NO752568L

NO752568L -

Info

Publication number: NO752568L
Application number: NO752568A
Authority: NO
Inventors: S M Russell; L W J Bishop
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1974-07-19
Filing date: 1975-07-18
Publication date: 1976-01-20
Also published as: CH621874A5; NL7508624A; GB1501395A; ES439520A1; FR2278308A1; FI752081A; IE41633L; DK328075A; JPS5135418A; IE41633B1; IT1048304B; AT352289B; AU500101B2; DE2532283A1; BR7504584A; NZ178160A; CA1054935A; ZA754643B; FR2278308B1; BE831554A

Description

Fremgangsmåte for diagnostisering avProcedure for diagnosis of

sykdommer.diseases.

Foreliggende oppfinnelse angår et system for diagnostisering av mikrobesykdommer i mennesker, dyr og planter, mer spesielt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for måling av den mengde antistoff som oppstår på grunn av sykdommen . The present invention relates to a system for diagnosing microbial diseases in humans, animals and plants, more particularly the invention relates to a method for measuring the amount of antibody that occurs due to the disease.

Den mest vanlige fremgangsmåte som brukes for diagsnose av visse typer virussykdommer er den såkalte "hemagglutinasjonsinhiberingsprøve" (H.I.). Denne prøve har den ulempe at den er avhengig av at visse typer virus bare vil agglutinere visse typer erythrocyter. F.eks. vil influensa, kusma og para-influensa virus agglutinere kyllingTmenneske-og marsvih-erythrocyter, adenovirus vil agglutinere rotte og ape erythrocyter, mens reoviruser og mange entero-viruser bare vil agglutinere erythrocyter fra mennesker. Denne prøve utføres ved å blande virus med passende erythrocyter i nærvær av pasientens serum, det vil si den væske som man får tilbake når blodet koagulerer og danner en klump. Hvis anti-stoffene til virues er tilstede i nevnte serum, vil virusen være ute av stand til å agglutinere cellene. Hemagglutinasjons-inhiberingsprøven har videre den ulempe at den er langsom og ikke helt nøyaktig, idet man må bruke såkalte fordoblede for-tynningsserier, noe som gjør at man taper nøyaktighet og som gjør det umulig å påvise små forskjeller med hensyn til mengden av antistoff. Videre må nevnte sera fremstilles eller forbehandles slik at man fjerner ikke-spesifikke hemnings-stoffer som hindrer at virusen binder seg til erythrocytene og derfor resulterer i en falsk positiv reaksjon på prøven. The most common method used for the diagnosis of certain types of viral diseases is the so-called "hemagglutination inhibition test" (H.I.). This test has the disadvantage that it relies on the fact that certain types of virus will only agglutinate certain types of erythrocytes. E.g. influenza, mumps and para-influenza viruses will agglutinate chicken, human and guinea pig erythrocytes, adenovirus will agglutinate rat and monkey erythrocytes, while reoviruses and many enteroviruses will only agglutinate human erythrocytes. This test is carried out by mixing virus with suitable erythrocytes in the presence of the patient's serum, that is to say the liquid that you get back when the blood coagulates and forms a clot. If the anti-substances to viruses are present in said serum, the virus will be unable to agglutinate the cells. The hemagglutination inhibition test also has the disadvantage that it is slow and not completely accurate, since you have to use so-called doubled dilution series, which means that you lose accuracy and which makes it impossible to detect small differences with regard to the amount of antibody. Furthermore, said sera must be prepared or pre-treated in such a way as to remove non-specific inhibitory substances which prevent the virus from binding to the erythrocytes and therefore result in a false positive reaction to the sample.

Det er nylig foreslått en ny prøve for påvising av antistoff fra influensa-virus, det vil si den såkalte "enkle utstrålingsdiffusjons-prøven" og denne er foreslått av Schild et al.(Symp.Series Immunobiol. Standard, Vol.20, sidene 39~4-6) > hvor den passende influensavirus (67 til 100^ig rensede viruspartikler pr. ml gel) inkorporeres i agarose-gel. Når gelen har stivnet, skjærer man ut sirkulære brønner, og pasientens eller dyrets serum som skal prøves føres inn i nevnte huller eller brønner. Et nærvær i serumet av virus antistoff påvises ved at det i veggene omkring brønnene blir soner av ugjennomskinnelighet. Denne ugjennomskinnelighet forårsakes av lysbrytningen som skylles en krans av antistoff-molekyler som omgir hver viruspartikkel. A new test for the detection of antibody from influenza virus has recently been proposed, that is, the so-called "simple radiation diffusion test" and this has been proposed by Schild et al. (Symp.Series Immunobiol. Standard, Vol.20, pages 39 ~4-6) > where the appropriate influenza virus (67 to 100 µg purified virus particles per ml of gel) is incorporated into the agarose gel. When the gel has solidified, circular wells are cut out, and the patient's or animal's serum to be tested is introduced into said holes or wells. A presence in the serum of virus antibody is demonstrated by the fact that there are zones of opacity in the walls around the wells. This opacity is caused by the refraction of light that washes off a wreath of antibody molecules that surrounds each virus particle.

Den enkle radiale diffusjonsprøven har bedre opp-løsning enn H.I.-metoden og er raskere å utføre. Den har imidlertid den ulempe at de influensavirus-preparater som brukes for dette formål må renses og høykonsentreres i gelen, og dette gjør prøven kostbar. Videre er det nødvendig å ha store mengder virus for å få utført prøven. The simple radial diffusion test has better resolution than the H.I. method and is faster to perform. However, it has the disadvantage that the influenza virus preparations used for this purpose must be purified and highly concentrated in the gel, and this makes the sample expensive. Furthermore, it is necessary to have large amounts of virus in order to perform the test.

Man har nå funnet en ny prøve som går ut på følgende. Først inkorporerer man i en gel erythrocyter som på sine overflater har festet mikrobepartikler. Deretter lar man en prøve av kroppsvæsken som kan inneholde spesifikke antistoffer til mikroben diffudere inn i gelen. Deretter til-føres systemet et komplement, og dette komplement vil fikseres eller kombineres på de steder hvor spesifikke antistoffer har virket på mikrobepartiklene. Som et resultat av denne får man en synlig sirkulær sone med nedbrytning og hvis størrelse er avhengig av den tilstedeværende mengde antistoff. Selve nedbrytningen er en oppsprekking av erythrocytene og dette resulterer i en frigjøring av hemoglobin. A new test has now been found which involves the following. First, erythrocytes are incorporated into a gel which have fixed micro-particles on their surfaces. A sample of the body fluid, which may contain specific antibodies to the microbe, is then allowed to diffuse into the gel. A complement is then supplied to the system, and this complement will be fixed or combined in the places where specific antibodies have acted on the microbe particles. As a result of this, a visible circular zone of degradation is obtained, the size of which depends on the amount of antibody present. The breakdown itself is a rupture of the erythrocytes and this results in a release of hemoglobin.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer såledesThe present invention thus provides

et system for påvisning av et spesifikt mikrobielt antistoff i kroppsvæsker såsom blod, serum, plasma, nesedråper, spinal-væsker, spytt eller melk, som innbefatter en gel inneholdende intakte erythrocyter som på sin overflate er tilklebet passende mikrobepartikler. Mer spesielt inngår det i systemet slik dette er definert tidligere, også et komplement. a system for the detection of a specific microbial antibody in body fluids such as blood, serum, plasma, nasal drops, spinal fluids, saliva or milk, which includes a gel containing intact erythrocytes to which appropriate microbial particles are adhered. More specifically, the system as defined earlier also includes a complement.

