NO346254B1 - Isolert salmonid alfavirus og anvendelse derav - Google Patents

Isolert salmonid alfavirus og anvendelse derav Download PDF

Info

Publication number
NO346254B1
NO346254B1 NO20191081A NO20191081A NO346254B1 NO 346254 B1 NO346254 B1 NO 346254B1 NO 20191081 A NO20191081 A NO 20191081A NO 20191081 A NO20191081 A NO 20191081A NO 346254 B1 NO346254 B1 NO 346254B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
virus
cells
tcid50
vaccine
vol
Prior art date
Application number
NO20191081A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20191081A1 (no
Inventor
Trygve Meum Eliassen
Marit Rode
Anne Aas-Eng
Bernt Martinsen
Svein Aleksandersen
Inge-Tom Solbakk
Original Assignee
Pharmaq As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=51302828&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO346254(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Publication of NO20191081A1 publication Critical patent/NO20191081A1/no
Application filed by Pharmaq As filed Critical Pharmaq As
Publication of NO346254B1 publication Critical patent/NO346254B1/no

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12Viral antigens
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12Viral antigens
    • A61K39/295Polyvalent viral antigens; Mixtures of viral and bacterial antigens
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • A61P31/14Antivirals for RNA viruses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • C12N7/06Inactivation or attenuation by chemical treatment
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81Aquaculture, e.g. of fish

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Description

Oppfinnelsens tekniske område
Foreliggende oppfinnelse vedrører veterinærimmunologi og spesielt isolert salmonid alfavirus av undertpe SAV3 samt måter for å forebygge eller kontrollere infeksjoner av salmonid alfavirus og utbrudd av fiskepankreatisk sykdom (fish pancreatic disease) eller sovesyke (sleeping disease) ved anvendelse av et inaktivert salmonid alfavirus av undertpe SAV3.
Oppfinnelsens bakgrunn
Pankreassykdom (pancreas disease) har blitt en alvorlig sykdom i lakseoppdrett i flere geografiske områder. Sykdommen ble først rapportert fra Skottland og har senere blitt rapportert fra Irland, Norge og Nord-Amerika. Siden 2007 har pankreassykdommen blitt endemisk i de fleste oppdrettsanlegg i Irland og det har blitt rapportert om isolerte utbrudd av pankreassykdom i Nord-Amerika. En annen diagnose, sovesyke, er endemisk i deler av Frankrike og har også blitt rapportert i Italia og Spania (McLoughlin & Graham, 2007). Nylig har det kommet uoffisielle rapporter om at pankreassykdom også er observert i Chile.
I Norge har sykdommen spredt seg i løpet av de siste 10 årene med 58 bekreftede infiserte områder i 2006 og 98 bekreftede infiserte områder i 2007. I 2006 spredte sykdommen seg også til Møre og Romsdal, som ligger nord for det tidligere definerte geografiske området som var berørt av salmonid pankreassykdom. Pankreassykdom er nå det største helseproblemet for akvakulturindustrien i den vestlige delen av Norge. Pankreassykdom (PD) og den beslektede sovesyken forårsakes begge av alfavirus og kan ikke behandles med noen terapeutika.
Det første alfaviruset ble isolert fra fisk i 1995 (Nelson m.fl. 1995). I dag har alfavirus blitt isolert fra både atlantisk laks som lider av pankreassykdom og regnbueørret som lider av sovesyke (McLoughlin og Graham 2007).
Salmonis alfavirusene (SAV) er sfæriske (omtrent 65 nm i diameter) innhyllede RNA-virus. De inneholder et enkelttrådet positiv-sense-RNA-genom på 11–12 kB (McLoughlin og Graham 2007). I europeisk patent EP 712 926 er det beskrevet å være sensitivt for kloroform, raskt inaktivert ved pH=3 og ved 50 <o>C og med en flytende tetthet på 1,20 g/ml. Nukleotidsekvenseringsstudier tilordner salmonide alfavirus i tre genetisk forskjellige undertyper (Powers m.fl. 2001, Hodneland m.fl. 2005, Weston m.fl. 2005). Salmonid alfavirus 2 (SAV2) forårsaker sovesyke hos regnbueørret, salmonid alfavirus 1 (SAV1) forårsaker pankreassykdom i atlantisk laks i Irland og Skottland, mens salmonid alfavirus 3 (SAV3) forårsaker pankreassykdom i atlantisk laks og sjøoppdrettet regnbueørret i Norge. Dette er videre understøttet av Karlsen et al. (2006) som fant at SAV3 undertypene som forårsaker pankreassykdom i Norge er genetisk homogene, men forskjellig fra SAV1 og SAV2. Nylig har SAV4, SAV5 og SAV6 blitt identifisert som undertyper beslektet med SAV1. Andersen et al. (2007) har videre identifisert at pseudobrankiene og hjertet er de mest egnede vevene for RT-PCR diagnostikk ved eksponeringsforsøk med SAV1 og SAV3.
I Norge er all oppdrettet atlantisk laks vaksinert mot de vanligste bakterielle sykdommene og svært ofte mot pancreatic necrosis virus (IPNV) før de forflyttes til sjøen. Selv om omfattende vaksinasjonsprogrammer absolutt er ønsket for å unngå økonomiske tap og ytterligere spredning av smittsomme sykdommer er slike program også forbundet med tekniske utfordringer. Administrasjon av vaksiner krever omfattende behandling av fisken, noe som forårsaker stress og dødelighet fordi fisken må pumpes inn i oppbevaringstanker, overføres til en tank med anestesi, injiseres med vaksine og pumpes tilbake til oppbevaringstanker. På grunn av den store målestokken i moderne akvakultur er slike vaksinasjonsprogrammer dyre og arbeidskrevende og forårsaker stress hos fisken. Av disse grunnene administreres vaksiner mot de forskjellige smittsomme sykdommene fortrinnsvis i kombinerte, polyvalente vaksiner som inneholder flere antigener.
Teoretisk skal kombinasjon av vaksiner være ukomplisert. I praksis fører imidlertid kombinasjon av flere vaksineantigener ofte til redusert virkning av hvert enkelt antigen. Slike problemer forbundet med polyvalente vaksiner, diskuteres for eksempel i André, E.F. (1999), som gir en oversikt over strategier for humane pediatriske vaksinasjonsprogrammer. Lignende problemer vekker bekymring i vaksinasjonsprogrammer for dyr, for eksempel når det gjelder vaksiner mot klovsyke hos sau, som gjennomgått av O’Meara m.fl. (1993).
Tross det faktum at salmonid alfavirus ble isolert og karakterisert for mer enn et tiår siden er vaksinering mot pankreassykdom fremdeles en utfordring. I europeisk patent EP 712 926 fremviser eksempel 11 data som viser at en sammensetning ment for vaksinasjonsformål basert på pankreassykdomsvirus SAV1, inaktivert ved tilsetting av beta-propiolakton og NaOH, er ineffektiv for beskyttelse mot etterfølgende infeksjon. I det samme eksperimentet synes en sammensetning basert på PDV behandlet med 0,1 % formalin (35–38 %) å fremkalle en beskyttende immunrespons i eksperimentelle omgivelser. Siden behandling med 0,1 % formalin er utilstrekkelig for å inaktivere PDV må man imidlertid konkludere med at den sistnevnte sammensetningen er en med levende virus. Begge sammensetningene inneholdt PD-virus av SAV1-undertypen med en titer på 10<7,5>TCID50ml<-1>.
Per februar 2008 var kun én PD-vaksine, solgt under navnet Norvac compact PD, kommersielt tilgjengelig. Vaksinen er basert på inaktivert PD-virus av SAV1-undertypen: Et førstegenerasjonsprodukt inneholdt antigen i mengder på 10<7,2>TCID50/dose med et doseringsvolum på 100 μl. Et andregenerasjonsprodukt har blitt utviklet som inneholder 10<7,5>TCID50/dose. Rodger & Mitchell (2005) undersøkte effekten av denne vaksinen: I 2003 fant de at vaksinering ikke reduserte risikoen for utbrudd av pankreassykdom; i 2004 virket det som om vaksinerte fisk hadde en noe mindre risiko for infeksjon, men resultatet var imidlertid ikke statistisk signifikant. Videre var det i blandede populasjoner med vaksinerte og ikke-vaksinerte fisk en tendens til lavere dødelighet hos vaksinerte fisk.
I sammendraget over produktkjennetegn beskrives Norvac compact PD som inkompatibel med andre vaksiner og immunologiske produkter. Følgelig anbefales denne monovalente PD-vaksinen kun for injeksjon minst 210 graddager før injeksjon av andre multivalente vaksiner som beskytter mot vanlige bakterielle sykdommer og IPNV i oppdrettsfisk (graddager beregnes som produktet av dager og temperatur: 10 dager med en temperatur på 10 ºC er det samme som 100 graddager). Under normale forhold må Norvac compact PD administreres 2–3 uker før administrasjon av en polyvalent vaksine.
