NO751303L

NO751303L -

Info

Publication number: NO751303L
Application number: NO751303A
Authority: NO
Inventors: K Apostolov
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1969-07-03
Filing date: 1975-04-14
Publication date: 1971-01-05

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til The present invention relates to another method

dyrking av heteroploide cellelinjer fra menneskelever. cultivation of heteroploid cell lines from human liver.

Man kjenner til at visse typer menneskelig vev kan dyrkes in vitro som vevkulturer, og enkelte av disse omdannes til cellelinjer som kan dyrkes og overføres flere ganger i rime-lig målestokk. Slike vevkulturer som har vært' utsatt for vesentlige kromosomforandringer og er blitt heteroploide er særlig nyttige, .siden slike cellelinjer er kontinuerlige og kan It is known that certain types of human tissue can be grown in vitro as tissue cultures, and some of these are converted into cell lines that can be grown and transferred several times on a reasonable scale. Such tissue cultures which have been exposed to significant chromosomal changes and have become heteroploid are particularly useful, since such cell lines are continuous and can

overføres og formeres i meget stor målestokk praktisk talt uendelig, og således tjene som basis for industriell fremstilling av virus og tilsvarende vaksiner. Flere typer patogene virus infiserer leveren og formeres i denne, og.det har vært stor etterspørsel etter kontinuerlige cellelinjer som er i stand til å opprettholde slike virus. transmitted and multiplied on a very large scale practically indefinitely, and thus serve as the basis for the industrial production of viruses and corresponding vaccines. Several types of pathogenic viruses infect the liver and multiply in it, and there has been a great demand for continuous cell lines capable of maintaining such viruses.

Bare diploide cellelinjer av fibroblaster har hittil vært fremstilt fra leverceller, men disse hadde begrenset leve-tid. Til nå har man ikke avledet kontinuerlige heteroploide cellelinjer fra menneskeleverceller som har beholdt deres karakteristika, hvilket ville gjøre det mulig for forskere å undersøke patogener i slike celler, dyrke dem i kontinuerlige kulturer og derved åpne muligheten for fremstilling av antigene stoffer fra de formerte og isolerte viruser for vaksinering og diagnose. En hensikt med foreliggende oppfinnelse er å frem-stille en slik cellelinje, spesielt en levercellelinje av menneskeepitelceller som inneholder glykogen og morfologisk og som i morfologi og biokjemisk aktivitet ligner -funksjonelle leverceller in vivo. Only diploid cell lines of fibroblasts have so far been produced from liver cells, but these had a limited lifespan. Until now, continuous heteroploid cell lines have not been derived from human liver cells that have retained their characteristics, which would enable researchers to examine pathogens in such cells, grow them in continuous cultures, and thereby open the possibility of producing antigenic substances from the propagated and isolated viruses for vaccination and diagnosis. One purpose of the present invention is to produce such a cell line, in particular a liver cell line of human epithelial cells which contain glycogen and morphologically and which in morphology and biochemical activity resemble functional liver cells in vivo.

Ifølge oppfinnelsen fremstilles således en heteroploid cellelinje av menneskelever-epitel, med betegnelsen WRL 68, som danner individuelt adskilte øyer eller enkeltklumper når de dyrkes på vekstmedium, har en morfologi som ligger nær opptil hepatocytter fra menneske lever og har generasjonstid høyst 2 4 timer, gir øket glykogenproduksjon i nærvær av 1 % glukose i mediet, og'kan underholde virus. According to the invention, a heteroploid cell line of human liver epithelium, with the designation WRL 68, is thus produced, which forms individually separated islands or single clumps when cultivated on growth medium, has a morphology that is close to that of hepatocytes from human liver and has a generation time of no more than 2 4 hours, gives increased glycogen production in the presence of 1% glucose in the medium, and can entertain viruses.

Cellelinje WRL 6 8 er innlevert ved Wellcome Collection of Micro-organisms and Cultures, Beckenham, Kent, England, og hos American Type Culture Collection ved Rockville, Maryland, USA (ATCC nr. CL48). Cell line WRL 6 8 is deposited at the Wellcome Collection of Micro-organisms and Cultures, Beckenham, Kent, England, and at the American Type Culture Collection at Rockville, Maryland, USA (ATCC No. CL48).

Typen av cellelinjer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er heteroploid, d.v.s. rekken av typiske menneske-kromosomer er overveiende ikke-diploid eller abnormal, i antall mellom 63 og 91,' med middeltall ca. 72. Under det optiske mikroskop er cellene polygonale og epitelaktige av utseende og ligner hepatocytter. The type of cell lines produced according to the present invention is heteroploid, i.e. the series of typical human chromosomes is predominantly non-diploid or abnormal, in numbers between 63 and 91,' with a mean number of approx. 72. Under the optical microscope, the cells are polygonal and epithelial in appearance and resemble hepatocytes.

