NO751769L - - Google Patents

Description

"Polypeptidantigen med tilknytning til kreft og fremgangsmåte for fremstilUng derav"

Foreliggende oppfinnelse angår problemet med isolering av antigen knyttet til kaneer, som viser monospesifitet og er nær»

værende i mange forskjellige typer av humankancer med forskjellige lokaliseringer.

Det har blitt utført mange forsøk på å påvise nærvær av tumor reaktive antistoffer i sera oppnådd fra dyr, til hvilke preparater av humankancertumorer har blitt administrert. Om slike forsøk skulle vise seg å være entydig reproduserbare, skulle dette peke på nærværet i humankancervev av viktige antigener som ikke er nær» værende i normalt vev, og dette skulle således kunne tenkes å lede til bedre forståelse av den neoplastiske prosessens karakter.

I den hensikt å oppnå et bedro kjennskap til kancersykdommer har humankancervev blitt studert for å finne ut om det forekommer mono spesifikke antigener knyttet til kancer og fremfor alt å finne en reproduserbar måte for rensing og isolering av et slikt antigen. Nærværet av antigener som er knyttet til adenocarcinoma i tykktarmen og fordøyelsessystemet har blitt påvist av Gold et alt J. expt. Med. 121 (1965) 439-462 og J. expt. Med. 122, 1965, 467-487. I disse rapporter henvises til tidligere arbeider av B. Bjørklund, som peker på forekomsten av antigen knyttet til humankancer som er felles for hoveddelen av alle kjente maligne tumorer av epitelisk opprinnelse. Internat. Arch. Allergy and Appl. Immunol. 1966, 8, 179 og Internat. Arch. Allergy and Apll. Immunol. 1958, 12, 241. I det amerikanske patentskriftet 3.663.684 beskrives et karcinomembryonisk antigen som oppviser s.k. "CBA— aktivitet". Dette antigen skiller seg imidlertid helt fra antigenet ifølge foreliggende oppfinnelse, som det i detalj skal vises nedenfor i foreliggende beskrivelse.

Sn praktisk og teknisk anvendbar isolering av antigen som sådant, såvel som dets samband med forskjellige kareinornatiske sykdommer, har hittil ikke blitt oppnådd. Det har således hittil ikke vært mulig å isolere og karakterisere antigen som er knyttet til humankancer ved praktiske og reproduserbare fremgangsmåter, heller ikke har det vært mulig å bestemme eller påvise nærværet av antigenet i blodet hos personer som lider av skjult eller åpen kaneersykdom ved hjelp av en diagnostisk test som egner seg for undersøkelser i stor skala.

Med det formål fullt å utnytte nærværet av antistoffer som er spesifikke overfor antigener som er knyttet til tumor i dyre-antisera som et diagnostisk middel, må det utarbeides en test som viser nærvær av tumorantigenet i pasientens blod. De fremgangsmåter som hittil har blitt foreslått har ikke vist seg effektive når det gjelder å forsøke å stille en viss diagnose med hensyn til nærvær av kaneersykdom.

Et av hovedformålene med foreliggende oppfinnelse er å komme frem til en fremgangsmåte for isolering og rensing av antigen som er knyttet til kancer, fra humantumorvev eller annet vev som inneholder slikt antigen.

Et annet formål med oppfinnelsen er karakterisering av et

slikt antigen efter dets isolering.

Et ytterligere formål med oppfinnelsen er å få i stand diagnostiske testfremgangsmåter som er basert på anvendelsen eller nærværet av et ølikt antigen som er knyttet til humankancer.

Et ytterligere formål med oppfinnelsen er å komme frem til en fremgangsmåte for fremstilling av antistoffer som er spesifikke for de nevnte polypeptidentigener som er knyttet til kancer.

Ytterligere formål med oppfinnelsen er å frembringe et preparat som er anvendbart som immuniseringsmiddel.

Ennu et formål med oppfinnelsen er å komme frem til et preparat som inneholder et slikt antigen og en stabiliserende mengde albumin i blanding med det og en fremgangsmåte for fremstilling av et slikt preparat.

St ytterligere formål med oppfinnelsen er å komme frem til et diagnostisk preparat som inneholder et partikkelformet materiale som er merket med albuminstabilisert antigen.

I foreliggende beskrivelse omfattende patentkravene for-kortes uttrykket "til kancer knyttet polypeptidantigen" til CAPA.

Ifølge oppfinnelsen frembringes således bl.a. praktiske fremgangsmåter fon

a) Rensing, isolering, karakterisering og bekreftelse av identiteten og spesifisiteten for CAPA; b) Anvendelse av et slikt CAPA for diagnostisering av nærvær av kancer ved påvisning av nærvær av sirkulerende CAPA, og c) Fremgangsmåte for fremstilling av antistoffer som er monospesifikke med hensyn til slikt CAPA.

Andre formål og kjennetegn hos oppfinnelsen kommer til å fremgå av følgende beskrivelse av oppfinnelsen i generelle trekk såvel som ved konkrete eksempler.

Et materiale som har CAPA-aktivitet isoleres og renses ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse ved homogenisering av malignt vev fra obduksjoner, hvorved karcinomvev av forskjellige typer og fra forskjellige lokaliseringer sammenføres for å danne en tumorpool. Et alternativt utgangsmateriale er vev fra humanplacenta eller dyrkninger av ondartede celler in vitro (vedr. detaljer angående slike dyrkninger se B. BjOrklund, V. BjOrklund og I. Hedlof, J. Nat. Cancer Inst. 261533-545, 1961, "Antigenicity of Pooled Human Malignant and Normal Tissues by Cytoimmunological Technique. III. Distribution of Tumor Antigen). Også normalt vev oppsamles parallelt med ondartet vev, og for å oppnå en anvendbar rekkefølge av fremgangsmåtetrinn som leder til Isolering av et rent antigen har det blitt utviklet en ny testprosedyre, overensstemmende med medfølgende fig. 1. Tillempningen av biokjemiske separasjonsmetoder ble således styrt av en følsom immunologisk undersØkelsesfremgangsmåte, som tillot detektering av mindre enn 1 ng (nanogram) antigen. Den største verdien har detokterings-teknikken overensstemmende med fig. 1 på grunn av sin selektivitet. Antigeniske forskjeller mellom de ekstrakter som ble sammenlignet, ble bestemt mot en bakgrunn av insignifikante likheter, hvorved detekteringsarrangementet tjener som feed-back-kontroll av en serie kjemiske fremgangsmåter, hvilke ble variert for å danne tumorfraksjoner medt 1) maksimal antigenisk reaktivitet med antitumorsera, som ble absorbert av normale antigener, og 2) minimal antigenisk reaktivitet med antitumorsera som har blitt absorbert av tumorantigener. For ytterligere kontrollformål ble også tumorfraksjoner bestemt med den minste reaktivitet med anti-normalsera, som har blitt absorbert av normale antigener eller tumorantigener.

Karcinomvev og normalt vev i frossen tilstand blandes separat med vann med en temperatur av ca. 0°c og homogeniseres på en slik måte at det ikke utvikles friksjonsvarme i overskudd, noe som skulle medføre inaktivering av aktuelt CAPA. Suspensjonens temperatur bør ikke tillates å stige over ca. 0°C.

Den dannede kalde blandingen av flytende homogent stoff og faste bestanddeler blandes med et organisk løsningsmiddel som har evnen til å løse opp lipidstoffer, som f.eks. nøytralt fett, eksempelvis aceton eller etyleter, ved en temperatur under ca. 0°C, hvorved løsningsmiddelbehandlingen har til hensikt å fjerne bl.a. lipoide stoffer og gi forhøyet eksponering av antigeniske grupper. De faste bestanddelene avskilles fra blandingen, passende ved sentrifugering, hvorved vann- og løsningsmiddelskiktene kastes. Temperaturen bør ikke overstige ca. +4°C.

De oppnådde faste bestanddelene lyofiliserea og det lyofiliserte vevpulveret males, eksempelvis i en kulemølle av rustfritt stål ved lav temperatur, fortrinnsvis under ca. 0°c og hensiktsmessig ved en temperatur av ca. -70°C. Malingen resulterte i et fint, gråbrunt pulver.

Om det ønskelig ekstraheres det dannede pulver med en salt-løsning, som f.eks. en koksaltløsning, ved nøytralt pfi og lav temperatur, hensiktsmessig ca. 0°C, hvorved den overliggende væsken kastes efter sentrifugering» Det oppnådde sedimentet kan pånytt suspenderes i kaldt vann, hvorved sedimentet tilvaretas og lyofiliseres. Det dannede pulveret kan lagres i årevis i lukkede

flaskar vad ca. 4°C.