Ifølge sammendraget over produktkjennetegn er ingen informasjon tilgjengelig om sikkerhet og virkning for den samtidige anvendelsen av denne vaksinen sammen med noen andre immunologiske produkter. Den angitte mangelen på kompatibilitet med andre vaksiner er imidlertid konsistent med tidligere rapporter om multivalente PD-vaksiner som ikke lykkes i å fremkalle god beskyttelse mot pankreassykdom (Christie m.fl. 1999 A, Intervet newsletter 2002, Christie m.fl.
1999 B). Christie rapporterte induksjon av nøytraliserende antistoffer i 60 % av individene vaksinert med en monovalent PD-vaksine. Den beskjedne virkningen ble kraftig kompromittert da vaksinen ble kombinert med andre immunologiske produkter siden den resulterende polyvalente vaksinen induserte nøytraliserende antistoffer i kun 20 % av de vaksinerte individene.
I EP 1 075 523 er oppfinnerne også bekymret over problemet med at PD-vaksiner er inkompatible med andre vaksiner. I avsnitt [0004] heter det: “En ulempe i produksjonen av inaktiverte vaksiner fra PD-viruset beskrevet i EP-A-712 926, er den langsomme veksten av viruset, spesielt i cellekulturer, noe som gjør fremstillingen av vaksinene til en relativ ineffektiv prosess. En ytterligere ulempe med de inaktiverte vaksinene er ustabiliteten til det inaktiverte viruset i nærvær av andre inaktiverte patogener hvilket fører til potenstap. Fiskevaksiner fremstilles generelt som multivalente vaksiner, og det kreves betydelig høyere mengder inaktiverte virus i de multivalente vaksinene enn det som ville være nødvendig i en monovalent vaksine for å kompensere for potenstapet.” Oppfinnerne viser til rekombinante proteinvaksiner som en løsning, men slike rekombinante vaksiner har aldri blitt implementert i behandlingen av pankreassykdom. I WO2007031572 A1 identifiserte oppfinnerene en epitop for SAV E2 med evne til å indusere en virus-nøytraliserende immunrespons til bruk for vaksineutvikling og diagnostikk.
Som en konklusjon er eksisterende vaksinasjonsprogrammer mot fiskepankreatisk sykdom fremdeles ineffektive og har ikke vært i stand til å stoppe spredning av sykdommen. I tillegg er, ifølge den generelle oppfatningen på området, PD-vaksiner basert på inaktiverte virus kun tilgjengelig til høy produksjonskostnader og de er inkompatible med vaksiner mot andre smittsomme sykdommer som er utbredt i oppdrettsfisk.
Det er derfor fremdeles et akutt behov for effektive tiltak som kan kontrollere fiskepankreatisk sykdom, både av etiske og økonomiske grunner.
Oppsummering av oppfinnelsen
Et formål ved foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe i) et isolert alfavirus av undertpe SAV 3; samt måter for å forebygge eller kontrollere infeksjoner av salmonid alfavirus og utbrudd av fiskepankreatisk sykdom (fish pancreatic disease) eller sovesyke (sleeping disease) ved anvendelse av et inaktivert salmonid alfavirus av undertpe SAV3.
Spesielt vedrører ett aspekt av oppfinnelsen et isolert salmonid alfavirus av undertype SAV3 som omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 90 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1 og er videre karakterisert ved
a. en synlig cytopatogen effekt under tidlig passasje i cellekultur, og
b. evnen til å fremkalle dødelighet på minst 30 % i en laboratoriesmittemodell, modellen omfatter smoltifisering av atlantisk laks i henhold til standardfremgangsmåter og utfordring av postsmolt ved intraperitonal injeksjon med en SAV3-dose på minst 10<8>TCID50 pr. fisk, slik som minst 10<9>TCID50, minst 10<10>TCID50 eller fortrinnsvis minst 3,5 x 10<8 >TCID50 pr. fisk innen én dag etter overføring til sjøvann på 12 <o>C, og
c. evnen til å vokse in vitro til en titer på minst 1x10<8 >TCID50/ml i supernatanten/vekstmediet kulturer av CHH-1-celler eller CHSE-214-celler.
Oppfinnelsen tilveiebringer også isolert virus som definert ovenfor, hvor virus har en synlig cytopatogen effekt under den første, andre, tredje eller fjerde passasjen på en kultur med CHSE-celler.
Oppfinnelsen tilveiebringer også isolert virus som definert ovenfor, hvor nevnte titer på minst 1x10<8 >TCID50/ml oppnås når:
i) Celler dyrkes ved bruk av vertsceller som har blitt sådd med en tetthet på 0,1-1x10<5 >celler cm<-2>;
ii) Vertscellene dyrkes i 4-6 dager før virusinfeksjon;
iii) Vertscellene dyrkes til en tetthet fra 0,1-1,0 x10<6 >celler cm<-2 >på infeksjonstidspunktet med nevnte virusisolat;
iv) Vertscellene dyrkes i et vekstmedium som omfatter EMEM (EBSS)+ 10 % føtalt bovint serum (FBS) 2 mM L-glutamin 1 % ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) 0,1 % gentamicin og
v) De infiserte cellene dyrkes ved en temperatur på 15 ºC i en periode på 10-14 dager.
Oppfinnelsen tilveiebringer også isolert virus som definert ovenfor, hvor viruset omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 80 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 4.
Oppfinnelsen tilveiebringer også isolert virus som definert ovenfor, hvor viruset omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 98 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1.
Oppfinnelsen tilveiebringer også isolert virus som definert ovenfor, hvor virus er positive i en SAV reverse transkriptase kvantitativ PCR-identitetstest ved anvendelse et sett primere slik som primerne angitt i SEQ ID NO: 7 og 8 og betingelsene 50 <o>C, 30 min - 95 <o>C, 10 min –(95 <o>C, 30 sek - 57 <o>C, 60 sek -72 <o>C,30 sek)*40.
Oppfinnelsen tilveiebringer også isolert virus som definert ovenfor, hvor viruset er en genetisk variant av en enkelt av virusstammene deponert under Budapestkonvensjonen ved European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 0JG UK 12. desember 2007 under deponeringsnumre 07121201 og 07121202.
Et annet aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer en anvendelse av et inaktivert salmonid alfavirus av undertype SAV3, hvor virus omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 90 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1 og er videre karakterisert ved
a. en synlig cytopatogen effekt under tidlig passasje i cellekultur, og b. evnen til å fremkalle dødelighet på minst 30 % i en laboratoriesmittemodell, modellen omfatter smoltifisering av atlantisk laks i henhold til standardfremgangsmåter og utfordring av postsmolt ved intraperitonal injeksjon med en SAV3-dose på minst 10<8>TCID50 pr. fisk, slik som minst 10<9>TCID50, minst 10<10>TCID50 eller fortrinnsvis minst 3,5 x 10<8 >TCID50 pr. fisk innen én dag etter overføring til sjøvann på 12 <o>C, og c. evnen til å vokse in vitro til en titer på minst 1x10<8 >TCID50/ml i supernatanten/vekstmediet kulturer av CHH-1-celler eller CHSE-214-celler; i fremstillingen av en vaksine for å forebygge eller redusere forekomsten av infeksjon med salmonid alfavirus.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en anvendelse som definert ovenfor, hvori det salmonide alfaviruset er inaktivert ved tilsetting av formaldehyd.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en anvendelse som definert ovenfor, hvori det salmonide alfaviruset er inaktivert ved anvendelse av en prosedyre omfattende tilsetting av 1,5-2,5 g/kg, formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 48–96 timer ved en temperatur fra 14–17 <º>C.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser SAV3-titre i ubearbeidede supernatanter fra CHH-1-cellekulturer inokulert med forskjellige SAV3-isolater eller passasjer av isolater.
Figur 2 er en fremstilling av SAV3-titre i ubearbeidede supernatanter fra SAV3-infiserte CHSE-214-cellekulturer.
Figur 3 A og B viser % akkumulert dødelighet etter utfordring av atlantisk laksesmolt med salmonid alfavirus type 3 (SAV3). Figuren viser enn videre effekten av å vaksinere fisk i parrstadiet mot salmonid pankreassykdom ved anvendelse av en polyvalent vaksine ifølge oppfinnelsen. To parallelle eksperimenter ble utført i separate utfordringstanker (A og B).
