartet melanom såvel for kontrollpersoner som pasientene med brystkreft. Derfor er for hensikter ifølge oppfinnelsen en fortynning på 1/8 av antigener, dvs. 1 del antigenekstrakt på 8 deler fortynningsmiddel foretrukket. Gode resultater oppnås dog med fortynninger på 1 : 4 til 1 : 16.

Cholelithiasis- og herni-pasienter er kontrolltilfelle, bryst-kreftpasienter ga det ikke-spesifike antigenet og pasienter med ondartet melanom ga det speslfike antigenet.

Tabell III viser at NHI var liknende når nå de perifere blodleukocytene fra pasienter med ondartet melanom var utsatt for allogene eller autoktone melanomekstrakter. Den eneste pasienten som viste en liten aktivitet overfor det autoktone tumorekstrak hadde et fremskredet stadium av ondartet melanom og hans NHI hadde avtatt tilsvarende.

Anvendes andre tumorer som ikke-sepsifikert kontrollantigen,

er resultatene liknende som dem med brystkreftekstrakt som ikke-spesif ikt kontroll. Ble et blærekreftekstråks prøvet mot pasienter med ondartet melanom og blærekreft samt kontrollpersoner, reagerte leukocytene fra melanompasienter med melanomtumorekstraktet, og leukocytene fra pasientene med blærekreft reagerte med blærekreftekstraket. De reagerte ikke med det ikke-spesifike antigen eller kontrollen. Dette viser at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er anvendelig på prøven på blærekreft samt på ondartet melanom. Blærekreft er et karzinom. Ovenstående resultater er sammenfattet i tabell IV.

<a>^ NHI beregnet med melanomtumor som spesifikt antigen

og blærekreft som ikke-spesifikt antigen.

fo )NHI beregnet med blæreekstrakt som spesifikt antigen

og melanomtumorekstrakt som ikke-spesifikt antigen viste at 9 av 15 pasienter med blærekreft hadde en NHI større enn 30 ovenfor blærekreftekstrakt og en

mildere NHI på 38 og et området på 90- (-20).

Leukocyter fra 2 ondartede melanomata som var reaktive ovenfor ondartet melanomekstrakt viste ingen tegn på kryssreaktivitet overfor tumorekstrakter fra lunge, blære eller eggstokker ved leukocyt-hemningsprøven ifølge oppfinnelsen.

Hos 33 pasienter med histologisk påviselig ondartet melanom inntrådte leukocytheftehemning med perifere blodleukocyter fra 22 pasiseter med ondartet melanom. Hos denne pasientrekken og med disse tumorekstraktene ble en NHI større enn 30 valgt som signifikante melanolpasienter og kontrollpersoner. Den følgende tabell V viser at av 475 kontrollpersoner hadde 21 en NHI-verdi på større enn 30. Ved ny undersøkelse hadde bare 2 ytterligere en NHI-verdi på større en 30.

Kontrollpasienter med andre kreftstyper enn ondartet melanom viste ingen LHI ved prøven med melanomtumorekstrakt. Pasienter med ondartet melanom som var undersøkt før kirurgisk uttak av melanomtumor hadde en mildere NHI på 61, 103 og 32 for ondartet melanomata fra trinn I, II henholdsvis III. Dette er statistisk betraktelig forskjellig fra kontrollgruppen ( p mindre enn 0.001 etter uparret t-prøven).

a)

NHI større enn 30 ble betraktet som positiv

Trinn I - et lokalisert primært ondartet melanom,

begrenset til hud eller øye

Trinn II - regioanlt lymfeknute-metastase eller lokal

gjentatt opptreden av tumor i huden eller lymfeknutene.

Trinn III - vidtgående metastaser.

Avhengig av kreftens stadium hadde de perifere blodleukocytene til pasienten med ondartet melanom forskjellige reaktivitet med LHI-prøven. Av de 13 pasientene med ondartet melanom i trinn I in situ viste 11 reaktivitet ved LHI-prøven, skjønt mange hadde små hudsår. Deres mildere NHI var 61. 2 pasienter hadde en NHI under 30. En pasient hadde en ondartet melanom på 3 x 5 mm på bindehuden uten noe utbredelse, og den andre pasienten hadde en benskade på 1 x 1,2 cm. Alle pasienter med ondartet melanom i trinn II viste LHI-reaktivitet, og deres mildere NHI på 103 var den høyests av alle trinn.

Derimot viste 3 av 5 pasienter med ondartet melanom i trinn III ingen LHI-reaktivitet. Deretter ble den positive NHI til en av pasienten negativ med tiltagende tumorbelastning. Den andre pasienten i trinn III med en positiv NHI fikk en lever-enkel-metastase-reseksjon, og han er klinisk kreftfri etter 16 måneder. Den mildere NHI på 32 av pasienter på trinn III var den laveste for pasienter med aktiv kreft.

Endelig ble 8 pasienter, som alle hadde hatt en reseksjon av ondartet melanom i trinn I eller II minst 1 år tidligere og var klinisk kreftfrie, underkastet NHI-prøven i prøverør. 6 av 8 pasienter hadde en NHI på 30 eller lavere og de øvrige 2 pasienter en sådann på 38 og 40. Disse pasientene med en tidligere ondartet melanom som var klinisk frie for kreft, hadde en mildere NHI på 22.

Bukvæske fra en pasient med metastase ondartet melanom i buk-hulen viste at leukosyten til en pasient er reaktivt melanom reagerte på bukvæsken og melanomekstraktet, hviklet viser at

bukvæsken ikke holdt melanomtuinor-antigen.

Den forutgående beskrivelse viser at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er en enkel og kvantitativ metode for måling av celleformidlet immunitet overfor antigen ondartet melanomtumor og blærekarzinomtumor samt andre tumorer, for eksempel hals, eggstokk, leverkarsinom, sarkom. Prøven er immunologisk spesifik og reproduserbar og kan finne anvendelse på allogene - og autologe tumorekstrakter.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for påvisning av forkomst av melanom, blære-karsinom, eggstokkreft, lungekreft, leverkreft, zervikalkreft og sarkom hos mennesker, karakterisert ved at en utmålt mengde leukocyter fra blodet til en: pasient med vandig basiske ekstrakter av en tumor av kreften som skal påvises inkuberes og deretter leukocyt-ikke-hefte-indeksen bestemmes ved sammenlikning ved en kontroll.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at ondartet melanom påvises som kreft som skal påvises.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at blærekarzinom påvises som kreft som skal påvises.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at eggstokkreft påvises som kreft som skal påvises.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at zorvikalkreft påvises som kreft som skal påvises.

6. Fremgangsmåte ifølge ét av kravene 1 til 5, karakterisert ved at som tumorekstrakt anvendes et sådant fra en tumor hos pasienten som skal undersøkes.

7. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 'til 5, karakterisert ved at som tumorekstrakt anvendes et sådant fra en tumor fra en pasient som ikke skal undersøkes.

8. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 til 7, karakterisert ved at som tumorekstrakt av ondartet melanom anvendes et vandig ekstrakt med en pH på 7.3.