Den gel som brukes er fortrinnsvis fremstilt fra 0,5 til 2,0% agarose, men man kan også bruke agar, gelatin eller ethvert annet egnet materiale som tillater diffusjon og som ikke har anti-komplement aktivitet. Gelkonsentrasjonen bør fortrinnsvis være så sterk at den blir lett å behandle, men The gel used is preferably prepared from 0.5 to 2.0% agarose, but agar, gelatin or any other suitable material that allows diffusion and does not have anti-complement activity can also be used. The gel concentration should preferably be so strong that it is easy to process, but

ikke så sterk at diffusjon ikke kan finne sted.not so strong that diffusion cannot take place.

Erythrocytene kan oppnås ved venepunktur at et pattedyr og kan oppsamles i et medium som hindrer sammenkleb-ning. For det foreliggende formål kan man bruke flere typer erythrocyter, f.eks. erythrocyter fra kveg kan brukes med visse typer virus. Man bruker imidlertid vanligvis erythrocyter fra sauer, men disse har den ulempe at de har Forssmans erythrocyt-antigen på sin overflate, og den væske som skal prøves må før prøvingen behandles med saueerythrocyter ved 37°C i 30 minutter for å absorbere antistoff til Forssman-antigenet. The erythrocytes can be obtained by venipuncture in a mammal and can be collected in a medium that prevents adhesion. For the present purpose, several types of erythrocytes can be used, e.g. erythrocytes from cattle can be used with certain types of virus. However, erythrocytes from sheep are usually used, but these have the disadvantage that they have Forssman's erythrocyte antigen on their surface, and the liquid to be tested must be treated with sheep erythrocytes at 37°C for 30 minutes before the test to absorb antibody to Forssman's the antigen.

Andre typer kan være foretrukket i forbindelse med visse typer mikrober, f.eks. når meslingvirus brukes, så er vanligvis Påtas ape-erythrocyter meget hensiktsmessige og foretrukne, skjønt visse erythrocyter kan være for sprø eller større enn det som er nødvendig, og følgelig får man ikke så fint definerte nedbrytningssoner. Ved lagring har erythrocytene en tendens til å bli mer sprø med alderen og mer føl-somme overfor spontan nedbrytning, og derfor for å forlenge erythrocytenes brukbarhet, kan forskjellige kjemiske stoffer tilsettes gelen for å stabilisere cellene. Alternativt kan eryfhrocytene forbehandles med et kjemisk stoff så som glutaraldehyd for å stabilisere dem. Other types may be preferred in connection with certain types of microbes, e.g. when measles virus is used, Påta's monkey erythrocytes are usually very appropriate and preferred, although certain erythrocytes may be too friable or larger than necessary, and consequently one does not obtain so finely defined degradation zones. On storage, the erythrocytes tend to become more brittle with age and more sensitive to spontaneous breakdown, and therefore to extend the erythrocytes' useful life, various chemical substances can be added to the gel to stabilize the cells. Alternatively, the erythrocytes can be pretreated with a chemical such as glutaraldehyde to stabilize them.

En annen fremgangsmåte for å "forlenge livet" på erythrocytene er å inkorporere dimetylsulfoksyd (DMSO) i gelen når denne helles ut og så fryse gelen i dampen over flytende nitrogen. Ved å inkorporere ca. 10% DMSO vil gelens holdbarhet opprettholdes. Another method to "extend the life" of the erythrocytes is to incorporate dimethylsulfoxide (DMSO) into the gel when it is poured out and then freeze the gel in the steam over liquid nitrogen. By incorporating approx. 10% DMSO, the shelf life of the gel will be maintained.

Hvis de mikrobepartikler som skal brukes i systemet er virus, kan disse fremstilles på vanlig kjent måte fra dyr, egg eller vevs-kultur, se.f.eks. "Textbook of Virology" av A.J. Rhodes og CE. van Rooyan, 5« utgave utgitt av Williams and Wilkins, Baltimore, USA 1968. If the microbial particles to be used in the system are viruses, these can be produced in a commonly known manner from animals, eggs or tissue culture, see e.g. "Textbook of Virology" by A.J. Rhodes and CE. van Rooyan, 5" edition published by Williams and Wilkins, Baltimore, USA 1968.

Med visse typer virus krever erythrocytene en forbehandling med et kjemisk stoff som fremmer bindingen av viruspartiklene på overflaten av erythrocytene. F.eks. vil influensavirus aggjutinere erythrocyter, men dette følges av en eluering ved 37°Cjdet vil si at viruspartiklene snart mister taket på erythrocyt en e:_- spontant, noe som skyldes virkningen av enzymet neuraminidase fra selve viruset på reseptorer i erythrocytene. For å sikre at influensavirus forblir perma-nent festet til erythrocytene, kan de forbehandles med kaliumperiodat-oppløsning, og konsentrasjonen av denne vil være avhengig av den type erythrocyter som brukes, og vil variere fra 1,25 til 5>5x 10"^" mol. Dette resulterer i dannelse av aldehyd eller tilsvarende modifiserte grupper på erythrocytenes overflate og hindrer virkningen av neuriminidase. Med andre typer virus, f.eks. reøde hunder, er det ikke nødvendig med en .forbehandling av erythrocytene med periodat eller andre kjemiske forbindelser så som kromklorid eller karbodiimid. With certain types of virus, the erythrocytes require a pre-treatment with a chemical substance that promotes the binding of the virus particles on the surface of the erythrocytes. E.g. influenza virus will agglutinate erythrocytes, but this is followed by an elution at 37°C, which means that the virus particles soon lose their hold on the erythrocyte spontaneously, which is due to the effect of the enzyme neuraminidase from the virus itself on receptors in the erythrocytes. To ensure that influenza viruses remain permanently attached to the erythrocytes, they can be pre-treated with potassium periodate solution, the concentration of which will depend on the type of erythrocytes used, and will vary from 1.25 to 5>5x 10"^" mol. This results in the formation of aldehyde or similarly modified groups on the surface of the erythrocytes and prevents the action of neuriminidase. With other types of viruses, e.g. red dogs, it is not necessary to pre-treat the erythrocytes with periodate or other chemical compounds such as chromium chloride or carbodiimide.

Visse mikroorganismer vil ikke feste seg direkte til erythrocytene og i slike tilfeller er det mulig å koble organismen til erythrocytene indirekte ved å bruke forbindelser som har en affinitet for erythrocytene, såsom lectiner eller lipo-polysaccharider. Certain microorganisms will not attach directly to the erythrocytes and in such cases it is possible to connect the organism to the erythrocytes indirectly by using compounds that have an affinity for the erythrocytes, such as lectins or lipo-polysaccharides.