Foreliggende oppfinnelse vil i det følgende bli beskrevet mer detaljert.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse er basert på observasjonen at til tross for tidligere rapporter om det motsatte, er utvikling av polyvalente vaksiner som kombinerer inaktivert salmonid alfavirus med vaksiner mot andre fiskepatogener faktisk den mest effektive måten for å beskytte oppdrettslaks mot pankreassykdom.
Oppfinnerne gjorde spesielt følgende observasjoner:
i) Til tross for testing av forskjellige vaksineformuleringer var det ikke mulig å etablere noen ugunstig effekt av andre vaksinekomponenter på stabiliteten av pankreassykdomsantigenet. Med andre ord: PD-vaksiner basert på inaktiverte virus er høyst kompatible med vaksiner mot for tiden utbredte fiksepatogener;
ii) I vaksiner basert på inaktivert virus synes en minste antigentiter i området 3,75 x 10<7 >TCID50/dose å være ønskelig for å effektivt indusere beskyttende immunitet, noe som indikerer at tidligere vaksinasjonsprogrammer har vært basert på vaksiner som inneholdt utilstrekkelige mengder antigen;
iii) Titre av salmonid alfavirus som er tilstrekkelige for fremstilling i stor skala av vaksiner med god virkning, kan visselig oppnås ved å anvende konvensjonell teknologi for viruspropagering og til en rimelig pris.
Mikrobiologisk materiale
I forbindelse med foreliggende oppfinnelse har isolater av salmonide alfavirus blitt deponert under Budapestkonvensjonen hos European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 0JG UK 12. desember 2007 under følgende aksesjonsnumre: 07121201, som svarer til isolat ALV 405 i eksemplene; 07121202, som svarer til isolat ALV 407 i eksemplene; og 07121203 som svarer til isolat ALV 409 i eksemplene.
Polyvalente vaksiner som inneholder antigener fra typiske fiskepatogener bortsett fra salmonide alfavirus, er velkjente i faget og er allerede kommersielt tilgjengelige. Identifikasjonen og isoleringen av passende antigener som skal anvendes i slike vaksiner er beskrevet i litteraturen og gir således fagmannen mulighet til å generere og fremstille slike polyvalente vaksiner. I tillegg er representative isolater av relevante fiskepatogener tilgjengelige uten restriksjoner fra forskjellige kilder. For eksempel er følgende bakteriearter tilgjengelige fra LGCPromochem/American Type Culture Collection ATCC oppbevarings- og distribusjonssenter (ATCC): A. salmonicida (ATCC 33658<TM >opphavsland: ikke oppgitt), Aeromonas hydrophila, V. salmonicida (ATCC 43839<TM>, opphavsland: Norge), V. anguillarum serotype O1(ATCC 43305<TM>, opphavsland: Danmark) og O2(ATCC 19264)<TM>, opphavsland: ikke oppgitt) og Moritella viscosa (ATCC BAA-105<TM>, opphavsland: Norge). Flavobacterium columnaris (deponert som Cytophaga columnaris) er tilgjengelig under ATCC-nummer 23463™ (Opphavsland: USA).
Når det gjelder Piscirickettsia salmonis, har nåværende søker deponert flere nyttige isolater under Budapesttraktaten hos European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 0JG UK: tre isolater ble deponert 9. juni 2006 under aksesjonsnumrene 06050901, 06050902 og 06050903 (isolat AL10005, AL10007 og AL10008). Et enkelt isolat ble deponert 21. mars 2007 under aksesjonsnummer 07032110 (opphavsland: Chile). På en lignende måte er representative isolater av relevante virusarter tilgjengelige inklusive infectious pancreatic necrosis virus (IPNV, ATCC VR-1318, opprinnelsesland: ikke oppgitt), Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV, ATCC VR_1389, opprinnelsesland: Danmark); Infectious Hematopoietic Nerosis Virus (IHNV, ATCC VR-1392, opprinnelsesland: USA)); Pancreatic Necrosis Virus; Spring Viremia of Carp (SVC, ATCC VR-1390, opprinnelsesland: Danmark); Channel Catfish Virus (CCV) (ATCC VR-665, opprinnelsesland: USA); Infectious Salmon Anaemia (ISA) virus (ATCC VR-1554, opprinnelsesland:
Canada).
Patentdeponeringer har tidligere blitt gjort av nåværende søker av følgende virusarter: Heart and Skeletal Muscle Infection Virus (HSMIV, patentdeponeringsnr. ECACC 04050401, opprinnelsesland: Norge); Cardiomyopathic syndrome virus (CMSV, patentdeponeringsnr. ECACC 07032902, opprinnelsesland: Norge).
Definisjoner
Før foreliggende oppfinnelse diskuteres i videre detaljer vil de følgende uttrykkene og konvensjonene bli definert:
“Et antigent og/eller immunogent materiale” i foreliggende kontekst refererer til et materiale som inneholder én eller flere beskyttende epitoper. En epitop er beskyttende hvis den kan indusere en immunrespons som er i stand til å effektivt interferere med omfanget eller utviklingen av infeksjon med salmonid alfavirus, inklusive SAV1, SAV2 og spesielt SAV3. Uttrykket innbefatter polypeptider, inklusive polypeptider som er fremstilt ved bruk av rekombinante teknikker og deler av slike polypeptider.
Uttrykket “genotypiske karakteristika” viser i store trekk til sammensetningen av én eller flere deler av et individs genom som bidrar til å bestemme en spesifikk egenskap.
Med hensyn til viruset ifølge oppfinnelsen brukes uttrykket “relaterte genotypiske karakteristika” i relasjon til virus som innehar nukleinsyresekvenser med en høy grad av sekvensidentitet sammenlignet med kjente nukleinsyresekvenser fra tidligere isolerte salmonide alfavirus. Sammenligning kan gjøres med nukleinsyresekvensene som koder for en enkelt av de nsP1, nsP2, nsP3 og nsP4 ikkestrukturelle proteinene. Sammenligning kan videre gjøres med nukleinsyresekvensene som koder for kapsid, glykoprotein E2, glykoprotein E3 eller 6K- og gpE1-proteiner. Uttrykket anvendes spesielt for å definere virus som har nukleinsyresekvenser med en høy grad av sekvensidentitet sammenlignet med alle slike kjente aminosyresekvenser av deponerte isolater ALV 405, ALV 407 og/eller ALV 409. Med sikte på å definere de virale isolatene anvendt i forbindelse med foreliggende oppfinnelse vises det spesielt til nukleinsyresekvenser av glykoprotein E2 og det ikke-strukturelle proteinet nsP3 som tilveiebrakt heri og identifisert ved SEQ ID NOs: 1-6. Det skal derfor forstås at viruset ifølge oppfinnelsen innehar nukleinsyresekvenser som er minst 80 % identiske, slik som minst 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 % eller 99,9 % identiske med nukleinsyresekvensene i glykoprotein E2 og det ikke-strukturelle proteinet nsP3 som tilveiebrakt heri og identifisert ved SEQ ID NOs: 1–6.
Uttrykket “sekvensidentitet” indikerer et kvantitativt mål på graden av homologi mellom to aminosyresekvenser eller mellom to nukleinsyresekvenser med lik lengde. Hvis de to sekvensene som skal sammenlignes ikke har lik lengde, må de justeres for å gi best mulig tilpassing, som tillater innsettingen av hull (gaps) eller alternativt trunkering ved endene av polypeptidsekvensene eller
nukleotidsekvensene. Sekvensidentiteten kan beregnes som der Ndif er det totale antall ikke-identiske rester i de to sekvensene når de er justert, og hvori Nref er antall rester i én av sekvensene. Derfor vil DNA-sekvensen AGTCAGTC ha en sekvensidentitet på 75 % med sekvensen AATCAATC (Ndif=2 og Nref=8). Et hull regnes som ikke-identitet av de(n) spesifikke resten(e), dvs. DNA-sekvensen AGTGTC vil ha en sekvensidentitet på 75 % med DNA-sekvensen AGTCAGTC (Ndif=2 og Nref=8).
Med hensyn til alle oppfinnelsens utførelsesformer som vedrører nukleotidsekvenser, kan også prosenten av sekvensidentitet mellom én eller flere sekvenser være basert på tilpasning ved bruk av clustalW software (http:/www.ebi.ac.uk/clustalW/index.html) med standardinnstillinger. For nukleotidsekvenstilpasninger er disse innstillingene: Tilpasning=3Dfull, Gap Open 10,00, Gap Ext. 0,20, Gap separation Dist. 4, DNA weight matrix: identity (IUB).