Vad ekstraksjon av ovenstående polypeptidholdige tumor- og normale pulver med IL^O ved alkalisk pH blir ekstraktene uklare ved tilsetning av NaCl ved nøytralt eller lett alkalisk pH. Denne uklarhet beror stort sett på nærvær av forurensninger av nuklein-syrekarakter. Bfter sentrifugering av de med koksaltløsning behandlede ekstraktene forblir all aktiviteten i den klare, ovenforliggende løsningen. Denne kan gjøres til gjenstand for isoelektrisk felning ved surt pH, hensiktsmessig ca. 4,8, og dannede felninger oppløses i en fosfatbufret vannløsning med pH

ca. 7,0.

De løsninger som oppnås ved ovenstående fremgangsmåte filtreres med en passende gol av molekylsikt-typen i perloform med evnen til å fraksjonere forbindelser med et molekylvektsomrada ora-fattende 10.10 til 20.10 , spesielt ca. 15.10 , hvorved filtreringsgelen eluereo med en buffer med omtrent nøytralt pH og 6 6 6 det tas vare på fraksjonen 10.10 til 20.10 , spesielt ca. 15.10 . Gelen eller molekylsikten kan velges blant polyakrylamidgeler, fomettede dekstrangeler, agar- og agarosegeler og ekvivalente geler eller molekylsikter, som f.eks. "Bio-Gel A-50m" (handelsnavn for en agarosegel fra Bio-Rad Laboratories, Mttnchen, Vesttyskland; 100-200 mesh, eksklusjonsgrense (Daltons) 50.IO c., fraksjoneringsintervall (Daltons) IO<5>til 50.IO<6>, omtrentlig agarooeinnhold 2%) eller "Sepharose 2BM (handelsnavn for en agarosegel fra Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige; 60-300/im, perler, fraksjoneringsintervall 10 5 til 20.10 6, omtrentlig agaroseinnhold 2%), hvorved gelen bringes i likevekt med en passende bufferoppløsning ved pH ca. 7,0 som f.eks. Sørensens buffer (en 1/15m bufferløsning basert på natrium- og kaliumfosfater) fortynnet 1:10. Den type av sikt eller gel som anvendes for denne gelfiltrering er ikke kritisk og det eneste kravet i denne henseende er at den bør ha evnen til å få til en fraksjonering av foreninger innen det ovenfor angitte molekylvektintervall. En annen anvendbar gel for formålet ifølge oppfinnelsen er<H>Bio-Gel A-150m", (Bio-Rad Laboratories; 100-200 mesh, eksklusjonsgrense (Daltons) 150.IO<6>, fraksjoneringaintervall 10 6 til * 150.10 6)• Angående ytterligere detaljer vedrørende gelfiltreringsteknikk, se H.Determann "Gelchromatographie", Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg,

New York, 1967. Det elueringsmiddel som anvendes for filtreringen er en bufferløsning med pH ca. 7, og i den avgående løsningen gjenfinnes antigenaktiviteten i den fraksjon som inneholder nevnte molekylvektlnterval1, hvorved det tas vare på denne fraksjon.

De sedimenterte aktive fraksjonene fra ovenstående gelfiltrering oppløses i en egnet buffer med pH ca. 7,0 som f.eks. Sørensens buffer fortynnet ltlO, og dannede oppløsninger filtreres gjennom en kolonne fylt mad en svak ionebyttergel av molekylsikt-typen med svake anionbytteregenskaper, eksempelvis en polyakrylamidgel som f.eks. "Bio-<5el P-2" (definert nedenfor), hvorved kolonnen bringes i likevekt med en lignende buffer med pH ca. 7,0. Den fraksjon som oppviser antigenaktivitet gjenfinnes i den første fraksjonen av den løsning som forlater kolonnen og det tas vare på nevnte fraksjon.

Den fraksjon som ble tatt vare på fra kromatograferingen på "Bio-Gel P-2" ovenfor, utsettes for en spesiell fremgangsmåte som er utviklet for ytterligere å rense CAPA. I prinsippet innebærer denne fremgangsmåte følgende trinn i En blanding av proteiner eller konjugerte proteiner utfelles ved isoelektrisk innstilling av pH. Den herved oppnådde felning blandes med en passende gel som velges med hensyn til den proteinblanding som foreligger. Den dannede blandingen av felning og gel skiktes på en kolonne som inneholder en identisk gel med samme isoelektriske pH, dvs. det pH som er isoelektrisk for at proteinene skal utfelles i det foregående trinn. Kolonnen utsettes så for eluering under efterhverandre stigende eller synkende pH. I eluatet tas det vare på den eller de fraksjoner som inneholder ønsket protein eller proteiner. Selv om fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ikke er bundet til noen spesiell teori antas det at separasjonen av molekylelagena i proteinblåndingen kan forklares på følgende måtet

De utfelte proteinene utsettes for en ionestrøm som bringer det ene proteinet efter det andre i oppløsning. Den tid som fordres for solubilisering av de forskjellige proteinene beror på ione-styrken, pH, temperatur og strømningshastighet. Eftersom fordelings-koeffisienten for hvert oppløst protein er lavere enn for ione-gradienten, beveger proteinet seg raskere i gelen enn i gradienten. Som følge herav kommer proteinet til å utfelles på nytt og bli stasjonært inntil det på nytt oppløses av den ionefront som nærmer seg. Denne fremgangsmåte gjentas et uendelig antall ganger, noe som medfører separasjon av molekylarter som bare skiller seg lite fra hverandre.

"Bio-Gol P2" er et fornettet polyakrylamid (100-200 mesh) med

en molekylvekteksklusjonsgrense på ca. 2000, men denne eksklusjonsgrense er ikke kritisk. Andre anvendbare geler er fornettede deke trang el er • som f.eks. "Sephadex 0-25", som tiar en mol ekyl vekt-eksklusjonsgrense på ca. 25.000, men denne eksklusjonsgrense er ikke kritisk. Disse geler er av molekylsikttypen og anvendes på vanlig måte 1 perleform. Hvilken som helst slik gel av molekylsikt-typen med molekylvekteksklusjonsgrenser på minst ca. 2-3000 kan anvendes på tilfredsstillende måte. For on oversikt av geler av molekylsikttypen som er egnet for golflltrering i kombinasjon med gradienteluering ifølge oppfinnelsen henvises til Gellotte, Fractionation of Proteins, Peptides and Amino Acids by Gel-filtration, i "New Biochemical Separations", Van Nostrand, London/ New York, 1964.

De normale ogCAPA-fraksjonene som er oppnådd fra ovenstående kromatografering. utsettes for aktiv substansutfeining ved pH ca. 5, hvorved sedimentet tas til vare og oppløses i vann med et pH på

ca. 8,5. De klare løsningenes pH bringes derefter til surt pH, passende til ca. 5,0, med maursyre, hvilken behandling resulterer i utfelning. Hver felning blandes med en oppsiemning av en lignende gel som er bragt i likevekt med HCOOH-HCOONH^ved et pH av ca. 5,0. Hver av disse blandinger plasseres så opp på en ifølge det ovenstående til likevekt bragt gelkolonne.

Por eluering av feiningene anvendes en pH-gradient, i dette tilfelle med suksessivt synkende pH. Et passende buffersyotem er HC00H-HC00NH4og NH4HC03-NH3. Antigenaktiviteten gjenfinnes i den avgående løsningen innen pH-intervallet fra det opprinnelige pH til ca. 3.

Den utgående fraksjon som ivaretas innen det ovenfor angitte pH-intervall inneholder ønsket CAPA, som kan ivaretas ved fryse-tørking. For å bestemme raolekylvekten for CAPA i nevnte ut-

gående fraksjon kan fraksjonen utsettes for filtrering på en gelkolonne som er bragt i likevekt med HCOOH-HCOONil^ved et pH på

ca. 3,0, hvorved gelen er valgt fra de ovenfor nevnte. "Bio-Gel P-30" (handelsnavn for en polyakrylamidgel fra Bio-Rad Laboratories, Mflnchen, Vest-tyskland; 100-200 mesh, eksklusjonsgrense (Daltons) 40.000, fraksjoneringsintervall (Daltons) 2500-40.000), og "Sephadex G-75" eller "G-50" (handelsnavn for dekstrangeler fra Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige» 40-120 og 50-150^um, fraksjoneringsintervall 3-70.000 og 1-30.000, respektive) er spesielt egnede geler for utførelsen av denne filtrering. De eluarte

fraksjonene av CAPA med en spektrofotometrisk absorbsjonstopp-bølgelengde innen intervallet ca, 229 til ca. 233 nm og en molekylvekt på fra ca. 20.000 til ca. 27.000 oppsamles.