Komplementet som i en spesiell type av systemet allerede er inkorporert i gelen, består av en kompleks gruppe av serumproteiner,hvorav de fleste har det karakteristika at de samvirker med antistoff-molekylene såsnart disse har kombi-nert seg med et antigen, og effekten av en slik kombinasjon er at det frembringes en oppløsning hvor det antigen som det angår er en celle såsom en erythrocyte. Det komplement som er nødvendig for det foreliggende formål er hensiktsmessig et pattedyr-komplement, og dette kan fortrinnsvis oppnås kommersielt fra Wellcome Reagents Ltd. eller fremstilles ved å la blod koagulere, fjerne serumet og lagre det ved 4°C eller under, fortrinnsvis ved -20°C. Det inkorporeres så i systemet i en tilstrekkelig stor mengde til å sikre en oppløsning. The complement, which in a special type of system is already incorporated into the gel, consists of a complex group of serum proteins, most of which have the characteristic that they interact with the antibody molecules as soon as these have combined with an antigen, and the effect of a such a combination is that a solution is produced where the antigen concerned is a cell such as an erythrocyte. The complement required for the present purpose is conveniently a mammalian complement, and this can preferably be obtained commercially from Wellcome Reagents Ltd. or prepared by allowing blood to coagulate, removing the serum and storing it at 4°C or below, preferably at -20°C. It is then incorporated into the system in a sufficiently large quantity to ensure a solution.

Komplementet kan også tilveiebringes for senere inkorporering i systemet, f.eks. i et lukket glass eller i en plastampulle, sammen med passende instruksjoner for bruk sammen med gelen. Iqtillegg er det hensiktsmessig å tilveiebringe to ytterligere lukkede og steriliserte ampuller som inneholder referansesera, ett som inneholder antistoff til mikroben som er inkorporert i systemet, mens den annen er fri The complement can also be provided for later incorporation into the system, e.g. in a closed glass or in a plastic ampoule, together with appropriate instructions for use with the gel. In addition, it is appropriate to provide two additional sealed and sterilized ampoules containing reference sera, one containing antibody to the microbe incorporated into the system, while the other is free

for slike antistoffer. Alle disse komponenter i systemet for prøving av kroppsvæsker for visse mikrobielle antistoffer kan pakkes i en boks eller i en beholder sammen med instruksjoner for such antibodies. All these components of the system for testing body fluids for certain microbial antibodies can be packaged in a box or container together with instructions

for bruk. Det er derfor underforstått at en slik sammensetning av systemet, det vil si en som består av en gel-sammensetning, komplementet samt instruksjonene foruten andre eventuelle komponenter og hjelpemidler, faller innenfor den foreliggende oppfinnelse og følgelig utgjør et prøvesett. for use. It is therefore understood that such a composition of the system, i.e. one that consists of a gel composition, the complement and the instructions in addition to other possible components and aids, falls within the scope of the present invention and consequently constitutes a test set.

Systemet kan tilpasses slik at det skiller mellomThe system can be adapted to distinguish between

et primært og et sekundært angrep av en spesiell sykdom. Ved en første infeksjon vil immun-systemet i en pasient starte slik at det funksjonerer en gruppe immunoglobulin-antistoffer som kalles IgM, og som har en molekylvekt omtrent på 9 x 10 . Etterhvert som infeksjonen skrider frem vil immun-systemet gå over til å produsere en annen gruppe immunoglobulin-antistoffer som kalles IgG, og som har en mindre molekylvekt på ca. 1,5 x 10^. Når en pasient blir angrepet en annen gang av samme mikrobe, vil immunsystemet i alt vesetnlig produsere IgG antistoffer. Man har funnet det mulig å utføre en distingsjon mellom et primært og et sekundært angrep ved å bruke i tillegg til den gel som inkorporerer den spesifikke mikrobe, og så en gel som inkorporerer anti IgM-serum. Et slikt serum vil inneholde antistoffer mot IgM og vil kombinere og inaktivere eventuelle tilstedeværende IgM-immunoglobuliner i prøven av kroppsvæsken, og tilbake blir det eventuelle spesifikke IgG-immunoglobuliner som kombinerer seg med den mikrobe som er belagt på erythrocytene slik at man får en prøvereaksjon som indikerer sannsynlighet for en sekundær infeksjon. a primary and a secondary attack of a particular disease. In the event of a first infection, the immune system in a patient will start so that it functions a group of immunoglobulin antibodies called IgM, which have a molecular weight of approximately 9 x 10 . As the infection progresses, the immune system will switch to producing another group of immunoglobulin antibodies called IgG, which have a smaller molecular weight of approx. 1.5 x 10^. When a patient is attacked a second time by the same microbe, the immune system will essentially produce IgG antibodies. It has been found possible to make a distinction between a primary and a secondary attack by using, in addition to the gel incorporating the specific microbe, a gel incorporating anti IgM serum. Such a serum will contain antibodies against IgM and will combine and inactivate any IgM immunoglobulins present in the sample of the body fluid, and in return there will be any specific IgG immunoglobulins that combine with the microbe coated on the erythrocytes so that a test reaction is obtained which indicates the likelihood of a secondary infection.

Alternativt kan man bruke en gel som også inkorporerer anti IgG-serum for å indikere en infeksjon som sannsynlig-vis ikke er av sekundær type. Antistoffer mot IgG som kombinerer seg med og inaktiverer eventuelle uønskede IgG-immunoglobuliner, og etterlater spesifikke IgM-immunoglobuliner som kombinerer seg med den mikrobe som er belagt med erythrocytene, kan derfor oppnås å isoleres og inkorporeres i en gel, og vil derved tilveiebringe en prøvereaksjon som indikerer et primært angrep. Alternatively, a gel can be used which also incorporates anti IgG serum to indicate an infection which is probably not of a secondary type. Antibodies to IgG that combine with and inactivate any unwanted IgG immunoglobulins, leaving specific IgM immunoglobulins that combine with the microbe coated on the erythrocytes, can therefore be obtained to be isolated and incorporated into a gel, thereby providing a sample reaction which indicates a primary attack.

I et videre spesielt aspekt kan således systemet innbefatte en sammensetning slik det tidligere er beskrevet foruten en effektiv mengde av et anti-immunoglobulin-serum. Thus, in a further particular aspect, the system may include a composition as previously described in addition to an effective amount of an anti-immunoglobulin serum.

Slike- anti-immunoglobulinsera, spesielt rike på anti IgM-fraks joner eller preparater, kan oppnås kommersielt fra Such anti-immunoglobulin sera, particularly rich in anti-IgM fractions or preparations, can be obtained commercially from

Wellcome Reagents Ltd., eller ved å rense sera fra myeloma-pasienter, f.eks. på DEAE-cellulose for å fjerne uønskede immunoglobuliner, hvoretter man tilsetter fortynningsmiddel og injiserer blandingen i dyr. Senere blir dyrene tappet for blod og sera blir fjernet og kan så brukes for tilsetning til gelen. Wellcome Reagents Ltd., or by purifying sera from myeloma patients, e.g. on DEAE cellulose to remove unwanted immunoglobulins, after which diluent is added and the mixture is injected into animals. Later, the animals are bled and sera are removed and can then be used for addition to the gel.

Systemet kan også tilpasses slik at man kan påvise visse hemagglutinin og neuramiidase-antigener på influensa-virus-partikler, ved å bruke forskjellige rekombinerte raser av influensavirus. The system can also be adapted to detect certain hemagglutinin and neuramiidase antigens on influenza virus particles, using different recombinant strains of influenza virus.