Alternativt kan nukleotidsekvenser analyseres ved å bruke programmet DNASIS Max, og sammenligningen av sekvensene kan gjøres ved http://www.paralign.org/. Denne servicen er basert på de to sammenligningsalgoritmene kalt Smith-Waterman (SW) og ParAlign. Den første algoritmen ble publisert av Smith og Waterman (1981) og er en veletablert metode som finner den optimale lokale tilpasningen for to sekvenser. Den andre algoritmen, ParAlign, er en heuristisk metode for sekvenstilpasning; detaljer om metoden er publisert i Rognes (2001). Standardinnstillinger for score matrix og Gap-handikap samt E-verdier ble brukt.
Uttrykket “fenotypiske karakteristika” viser like generelt til én eller flere observerbare egenskaper hos en organisme som frembringes ved interaksjon av den arvede genotypen til individet med overførte epigenetiske faktorer og/eller ikke-nedarvet miljømessig variasjon. I sammenheng med foreliggende oppfinnelse inkluderer uttrykket “relaterte fenotypiske karakteristika” enhver av de følgende karakteristika: størrelse, fasong, pH-stabilitet, temperaturstabilitet, kloroformsensitivitet og hemagglutinasjon.
“Fenotypiske karakteristika” inkluderer videre evnen til å fremkalle ethvert av de kliniske tegnene på pankreatisk sykdom og sovesyke, inklusive store patologiske tegn og histopatologiske tegn som beskrevet i foreliggende søknad. “Fenotypiske karakteristika” inkluderer også virusets evne til å introdusere slike kliniske tegn i et laboratorieutfordringseksperiment som beskrevet heri. Enn videre refererer uttrykket til virusets opptreden når det vokser på cellekulturer, inklusive vekstkinetikk og evnen til å fremkalle en cytopatogen effekt.
Uttrykkene SAV1, SAV2 og SAV3 definerer undertyper av salmonide alfavirus: SAV1-undertypen er definert og karakterisert i Nelson m.fl. Diseases of Aquatic Organisms, 22, 25-32, 1995 og et representativt isolat har blitt deponert ved ECACC under deponeringsnummer V94090731. SAV2-undertypen er på den annen side utløsende for “sovesyke” og ble først isolert og karakterisert av Castric m.fl. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 17, 27-30, 1997. SAV3-undertypen ble først isolert og karakterisert av Hodneland m.fl. som beskrevet i Dis Aquat Organ. 2005 Sep 5; 66(2):113-20 (Erratum i: Dis Aquat Organ. 2005 Nov 9; 67(1-2):181). Uttrykkene SAV4, SAV5 og SAV6 definerer nye undertyper av salmonide alfavirus funnet nær Skottland og Irland.
Som fagmannen vil forstå, viser “cytopatogen effekt” til synlige morfologiske endringer i celler infisert med virus. Den kan spesielt inkludere avstenging av cellulært RNA og proteinsyntese, cellefusjon, frigjøring av lysosomale enzymer, endringer i cellemembranpermeabilitet, diffuse endringer i intracellulære strukturer, tilstedeværelse av virale inklusjonslegemer og kromosomale aberrasjoner.
Uttrykket “komponent eller del av nevnte virus” viser til en komponent eller del av nukleinsyrekjernen til viruset eller den omliggende proteinkappen.
“Cellekultur” viser til kulturer av celler slik som omdannede celler etablert in vitro. Spesielt, som anvendt heri, viser "cellelinje" til en populasjon av celler som er i stand til kontinuerlig eller langvarig vekst og deling in vitro. Ofte er cellelinjer klonale populasjoner avledet fra en enkelt stamcelle. Det er videre kjent i faget at spontane eller induserte endringer kan forekomme i karyotyp under lagring eller overføring av slike klonale populasjoner. Celler avledet fra cellelinjen det vises til kan derfor ikke være helt identiske med stamcellene eller -kulturene, og cellelinjen det vises til inkluderer slike varianter. Uttrykket “cellelinjer" inkluderer også immortaliserte celler.
Uttrykket “adjuvans” brukes i sin normale betydning og definerer et middel som kan stimulere immunsystemet og øke responsen på en vaksine uten å ha noen spesifikk antigen effekt i seg selv.
På samme måte brukes uttrykket “emulgator” vanligvis for å definere en substans som stabiliserer en emulsjon, ofte en surfaktant.
Uttrykket “detergent” definerer en annen surfaktantklasse som vil interagere kjemisk med både olje og vann og dermed stabilisere grenseflaten mellom oljeeller vanndråper i en suspensjon.
Emulsjoner omfattende vann og olje omtales generelt enten som vann-i-olje emulsjoner, olje-i-vann emulsjoner eller vann-i-olje-i vann emulsjoner. Hvorvidt en emulsjon blir en vann-i-olje emulsjon eller en olje-i-vann emulsjon avhenger av volumfraksjonen av begge faser og av emulgatortypen. Generelt tenderer emulgatorer og emulgerende partikler til å fremme dispersjon av fasen de ikke løses særlig godt i. Proteiner løses f.eks. bedre i vann enn i olje og tenderer dermed til å danne olje-i-vann emulsjoner (dvs., de fremmer spredningen av oljedråper gjennom en kontinuerlig vannfase).
I den foreliggende sammenhengen er en “surfaktant”, også kjent som “et tensid”, et fuktemiddel som senker overflatespenningen i en væske, tillater lettere spredning og senker grenseflatespenningen mellom to væsker.
Til sist, i sammenheng med foreliggende oppfinnelse, anvendes en ”polyvalent vaksine” (også kjent som multivalent vaksine) for å definere en kombinasjon av flere antigener i én vaksine. Derfor kan en polyvalent vaksine beskytte mot mer enn én sykdom. I motsetning til en polyvalent vaksine er en “monovalent vaksine” en vaksine som inneholder vaksinekomponenter rettet mot bare ett patogen. Spesielt kan en monovalent vaksine inneholde bare ett antigen som beskytter mot én spesiell sykdom.
Ifølge et første aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et isolert salmonid alfavirus av undertype SAV3 som omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 90 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1 og er videre karakterisert ved
a. en synlig cytopatogen effekt under tidlig passasje i cellekultur, og
b. evnen til å fremkalle dødelighet på minst 30 % i en laboratoriesmittemodell, modellen omfatter smoltifisering av atlantisk laks i henhold til standardfremgangsmåter og utfordring av postsmolt ved intraperitonal injeksjon med en SAV3-dose på minst 10<8>TCID50 pr. fisk, slik som minst 10<9>TCID50, minst 10<10>TCID50 eller fortrinnsvis minst 3,5 x 10<8 >TCID50 pr. fisk innen én dag etter overføring til sjøvann på 12 <o>C, og
c. evnen til å vokse in vitro til en titer på minst 1x10<8 >TCID50/ml i supernatanten/vekstmediet kulturer av CHH-1-celler eller CHSE-214-celler.
Det er også beskrevet en sammensetning som omfatter et salmonid alfavirus eller et antigent og/eller immunogent materiale avledet derav, kombinert med én eller flere komponenter valgt fra gruppen bestående av:
a. en levende, svekket, drept eller inaktivert bakterie,
b. et virus som ikke er salmonid alfavirus, nevnte virus er fortrinnsvis svekket eller inaktivert,
c. en sopp,
d. en parasitt og
e. et antigent og/eller immunogent materiale avledet fra nevnte bakterie i a), fra nevnte virus i b), fra nevnte sopp i c) eller fra nevnte parasitt i d).
Selv om sammensetninger basert på underenheter av viruset, for eksempel sammensetninger omfattende rekombinante antigener, kan overveies, foretrekkes det at sammensetningen fremstilles på grunnlag av kulturer av viruset. For det formål er det ønskelig at sammensetningen inneholder salmonid alfavirus ved en titer på minst 7,5x10<8 >TCID50/ml.
Selv om naturlig forekommende ikke-virulente stammer av salmonide alfavirus og stammer av viruset som har blitt svekket i laboratoriet kan overveies, inneholder sammensetningen fortrinnsvis et salmonid alfavirus som enten er drept eller inaktivert.
På lignende vis er bakterie-, sopp- og parasittkomponentene i vaksinen fortrinnsvis drept eller på annen måte gjort ute av stand til å infisere/angripe fisken.
Inaktivering av viruset kan oppnås med kjemiske eller fysiske metoder.
Kjemisk inaktivering kan utføres ved behandling av virusene med for eksempel, men ikke begrenset til, behandling med enzymer, med formaldehyd, βpropiolakton eller etylenimin eller et derivat derav, med organisk løsningsmiddel (f.eks. 30 halogenert hydrokarbon) og/eller detergent, f.eks. Triton<® >eller Tween<®>. Fysiologisk inaktivering kan fordelaktig utføres ved å underkaste virusene energirik stråling slik som UV-lys, gammabestråling eller røntgenstråler. Om nødvendig kan inaktiveringsmidlet nøytraliseres med tiosulfat. Om nødvendig returneres pH deretter til ca pH 7.