For at oppfinnelsen skal forstås lettere og hovedtrek-kene 'hos cellene gjenfinnes, skal det nå beskrives de trekk som er synlige under optisk mikroskop og elektronmikroskop av cellelinjer WRL 68, i forbindelse med de vedlagte figurer, hvor: Fig. 1 er. en tegning av en enkelt celleklump som viser de hovedtrekk som er synlig under optisk mikroskop ved forstørrelse 2.400 . Fig. 2 er en tegning av det som kan sees under elektronmikroskop når et snitt forstørres 19.000 ganger og under-søkes. In order for the invention to be understood more easily and the main features of the cells to be found, the features that are visible under the optical microscope and electron microscope of cell lines WRL 68 will now be described, in connection with the attached figures, where: Fig. 1 is. a drawing of a single clump of cells showing the main features visible under an optical microscope at magnification 2,400. Fig. 2 is a drawing of what can be seen under an electron microscope when a section is enlarged 19,000 times and examined.

På fig. 1 vises enkeltceller C med avrundede kjerner In fig. 1 shows single cells C with rounded nuclei

■ som inneholder opptil 5 mukleoler NI. Cytoplasma CP omgir hver kjerne N. Fig. 2 viser at under elektronmikroskopet ser man at cytoplasma CP inneholder mange granulater MB som sannsynligvis • består av lipider. Mitochondria M er meget tallrike og det ■ containing up to 5 mucleoles NI. Cytoplasm CP surrounds each nucleus N. Fig. 2 shows that under the electron microscope it can be seen that cytoplasm CP contains many granules MB which probably • consist of lipids. Mitochondria M are very numerous and that

samme gjelder glykogen CL. Utseendet under elektronmikroskop er også meget likt det typiske menneskehepatocytter, og skiller seg sterkt fra vanlig oppbygning hos fibroblastceller. the same applies to glycogen CL. The appearance under the electron microscope is also very similar to that of typical human hepatocytes, and differs strongly from the normal structure of fibroblast cells.

Slike vesentlig identiske cellelinjer som kan fremstilles av fagfolk ved å modifisere eller formere (clone) de beskrevne cellelinjer uten forandring av cellelinjens eller 'kulturens morfologiske og funksjonelle egenskaper, ligger innenfor oppfinnelsens ramme. Selv om de angitte offisielle preparatbanker er de enkleste kilder til cellelinjer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, er det ikke helt umulig eller usannsynlig at lignende og funksjonelt i det vesentlige identiske cellelinjer av menneskelever-epitel kan fremstilles ifølge andre metoder eller ved lignende uventede tilfeldighe-ter. Slike funksjonelt i det vesentlige identiske cellelinjer er biologiske ekvivalenter til cellelinje WRL 68 og er også innenfor oppfinnelsens generelle ramme. Such essentially identical cell lines which can be produced by professionals by modifying or multiplying (clone) the described cell lines without changing the morphological and functional characteristics of the cell line or culture, are within the scope of the invention. Although the specified official preparation banks are the simplest sources of cell lines produced according to the present invention, it is not entirely impossible or improbable that similar and functionally essentially identical cell lines of human liver epithelium can be produced according to other methods or by similar unexpected coincidences. Such functionally essentially identical cell lines are biological equivalents to cell line WRL 68 and are also within the general framework of the invention.

Cellelinje WRL 68 er såvidt vi kjenner til fremstilt gjennom en fullstendig uventet og original spontandannelse når levervev fra menneske-embryo ble trypsinisert og anbragt i Eagle's'Minimum Essential Medium (H. Eagle, Science 1959, 130, 432), blandet med 10 % kvegserum ved 37°C i noen måneder. Cell line WRL 68 was, as far as we know, produced through a completely unexpected and original spontaneous formation when liver tissue from a human embryo was trypsinized and placed in Eagle's'Minimum Essential Medium (H. Eagle, Science 1959, 130, 432), mixed with 10% bovine serum at 37°C for a few months.

Cellelinjen vokser raskt i standard kulturmedium. The cell line grows rapidly in standard culture medium.