Det kar i hvilket gelen helles kan hensiktsmessig være en plast eller glass-plate som har en flat rektangulær nedsenkning, hvor man kan legge gellaget, og en flat gjennom-skinnelig rektangulær glass- eller plast-plate~som kan plaseres over platen med nedsenkningen, for å holde gelen fuktig, steril og for å hindre fordampning. Alternativt kan man bruke en Petri-skål eller enhver egnet beholder, sålenge tykkelsen på systemet ikke er mindre enn 0,1 mm og større enn 5 mm. I tillegg må gelen ha jevn tykkelse. The vessel into which the gel is poured can conveniently be a plastic or glass plate that has a flat rectangular immersion, where the gel layer can be placed, and a flat translucent rectangular glass or plastic plate~which can be placed over the plate with the immersion, to keep the gel moist, sterile and to prevent evaporation. Alternatively, a Petri dish or any suitable container can be used, as long as the thickness of the system is not less than 0.1 mm and greater than 5 mm. In addition, the gel must have a uniform thickness.

Karet blir normalt pakket under sterile betingelser og krever derfor ingen ytterligere steriliseringsbehandling. For å hindre uønsket vekst av bakterier eller sopp på den ferdige gelen, kan man tilsette et bakteriocidalt eller fungicidalt middel, så som natriumazid eller methiolat. Natrium-azidet har derfor den egenskap at den forlenger lagringstiden for komplementet, hvis dette er inkorporert i gelen. The vessel is normally packaged under sterile conditions and therefore requires no further sterilization treatment. To prevent unwanted growth of bacteria or fungi on the finished gel, a bacteriocidal or fungicidal agent, such as sodium azide or methiolate, can be added. The sodium azide therefore has the property that it extends the storage time for the complement, if this is incorporated in the gel.

Prøven av den kroppsvæske man ønsker å prøve ved hjelp av foreliggende system, kan oppnås fra en pasient eller The sample of the body fluid one wishes to sample using the present system can be obtained from a patient or

dyr på flere forskjellige måter, alt avhengig av den væske som man ønsker å prøve. F.eks. kan blod oppnås ved hjelp av venepunktur. Hvis man skal bruke serum for prøven, bør dette fortrinnsvis holdes på ^ >6°G i ca. 30 minutter for å fjerne even-tuell tilstedeværende komplement. Prøven kan påsettes gelen enten ved avsetning i en brønn utskåret i gelen, eller ved absorbsjon på et sirkulært filterpapir med en diameter på 4~5mm som så plaseres på overflaten av gelen. animal in several different ways, all depending on the liquid that one wants to try. E.g. blood can be obtained by venipuncture. If serum is to be used for the sample, this should preferably be kept at ^ >6°G for approx. 30 minutes to remove any complement present. The sample can be applied to the gel either by deposition in a well cut in the gel, or by absorption on a circular filter paper with a diameter of 4~5mm which is then placed on the surface of the gel.

I de tilfeller det er visse spesifikke mikrobe-antistoffer tilstede i prøven eller væsken, vil man få en synlig sirkulær oppløsningssone, og enten komplementet er til stede i gelen eller tilsettes etter væsken, vil størrelsen på denne sonen være positivt avhengig av logaritmen til antistoff-mengden. In cases where certain specific microbe antibodies are present in the sample or liquid, a visible circular dissolution zone will be obtained, and whether the complement is present in the gel or is added after the liquid, the size of this zone will be positively dependent on the logarithm of the antibody the quantity.

I en annen fremgangsmåte for å skille mellom et primært og sekundært angrep av en sykdom, skjærer man ut en brønn i sentrum av gelen, hvor man plaserer prøvevæsken. I In another method to distinguish between a primary and secondary attack of a disease, a well is cut out in the center of the gel, where the sample fluid is placed. IN

like avstander fra den sentrale brønn skjærer man ut minst to andre brønner, og i den ene plaserer man anti IgM-serum og i den andre anti-IgG-serum. Gelen inkuberes slik at man utvikler nedbrytningssonen, og når en halvmånedel uten hemolyse opptrer ved kanten av hemolysesonen nær en av de omkringliggende brønner, viser dette at en spesiell gruppe immunoglobuliner, f.eks. at equal distances from the central well, at least two other wells are cut out, and in one you place anti-IgM serum and in the other anti-IgG serum. The gel is incubated so that the degradation zone develops, and when a crescent without hemolysis appears at the edge of the hemolysis zone near one of the surrounding wells, this shows that a special group of immunoglobulins, e.g.

IgM, er tilstede i prøvevæsken og er derfor blitt nøytralisert. Nærvær av IgM-immunoglobuliner i prøvevæsken indikerer et første'angrep av sykdommen. IgM, is present in the sample fluid and has therefore been neutralized. The presence of IgM immunoglobulins in the sample fluid indicates a first attack of the disease.

I et annet aspekt av oppfinnelsen tilveiebringesIn another aspect of the invention is provided

en fremgangsmåte for å påvise et nærvær av mikrobe-antistoffer i kroppsvæsker som innbefatter at en prøve av en kroppsvæske, f.eks. blod, serum, plasma, nesedråper, spinalvæske, spytt eller melk fra en pasient eller et dyr, påsettes et diagnostisk system slik dette er definert ovenfor, hvoretter man lar væsken diffundere inn i gelen og virke sammen med komponentene i systemet som innbefatter et komplement, eller ved at man fører et komplement inn i gelen, hvorved'man får en synlig sone av' erythrocyter som er under oppløsning og som tilsvarer den mengde mikrobeantistoff som finnes i kroppsvæsken. a method for detecting a presence of microbe antibodies in body fluids which includes that a sample of a body fluid, e.g. blood, serum, plasma, nasal drops, spinal fluid, saliva or milk from a patient or an animal, a diagnostic system as defined above is applied, after which the liquid is allowed to diffuse into the gel and interact with the components of the system which include a complement, or by introducing a complement into the gel, whereby a visible zone of erythrocytes is obtained which is under dissolution and which corresponds to the amount of microbial antibody found in the body fluid.

Den fremgangsmåte for påvi-sing av mikrobe-antistoffer som er beskrevet kan brukes for diagnostisering av mange sykdommer, f.eks. virussykdommer så som influensa, både A og B, røde hunder, meslinger, parainfluensa, cytomegalovirus samt forskjellige virussykdommer hos sauer. Prøven er spesielt bruk-bar for påvising av de dyr eller pasienter som ikke har noen immunitet eller lave immunitetsnivåer for en spesiell sykdom og derfor er særlig utsatt og krever vaksinasjon. Prøven kan også brukes for å diagnostisere virussykdommer i planter. Et preparat av det syke plantevevet injiseres inn i et dyr og etter en periode•fjerner man serum som da inneholder antistoffer fra plantevirusen, og bruker dette i prøven. Prøven kan også brukes for å påvise antistoffer til psittacose, mycoplasma så- The method for detecting microbe antibodies that has been described can be used for the diagnosis of many diseases, e.g. viral diseases such as influenza, both A and B, rubella, measles, parainfluenza, cytomegalovirus and various viral diseases in sheep. The test is particularly useful for detecting those animals or patients who have no immunity or low levels of immunity to a particular disease and are therefore particularly vulnerable and require vaccination. The sample can also be used to diagnose viral diseases in plants. A preparation of the diseased plant tissue is injected into an animal and, after a period, the serum, which then contains antibodies from the plant virus, is removed, and this is used in the sample. The sample can also be used to detect antibodies to psittacosis, mycoplasma so-

vel som bakterier.as well as bacteria.