CAPA kan, efter filtrering gjenvinnes fra den aktive fraksjonen ved frysetørking og kan lagres i lang tid i vakuum, kulde og mørke.

Det isolerte materialet består av et polypaptid basert på

en enkel peptidkjede, slik som det kan vises ved behandling med permaursyre. CAPA oppviser basisk reaksjon og er løselig i pH-intervallet 1-3,5. Det ubeskyttede polypeptidet denatureres irreversibelt ved nøytrale pH, nemlig ved pH overstigende ca. 4,5. Antigenet er hygroskopisk, blir gult og inaktivert og klebrig når det tar opp fuktighet.

Renset CAPA inneholder en fluorescerende gruppe som kan aktiveres ved en bølgelengde av ca. 288 nm under utsendelse av lys med en bølgelengde på ca. 350 nm. Fluorescensen er proporsjonen med CAPA-kvantiteten og kan anvendes for å bestemme nærværat av polypaptid under isoleringafremgangsmåten.

CAPA oppviser spektrofotometrisk toppabsorbsjon ved en bølge-lengde i intervallet fra ca. 229 til ca. 233 nm. Dessuten viser det sterke tendenser til aggregering og kan ikke filtreres på vanlige filtermedia som anvendes for sterilisering. Det har blitt vist at CAPA stammer fra kancercelleveggene, eftersom antistoffer oppnådd ved injisering av CAPA på et levende dyr medfører full-stendig lyse eller spaltning av kancercellene in vivo når slike celler utsettes for virkningen av slike antistoffer.

Som tidligere angitt har polypeptidene en molekylvekt i intervallet 20.000 til 27.000, spesielt ca. 24.000. Analyser viser at det ikke inneholder karbohydrater og spcaktrofotoroetri visar at CAPA er fritt for nukleinsyrer. Analyser utført med aminosyre-analysator med og uten oksydasjon viser overensstemmelse med molekylvekten slik den bestemmes ved golfiltrering på "Bio-Gel P-30" eller dens ekvivalent.

Isolert CAPA kan anvendes i mange tillempninger, slik som

ved fremstilling av monospesifikke antistoffer, for diagnostiske formål, for immuniseringsfremgangsmåter og som aktiv bestanddel i blandinger som er anvendbare som immuniseringsmidler.

I tilslutning til fremstillingen av antistoffer som er monospesifikke med hensyn til polypeptidantigener som er knyttet til kancer, har det blitt utviklet en ny fremgangsmåte. Som angitt ovenfor denatureres ubeskyttet CAPA irreversibelt ved nøytrale pH, noe som betyr at injisering av en sur løsning av CAPA på et levende dyr resulterer i denaturering av CAPA straks det kommer i kontakt med de nøytrale kroppsvæskene. For & forhindre en slik denaturering fremstilles en oljeemulsjon hvori en vannløsning av CAPA ved et pH i intervallet fra ca. 2 til ca. 3 utgjør den inne-sluttede fase omgitt av oljefasan. Ved injisering av en slik olje-emulsjon i et levende dyr beskyttes den sure vannlØsningen av CAPA av den omgivende oljefasen ved kontakt med de nøytrale kroppsvæskene. På denne måten bibeholder CAPA aktiviteten in vivo og det kan transporteres til de antistoffproduserende cellene.

En måte å bibeholde antigenaktiviteten in vitro på ved nøytrale pH består i at CAPA bindes kompleks mad inert protein,

som f.eks. human- eller kreaturalbumin. Ved å arbeido på denne måten dannes et kompleks som er løselig ved nøytrale pli mens antigenaktiviteten in vitro bibeholdes.

Med hensyn til kancerdiagnose har det blitt utviklet en modifisert hemagglutineringsinhiberingsteknikk. Denne teknikk muliggjør bestemmelse av nærvær av CAPA i forskjellige stadier av kancerforløpet ved undersøkelser av materiale av interesse, som f.eks. pasientsera, vev, kirurgprøver, punksjoner og utstryknings-prøver. Denne nye modifiserte hemagglutineringsinhiberingsteknikk består i en fremgangsmåte omfattende trinnenes a) tilberedning av en serie prøver av det materiale som skal undersøkes ved seriefortynningj b) tilsetning til hver av nevnte prøver av en forutbestemt mengde antiserum som inneholder antistoffer som er spesifikke mod

hensyn til CAPAi

c) tilsetning after inkubering til hver av nevnte inkuberto prøver av en forutbestemt mengde CAPA båret av en partikkelforraig

bærer#

d) sammenligning av oppnådd serie av behandlede prøver med kontrollprøver av minskende kjente mengder av CAPA som forårsaker inhibering og forutbestemte mengder av antiserum inneholdende nevnte antistoffer og derefter tilsetning til hver av nevnte kontroll-prøver av en forutbestemt mengde CAPA oppebåret av en lignende partikkelformig bærerj og e) bestemmelse av mengden CAPA i det undersøkte materialet ved sammenligning av nevnte prøveserie og nevnte kontrollprøver for

å oppdage nærvær av kancer og dens utviklingsstadium.

Ved oppfinnelsen oppnås også en blanding som er anvendbar som<i>mmuniserin<g>smiddGl som er aktivt in vivo, hvilken blanding inneholder her definert CAPA og en farmasøytisk akseptabel bærer. Uttrykket "levende dyr" menes i foreliggende beskrivelse også å omfatte mennesket.

Oppfinnelsen skal nå beskrives ytterligere ved hjelp av følgende ikke begrensende eksempler.

Eksempel X

isolering av rent antigen

Eftersom det har blitt vist (Int. Arch. Allergy 36, 191-203

(1969), "Systematic Antigenic Change in Human Carcinoma Tissues

by Hemagglutination Techniques" av B. Bjdrklund) at de fleste kancer-vev inneholder antigenet ifølge foreliggende oppfinnelse, ble kaneervev av forskjellige typer og fra forskjellige lokaliseringer oppsamlet for å lage en tumorpool. I dette tilfelle lagdes poolen av makroskopisk rent, histologisk verifisert, karcinomatøst vev fra følgende organer (obduksjon)i bryst, bronkier, blindtarm, tykktarm, tolvfingertarm, galleblære, nyre, strupehode, lever, lunge, spiserør,

eggledere, bukspyttkjertel, prostata, endetarm, mave, livmor.

Normalt vev ble oppsamlet fra et antall individer for å oppnå en pool av isoantigener, vevsantigener og Individuelle antigener. Obduksjonst il felle ble anvendt og tuiuordiagnosene var histologisk verifiserte. Dessuten ble det bekreftet at omtalte tumorantigen var intakt på grunn av immunologisk kryssaktivitet med nye tumorvev og levende tumorceller. Aseptiske betingelser ble opprettholdt der det var mulig.

Karcinomatisk og normalt vev fra obduksjoner ble befridd separat for tilliggende vev og ble skåret i 2-3 cm kuber, som ble vasket i 0,9%ig NaCl ved 0°C inntil de ikke lenger avgav blodfarve. De vaskede kubene ble frosset og lagret ved -24°C.

Fortsatt i frosset tilstand ble vevskubene blandet med 10 ml HjO ved 0°C for hvert gram frosset vev og homogenisert i en avkjølt RSfi Ato-Mix homogenisator med roterende kniver ved "halv hastighet" i løpet av tre tidsperioder på 1 min. I denne sammenheng bør det observeres at suspensjonens temperatur bør holdes ved ca. 0°C, fortrinnsvis noe under nevnte temperatur.