Man kan med fordel bruke Eaglé's Minimal Essential eller Basal Media (H. Eagle,"J. Exp. Med., 1955, 102, 595), siden disse lett kan fåes. Som vanlig kan disse media tilsettes kvegserum, særlig kalveserum. Fortrinnsvis økes det vanlige innhold av aminosyrer og vitaminer med en faktor på ca. to. Medium 199 (j.F. Morgan og medarbeidere, Proe. Soc. Exp. Biol. Med., 1950 73, 1) kan også brukes. Generasjonstiden er vanligvis ca. 15 timer under gunstige forhold, ved 37°C. Cellelinjen danner ikke kontinuerlige matter men vokser som øyer eller enkeltklumper som ligner leverlobuler. Middeldimensjonen for disse klumper, er mellom 2 og 3 mm, eller ca. 3 mm. One can advantageously use Eaglé's Minimal Essential or Basal Media (H. Eagle," J. Exp. Med., 1955, 102, 595), since these can be easily obtained. As usual, these media can be added to bovine serum, especially calf serum. Preferably, increased the usual content of amino acids and vitamins by a factor of about two. Medium 199 (cf. Morgan et al., Proe. Soc. Exp. Biol. Med., 1950 73, 1) may also be used. The generation time is usually about 15 hours under favorable conditions, at 37° C. The cell line does not form continuous mats but grows as islands or single lumps resembling liver lobules. The mean dimension of these lumps is between 2 and 3 mm, or about 3 mm.

Biokjemisk produserer cellelinjer 'fremstilt ifølge oppfinnelsen glykogen som de funksjonelle celler, hepatocyttene Biochemically, cell lines produced according to the invention produce glycogen as the functional cells, the hepatocytes

i leveren. Som alle kontinuerlige heteroploide linjer fra mennesker, er de kreftdannende (oncogene) når de påføres hamster-kinnlommer. in the liver. Like all continuous human heteroploid lines, they are cancerous (oncogenic) when applied to hamster cheek pouches.

Cellelinjene kan brukes for dyrking av forskjellige menneskelige og dyriske virus. Disse omfatter DNA-virus som vaccinia-virus, adenovirus og herpes-virus, RNA-virus som poliomylitt-virus, HeLa-celletilpassede echovirus, parainflu-enza-1 (Sendai)-virus, katte-enteritis-virus og orbovirus som Semliki skog virus, Sindvis virus. The cell lines can be used for the cultivation of various human and animal viruses. These include DNA viruses such as vaccinia virus, adenovirus and herpes virus, RNA virus such as poliomyelitis virus, HeLa cell-adapted echovirus, parainfluenza-1 (Sendai) virus, feline enteritis virus and orboviruses such as Semliki forest virus, Sindvis virus.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for dyrking av en heteroploid cellelinje fra menneskelever-epitel som ovenfor definert, som består i å opprettholde og dyrke cellene i kulturmedium. Den fremstilte heteroploide cellelinje av menneskelever eller dens kultur kan benyttes til dyrking av virus hvorved cellelinjen inokuleres med virus som cellene er følsomme for og dyrke cellelinjen som angitt. According to the present invention, a method for cultivating a heteroploid cell line from human liver epithelium as defined above is provided, which consists in maintaining and cultivating the cells in culture medium. The produced heteroploid cell line of human liver or its culture can be used for the cultivation of viruses whereby the cell line is inoculated with viruses to which the cells are sensitive and culture the cell line as indicated.

Virus som er dyrket på denne måten er egnet for videre-behandling på kjent måte, f.eks. ved å overføre til samme eller andre cellekulturer for fremstilling av rendyrkede eller fortynnede arter og en levende vaksine. Det antigene virusmateriale- som dyrkes i henhold til oppfinnelsen kan også inaktiveres på kjent måte for produksjon av en inaktivert vaksine. Levende eller inaktiverte vaksiner foreligger vanligvis sammen med et farmasøytisk bæremiddel i flytende eller fast form. Viruses grown in this way are suitable for further processing in a known manner, e.g. by transferring to the same or other cell cultures for the production of pure or diluted species and a live vaccine. The antigenic virus material cultivated according to the invention can also be inactivated in a known manner for the production of an inactivated vaccine. Live or inactivated vaccines are usually available together with a pharmaceutical carrier in liquid or solid form.

En annen mulighet er at den fremstilte cellelinjen kan brukes til forskning, f.eks. for undersøkelse av de metabolske prosesser i leveren, eller for produksjon av glykogen eller av enzymer som vanligvis produseres av leveren in vivo. Videre kan cellene være verter for menneske-hepatitis-virus som ikke hittil har vært dyrket med hell i noen kultur in vitro. Another possibility is that the produced cell line can be used for research, e.g. for the investigation of the metabolic processes in the liver, or for the production of glycogen or of enzymes normally produced by the liver in vivo. Furthermore, the cells can host human hepatitis viruses that have not yet been grown successfully in any culture in vitro.