Fordelene ved foreliggende fremgangsmåte i forhold til tidligere kjente fremgangsmåter, er at fremgangsmåten er rask, enkel og lett å utføre, og den er meget spesifikk etter-som den kan skille mellom antisera fra nærstående raser av en virus, da spesielt raser av influensavirus, og kan endog skille mellom et primært og et sekundært angrep eller en infeksjon. Fordelen med det tilveiebragte system er at den sammenlignet The advantages of the present method in relation to previously known methods are that the method is fast, simple and easy to carry out, and it is very specific as it can distinguish between antisera from related races of a virus, especially races of influenza virus, and can even distinguish between a primary and a secondary attack or infection. The advantage of the provided system is that it compared

med Schild-teknikken ikke trenger en rensing eller konsentrasjon av virusen, og med influensavirus kan man endog bruke uren allantois-væske. I tillegg vil de synlige nedbrytningsområder with the Schild technique there is no need for purification or concentration of the virus, and with influenza virus one can even use impure allantois fluid. In addition, they will visible areas of degradation

gL antistoffnivåer innenfor et nøyaktighetsområde på fra 5 til 20%. gL antibody levels within an accuracy range of 5 to 20%.

En Hyland-plate som er egnet for en gel ifølge foreliggende oppfinnelse vil nå bli beskrevet med henvisning til den vedlagte tegning. Hyland-platen 2 består av en flat, rektangulær basisplate 4°g et lokk 6, som begge er fremstilt av transparent plastmateriale. Basisplaten 4 nar en rektangulær utsparing 8, hvori gelen 10 er hellet. Brønnene 12 er skåret ut av gelen 10 for hensettelse av kroppsvæskeprøver. Lokket 6 passer tett over basisplaten 4 f°r å beskytte gelen fra ut-tørking og fysisk skade. Lokket 6 er omgitt av en kant 14 som passer over en kant som omgir basisplaten 4- A Hyland plate which is suitable for a gel according to the present invention will now be described with reference to the attached drawing. The Hyland plate 2 consists of a flat, rectangular base plate 4 and a cover 6, both of which are made of transparent plastic material. The base plate 4 forms a rectangular recess 8, into which the gel 10 is poured. The wells 12 are cut out of the gel 10 for the provision of body fluid samples. The lid 6 fits tightly over the base plate 4 to protect the gel from drying out and physical damage. The lid 6 is surrounded by an edge 14 which fits over an edge surrounding the base plate 4-

De følgenge eksempler illustrerer oppfinnelsen. The following examples illustrate the invention.

Eksempel 1.Example 1.

Like volumer av vaskede, pakkede erythrocyter fra sauer og en 5?5x 10~^ molar oppløsning av kaliumperiodat i saltvann ble blandet og hensatt ved romtemperatur i 10 minutter. Allantois-væske fra kyllingegg inneholdende influensavirus rase A2 (hemagglutinasjonsnivå ca. 4 x 10^/ml) ble tilsatt, og volumet av væsken var ti ganger det som var i de pakkede erythrocyter. Blandingen ble hensatt ved romteperatur i 10 minutter, de belagte erythrocyter ble så vasket tre ganger med Barbiton-bufferet saltoppløsning, det vil si saltoppløsning inneholdende Barbiton og bufret til pH 7>2, for å fjerne frie virus-partikler som ikke var festet til erythrocytene, og ble så opp-fylt til en 50% volum/volumsuspensjon i bufret saltoppløsning. Equal volumes of washed, packed sheep erythrocytes and a 5?5x 10~^ molar solution of potassium periodate in saline were mixed and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Allantoic fluid from chicken eggs containing influenza virus race A2 (hemagglutination level about 4 x 10^/ml) was added, and the volume of the fluid was ten times that of the packed erythrocytes. The mixture was left at room temperature for 10 minutes, the coated erythrocytes were then washed three times with Barbitone-buffered saline, i.e. saline containing Barbitone and buffered to pH 7>2, to remove free virus particles that were not attached to the erythrocytes , and was then made up to a 50% volume/volume suspension in buffered saline.

1% agarose ble fremstilt i Barbiton-bufret salt-oppløsning, og en prøve på 1,5 ml av denne ble helt over på en Hyland-plate og dannet et basislag på 1 mm. En prøve på 100 ja 1 av en ^ >0% erythrocyt-suspensjon ble blandet med agarose (1,5 ml) ved 45°Cj°g den resulterende suspensjon ble helt på toppen av basislaget og hensatt for størkning slik at man fikk et prøve-system med en jevn tykkelse på 2mm. 1% agarose was prepared in Barbiton buffered saline and a 1.5 ml sample of this was poured onto a Hyland plate forming a 1 mm base layer. A sample of 100 and 1 of a ^>0% erythrocyte suspension was mixed with agarose (1.5 ml) at 45°Cj°g and the resulting suspension was poured on top of the base layer and set aside for solidification to give a sample system with a uniform thickness of 2mm.

Eksempel 2.Example 2.

En ^ 0% volum/volumvirus belagt erythrocyte-suspensjon ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 1. En 100<y>ul del av denne ble tilsatt agarose (3 ml) og denne ble så tilsatt en marsvin komplementoppløsning (100<y>ul av 1 : l60 hemolytisk titrervæske) som oppnås fra Wellcome Reagents Ltd. Den resulterende suspensjon ble helt over i en Hyland-plate og hensatt for størkning, noe som ga et jevnt lag på 2 mm tykkelse. A ^ 0% vol/vol virus-coated erythrocyte suspension was prepared as described in Example 1. A 100<y>ul portion of this was added to agarose (3 ml) and this was then added to a guinea pig complement solution (100<y>ul of 1 : 160 hemolytic titration fluid) obtained from Wellcome Reagents Ltd. The resulting suspension was poured into a Hyland plate and set aside for solidification, yielding a uniform layer of 2 mm thickness.

Eksempel 3.Example 3.

En 1% oppløsning av agarose ble fremstilt i Barbiton-bufret saltoppløsning, og denne ble tilsatt tilstrekkelig natriumazide, slikat man fikk-en 0,1% oppløsning. En suspensjon inneholdende virusbelagte erythrocyter og marsvin komplement ble så fremstilt som i Eksempel 2, idet man brukte agarose-oppløsningen og hvoretter en prøve på 3 ml ble hé± A 1% solution of agarose was prepared in Barbiton-buffered saline, and to this was added sufficient sodium azide to give a 0.1% solution. A suspension containing virus-coated erythrocytes and guinea pig complement was prepared as in Example 2, using the agarose solution and after which a sample of 3 ml was mixed

over på en Hyland-plate.onto a Hyland disc.

Eksempel 4.Example 4.