Mens inaktivering med formaldehyd tidligere har blitt ansett suboptimalt som en metode for inaktivering av salmonid alfavirus, har nåværende oppfinnere erfart at formaldehydinaktivering virkelig er en nyttig tilnærming. I en fortrukket utførelsesform inaktiveres viruset ved tilsetting av formaldehyd. I en fortrukket utførelsesform inaktiveres viruset ved tilsetting av 1,5-2,5 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 12-96 timer, slik som i 48-84 timer ved en temperatur fra 13-17 ºC, slik som fra 14-16 ºC.
Viruset inkuberes med formaldehyd i en periode på 12 – 96 timer, slik som fra 24 - 96 timer, fra 36 - 96 timer, fra 36 - 72 timer, fra 36 - 60 timer eller slik som fra 48 - 96 timer, fra 48 - 72 timer eller slik som fra 48 - 60 timer. Oppfinnerne har funnet at når det brukes 2,0 g/kg formaldehyd, er en 48-timers inkubasjon vanligvis tilstrekkelig for å sikre tilfredsstillende inaktivering av viruset. For å tilfredsstille spesifikke regulatoriske krav kan imidlertid lengre inkubasjonsperioder være foretrukket, slik som en inkubasjonsperiode på minst 72 timer. Viruset inkuberes fortrinnsvis med formaldehyd ved en temperatur på 13-17 <º>C, slik som en temperatur på 14-17 <º>C, 15-17 <º>C, 16-17 <º>C, 13-16 <º>C, 13-15 <º>C, 14-16 <º>C eller slik som en temperatur på 14-15 <º>C.
Når det gjelder sammensetningens bakterielle komponenter, skal det likeledes forstås at flere anvendelige metoder for inaktivering er tilgjengelige for fagmannen. Bakterien kan inaktiveres ved å anvende en prosedyre som omfatter tilsetting av 3,5 – 4,5 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 1-2 timer ved en temperatur på 20 <º>C.
Selv om hver av de virale, bakterielle, fungale og parasittiske komponentene i vaksinen kan drepes eller inaktiveres før de kombineres med de andre komponentene, kan de også inaktiveres eller drepes etter at de har blitt satt til vaksinen.
Nevnte levende svekkede, drepte eller inaktiverte bakterie kan være av en art som er et anerkjent fiskepatogen. Følgelig velges bakterien fortrinnsvis fra gruppen bestående av bakterier av artene Piscirickettsias spp., Aeromonas spp., Vibrio spp., Listonella spp., Moritella viscosa, Photobacterium damsela, Flavobacterium spp., Yersinia spp., Renibacterium spp., Streptococcus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp., Bifidobacterium spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Edwarsiella spp., Francisella spp., Pseudomonas spp., Cytophaga spp., Nocardia spp., Haphnia spp. og Mycobacerium spp.
Bakterien kan videre velges fra gruppen bestående av Aeromonas spp., Vibrio spp., Flavobacterium spp., Haphnia spp., Piscirickettsia spp. og Moritella viscosa. Enda mer spesielt velges bakterien fra gruppen bestående av Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio salmonicida, Vibrio anguillarum, Vibrio ordali, Flavobacterium columnaris, Haphnia sp., Piscirickettsia salmonis og Moritella viscosa.
Sammensetningen kan videre omfatte drepte eller inaktiverte bakterier av én eller flere arter valgt fra gruppen bestående av A. salmonicida, V. salmonicida, V. anguillarum og M. viscosa.
Sammensetningen kan videre omfatte nevnte bakterier av artene Vibrio ordali og/eller Piscirickettsia salmonis.
Sammensetningen kan også omfatte bakterier av én eller flere arter valgt fra gruppen bestående av Aeromonas hydrophila, Flavobacterium columnaris og Haphnia sp.
Sammensetningen er i visse tilfeller beregnet primært for anvendelse i forbindelse med fiskeoppdrett av atlantisk laks, spesielt i Nord-Atlanterhavet. Bakterier av artene Aeromonas sp. spesielt A. salmonicida; Vibrio sp., spesielt V. salmonicida og V. anguillarum serotyp O1 og O2; og Moritella viscosa gir en utfordring for fiskeoppdrett i norske farvann, og derfor kan det være foretrukket at den levende svekkede, drepte eller inaktiverte bakterien i sammensetningen velges fra denne spesielle gruppen av bakteriearter.
I andre tilfeller er sammensetningen tiltenkt bruk i Sør-Amerika, inkludert Chile, og i disse tilfellene velges bakterien fra gruppen av bakteriearter bestående av Vibrio sp, spesielt Vibrio ordali og Piscirickettsia sp., spesielt Piscirickettsia salmonis.
I ytterligere andre tilfeller som hovedsakelig er tiltenkt for anvendelse i Sørøst-Asia, velges bakterien fra gruppen bestående av Aeromonas sp., spesielt Aeromonas hydrophila, Flavobacterium sp., spesielt Flavobacterium columnaris og Haphnia sp.
På en lignende måte er nevnte virus som ikke er salmonid alfavirus et anerkjente fiskepatogen. Følgelig velges det fortrinnsvis fra gruppen bestående av: infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV); Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV); Infectious Hematopoetic Necrosis virus (IHNV); Pancreatic Necrosis Virus; Spring Viremia of Carp (SVC); Channel Catfish Virus (CCV); Infectious Salmon Anaemia (ISA)-virus; nodavirus; iridovirus, koi herpes-virus; Heart and Skeletal Muscle Inflammation Virus (HSMV) og Cardiomyopathy Syndrome Virus.
Av disse virusene er infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) særlig relevant i forbindelse med norsk oppdrett av laks. Det er derfor foretrukket i visse tilfeller at nevnte virus, bortsett fra salmonid alfavirus, er infectious pancreatic necrosis virus (IPNV).
Soppen velges fortrinnsvis fra gruppen bestående av: Saprolegnia Sp., Branchiomyces sanguinis, Branchiomyces demigrans og Icthyophonus hoferi.
Videre kan parasitten spesielt velges fra gruppen bestående av: Lepeophtheirus Sp., Caligus Sp.og Ichthyophthirius Sp.
Av bekvemmelighetshensyn foretrekkes det ofte at tilnærminger for å kontrollere infeksjoner i fiskepopulasjoner rettes mot alle eller i det minste de fleste av de potensielt relevante patogenene. Det kan derfor være foretrukket at sammensetningen omfatter to eller flere virus-, bakterie-, sopp- og/eller parasittkomponenter som definert ovenfor, slik som 3 eller flere, 4 eller flere, 5 eller flere, 6 eller flere, 7 eller flere, 8 eller flere, 9 eller flere eller 10 eller flere komponenter som definert over. Spesielt kan sammensetninger omfatte 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 eller 10 virus-, bakterie-, sopp- og/eller parasittkomponenter valgt blant de ovennevnte.
Det vil bli forstått at sammensetningen bør inneholde antigener i mengder som er tilstrekkelige til å fremkalle en immunrespons, fortrinnsvis en beskyttende respons, etter injeksjon av sammensetningen i en fisk. Generelt er det foretrukket at sammensetningen har et relativt høyt innhold av salmonid alfavirus siden dette antas å forbedre den beskyttende immunresponsen når sammensetningen anvendes til vaksinasjonsformål. De nåværende oppfinnerne har observert at det generelt er mulig å dyrke salmonid alfavirus for å oppnå en tilfredsstillende titer i cellekultur, og at produksjonskostnadene ikke hindrer utviklingen av multivalente vaksiner. Tilgjengeligheten av isolater med en spesiell SAV3-undertype som foreviser utmerket vekstkinetikk når de dyrkes på cellekulturer, har videre tillatt de nåværende oppfinnerne å utvikle en ekstremt kostnadseffektiv virusvaksinekomponent for pankreatisk sykdom.