Følgende -eksempler illustrerer oppfinnelsen: The following examples illustrate the invention:

Eksempel 1 Example 1

En prøve av heteroploid levercellelinje WRL 68 inne-5.6 A sample of heteroploid liver cell line WRL 68 inne-5.6

holdende ca. 10 til 10 celler ble overført til medisinske flatbunnede kolber inneholdende Eagle's Minimal Essential Medium, med tilsetning av 10 volum-% kalveserum. Etter 3 dager ved 37°C iakttok man maksimal utvikling av klumper. 0,5 ml suspensjon adenovirus 11 i Eagle<1>s Basal Medium, inneholdende ca. 10 -TCID 50 (tissue culture infective doses = vevkultur-infeksjonsdoser) ml, ble blandet med cellene og virusen adsorberte en 1/2 time. . Overskuddet av virus ble vasket av med nøytralmedium (uten serum) og kulturen ble inkubert ved 37°C. holding approx. 10 to 10 cells were transferred to medical flat-bottomed flasks containing Eagle's Minimal Essential Medium, with the addition of 10 vol% calf serum. After 3 days at 37°C, maximum development of clumps was observed. 0.5 ml suspension adenovirus 11 in Eagle<1>'s Basal Medium, containing approx. 10 -TCID 50 (tissue culture infective doses) ml was mixed with the cells and the virus adsorbed for 1/2 hour. . The excess virus was washed off with neutral medium (without serum) and the culture was incubated at 37°C.

Man iakttok en cytomatisk virkning typisk for adenovirus etter 3 dager. Kulturen ble deretter frosset og tint for frigivelse av virus fra cellene. Cellemassen ble frafiltrert og nærvær av virus i mediet ble demonstrert ved hemaglutinering med røde blodlegemer fra. patasaper. Titeren var 128, hvilket angir maksimal fortynning som fremdeles viser hemaglutinering. A cytomatic effect typical of adenovirus was observed after 3 days. The culture was then frozen and thawed to release virus from the cells. The cell mass was filtered off and the presence of virus in the medium was demonstrated by hemagglutination with red blood cells. patas monkeys. The titer was 128, indicating the maximum dilution still showing hemagglutination.

Adenovirus-arter 4, 5, 7 og 15 ble også dyrket i cellelinjen og ga tilfredsstillende titre. Adenovirus species 4, 5, 7 and 15 were also grown in the cell line and gave satisfactory titers.

Eksempel 2 Example 2

Listerarten av vaccinia-virus ble adsorbert på en kultur av heteroploide levercellelinjer som beskrevet i eksempel 1. Man fant en typisk cytopatogen virkning etter inkubering i 24 timer ved 37°C. Cellelinjen var også følsom for Jenner-arten av vaccinia-virus og man fikk en lignende cytopatisk virkning. The list species of vaccinia virus was adsorbed on a culture of heteroploid liver cell lines as described in example 1. A typical cytopathogenic effect was found after incubation for 24 hours at 37°C. The cell line was also sensitive to the Jenner species of vaccinia virus and a similar cytopathic effect was obtained.

Eksempel 3 Example 3

Følgende virus ble også med hell dyrket på heteroploid levercellelinje WRL 68 som beskrevet i de ovenstående eksempler: Poliomyelitvirus, echovirus 2, 7, 9, 11, 15, 17,'20, 23 og 25, som på forhånd var tilpasset HeLa-cellekulturer, Sendai-virusherpes-virus, katte-enteritis-virus, San Carlos-virus, og-arbovirus som Semliki-skogvirus og Sindbis-virus .-Disse virus oppviser tilfredsstillende antigenitet etter tilpassing til heteroploid cellelinje av menneskelever. Slike og andre a'ktive virus kan derfor dyrkes på den fremstilte cellelinje og presenteres som en vaksine sammen med farmasøytisk akseptable bærere, etter passende inaktivering eller fortynning i henhold til velkjente metode-r. The following viruses were also successfully cultured on the heteroploid liver cell line WRL 68 as described in the above examples: Poliomyelitis virus, echovirus 2, 7, 9, 11, 15, 17,'20, 23 and 25, which were previously adapted to HeLa cell cultures, Sendai virus herpes virus, feline enteritis virus, San Carlos virus, and arboviruses such as Semliki forest virus and Sindbis virus.-These viruses show satisfactory antigenicity after adaptation to heteroploid cell line of human liver. Such and other active viruses can therefore be cultured on the prepared cell line and presented as a vaccine together with pharmaceutically acceptable carriers, after appropriate inactivation or dilution according to well-known methods.

Claims

1. Method for cultivating a heteroploid cell line of human liver epithelium, such as line WRL 68 with ATCC No. CL 48, characterized in that the cells are kept or cultivated in a nutrient medium, preferably "Eagle's Minimal Essential" or "Basal medium" or "Medium 199".

2. Method according to claim 1, characterized in that bovine serum, preferably calf serum, is added to the medium.

3. Method according to claim 1, characterized in that the usual amount of amino acids and vitamins is increased by a factor of approx. two.