En virusbelagt erythrocyte-suspensjon ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 1. Etter henstand ved romtemperatur i 10 minutter ble cellene vasket en gang, hvoretter 1 ml av de pakkede celler ble behandlet med 0,5 ml 1% glutyraldehyd-oppløsning i 7 > 5 minutter. Cellene ble så vasket fire ganger for å fjerne overskudd av gluteraldehyd og en gelplate ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 1. A virus-coated erythrocyte suspension was prepared as described in Example 1. After resting at room temperature for 10 minutes, the cells were washed once, after which 1 ml of the packed cells were treated with 0.5 ml of 1% glutyraldehyde solution for 7 > 5 minutes . The cells were then washed four times to remove excess gluteraldehyde and a gel plate was prepared as described in Example 1.

Eksempel 5»Example 5»

En gel ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 1, bortsett fra at det nevnte virus var røde hunder, BHK grodd Thomas-rase (hemagglutinasjonstitrervæske ca. 1024/ml). Erythrocytene og virus fra røde hunder ble så hensatt i én time .ved 4°C for å få en absorbsjon. I tillegg ble 0,1 % natriumazid inkorporert i agarose-gelen. A gel was prepared as described in Example 1, except that the said virus was rubella, BHK germ Thomas breed (hemagglutination titer fluid approx. 1024/ml). The erythrocytes and rubella virus were then left for one hour at 4°C to obtain absorption. In addition, 0.1% sodium azide was incorporated into the agarose gel.

En prøve av pasientens blod ble plasert på et området av et filtrerpapir (Whatman) i en tilstrekkelig mengde til at man fikk skiver (4 mm i diameter) skåret ut som hver inneholdt2,3 x 10 ml blod. De blodmettede skiver ble så plasert på toppen av gelen og hensatt ved 4°C over natten og inkubert ved 37°C i 3 timer, og man fikk etter dette en ned-brytningssone under hver filtrerpapirskive som indikerte at pasienten hadde i sitt blod antistoffer til røde hunder. A sample of the patient's blood was placed on an area of filter paper (Whatman) in sufficient quantity to obtain discs (4 mm in diameter) cut out, each containing 2.3 x 10 ml of blood. The blood-saturated discs were then placed on top of the gel and left at 4°C overnight and incubated at 37°C for 3 hours, after which a degradation zone was obtained under each filter paper disc indicating that the patient had antibodies to rubella.

Eksempel 6.Example 6.

En gel ble fremstilt som i Eksempel 1, bortsett fra at det brukte virus var fra en såkalt "louping ill" som er en virusinfeksjon hos sauer(hemagglutinasjonstitrerstyrke 1:256)* Erythrocytene ble behandlet med et tilsvarende volum av en 10"^ molar kaliumperiodat-oppløsning og så hensatt med nevnte virus i 45 minutter ved /\. °G f°r å. få en absorbsjon. Standardfremgangsmåte for fremstilling av platen er som beskrevet i Eksempel 1. A gel was prepared as in Example 1, except that the virus used was from a so-called "louping ill" which is a virus infection in sheep (hemagglutination titer strength 1:256)* The erythrocytes were treated with a corresponding volume of a 10"^ molar potassium periodate -solution and then incubated with said virus for 45 minutes at /\.°G before obtaining an absorbance. Standard procedure for making the plate is as described in Example 1.

Eksempel 7• Example 7•

En gel ble fremstilt som i Eksempel 1 bortsettA gel was prepared as in Example 1 except

fra at de brukte erythrocyter var Påtas ape-celler og den brukte virus var meslingvirus (hemagglutinasjonstitrervolum 1:1024)- Nevnte Påtas ape-erythrocyter ble behandlet ble tilsvarende volum av 10"^ molar kaliumperiodat-oppløsning og så hensatt med nevnte virus i 15 minutter ved 37°G- Fremgangsmåten for fremstilling av platen er som beskrevet i Eksempel 1. from the fact that the erythrocytes used were Påta's monkey cells and the virus used was measles virus (hemagglutination titer volume 1:1024) - Said Påta's monkey erythrocytes were treated with the corresponding volume of 10"^ molar potassium periodate solution and then incubated with said virus for 15 minutes at 37°G - The procedure for producing the plate is as described in Example 1.

Eksempel 8.Example 8.

En gel ble fremstilt som i Eksempel 1 bortsett fra at den brukte organisme var Psittacose (komplementfikserings-titreringsnivå 1:64). Erythrocytene og Psittacose-organismene ble hensatt i en time for å få absorbsjon. Standardfremgangsmåte for fremstilling av platen var som beskrevet i Eksempel 1. A gel was prepared as in Example 1 except that the organism used was Psittacosis (complement fixation titration level 1:64). The erythrocytes and Psittacosis organisms were set aside for one hour for absorption. The standard procedure for producing the plate was as described in Example 1.

EksempelExample

En gel ble fremstilt som i Eksempel 1, bortsett fra' at den brukte mikroorganisme var mycoplasma-gallisepticum (hemagglutinasjonstitreringsnivå 1:64)• De periodat-behandlede erythrocyter ble blandet med 2,0 ml av en lydbehandlet 1 til 5 fortynning av nevnte mycoplasma-preparat og hensatt i 20 minutter. Standardfremgangsmåten for fremstilling av platen var som beskrevet i Eksempel 1. A gel was prepared as in Example 1, except that the microorganism used was mycoplasma gallisepticum (hemagglutination titration level 1:64).• The periodate-treated erythrocytes were mixed with 2.0 ml of a sonicated 1 to 5 dilution of said mycoplasma- preparation and set aside for 20 minutes. The standard procedure for producing the plate was as described in Example 1.

Eksempel 10.Example 10.

En gel ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 1, bortsett fra at den brukte mikroorganisme var Bordetella-pertussis. Erythrocytene og Bordetella-organismene ble hensatt i en time ved 4°C med jevn risting for å få absorbsjon. I tillegg ble 0,1 % natriumazid inkorporert i agarose-gelen. Standardfremgangsmåten for fremstilling av platen var som beskrevet i Eksempel 1. A gel was prepared as described in Example 1, except that the microorganism used was Bordetella pertussis. The erythrocytes and Bordetella organisms were left for one hour at 4°C with regular shaking to obtain absorption. In addition, 0.1% sodium azide was incorporated into the agarose gel. The standard procedure for producing the plate was as described in Example 1.

Eksempel 11.Example 11.

En gel ble fremstilt som i Eksenpel 10, bortsett fra at mikroorganismen var Vibrio-cholerae Inaba. A gel was prepared as in Example 10, except that the microorganism was Vibrio cholerae Inaba.

Eksempel 12.Example 12.

En suspensjon ble fremstilt som beskrevet i Eksemplene 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 og i tillegg til-satte man anti IgM-immunoglobulin-serum oppnådd fra Wellcome Reagents Ltd. Den resulterende suspensjon ble så helt over i A suspension was prepared as described in Examples 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 and in addition anti IgM immunoglobulin serum obtained from Wellcome Reagents Ltd was added. The resulting suspension was then poured into

en Hyland-plate.a Hyland record.

Eksempel 1, 3»Example 1, 3»

En pasient man antok hadde influensa rase A2 i kroppen ble brukt for uttak av blodprøver. A patient who was assumed to have influenza race A2 in his body was used for taking blood samples.