Det kalde homogenatet bie helt i kalde 1000 ml polyetenflasker. 400 ml suspensjon og 400 ml etyleter ved -20°C ("Aether ad Narcosin pH Nord., cont. diphenylamin 0,002%" fra Skånska Bomulla-krutfabriken AB, Dosjebro, Sverige) ble blandet i hver flaske og omrystet ved -2°C i 120 minutter i en International PR-2 sentrifuga-rysteanordning ved en raotorhaatighet på 300 omdr/min. Blandingen ble sentrifugert ved 1000 x G ved -2°Ci 5 min. Ved dette tidspunkt blander ikke lipidskiktet seg med vevskiktet. Etyleteran og lipidskiktet ble kastet og en andre ekstraksjon ble utført i 60 min. efterfulgt av sentrifugering i 5 rain. og fjernelse av eter-lipidskiktet. Endelig ble det utført sentrifugering ved 1000 x G ved -2°C i 30 minutter og vannskiktet ble fjernet salv om dat inneholdt noe CAPA. Gjenværende uløselige bestanddeler ble beholdt. Resterende etyleter ble fjernet ved påføring av vakuum i 5 minutter.

Det antigeniske materialet ble suspendert i 50 ml H,0 ved

0 o C, overført til 500 ml infusjonsflanker og skallfrosset ved -70 oC (tørris og etanol).

Lyofilisering ble utført i en Texvac, Type IV A, lyofilisator (Textor, Bad {Joden, Taunus, Vesttyskland) ved kontrollert temperatur

Det lyofiliserte vevspulveret ble malt i en kulemølle av rustfritt stål ("Cytolator", Lars Ljungberg Company, Stockholm, Sverige) ved en temperatur ev ca. -70 C i 2 timer ved 40 orodr/rain. Malingen resulterte i et fint, gråbrunt pulver. Dette pulver ble ekstrahert med på forhånd avkjølt etyleter ved -2°C i en PR-2 rysteanordning ved 300 omdr/min i 60 minutter og sentrifugert ved lOOO x G ved -2°C i 30 minutter. Eterskiktet ble fjernet og sedimentet tørket i vakuum. Det oppnådde rå vevspulveret (CTP) kan lagres i årevis ved 4°C i lukkede flasker uten nevneverdig tap av aktivitet. 5 g av CTP ble suspendert ved nøytralt pH i 500 ml koksaltr oppløsning inneholdende sterile isterninger. Suspensjonen ble homogenisert i en MSE Ato-Mix ved "halv hastighet" i 3 perioder a 1 min. Temperaturen ble holdt på 0°C. Blandingen ble holdt ved 0°C i 30 minutter under langsom omrøring..Sentrifugering ble ut-ført ved lOOO x G ved 0°C i løpet av 40 minutter. Dan ovenforliggende væske ble kastet.

Sedimentet ble på nytt suspendert i 500 ml kaldt, destillert vann og omrørt langsomt ved 0°C i 30 minutter. Efter sentrifugering ved 1000 x G ved 0°C i 40 minutter ble den ovenforliggende løsning kastet. Det gjenværende sediment ble suspendert i 25 ml kaldt, destillert vann og skallfrosset ved -70°C (tørris og etanol). Lyofiliseringen resulterte i et vasket vevspulver (WTP), som kan lagres i årevis i lukkede flasker ved 4°C.

Det ble laget et vannekstrakt av CAPA og normalt WTP ved

pH 9,5 og denne ekstrakt ble konsentrert 10 ganger ved isoelektrisk utfelning ved pH 4,8 og felningen oppløst i .1/10 av volumet med vann ved pH 9,5. Det oppnådde konsentratet ble stabilisert ved rask oppvarming til en temperatur av 98-100°C, hvilken temperatur ble bibeholdt i 5-10 minutter. Denne varmebehandling ødelegger enzymer, som ellers skulle inaktivere CAPA. Den stabiliserte ekstrakten blir uklar ved tilsetning av koksaltløsning ved pH 7,5 som følge av utfeining av gjenværende forurensninger av nukleinsyre-karakter. For utfeining av slike gjenværende forurensninger ble utfeiningen utført i 8,0 ml CAPA- og normale v nnekstrakter separat ved tilsetning av 0,8 ral 10%ig oppløsning ev NaCl. Efter sentrifugering ved 27.000 x G i 1 time ble de klare, ovenforliggencU-løsningene utsatt for isoelektrisk utfelning ved pH 4,8 (pH-£.ustering med 0,ln IlCl eller 0,ln HC00I1) . Felningene ble oppløst i 2-3 ml m/150 fosfatbuffer, pH 7.

De oppnådde løsningene som stammer fra tumor- og normal-WTP bl©filtrert med "Bio-Gel A-50ra" (som tidligere definert) i avkjølte kolonner med en indre diameter på 2,5 cm og en lengde av 138 cm ved en strømningshastighat på 6,3 ml/cm<2>Vtime. Gelen ble bragt i likevekt med m/150 fosfatbuffer med pil 7,0 med 2% butanol og eluert med samme buffer. Ved hver charge ble det anvendt 4-8 ml ekstrakt som inneholdt en totalmengde på 50-100 mg protein.

Antigenaktiviteten ble gjenfunnet i mellomfraksjonen av den utstrømmende tumorekstrakten. 1,0 ral alikvote mengder av denne fraksjon, totalt 160-180 ml, ble fortynnet 3 ganger og justert til forskjellige pH-verdier varierende fra 2,0 til 9,0. Efter 5 minutter ved romtemperatur ble prøvene overført til kyvetter og deres lysspredning ved 500 nm ble oppmålt under en vinkel på 90°. Spredningsintensitetenu ble avsatt mot pH og anga et maksimum ved pH 4,8, hvilket pH utgjorde fraksjonens isoslektriske punkt. Denne fremgangsmåte er en ny teknikk som har blitt utviklet med det formål å bestemme de nøyaktige og nødvendige betingelser for rensingen av CAPA. Konvensjonell teknikk for bestemmelse av det isoelektriske punktet kan ikke anvendes på grunn av peptidets lave konsentrasjon.

Den gjenstående delen av den aktive mellomfraksjonen ble utfelt ved pH 4,8 ved hjelp av 0,ln HCl. Sentrifugering ved 3800 x G ved 0°C i 5 minutter resulterte i kvantitativt utbytte av aktivitet.

For å oppnå ytterligere rensing av CAPA ble de sedimenterte, oktive me 11 omf r aks jon une fra fem "Bio-Gel A-50m"-kolonnor oppløst i m/150 fos f r.tbuf forløsning'med'pl-l 7,0 (Sørensens buffer i 2% N-butanol) til 5% av det opprinnelige volumet, berme løsning com inneholdt 130 mg protein i 8,5 ml ble filtrert gjennom en "Dio-Gel P-2"-kolonne (som tidligere definert) med et forhold diameter/høyde på 1/35 og ved en strømningshastighet på 35 ml/cm''/time. Kolonnen hadde blitt bragt i likevekt med m/150 f os»f atbuf f er med pli 7,0 (Sørensens buffer i 2% N-butanol). For hvert rag protein ble dat tillatt et lagvolum på 10 ml.

Den første fraksjonen var aktiv og ble ekskludert med elueringsbuffer med pH 7,0 mens forurensninger ble absorbert på gelen ved den lave ioncstyrka som ble anvendt. Det aktiva stoffet ble utfalt ved pli 4,8 med 0,lm HCOOH og sentrifugert ved 3800 x G ved 0°C i 5 minutter. Sedimentet ble oppLøst i 8,5 rui H^O og pir. justert til 8,5 med 0,lm NH40H. Den klare løsningen ble omfelt 3 ganger med 0,lm HCOOH ved pH 4,8, vasket i sentrifugen ved samme pil og oppløst ved pli 8,5. Fjerningen av N-butanol ble fulgt med gass-væakekromatografi. Den ferdige løsningen ble lagret i ampuller, skallfrosset og lyofilisert. Lut dannede produktet var et tørt, nesten hvitt pulver og dette pulver ble lagret ved -24°C

i evakuerte og lukkede ampuller.

£n identisk fremgangsmåte ble tillempet med tilsvarende ekstrakt som stammet fra normalt vev og det oppnåddes ikke noen aktivitet.

For ytterligere rensing av dat produktet som er blitt oppnådd fra den tidligere kromatografiske fremgangsmåte, ble det utviklet en pH-gradientelueringsmstoda. Denne metode består i prinsipp av følgende trinnj En proteinblanding som skal rensas med hensyn på don aktive komponenten i. dem, utfelles ved hjelp av isoelektrisk justering av pH. Felningen blandes med en pa f. senda gel,3om f..eks. "Sephadex G-25" eller "Bio-Gel P-2". Denne blanding skiktos på topper av en kolonne inneholdende en identisk gel med samme isoelektrisk©pli. Kolonnen utsettes dereftsr for pH-gradienteluering under konstant strømningshastighet og temperatur. Kolonnen elueres således med et medium av kontinuerlig eller trinnvis stigende eller synkende pH.