Vaksinen kan spesielt omfatte en mengde salmonid alfavirusantigen, slik som en mengde av SAV3-antigen, som tilsvarer 1,5x10<8>-1x10<11 >TCID50/ml vaksine, slik som fra 1,5x10<8>-5x10<10>, fra 1,5x10<8>-1x10<10>, fra 1,5x10<8>-5x10<9>, fra 1,5x10<8>-2x10<9>, fra 1,5x10<8>-9x10<8>, fra 1,5x10<8>-8x10<8>, fra 1,5x10<8>-7x10<8>, 1,5x10<8>-6x10<8>, 2,5x10<8>-1x10<11>, 5x10<8>-1x10<11>, 7,5x10<9>-1x10<11>, 1x10<10>-1x10<11>, 2,5x10<10>-1x10<11>, 5x10<10>-1x10<11>, 7,5x10<10>-1x10<11>, 2,5x10<8>-7,5x10<10>, 5x10<8>-5x10<10>, 5x10<8>-7x10<9>, 5x10<8>-6x10<9>, 5x10<8>-5x10<9>, 5x10<8>-4x10<9>, 5x10<8>-3x10<9>, 5x10<8>-2x10<9>, fra 5x10<8>-1x10<9>, 6x10<8>-7x10<9>, 6x10<8>-6x10<9>, 6x10<8>-5x10<9>, 6x10<8>-4x10<9>, 6x10<8>-3x10<9>, 6x10<8>-2x10<9>, 6x10<8>-1x10<9>, 7x10<8>-7x10<9>, 7x10<8>-6x10<9>, 7x10<8>-5x10<9>, 7x10<8>4x10<9>, 7x10<8>-3x10<9>, 7x10<8>-2x10<9>, 7x10<8>-1x10<9>, 8x10<8>-7x10<9>, 7,5x10<8>-1x10<10>, 8x10<8>-6x10<9>, 8x10<8>-5x10<9>, 8x10<8>-4x10<9>, 8x10<8>-3x10<9>, 8x10<8>-2x10<9>, 8x10<8>-1x10<9>, 9x10<8>-7x10<9>, 9x10<8>-6x10<9>, 9x10<8>-5x10<9>, 9x10<8>-4x10<9>, 9x10<8>-3x10<9>, eller fra 9x10<8>-2x10<9>, 1x10<9>-7,5x10<10>, 7,5x10<8>-5x10<10>, 1x10<9>-2,5x10<10>, 1x10<9>-1x10<10>, 1x10<9>-8x10<9>, 1x10<9>-5x10<9>, 1x10<9>-2,5x10<9>, 2,5x10<9>-1x10<10 >eller fra 5x10<9>-7,5x10<9 >TCID50/ml vaksine.
Som fagmannen vil vite, kan flere metoder og måter for administrasjon av vaksiner være anvendelige i akvakulturen. Det skal derfor forstås at vaksinen kan formuleres for administrasjon ved en rute valgt fra gruppen bestående av: intraperitoneal injeksjon, bad, nedsenking, intramuskulær injeksjon og oral administrasjon eller kombinasjoner av herav.
Når vaksiner skal administreres ved injeksjon, er generelt et relativt lite doseringsvolum nødvendig. Således er det ønskelig å formulere sammensetningen slik at hver dose har et volum på 25-200 μl. Mer foretrukket har hver dose et volum på 40-120 μl, slik som et volum på 90-110 μl eller 45-55 μl. For øyeblikket foretrekkes et doseringsvolum på 50 μl.
Når sammensetningen er formulert for injeksjon, kan den spesielt være formulert for intraperitoneal injeksjon i en teleostei inkludert, men ikke begrenset til laksefisker, havabbor, brasme, torsk, snapper, flyndrefisk, steinbit, gulhale og tilapias. Fortrinnsvis er vaksinen formulert for injeksjon i en laksefisk.
Når sammensetningen er tiltenkt for injeksjon, kan den formuleres slik at en alikvot på 25-200 μl, fortrinnsvis en alikvot på 40-120 μl, slik som en alikvot på 90-110 μl eller 45-55 μl, og mest foretrukket en alikvot på 50 μl, inneholder salmonid alfavirus i mengder tilsvarende 0,75x10<7>-0,5x10<10 >TCID50, slik som fra 0,75x10<7>-2,5x10<9>, fra 0,75x10<7>-0,5x10<9>, fra 0,75x10<7>-2,5x10<8>, fra 0,75x10<7>-1x10<8>, fra 0,75x10<7>-4,5x10<7>, fra 0,75x10<7>-4x10<7>, fra 0,75x10<7>-3,5x10<7>, 0,75x10<7>-3x10<7>, 1,25x10<7>-0,5x10<10>, 2,5x10<7>-0,5x10<10>, 3,75x10<8>-0,5x10<10>, 0,5x10<9>-0,5x10<10>, 1,25x10<9>-0,5x10<10>, 2,5x10<9>-0,5x10<10>, 3,75x10<9>-0,5x10<10>, 1,25x10<7>-3,75x10<9>, 2,5x10<7>-2,5x10<19>, 2,5x10<7>-3,75x10<8>, 2,5x10<7>-3x10<8>, 2,5x10<7>-2,5x10<8>, 2,5x10<7>-2x10<8>, 2,5x10<7>-1,5x10<8>, 2,5x10<7>-1x10<8>, fra 2,5x10<7>-0,5x10<8>, 3x10<7>-3,5x10<8>, 3x10<7>-3x10<8>, 3x10<7>-2,5x10<8>, 3x10<7>-2x10<8>, 3x10<7>-1,5x10<8>, 3x10<7>-1x10<8>, 3x10<7>-0,5x10<8>, 3,5x10<7>-3,5x10<8>, 3,5x10<7>-3x10<8>, 3,5x10<7>-2,5x10<8>, 3,5x10<7>-2x10<8>, 3,5x10<7>-1,5x10<8>, 3,5x10<7>-1x10<8>, 3,5x10<7>-0,5x10<8>, 4x10<7>-3,5x10<8>, 3,75x10<7>-0,5x10<9>, 4x10<7>-3x10<8>, 4x10<7>-2,5x10<8>, 4x10<7>-2x10<8>, 4x10<7>-1,5x10<8>, 4x10<7>-1x10<8>, 4x10<7>-0,5x10<8>, 4,5x10<7>-3,5x10<8>, 4,5x10<7>-3x10<8>, 4,5x10<7>-2,5x10<8>, 4,5x10<7>-2x10<8>, 4,5x10<7>-1,5x10<8>, eller fra 4,5x10<7>-1x10<8>, 0,5x10<8>-3,75x10<9>, 3,73x10<7>-2,5x10<9>, 0,5x10<8>-1,25x10<9>, 0,5x10<8>-0,5x10<9>, 0,5x10<8>-4x10<8>, 0,5x10<8>-2,5x10<8>, 0,5x10<8>-1,25x10<9>,1,25x10<8>-0,5x10<9 >eller til 2,5x10<8>-3,75x10<8 >TCID50.
Som nevnt ovenfor er det ønskelig at sammensetningen inneholder salmonid alfavirus ved en titer på minst 7,5x10<8 >TCID50/ml. Dette gir fortrinnsvis en mengde salmonid alfavirus på minst 3,75x10<7 >TCID50/dose.
Det skal forstås at for den foreliggende oppfinnelsens formål bestemmes de spesifiserte mengdene salmonid alfavirus ved titrering av CHH-celler som illustrert i eksemplene. En alternativ tilnærming er titrering av CHSE-celler. Som fastslått i eksempel 3, er CHH-celler omtrent dobbelt så sensitive for salmonid alfavirus som CHSE-cellene. Når man bestemmer virustitre for CHH-celler, er de oppnådde verdiene derfor omtrent dobbelte så høye som når de bestemmes ved titrering av CHSE-celler.
I europeisk patent EP 712,926 brukes CHSE-celler for titrering. Det er derfor rimelig å anta at virustitrene i PD-vaksinen, som er kommersielt tilgjengelig fra innehaveren av EP 712,926, også bestemmes ved titrering av CHSE-celler. Det angitte antigeninnholdet på 10<7,2>TCID50/dose i den første generasjonen monovalent vaksine fra patentinnehaveren ville derfor tilsvare 3,2x10<7>TCID50/dose hvis bestemt ved anvendelse av CHH-celler for titrering. Likeledes ville det angitte antigeninnholdet på 10<7,5>TCID50/dose i den andre generasjonen vaksine tilsvart 6,4x10<7 >TCID50/dose ved titrering med CHH-celler.
Sammensetningen omfatter gjerne inaktivert salminod alfavirus (SAV) ved en titer på 5x10<8 >- 5x10<10 >TCID50/ml (som gir et antigeninnhold på 2,5x10<7 >- 2,5x10<9 >TCID50/dose ved et doseringsvolum på 50 μl).