Man brukte et prøvesystem som i Eksemplene 1, 2 og 3°g man skar ut brønner med en diameter på 3 mm» Hver brønn ble tilsatt en prøve på 10 yu 1 av kroppsvæsken, det vil si serum som på forhånd var behandlet ved ^ >6°G og holdt på'denne temperatur i 30 minutter for å inaktivere det. Systemet ble holdt over natten i en fuktet boks ved redusert temperatur på 4°C for å få en komplett diffundering. Etter diffunderingen ble systemet dekket med en oppløsning av marsvin-komplement A sample system was used in which, in Examples 1, 2 and 3, wells with a diameter of 3 mm were cut out. To each well was added a sample of 10 yu 1 of the body fluid, i.e. serum that had previously been treated at ^ > 6°G and held at this temperature for 30 minutes to inactivate it. The system was kept overnight in a humidified box at a reduced temperature of 4°C to obtain complete diffusion. After diffusion, the system was covered with a solution of guinea pig complement

(1 ml av et frysetørket preparat som fåes fra. Wellcome Reagents Ltd., og som var gjenopplivet med destillert vann slik det er beskrevet i instruksjonene) og inkubert ved 37°^ inntil man fikk nedbrytningssoner, noe som tok fra 2-til 3 timer, noe som viste at pasienten på ett eller annet tidspunkt haddet vært utsatt for A2 influensa-type. Systemet ble så vasket for å fjerne komplement og frigjort hemoglobin og ble så fiksert i formaldyd og saltoppløsning (10%) for lagring og referanse-formål. Diameteren på de fremstilte nedbrytningssoner ble så målt, og sammenlignet med kalibrerte referansesoner. (1 ml of a freeze-dried preparation obtained from Wellcome Reagents Ltd., which had been resuscitated with distilled water as described in the instructions) and incubated at 37°^ until degradation zones were obtained, which took from 2 to 3 hours , which showed that the patient had at one point or another been exposed to A2 influenza type. The system was then washed to remove complement and released hemoglobin and then fixed in formalin and saline (10%) for storage and reference purposes. The diameter of the produced degradation zones was then measured and compared with calibrated reference zones.

Eksempel 14»Example 14»

En gel ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 2-, bortsett fra at man brukte virus av røde hunder, og en brønn på 3 111111 i diameter ble skåret ut i sentrum. To andre brønner ble skåret ut i like avstander fra sentralbrønnen. I sentral-brønnen satte man ned en prøve på 10 ^1 1 av prøvevæsken, mens man i de andre brønnene avsatte 10 jol 1 av IgG-serum. A gel was prepared as described in Example 2-, except that rubella virus was used, and a well 3 111111 in diameter was cut in the center. Two other wells were cut at equal distances from the central well. In the central well, a sample of 10 1 1 of the sample liquid was placed, while in the other wells, 10 1 1 of IgG serum was deposited.

Gelen ble så inkubert inntil man fikk nedbrytningssoner. The gel was then incubated until degradation zones were obtained.

Nedbrytningssønene ble undersøkt, og i den del av sonen som lå nærmest IgG-brønnen og den halvdelen som pekte mot brønnen med prøvevæsken, fikk man ingen synlig hemolyse, noe som viste at IgG-immunoglobulin-molekyler var tilstede i The degradation sons were examined, and in the part of the zone that was closest to the IgG well and the half that pointed towards the well with the sample fluid, no visible hemolysis was obtained, which showed that IgG immunoglobulin molecules were present in

kroppsvæsken og var blitt nøytralisert.the body fluid and had been neutralized.

Eksempel. 15» ■ Example. 15» ■

Et sett som kan brukes for å diagnostisere influensa A2 eller for å påvise et nærvær av influensa A2 antistoff er sammensatt av en ampulle inneholdende et frysetørket preparat av referanseserum, hvorav et serum inneholder spesifikt influensa A2 antistoffer, mens det annet ikke gjør det. Også A kit that can be used to diagnose influenza A2 or to detect the presence of influenza A2 antibody is composed of an ampoule containing a freeze-dried preparation of reference serum, one serum of which contains specific influenza A2 antibodies, while the other does not. Also

i settet der Hyland-plater inneholdende systemet slik det er fremstilt i Eksempel 1 eller 4 sammen med instruksjoner for in the kit where Hyland plates containing the system as prepared in Example 1 or 4 together with instructions for

•bruk slik det er angitt i Eksempel 5»•use as indicated in Example 5»

Eksempel 16.Example 16.

Et sett for å kunne diagnostisere influensa A2 rasen eller for å påvise nærvær av influensa A2 antistoffer er sammensatt av to ampuller som hver inneholder et frysepreparat av,et referanseserum, en som inneholder spesifikke influensa A2 antistoffer og det annet uten, sammen med Hyland-plater inneholdende det system fremstilt som beskrevet i ethvert av Eksemplene 2, 3°S 4>sammen medinstruksjoner for bruk. A kit to be able to diagnose the influenza A2 race or to detect the presence of influenza A2 antibodies is composed of two ampoules each containing a frozen preparation of a reference serum, one containing specific influenza A2 antibodies and the other without, together with Hyland plates containing the system prepared as described in any of Examples 2, 3°S 4> together with instructions for use.

Claims

1. Diagnostic reagent for detecting specific microbial antibodies in body fluids, characterized by including a gel containing intact erythrocytes, the surfaces of which are adhered to appropriate microbial particles.

2. Diagnostic reagent according to claim 1, characterized by including a gel containing intact erythrocytes on whose surfaces suitable microbial particles are directly attached.

3. Diagnostic reagent according to claim 1, characterized by including a gel containing intact erythrocytes, where suitable microbial particles are attached indirectly to the surface.

4« Diagnostic reagent according to claim 3> characterized in that the microbial particles are linked by means of a lectin or lipopolysaccharide to the erythrocytes.

5. Diagnostic reagent according to any one of the preceding claims, characterized in that the gel also contains a complement.

6. Diagnostic reagent according to claim 5j, characterized in that the complement is from a guinea pig.

7. Diagnostic reagent according to claim 5 or 6, characterized in that the complement is present in the gel in a sufficient amount to ensure a dissolution of the erythrocytes.

8. Diagnostic reagent according to any one of the preceding claims, characterized in that the gel includes from 0.5 to 2% avagarose.

9. Diagnostic reagent according to any one of the preceding claims, characterized in that the concentration of efcythrocytes, on whose surfaces microbial particles are attached, is present in the gel from 0.5 to $%•

10.. Diagnostic reagent according to any one of the preceding claims, characterized in that the erythrocytes are bovine erythrocytes.

11. Diagnostic reagent according to any one of claims 1 to 9j, characterized in that the erythrocytes are from sheep.

12. Diagnostic reagent according to any one of claims 1 to 9) characterized in that the erythrocytes are from Patas monkeys.

13" Diagnostic reagent according to any of the preceding claims, characterized in that the gel also contains a preservative for the erythrocytes.

14. Diagnostic reagent according to claim 13, characterized in that the preservative is gluteraldehyde or dimethyl sulfoxide.

15. Diagnostic reagent according to krazv 14" characterized in that the concentration of gluteraldehyde is 0.5 to 2%.

16. Diagnostic reagent according to claim 14. characterized in that the concentration of dimethylsulfoxide in the gel is from 5 to 20%.

17. Diagnostic reagent according to any one of the preceding claims, characterized in that the gel also contains a bacteriocidal and/or fungicidal agent.