I foreliggende tilfelle ble gradientoluering utført mad 15 mg lyofilisert og saltfritt CAPA-pulver og normalt antig«npulver som er renset som beskrevet ovenfor, i dette tilfelle ved synkende pH. Pulvrene ble oppløst separat i H20, hvorved pli ble justert til 8,5 mod 0,ln NH^OH. De klare løsningenus pil blo rå bragt til 5,0 med 0,1 m HCOOH, noe som resulterte i utfeining. Hvsr felning ble blandet med 10 ml "Bio-Gel P-2"-oppslemming bragt i likevekt med en vannløsning laget av 0,02m HCOOH og 0,02 ra HCOONH^ for å oppnå et pH av 5,0. Hver av disse blandingene blo plassurt på toppen av en 15 ml silikonbohandlet "Bio-Gel P-2"-kolonne m^d en indre diametei ira 16 mm og en lengde av 150 mm som or bragt i likevekt sora ovenfor. Gelen ble oppebåret av et lite stykke glassull.

En pH-gradient ble anvendt for eluering av feiningene. Ved hjelp av en gradientmiksar (Ultrogrod, LKB, Sverige) holdtes pH

ved ca. 5 i en kort tidsperiode for vasking av feiningen, hvorafter pil suksessivt ble senket til 2,8. Til slutt ble pH hevet til 3. Buffersystemet omfattet 0,02m HC0011-HC00KH4 og 0,02m Uli^ aCO^- mL^ og elueringen ble utført ved romtamperåtur. Strømningshastigheten ble holdt ved 27,2 ml/cm<2>kolonnetverrsnitt/time.

Den fra tumorekstrakten avgående væsken ble analysert ved hjelp av fluorescensspektrometri (aktivering ved 288 nm, fluorescens avgitt ved 350 nm). Den fraksjonen som ble eluert mellom det opprinnelige pH og ca. 3 ble oppsamlet for ytterligere anvendelse. Efter lyofilisering og frysetørking kunne produktene lagres i lukkede ampuller efter fjerning av luft ved -24°C.

For karakterisering av molekylstØrrelseh og for å bekrefte renheten blo det antigeniske materialet filtrert i form av løsninger av dem med "Bio-Gel P-30" (som tidligere definert) som var bragt i likevekt med en buffer 0,02m HC00H-HC00NH4»pH 3,0. Det pH-eluerte CAPA ble oppløst i en liten mengde av samme buffer. Strømningshastigheten var 3,25 ml/cm 2/time og de fraksjoner som ble oppsamlet inneholdt 1,24 ml. De aktive fraksjonene oppviste et spektrofotometr is k åbsorbsj onsmaksimuut ved en bølgelengde av 229-233 nm og en fluorescens av 350 nm ved aktivering ved 288 nm.

I et typisk forsøk blo 10,4 iug CAPA oppløst i 3,0 ml sv ovenstående buffer pa en silikonbehandlet "Bio-Gel P-30"-kolonne (inriurdiam<y>ter 2,54 cm, lengde 50 cm) og dette resulterte i full-stendig gjenvinning av både substans og aktivitet. Eluerings-volumet var i overensstemmelse med en raolekylvekt i intervallet 22.000-24.000. Disse molekylvektsverdier ble oppnådd ved sammenligning av eluaringsvolumene fra forbindelser med kjente moiekyl-vekter, som f.eks. ribonukloase og inculin. Efter frysetørkning ble det oppnådd et hvitt, hygroskopisk pulver som kan lagres i kulde og i fravær av lys og oksygen. Ved analysering av produktene ble det ikke gjenfunnet noe karbohydrat og ingen nukleinsyrer. Analyser med aminosyreonalysator viste overensstemmelse med dm molekylvekt som ble bestemt ved golfiltrering. Analyser av amino-syrene viste følgende prosenttall, som har en nøyaktighet av 1 5%. Den beregnede molekylvekten var 23.2001 2500 (standardavvikelse).

Dette aminosyreinnhold tilsvarer et teoretisk nitrogen-innhold på 16,2-17,8%. Bestemmelse av totalnitrogan efter Dumas peker på en verdi av 17,010,5%. Som det vises ved behcindling mod perraaursyre baserer polypeptidet seg på en enkel paptidkjede. Dessuten denatureres polypeptidet irreversibelt ved pH overstigende ca. 5 om det ikke beskyttes ved kompleksdannelBe med albumin.

Ek sempel Ia.

På nøyaktig samme måte som beskrevet under eksempel I ovenfor fremstilles polypeptidet av vev fra humanplacenta.

Eksempel Ib

Fremstilling av CAPA- albumlnkompleks

En alikvot av i eksempel I fremstilt CAPA oppløses i maursyre (eksempelvis 0,05m; pH bør ligge i intervallet 2-3). Det oppnås

en klar løsning. Til nevnte løsning tilsettes albuminpulver eller en løsning av albumin ved samme pli som i ovenstående maursyre-løsning (200 vektdeler albumin pr. 1 vektdel CAPA) resulterende i en klar løsning av CAPA og albumin. Løsningens pH forhøyes derefter

langsomt ved tilsetning av en bar. ■■? (okcc-mpslvls tn vcjtml-øisning av natr .iumhydroksyd eller ammoniakk) til pil blir ca. 7,5. Dotte resulterer i en klar løsning inneholdende CAPA og albumin i form av et kompleks.

Denna løsning som inneholder 12 ^,ug CAPA/ml kan anvendes direkte i en diagnostisk prosedyre som er beskrevet nedenfor eller komplekset kan isoleres i form av it hvitt pulver ved frysetørking. Fulveret er stabilt i kulde (r4°C) under -.;n lang tidsperiode.

Det har ved forsøk blitt vist at maksimal utnyttelse av CAPA-aktiviteten oppnås ved et vektforhold av albumin/CAPA omtrent lik med eller overstigende 2CO:l.

Eksempel. Ic

Fremstilling av tinnsyrebehandlede og merkede røde blodlegemer

Ferskt saueblod (1 voluradel) tilsettes til steril Aisevers løsning (1,2 volumdeler) (Alsavers løsning fremstilles av 250 g glukose, 80 g natriumcitratdihydrat, 42 g NaCl og vann til 10 liter, pH justeres til 6,1 mod 10% citronsyremonohydrat). Blandingen sentrifugeres og de røde blodlegemene suspenderes enda en gang i Alsevers løsning og 2 ganger i en bufferløsning med pH 6,8. Tilslutt lages en suspensjon av de røde blodlegemene i bufferen med pH 0,8

1 en konsentrasjon av 10<9>celler/ml.

1 volumdel suspensjon av røde blodlegemer fremstilt ifølge det ovenstående tilsettes til 1 volum bufferløsning med pH 6,8 inneholdende ca. lS^ug tinn(IV)syra/ml under omrøring. De således tinnsyrebehandlede røde blodlegemene sentrifugeres og suspenderes 2 ganger i en buffer mad pH 7,5. Endelig suspenderes de røde blodlegemene i en buffer med pH 7,5 i en konsentrasjon av 10 9coller/ml.

En alikvot mengde av det i eksempel Ib ovenfor fremstilte CAPA-kompieks oppløses i en bufferløsning av pa 7,5 til det dannes en konsentrasjon av 3^ug CAPA pr. ml (beregnet på rentCAPA).

1 volumdel av suspensjonen av tinnsyrebehandlede røde blodlegemer

fremstilt ifølge det ovenstående tilsettes dråpevis til 1 volumdel CAPA-kompleksløsning ved 0°C i løpet av en tidsperiode på 10 minutter De merkede blodlegemene sentrifugeres og suspenderes på nytt i en bufferløsning med pH 7,5 inneholdende en stabiliserende mengde (ca. 1,2 volurner/volum) inart humanserura for å lage en suspensjon inneholdende 1,6 x 10 8merkede blodlegemer/ml. Disse merkede blodlegemer anvendes som det vises nedenfor i dan diagnostiske fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Eksempel J. I

Fremstilling av antistoffer'

Med hensyn til det faktum at CAPA ifølge oppfinnelsen denatureres irreversibelt ved høytrale pil, slik som tidligere angitt, mistenkte man at parenteral injeksjon av polypeptidet ikke skulle resultere i dannelse av antistoffer. Forsøk utført pa kaniner bekreftet dette09det ble funnet at det ikke opptrådte noen antistoffdannel3e efter injisering av polypeptid som er kompieksbundet med albumin på kaniner. Alle hemagglutinasjonsreaksjoner var negative.