Videre er det foretrukket at nevnte levende svekkede eller drepte bakterie er til stede i mengder tilsvarende 0,2 x10<8>-2,5x10<9 >celler/ml (0,1 x10<7>-1,25x10<8 >celler/dose), slik som 0,5 x10<8>-2,5x10<9 >celler/ml (0,25 x10<7>-1,25x10<8>celler/dose), 0,5 x10<8>-1x10<9 >celler/ml (0,25x10<7>-0,5x10<8>celler/dose), 0,5 x10<8>-0,5x10<9 >celler/ml (0,25 x10<7>-0.25x10<8>celler/dose), 1x10<8>-5x10<9 >celler/ml (0,5x10<7>-0,25x10<8>celler/dose), 2,5x10<8>-5x10<9 >celler/ml (1,25x10<7>-2,5x10<8 >celler/dose), 5x10<8>-5x10<9 >celler/ml (2,5x10<7>-2,5x10<8>celler/dose), 7,5x10<8>-5x10<9 >celler/ml (3,75x10<7>-2,5x10<8>celler/dose), 1-5x10<9 >celler/ml (0,5-2,5x10<8>celler/ml), 2-5x10<9 >celler/ml (1-2,5x10<8>celler/dose), 3-5x10<9 >celler/ml (1,5-2,5x10<8>celler/dose) eller 4-5x10<9 >celler/ml (2-2,5x10<8>celler/dose). Det foretrekkes videre at det bakterielle antigenet tilsettes i mengder som fremkaller en beskyttelse som resulterer i en relativ overlevelsesprosent (RPS) over 70 for den relevante sykdommen ved bruk av en utfordringsmodell for sykdommen ved anvendelse av intraperitoneal injeksjon som utfordring.
Bakterien er gjerne til stede i mengder som tilsvarer 1x10<8>-8x10<9 >celler/ml. Ved et doseringsvolum på 50 μl tilsvarer dette 5x10<6 >– 4x10<8 >celler/dose. Fortrinnsvis er bakterien til stede i mengder tilsvarende 0,9 - 5 x10<9 >celler/ml, tilsvarende 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose ved et doseringsvolum på 50 μl.
I tilfeller hovedsakelig rettet mot det norske markedet, er den levende svekkede eller drepte bakterien til stede i mengder tilsvarende ≥2,9x10<8 >celler/ml (≥1,45x10<7 >celler/dose) Aeromonas salmonicida, ≥7,4x10<7 >celler/ml (≥3,7x10<6>celler/dose) Vibrio salmonicida, ≥ 4,3x10<8 >celler/ml (≥ 1.65x10<7>celler/dose) V. anguillarum serovar O2 α, ≥3,2x10<8 >celler/ml (≥1,6x10<7 >celler/dose) V. anguillarum serovar O1 og ≥ 2,7x10<7 >celler/ml (≥ 1.35x10<6 >celler/dose) Moritella viscosa. I ytterligere tilfeller tiltenkt samme formål omfatter sammensetningen inaktivert Aeromonas salmonicida, inaktivert Vibrio.
Salmonicida, inaktivert Vibrio anguillarum og inaktivert Moritella viscosa, og hvert bakterielle antigen er til stede i en mengde som tilsvarer 0,9 -5x10<9 >celler/ml.
I tilfeller for øyeblikket tiltenkt det chilenske markedet, omfatter sammensetningen: inaktivert Vibrio ordali og inaktivert Piscirickettsia salmonis, begge i en mengde som tilsvarer 0,9 -5x10<9 >celler/ml.
I tilfeller for øyeblikket tiltenkt Øst-Asia omfatter sammensetningen inakrivert Aeromonas hydrophila, inaktivert Flavobacterium columnaris og inaktivert Haphnia sp., hver i en mengde som tilsvarer 0,9 -5x10<9 >celler/ml.
Viruset, bortsett fra salmonid alfavirus, kan fortrinnsvis være til stede i mengder tilsvarende ≥5x10<8 >PFU/ml. Disse mengdene er især relevante når viruset er infenctious pancreatic necrosis virus (IPNV). I spesifikke tilfeller er viruset til stede i mengder som tilsvarer 1,0 - 5x10<9 >PFU/ml eller 2-8 antigenenheter (AU)/ml i tilfeller med infectious pancreatic necrosis virus (IPNV). Ved doseringsstørrelser på 50 μl tilsvarer dette henholdsvis 0,5 – 2,5x10<8 >PFU/dose og 0,2-0,8 antigenenheter/dose.
Som fagmannen vil innse, er det mulig å inkludere én eller flere rekombinant fremstilte antigener i vaksinene. Spesielt kan det antigene og/eller immunogene materialet avledet fra det salmonide alfaviruset være et materiale som fremstilles ved bruk av rekombinante teknikker. I tillegg kan det antigene og/eller immunogene materialet avledet fra nevnt bakterie i punkt a), fra nevnte virus i punkt b), fra nevnte sopp i punkt c) eller fra nevnte parasitt i punkt d) som definert over fremstilles ved bruk av rekombinante teknikker.
Slike teknikker, inkludert teknikker for kloning, ekspresjon, syntese og rensing av peptider og polypeptider, er selvfølgelig tilgjengelige og velkjente for fagmannen.
Egnede rekombinante antigener kan være polypeptider klonet fra fiskepatogener eller immunogene deler av slike polypeptider. En immunogen del av et polypeptid kan omfatte en T-celle- og/eller en B-celle-epitop. T-celle-epitoper, som er lineære, kan identifiseres ved å undersøke effekten av deletion-mutasjoner systematisk introdusert i polypeptidsekvensen. B-celle-epitoper kan identifiseres ved å analysere B-celleresponsene på overlappende peptider som dekker polypeptidsekvensen av interesse. Fagmannen vil være klar over at immunogene aminosyresekvenser generelt vil ha en minimumslengde på 6 aminosyrer i en etterfølgende sekvens. Lengre aminosyresekvenser kan naturligvis være foretrukket, inklusive aminosyresekvenser på minst 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 30, 50, 100, 150 eller 200 aminosyrer i en etterfølgende sekvens.
Når påtenkt for formålet å fremkalle en beskyttende immunrespons, vil fagmannen erkjenne at sammensetningen videre kan omfatte et organisk adjuvans og/eller et uorganisk adjuvans.
Det organiske adjuvanset velges fortrinnsvis fra gruppen som består av: mineralolje, squalen 2,6,10,15,19,23-heksametyl-2,6,10,14,18,22-tetracosaheksan), virosomer, Montanid og CpG-oligodeoksynukleotider. Andre eksempler på hyppig benyttede adjuvantia i fisk- og skalldyroppdrett er muramyldipeptider, lipopolysakkarider, flere glukaner og glykaner, mineralolje og Carbopol<®>. Også adjuvantia som interleukin og glykoproteiner kan anvendes. En omfattende oversikt over adjuvantia egnet for fisk- og skalldyrvaksiner er gitt i oversiktsartikkelen av Jan Raa (1996), hvis innhold innlemmes heri ved referanse i sin helhet.
Nyttige uorganiske adjuvantia vil være kjent for den erfarne utøver og er beskrevet av JC Aguilar og EG Rodriguez, 2007, Vaccine 25, 3752 – 3762, hvis innhold innlemmes heri ved referanse i sin helhet.
Spesielt velges det uorganiske adjuvanset som eventuelt er inkludert i sammensetningen fra gruppen som består av Al(OH)3 (aluminiumhydroksid), Ca3(PO4)2 (kalsiumfosfat) og vannuløselige salter av aluminium, kalsium, jern eller zirkonium.
Sammensetningen kan videre omfatte en passende farmasøytisk bærer. Vaksinen kan være formulert som en emulsjon av vann i olje. Vaksinen kan også omfatte et såkalt “vehikkel”. Et vehikkel er et middel som antigenet fester seg til uten å være kovalent bundet til det. Slike vehikler er bl.a. biodegraderbare nano-/mikropartikler eller -kapsler av PLGA (polylaktid-co-glykolsyre), alginat eller kitosan, liposomer, niosomer, miceller, multiple emulsjoner og makrosoler, alle kjent i faget. En spesiell form for et slikt vehikkel der antigenet er delvis kapslet inn i vehikkelet, er det såkalte ISCOM (europeiske patenter EP 109.942, EP 180.564 og EP 242.380, hvis innhold innlemmes heri ved referanse i sin helhet).
I tillegg kan sammensetningen omfatte én eller flere passende overflateaktive forbindelser, detergenter og/eller emulgatorer.
Spesielt velges detergenten fra gruppen som består av ikke-ioniske detergenter, kationiske detergenter og anioniske detergenter.
Fagmannen vil innse at estere av ikke-PEG-ylert eller PEG-ylert sorbitan med fettsyrer er eksempler på nyttige emulgatorer. Som det fremgår i eksemplene kan emulgatoren spesielt være polysorbat eller sorbitanoleat. Mer spesielt kan nevnte detergent og/eller emulgator velges fra gruppen som består av polyoksyetylen (20) sorbitanmonooleat (Tween<®>80), sorbitanmonooleat (Span<®>80), kremofor, Tween® og Span®.