18. Diagnostic reagent according to claim 17, characterized in that the bacteriocidal and/or fungicidal agent is sodium azide or methiolate.

19. Diagnostic reagent according to claim 1, characterized in that the microbial particles are viruses.

20. Diagnostic reagent according to claim 19?characterized by - that said virus is measles virus.

21. Diagnostic reagent according to claim 19, characterized in that said virus is an influenza virus.

22. Diagnostic reagent according to claim 19, characterized in that said virus is rubella virus.

23• Diagnostic reagent according to claim 19, characterized in that said virus is cylomegalovirus.

24* Diagnostic reagent according to claim 1, characterized in that the gel contains sheep erythrocytes, to whose surface influenza virus particles are attached.

25. Diagnostic reagent according to claim 1, characterized in that the gel contains sheep erythrocytes, to the surface of which rubella virus particles are attached.

26. Diagnostic reagent according to claim 1, character-. distinguished by the fact that the gel contains Patas monkey erythrocytes, to whose surface meslin virus particles are attached.

27- Diagnostic reagent according to claim 1, characterized in that the microbial particles are bacteria.

28. Diagnostic reagent according to claim 27. characterized in that the bacterium is Vibro cholerae.

29" Diagnostic reagent according to claim 27, characterized in that the bacterium is Bordetella pertussis.

30. Diagnostic reagent according to claim 1, characterized in that the microbial particles are mycoplasma.

31- Diagnostic reagent according to claim 1, characterized in that the microbial particles are Psittacosis organisms.

32. Diagnostic reagent according to any one of the preceding claims, characterized in that the gel also contains an effective amount of anti-immunoglobulin serum.

33- Diagnostic reagent according to claim 32, characterized in that said anti-immunoglobulin serum is anti-IgM.

34" Diagnostic reagent according to claim 32" characterized in that said anti-immunoglobulin serum is anti-IgG.

35' Diagnostic reagent according to any of the preceding claims, characterized in that the gel is in the form of a thin layer.

36. Diagnostic reagent according to claim 35, characterized in that the thin layer is contained in a closed plate.

37' Diagnostic reagent for the detection of specific microbial antibodies in body fluids, substantially as described previously with particular reference to any of Examples 1 to 12.

38. Method for the production of a diagnostic reagent for the detection of specific microbial antibodies in body fluids, characterized by mixing intact erythrocytes with suitable microbial particles and incorporating the resulting suspension into a gel.

39' Method according to claim 38" characterized in that the erythrocytes are pre-treated with a coupling agent.

40. Method according to claim 39* characterized in that the coupling agent is a lectin or lipopolysaccharide.

41. Method according to claim 38, characterized in that the erythrocytes are pre-treated with a substance that promotes adhesion of microbial particles to the erythrocytes.

42. Method according to claim 41> characterized in that the compound is potassium periodate, chromium chloride or carbodiimide.

43 • Method according to any one of claims 38 to 43-characterized by mixing a complement into the gel.

44' Method according to claim 43' characterized in that the complement is from a guinea pig.

45' Method according to claim 43 or 44" characterized in that the complement is incorporated into the gel in a sufficient quantity to ensure dissolution of the erythrocytes.

46. Method according to any one of claims 38 to 45 > characterized in that the gel includes from 0.5 to 2% agarose.

47' Method according to any one of claims 38 to 465, characterized in that the concentration of the erythrocytes, to whose surfaces microbial particles have adhered, is found in concentrations from 0.5 to 5%

48. Method according to any one of claims 38 to 47 > characterized in that the erythrocytes are bovine erythrocytes.

49' Method according to any one of claims 3 to 47', characterized in that the erythrocytes are sheep erythrocytes.

50. Method according to any one of claims 38 to 47 * characterized in that the erythrocytes are from Patas monkey.

51. Method according to any one of claims 38 to 0, characterized in that the gel also contains a preservative for the erythrocytes.

52. Method according to claim 51, characterized in that the preservative is gluteraldehyde or dimethylsulfoxide.

53' Method according to claim 52" characterized in that gluteraldehyde is added to the gel in a concentration of from 0.5 to 2%.

54' Method according to claim 52, characterized in that dimethylsulfoxide is added to the gel in a concentration of from 0.5 to 20%.

55' Method according to any one of claims 38 to 54> characterized in that a bacteriocidal and/or fungicidal agent is also added to the gel.

56. Method according to claim 55, characterized in that the bacteriocidal and/or fungicidal agent is sodium azide or methiolate.

57' Method according to any one of claims 38 to 55" characterized in that the microbial particles are viruses.

58. Method according to claim 57, characterized in that said virus is measles virus.

59' Method according to claim 57" characterized in that said virus is an influenza virus.

60. Method according to claim 57, characterized in that said virus is rubella virus.

61. Method according to claim 57, characterized in that said virus is cytomegalovirus.

62. Method according to claim 38, characterized in that sheep erythrocytes are mixed with influenza virus.

63- Method according to claim 38. characterized in that sheep erythrocytes are mixed with rubella virus.

64. Method according to claim 38, characterized in that Patas monkey erythrocytes are mixed with measles virus.

65. Method according to claim 38, characterized in that the microbial particles are bacteria.

66. Method according to claim 65, characterized in that said bacteria are Vibrio cholerae.

67. Method according to claim 65, characterized in that said bacteria are Bordetella pertussis.

68. Method according to claim 38, characterized in that said microbial particles are myco-plasmas.

69. Method according to claim 38> characterized in that the microbial particles are Psittacosis organisms.

70. Method according to any one of claims 38 to JO, characterized in that an anti-immunoglobulin serum is also added to the gel.

71. Method according to claim JO, characterized in that said anti-immunoglobulin serum is anti-IgG.

72. Method according to claim 70, characterized in that said anti-immunoglobulin serum is IgM.

73' Method according to any one of claims 38 to J2, characterized in that the molten gel is poured into a closed container so that it forms a thin layer there.

74* Method for preparing a diagnostic reagent for detecting the presence of specific microbial antibodies in body fluids, generally substantially as described herein with particular reference to any of Examples 1 to 12.

75' Test kit that can be used for the detection of specific microbial antibodies in body fluids, characterized by consisting of a flat container containing a thin layer of a gel containing intact erythrocytes, which either directly or indirectly have attached suitable microbial particles to its surface, as well as a complement together with instructions for their application.

76. Test kit that can be used to detect specific microbial antibodies in body fluids, characterized by consisting of two containers, in the first of which there is a thin layer of a gel containing intact erythrocytes, to which the scar surface is directly or indirectly adhered to microbial particles, as well as another container, in which there is a complement, as well as instructions for the use of the two containers.

77* Sample set according to claim 75 or 76, characterized by including two further vessels, containing reference sera, and where one of the vessels contains reference serum with antibodies to the microbe incorporated in the gel, while the other vessel contains reference serum without such antibodies.

78. Method for detecting specific microbial antibodies in body fluids, characterized in that a sample of body fluids such as blood, serum, plasma, nasal drops, spinal fluid, saliva or milk from a patient or an animal is coated with a thin layer of a diagnostic reagent according to any of claims 1 to 37 j after which this liquid is allowed to diffuse into the gel and there interact with components of the reagent which also include a complement, or by introducing the complement into the gel, so that a visible zone of erythrocyte breakdown is provided.