For å muliggjøre overføring av polypeptidet i aktivt tilstand til de antistoffproduserende cellene er det nødvendig u bibeholde peptidet i løsning ved pli lavere enn ca. 3 (0,.02m HCOOH, pH 2,8) og å emulgere løsningen i olje for dannelse av ekstremt små dråper omgitt av et beskyttende oljeskikt. Injiseringen av emulsjonen resulterte i dannelse av tilfredsstillende mengder antistoffer, som reagert spesifikt med CAPA i hemagglutinasjonsreaksjoner dar blodlegemer var merket med CAPA.

Fremstilling av immuniseringsmiddel

816 mg rent CAPA fremstilt av poolede humankancartumorer ble oppløst i 1,0 ml 0,02m HCOOH med pH 2,8. Til den dannede opp-løsningen tilsattes dråpevis 1,0 ml adjuvantolje (teknisk fremstilt avDifco Laboratories, Detroit, Michigan, USA» Bacto-Adjuvant, Freund) under samtidig emulgering. Emulgeringen ble utført ifølge Freund ved hjelp av en injeksjonssprøyta, hvorved blandingen ble dratt opp og ned i sprøyten for å danne sn enhetlig, hvit emulsjon med omtrent samme konsistens som vispet krem. En dråpe av nevnte emulsjon ble testet med isvann for å bekrefte at den fløt separat og holdt seg intakt. Den dannede, halvflytende emulsjonen bla

, anvendt for subkutane og intramuskulære injeksjoner på kaniner.

Imm unisering av fem k aniner

Ved den første injiseringen ble det anvendt såkalt full-stendig adjuvant og i de efterfølgende injiseringena såkalt ufull-stendig adjuvant. Efter opprinnelig avtåpning av blod fra hvsr av de fem kaninene for bestemmelse av 0~v?j;dier, ble det injisert totalt 408 mikrogram emulgert CAPA ved pH 2,8 eubkutant pa både høyre og venstre side. Med ti døgns intervaller ble det gitt ytterligere tre injeksjoner, den første intramuskulært i begge bakbena og dan andre og tredje subkutant på begge fremsidene respektive begge bakdelene. Valent av injeksjonsoteder -gjordas for å utnytte adgangsstedene for-de reglanalo lymfokj ertlenc. Totalt mottok hver kanin 1,6 mgCAPA i form av emulsjon. 14 og 24 døgn efter den siste injiseringen ble det tatt testprøver av blod, hvilke utsattes for hernagglutinasjonsanalyse med hensyn pi nærværet av spesifikke antistoffer mot CAPA. To døgn efter den siste prøven ble det avtappet en maksimal mangde blod, som ble oppbevart i form av serum som ble steril filtrert og overført i små porsjoner til sterile rør. Disse rør kunne lagres avkjølt og bibeholdt sin spesifisitet.

Eksempel III

Diagnostisk prosedyre

a) Enkelt blindforsøk.

Blodprøver ble oppnådd fra Centrallasarettat i Eskilstuna,

Sverige, hvorav 42 kora fra pasienter på infeksjonsklinikken;

en fra kirurgisk klinikk; to fra radioterapi; 10 fra nyforløata mødre;

10 fra navlestrengblod og 10 fra gravide kvinner i I-trimester og

6 i II-trimester. Videre ble dot mottatt blod fra 20 10-åringer

fra Slottsskolan og 10 prøver fra eldre friske personer fra Dr. Lundstroms privatklinikk i Eskilstuna, Sverige. Fra den kirurgiske og medisinske klinikken ved Ersta Sjukhus i Stockholm, Sverige, ble det mottatt prøver fra 44 pasienter, fra Akeshovs sykehus ble det mottatt prøver fra 45 pasienter og fra den kirurgiske klinikken ved Karolinska Sjukhuset i Stockholm, Sverige ble det mottatt blodprøver fra 72 pasienter som var inntatt for eventuell operasjon. Blodgivercentralen på Karolinska Sjukhuset i Stockholm, Sverige skaffet 118 prøver fra givere i aldrene 20-67 år, middels alder 37,2 år (SD- 11,3 år), og fra Sjukhusens Kliniska Central-laboratoriura ble det mottatt sera fra 29 pasienter i pleie ved

, Radiumhemmets almindelige avdelinger og fra 12 pasienter ved dets gynekologiske avdelinger.

Det totale antallet blodprøver oppgikk til 431. For de 111 tilfellene fra Eskilstuna gjordes det en klinisk oppfølging og det ble oppstilt en medisinsk journal bortsett fra de åpenbart friske individene. Hår det gjelder Stockholms-tilfellene ble det gjort detaljerte journalstudier for 101 tilfeller. I de gjenstående tilfellene fantes det andre kliniske diagnoser enn maligne og det forelå ingen mistanke om malign sykdom.

Venøst blod ble overført til Wassermann-rør uten tilsetning

og sendt til laboratoriet, i visse tilfelle efter å ha fjernet

koagel og blodlegemer ved hjelp av sentrifugering.

Blodanalysen baserte sog på- indikasjon av i tarves r av CAP7\ved hjelp av en modifisert hemagglutinasjonsinhiberingsteknikk (mikro-metode). I prinsipp:» ble følgende prosedyre anvendt: 25^ul pasientserum, som hadde blitt absorbert med røde saueblodlegemer, ble titrert i 8-trinns 2-fortynning i Linbro IS-MRC-26-fortynningsplator, hvoretter 25^ul spesifikt antiserum i grense-fortynning (ca. 1:2000) ble tilsatt til hver grop. Efter inkuboring v-d 22°C i 10 minutter ble det til hver grop tilsatt SO^ul av den suspensjon på ca. 6-8 millioner røde saueblodlegemer som var tinn-syrebehandlet og merket med isolert CAPA bundet til humanalbumin, slik det er vist i eksempel 1c ovenfor (ca. 2-4/Ug pr. 10"' blodlegemer) . Andre partikkelformigo b-Drero, som f.e.ks. lateks, bentonitt og kollodiura, kan anvendes istedenfor røde blodlegemer. Reaksjonen ble avlest ved hjelp av et skråttstilt speil og en standardserie efter 4-24 timers inkubering ved l-2°c For kontrollformål ble det anvendt» 1. Blodlegemer merket med CAPA pluss antiserum; 2. Blodlegemer merket med CAPA uten antiserum; 3. Pasientserum pluss blodlegemer merket med humanaibumin; 4. Pasientserum og ubehandlede blodlegemer; 5. CAPA-merkede blodlegemer og antistoffer i en rekke der inhibering fremkommer med trinnvis fallende, kjente mengder CAPA.

De fortynningsvæsker som ble anvendt inneholdt poolet (dvs. sammenslått fra mange individer), inaktivert, nøytralt humanserum for stabilisering av blodlegemene.

CAPA-reagens ble fremstilt fra poolet humankarcinomvev og bla renset slik som beskrevet ovenfor ved hjelp av gelfiltrering, pH-gradienteluering, filtrering gjennom "Bio-Gel P-30" og kompieks-dannelse med albumin.

Som antiserum ble anvendt heste-anti-HjLa fra 19 november, 1962, absorbert med normalt vev og poolet humanserum. Imntunisuringan ble gjennomført med vaskede fragmenter av HeLa-celler dyrket i Eagles medium inneholdende 205b inaktivert humanserum i flate glass-flasker. Cellene hadde blitt høstet med EDTA, sentrifugert og vasket 3 ganger med vann.

I nærvær av CAPA i pasientserum ble hesteantistoffene nøytralisert, noe som medførte at agglutinasjonen uteble når du polypeptidmerkede blodlegemene senere ble tilsatt. Avlesning gjordes efter en stigende skala fra 0-6, der 0 innebar fravær av inhiber ing og 6 angir m?V«irnjvl inhibering cv agglutinasjonen, flelrsj onon mellom r$k al av ord? i'?, r 07 konsentrat on CAPA/ml sarwr. fremgår av tabell 1, som oppnås ved kalibrering av fortynninger av forutbestemte mengder GAPA i nøytralt serum.

Avlesningene bla utført uten kjennskap til pasientenes helsetilstand. Det materiale som var gjenstand for undersøkelse har blitt gruppert, slik som det fremgår av tabell 2 nedenfor.

Det fremgår av resultatene at de høyeste skalaverdiene har blitt oppnådd med de grupper som omfatter "primær kancer med metastaser" (regional) og "utbredt kancer" somt gruppen "nyfødte"

(navlestrengbiod).

LaveBkaiaverdiar har blitt oppnådd for blodgivere. En mellomstilling inntas av gruppen "primær kancer, ubehandlet" og gruppen "kancer, ikke radikalt behandlet". Verdiar i nærheten av blodgivernes gjenfinnes i gruppen "kancer, radikalt fjernet".

Middelverdier angående CAPA i samtlige grupper har blitt sammenlignet parvis og vises i tabell 3 nedenfor.

a) Signifikanstester av forskjeller ble utført ved hjelp av jji approksimativt normolfordelt variabel, z definert som: c) Denne gruppe omfatter 11 positive tester, hvorav 8 gjelder mistenkt, men ikke bekreftet kancer.

Det er åpenbart fra tabellen ovenfor at mod hensyn til "primær kancer" med metastaser" såvel som "utbredt kanoer" foreligger det signifikant høyere middelverdier enn for de andre gruppene med unntak for nyfødte (ss også tabell 2).

For gruppene "kanoer, ikke radikalt b<'handlet" og ''priacer kancer, ubehandlet" ef middelverdiene signifikant høyere i forhold til samtlige grupper utenom de to førstnevnte og til "malign sykdom, annen enn kancer", mot hvilken forskjellen er signifikant (0,01 P . 0,05).

Gruppene 5-9 oppviser ikke signifD.ante forskjeller inn-byrdes bortsett fra den signifikante forskjellen mellom 7 og 9. Denne forskjell kan forklares av at ekte, skjulte kancertiifeller kan forekomme blant de tilfelle som viser skalaverdier mellom 1 og 4.

Det positive funnet i navlestrengbiod fortjener en viss oppmerksomhet. For å bestemme hvorvidt CAPA stammer fra placenta ble. dot ekntrahort stykkor av slikt vev. i V; n'jo,; r på 300 mg frossent placentov.-sv pr. ml' buf rot fysiologisk r-iCi--?.r'.3ru<*>.u'j v :å pH 7,5 ble homogenisert ved 0°C og sentrifugert ved 1000 :< G i 30 minutter ved 0°c i konisk utstrakte rør (ifølgj Markham). Do ovenforliggende løsningene ble testet mod hensyn pA CAPA ved i) jalp av ovenfor beskrevne hemagglutina3jonsteknikk. For å utelukka muligheten av at inhiberingsreaksjoner son blir oppnådd sUnl ha blitt forårsaket av uspesifikk inaktivering av nå bl od leg omen i-aj)plioert CAPA, ble nevnte blodlegemer rystet efter hver måling og det ble tilsatt en sta71da.rdme.ngde antistoffer som er spesifikke mot CAPA. Ingen antiganinaktivering kunne iakttas i noen av tilfellene. Som kontrollmateriale blo det anvendt en ekstrakt av

■antigenpulver fremstilt av humankancervev av forskjellig opprinnelse og fra forskjellige lokallaeringor. Resultatene vxrvv..->t av 26 placentaer fra like mange individer inneholdt samtlige uten unntagelse signifikante mengder CAPA. Middelverdien (geometrisk) for de 26 placentaene var 297 l 8 mikrogram pr. g vått vev (0,03%).

Eftersom det av ovenstående undersøkelse er åpenbart at CAPA ifølge foreliggende oppfinnelse syntetiseres i placenta og eftersom de gener som inneholdes i placenta også må inngå i do fra samme eggcelle oppståtte individer, følger at anlegget eller evnen til å frembringe CAPA er et normalt fenomen. Normalt er dette anlegg hemmet eftersom normale celler ikke inneholder CAPA i målbare mengder. I kancerceller derimot har det funnet sted en aktivering av anleggetkarakterisertav on påtagelig forekomst av CAPA inne i og omkring cellene. Don antigene og i funksjonelle henseender funksjonelle likheten mellom trofoblaatcolier i placenta og kancer-coller og < ulik ho ton musl lom individenes øvrige coiler synes å overensstemme mod d!:n rafluksjon at k a uc • :u* sykdommen c or et uttrykk for en forandret kontroll av normalt forekommende anlegg.

En statistisk analyse av forsøkareoultatssne visor at det foreligger høyst signifikant korrelasjon mellom nærværet av kanoar-diagnose og forhøyet CAPA-konsentrasjon (P <.0,001) . Det samme gjelder relasjonen mellom størrelsen hoo angjeldende tumormasse og den forhøyede CAPA-konsentrasjonen innen samme aldersgruppor (P <0,001). Den forhøyede konsentrasjonen av CAPA har blitt iakttatt i forbindelse med mange forskjellige lokaliseringer av kancer. Uberoende av type og lokalisering har kancersvulster vist seg å

inneholde CAPA hvorigjennom nevnte CAPA synes å være felles for alle kjente typer av kancer, dvs. maligne tumorar av cpitelisk opprinnelse.

h) l.obb :lt blindforsøk

For ytterligere å bekrefte riktigheten ri v ov.rnst5.--nd i

konklusjoner ble det utført et dobbelt blindforsøk under høyst rigorøse betingelser. Kodede blodprøver ble mottatt fra de forskjellige avdelingene på Centrallasarettet i Kskil«tuna, Sverige. I dette tilfalle ble dut utført kvantitativ..; målinger av CAPA-nivået i pasientenes sorr».

Resultatene av d jtte dobbelta blind f or «søk.såvel som resultatene fra ovenstående enkelt-blindforsøk er sammenstilt i

tabellene 4-8 nedenfor. I de nevnte tabeller viser:

Tabell 4 totalantallet undersøkte individer og antallwt individer som oppviste kancerdiagnose;

Tabell, 5 antallet individer av de forskjelliga gruppone samt deres middelalder og spredning;

Tabell 6 nærværet av CAPA i sera fra samtlige undersøkte pasienter;

Tabell 7 prosenttallene av individer som hadde en CAPA-konsentrasjon på» 0,l5yUg/ml serum idet gruppene 9, 10 og 12 i tabell 5 ble utelukket; og

Tabell 8 nærværet av CAPA 1 forhold til tumorlokaliseringer for gruppene 1-3 i tabell 5. Site-nummar angår "Cancer Incidence in Sweden 1968".

ISn nøyaktig analyso av de i dett ..' dobbeltbl indfoxsøk0£>p~nådde data viser igjen den høyst "signif ik-p.te horr -l;-' i jon :n in .v 11 om nærvær av kanccrdiagno3e og forhøyet CAPA-konsvntrasj on (F ✓ 0,001), Denne dobbeltblindprøve bekrefter også sambandet mellom størrelsen hos den aktuelle tumormasse og den forhøyede c7vPfi-kor.sent.rasjonen innen samme al d erag rupper (P 0,001). D-1 forhe<:>yodo s jruri/iivået av CAPA har blitt gjenfunnet i tilslutning tiJ. ca. ?0 for ok j ..-Hig j. og lokal is as joner av kancer. Dette dobbelt.:- bl.indf crtrØk bekreft.-r således fullt ut riktigheten i de nyo erfaringene og dores praktiske cinvendel ighet. 1 den innledende delen av foreliggende bi-r.kr.ivelpo angis det at antigenet som or ?nyitt i US patent nr. 3.663.664 rc klort forskjellig fra antigenet ifølge foreliggende oppfinn«lu ri, foc ■ : vis; forskj ellen mellom d--t kjent-* antigen ot og antig-m st ifølge oppfinnelsen gis det nedenfor en detaljert sammenstilling av visse konkrete forskjeller både mod hensyn til fremgangsmåten for antigon-isolering og med hensyn til antigenets egenskaper.

Sammenfatning svis gis det nedenfor Icorte definisjoner på tii kancic knyttet pept ida n t i g en og den diagnostiske f r >_ mg ang småt e ifølge foreliggende oppfinnelse.

Definisjon av CAPA

HeLa-celler (stammer fra et kane ert il f elle år 195?.) dyrkes in vitro. Disse celler anvendes som antigenkilde. De høstede cellene Injiseres på hoster, noe som resulterer i dannelse av f-t spesifikt antistoff .«."om anvendes for ident i fisering av antigenet i tumorer, serum, placenta, osv. Let sistnevnte antiganet må ba og har en identisk, immunologisk r ereksj ons~F-.it e (sammenlignet med Hej.eO-antigen) , men kan naturligvis vcr-re nnvl cerledes i nnus.^he>v-spender når det er ni*Kreerende i naturlig tilr:.tand.

po f j. niai on,, fly., diagnostisk, f r enig aue/ små to

Antigen fra He.éa~oellodyrkninger in vitro auvendas for dannelse av antistoff i hester. Efter obsovbsjon av ikke ønskelige antistoffer anvendes hosteeerumet for agglutinering av røde blodlegemer merket med antigen tatt fra tumorer (eller placenta eller c 1e dy rien ing v >: av Hei.--, eller HF.p-2 oll ;-r Detroit-0). Lc-tto t. indikatorsysten<g>t. Ora en ukj ent prøve inneholder antigenisk aktivitet påvirker det således antistoffet og inhiberer agglutinasjon.

Uonslng .~y_ til. tumor kn yttet; ^nt^fjen

Flyteskjeina med gr«ner illustrerende den aimindeiiye ren.sn.ings-prosedyren.

Claims (27)

1. Polypeptidantigen som er tilknyttet kancer (CAPA), karakterisert ved at det har en molekylvekt av 23.20 0- 2.500 (SD) og med en spektrofotometrisk toppabsorpsjon ved en bølgelengde innen intervallet fra 229 til 233 nm, hvilket polypeptid er basert på en enkel polypeptidkjede slik det vises ved behandling med permaursyre, og, dersom det ikke beskyttes ved kompleksbinding med albumin, denatureres irreversibelt ved pH over 5.

2. CAPA ifølge krav 1, karakterisert ved at polypeptidet inneholder følgende aminosyrer med følgende mol-prosenttall:

3. CAPA ifølge krav 1, karakterisert ved at det inneholder en fluorescerende gruppe som avgir fluor-escent lys ved 350 nm ved aktivering ved en bølgelengde av 288 nm.

4. Fremgangsmåte for isolering av et polypeptidantigen som er knyttet til kancer (CAPA) i henhold til krav 1, karakterisert ved at 1 a) CAPA-holdig materiale homogeniseres i en væske ved en temperatur som ikke overstiger b°C, b) faste bestanddeler fra blandingen av væskeformig homogenat og faste bestanddeler som stammer fra trinn a) avskilles, c) nevnte faste bestanddeler ekstraheres med en alkalisk vann-løsning, d) ekstrakten fra trinn c) filtreres på en filtreringsgel av molekylsikttypen i perleform med evnen til å fraksjonere forurensninger med et molekylvektintervall omfattende 10.10 g til 20.10 6 , spesielt ca 15.10 6 , gelen elueres og 10.10 6 til 20.10 6 -fraksjonen, spesielt fraksjonen av ca. 15.10 6 oppbevares , e) fraksjonen fra trinn d) utsettes for kromatografering på en svak ionebytter for absorpsjon på denne av forurensninger, og den første fraksjon som forlater nevnte ionebytter, oppbevares , f) nevnte første fraksjon utsettes for isoelektrisk utfeining, g) dannet utfelning blandes med en gel av molekylsikttypen og nevnte gel utsettes for pH-grådienteluering og h) under senkning av pH oppbevares fraksjonen ned til pH 3 inneholdende CAPA med en spektrofotometrisk absorpsjonstoppbølge-lengde av 229-233 nm og en molekylvekt innen intervallet 20.000 - 2 7.000.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at den fraksjon som oppnås fra pH-gradientelueringen utsettes for gelfiltrering på en gelkolonne, ved hvilken de eluerte fraksjoner av antigen som har en spektrofotometrisk absorpsjonstopp-bølgelengde ved 229-233 nm og en molekylvekt innen intervallet, 20.000 - 27.000, oppbevares.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at homogenatet fra trinn a) utsettes for behandling med organisk løsningsmiddel i kulde før trinn b).

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det anvendte løsningsmidlet er etyleter.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at homogeniseringen utføres i vann ved en temperatur som ikke overstiger0 °C. 1

9. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at de fra trinn b) oppnådde faste bestanddelene lyofiliseres og derpå males i en stålkulemølle i kulde.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at nalingen finner sted ved lav temperatur.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 9,. karakterisert ved at malingen finner sted ved en temperatur under frysepunktet for det behandlede materialet.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at malingen finner sted ved en temperatur ar -70°C.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at filtreringen under trinn d) utføres på polyakrylamidgeler, fornettede dekstrangeler, agar- og agarosegeler, idet gelen bringes i likevekt med fosfatbuffer ved pH 7.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at kromatograferingen under trinn e) utføres i en kolonne av en svak ionebytter ved nøytralt pH.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at kromatograferingen utføres på en svak ionebytterpoly-akylamidgel som foreligger i form av en kolonne ved nøytralt pH.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det under trinn g) anvendes en gel valgt blant polyakrylamidgeler, fornettede dekstrangeler, aga- og agarosegeler.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte gelfiltrering utføres på en polyakrylamidgel eller en fornettet dekstrangel.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at vannekstrakten fra trinn c) utsettes for rask oppvarming til en temperatur innen intervallet 95 til 100°C for ødeleggelse av enzymer.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at nevnte vannekstrakt raskt oppvarmes til en temperatur innen intervallet 98-lO O°C og holdes ved nevnte temperatur i 5-10 minutter.

20. Fremgangsmåte for fremstilling av CAPA ifølge krav 4, i karakterisert ved at antigenholdig materiale homogeniseres i frossen tilstand i vann ved en temperatur som ikke overstiger 0°C, dannet homogenat utsettes for behandling med et løsningsmiddel valgt blant etyleter og aceton, faste bestanddeler avskilles fra den oppnådde blandingen av flytende homogenat og faste bestanddeler, nevnte oppnådde faste bestanddeler lyofiliseres og males i en stålkulemølle ved en temperatur under frysepunktet for det behandlede materiale, dannede faste bestanddeler ekstraheres med en alkalisk vannløsning og efter sentrifugering utsettes det overliggende væskeskiktet for rask oppvarming til en temperatur innen intervallet 95-lOO°C i et tidsrom av 5 - 10 minutter for å ødelegge enzymer, det oppvarmede overliggende skiktet behandles med en vannløsning av natriumklorid for utfelning av forurensninger og den ovenforliggende væsken oppbevares, den oppnådde væsken filtreres på en kald kolonne av en gel av molekylsikttypen i perleform med et fraksjoneringsintervall av 10.000 til minst 20.10 og bragt i likevekt med fosfatbuffer ved pH 7,0 og den aktive fraksjonen av eluatet oppbevares, nevnte aktive fraksjon utsettes for kromatografering på en kolonne av en svak ionebyttergel av molekylsikttypen bragt 1 likevekt med fosfatbuffer av pH 7,0, og den første fraksjon av den væske som forlater kolonnen oppbevares, og nevnte første fraksjon utsettes for isoelektrisk utfelning ved pH 5,0 og den dannede felning blandes med en gel av molekylsikttypen med en molekylvekteksklusjonsgrense på minst 2000 bragt i likevekt med HCOO H-HCOO NH^ ved pH 5, den dannede blanding påføres på en kolonne inneholdende en identisk gel bragt i likevekt på samme måte, kolonnen pH-gradientelueres og under senkning av pH oppbevares den fraksjon som elueres ned til pH 3 inneholdende CAPA med en spektrofotometrisk absorpsjons-toppbølgelengde ved 229-233 nm og en molekylvekt av 23.200 2 .500 (SD) .

21. Preparat anvendbart som immuniseringsmiddel, karakterisert ved at det som aktiv bestanddel omfatter CAPA ifølge krav 1 i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer.

22. Preparat ifølge krav 21, karakterisert ved at det omfatter en oljeemulsjon der en vannløsning med pH lavere enn 3 inneholdende CAPA utgjør en innesluttet fase som er beskyttet av den omgivende oljefasen.

23. Preparat ifølge krav 21, karakterisert ved at oljeemulsjonen er basert på Freunds adjuvant.

24. Preparat ifølge krav 21, karakterisert ved at det inneholder CAPA og en stabiliserende mengde inert protein, fortrinnsvis albumin i blanding med det.

25. Preparat ifølge krav 24, karakterisert ved at forholdet mellom albumin ogC APA er minst 200:1 beregnet efter vekt.

26. Fremgangsmåte for fremstilling av CAPA-albuminpreparat ifølge krav 24, karakterisert ved at CAPA og albumin blandes i sur løsning og at løsningens pH heves for å oppnå en samvirkning mellom komponentene.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26, karakterisert ved at preparatet lyofiliseres.