I visse tilfeller velges sammensetningen fra gruppen som består av en vann-i-oljeemulsjon, en vann-i-olje-i-vann-emulsjon og en olje-i-vann-emulsjon. For øyeblikket er den foretrukne sammensetningen en vann-i-olje-emulsjon.
I spesifikke tilfeller omfatter sammensetningen en mineralolje.
Visse tilfeller vedrører en vaksine som omfatter en oljefase og en vannfase, hver fase utgjør fra 20-80 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen.
I ytterligere tilfeller omfatter vaksinen en oljefase som utgjør fra 50-80 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen slik som 55-75 % (vol/vol), fra 45-62 % (vol/vol), fra 45-60 % (vol/vol), fra 50-70 % (vol/vol), fra 55-70 % (vol/vol), fra 50-65 % (vol/vol), fra 50-60 % (vol/vol) fra 55-60 % (vol/vol) eller fra 57-60 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen.
I enda ytterligere tilfeller omfatter vaksinen en vannfase som utgjør fra 20-55 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen slik som 20-50 % (vol/vol), fra 20-45 % (vol/vol), fra 20-40 % (vol/vol), fra 30-55 % (vol/vol), fra 30-52 % (vol/vol), fra 30-50 % (vol/vol), fra 37-55 % (vol/vol) fra 37-50 % (vol/vol) eller fra 37-45 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen.
I enda ytterligere tilfeller omfatter sammensetningen en oljefase og en vannfase, hvor hver fase utgjør fra 30-70 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen.
I enda ytterligere tilfeller omfatter sammensetningen en oljefase som utgjør fra 45-70 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen slik som fra 45-65 % (vol/vol), fra 45-62 % (vol/vol), fra 45-60 % (vol/vol), fra 50-70 % (vol/vol), fra 55-70 % (vol/vol), fra 50-65 % (vol/vol), fra 50-60 % (vol/vol) fra 55-60 % (vol/vol) eller fra 57-60 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen.
I enda ytterligere tilfeller omfatter sammensetningen en vannfase som utgjør fra 30-55 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen slik som fra 30-50 % (vol/vol), fra 30-45 % (vol/vol), fra 30-40 % (vol/vol), fra 35-55 % (vol/vol), fra 35-52 % (vol/vol), fra 35-50 % (vol/vol), fra 37-55 % (vol/vol) fra 37-50 % (vol/vol) eller fra 37-45 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen.
I ytterligere tilfeller omfatter sammensetningen en oljefase som utgjør fra 50-80 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen slik som fra 55-75 % (vol/vol), fra 45-62 % (vol/vol), fra 45-60 % (vol/vol), fra 50-70 % (vol/vol), fra 55-70 % (vol/vol), fra 50-65 % (vol/vol), fra 50-60 % (vol/vol) fra 55-60 % (vol/vol) eller fra 57-60 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen.
I enda ytterligere tilfeller omfatter sammensetningen en vannfase som utgjør fra 20-55 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen slik som fra 20-50 % (vol/vol), fra 30-45 % (vol/vol), fra 20-40 % (vol/vol), fra 30-55 % (vol/vol), fra 30-52 % (vol/vol), fra 30-50 % (vol/vol), fra 37-55 % (vol/vol) fra 37-50 % (vol/vol) eller fra 37-45 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen.
Det skal forstås at salmonid alfavirus i sammensetningen kan være et virus av enhver av de for øyeblikket kjente SAV-undertyper, SAV1, SAV 2, SAV 3, SAV4, SAV5 og SAV6 som definert over. De nåværende oppfinnerne har observert at tidligere beskrevne stammer av salmonide alfavirus er effektive når de anvendes som en antigen komponent i polyvalente vaksiner og gir god beskyttelse mot senere infeksjon.
Representative isolater av SAV1- og SAV 2-undertyper er beskrevet i faget: En patentdeponering av SAV1 har tidligere blitt gjort under Budapestkonvensjonen ved ECACC under deponeringsnummer V94090731. Det deponerte SAV1-isolatet tilsvarer isolatet beskrevet i Nelson m.fl. 1995 og isolatet tilveiebrakt i EP 712,926.
Fortrinnsvis er det salmonide alfaviruset i sammensetningen et salmonid alfavirus undertype 3 (SAV3)-virus. Det er mest foretrukket at salmonide alfaviruset i sammensetningen velges fra gruppen bestående av virusstammene deponert under Budapestkonvensjonen ved European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 0JG UK 12. desember 2007 under deponeringsnumre 07121201, 07121202 og 07121203.
Relaterte genotypiske karakteristika:
I videre utførelsesformer er viruset i følge første aspekt en stamme eller isolat med genotypiske karakteristika som er beslektet med eller lignende de i de deponerte stammene angitt over, spesielt enhver av de deponerte SAV3-stammene.
Selv om de genome organiseringene av alle karakteriserte SAVer er like, er nukleotidsekvenslikheten mellom SAV3 og SAV1 bare 91,6 %, og mellom SAV3 og SAV2 92,9 % (Hodneland m.fl. 2005). Dersom sammenligningen begrenses til bestemte gener, for eksempel det ikke-strukturelle proteinet nsP3, er likheten mellom undertyper så lav som 81,5 % (Weston m.fl. 2005).
I spesielle utførelsesformer omfatter det salmonide alfaviruset anvendt i forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen en nukleinsyresekvens som er minst 90 %, slik som 95 %, 97 % eller 99 % identisk med en enkelt av sekvensene angitt i SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 1
aagaagtgca ccagattttc caccaccccg aagaagtccg ccccctacct cgttgacgtg tacgacgctc tgccgatttc tgtagagatt agcaccgttg taacatgcaa cgacaatcag tgcacagtga aggtgccacc cggtaccaca gtgaaattcg ataagaagtg caagagcgct gcccaagcga ccgttacctt taccagcgac tcccagacgt ttacgtgtga ggagccggtt ctgacggccg ccagtatcac ccagggcaag ccgcacctta gatcatctat gttgcccagc ggaggcaagg aagtgaaggc gaggatccca ttcccgttcc cgccagagac cgcgacc;
SEQ ID NO: 2:
aagaaatgta ccagattttc cactactcca aaaaagtccg cactatacct cgttgatgtg tacgacgctc tgccgatttc cgtagagatt agcaccgtcg taacatgcaa cgatagccag tgcacagtga gggtgccacc cggcaccaca gtgaaattcg acaaaaaatg caagagcgct gcctcggcga ccgtcacttt caccagcgac tcccagacgt ttacgtgcga ggagccggtc ctaacggctg ccagtatcac ccagggcaag ccacacctca gatcggcaat gttgcctagt ggaggcaagg aagtgaaagc aaggatcccg ttcccgttcc cgccggaaac tgcaact;
SEQ ID NO: 3
aagaaatgca ccaggttttc caccaccccg aagaagtccg cgctctatct cgttgatgtg tatgatgctc tgccgatttc tgtagagatc agcaccgtgg tgacatgcaa cgaaagacag tgcacagtga gggtgccacc cggtaccaca gtgaaattcg ataagaagtg caagaacgtt gccaaagaga ccgtcacctt caccagcgac tcccagacgt ttacgtgcga ggagccggtc ctaacggccg ccagcatcac ccagggcaag ccgcacctta gatcgtcaat gttgcccagc ggaggcaaag aggtgaaagc gaggattcca ttcccgttcc cgccagagac tgcgact.
I ytterligere utførelsesformer omfatter det salmonide alfaviruset anvendt i forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen en nukleinsyresekvens som er minst 80 %, slik som 85 %, 90 %, 95 %, 98 % eller 99 % identisk med sekvensen angitt i en enkelt av SEQ ID NO: 4.
SEQ ID NO: 4
gttacgccag cggcatcatt ggcgggcagc gtccacggcc atagtgtacg cagcgcccct gccatgaggg ccgccagcac aggtgccaga agcgtgcgca gtgtccagtc cggttcagcc gggcatagaa ctgacgtcgc cagcgtcgcc ggctcagcgg ggctgcctag agggctaaca cgggaccagt tcggcgccgt gagagctagg gcccgcaggg acttagagct ggagggatca gagcatggca gtcagactag cttccgttcc ggctcgctga tggtggagag caccgctagt ggctacagcc aacgttctga cgatcaggac acgggctcc
SEQ ID NO: 5:
gtcgcgccag cggcatcatt ggcgggcagc gtccacagcc atagtgtgcg cagcgcccct gccattctga gggccgccag cacaggagcc agaagcgtgc gcagtgtcca gtccggctta accgggcaca gagatgatgc cgttagcgtc gccggttcgg tgagacagcc cagtgggccg cccagcagcg tgagcacgcc cgccgcgcct agagggctaa cacgggaaca gttcggcgcc gtaagagcta gggcccgcag ggacctagag ttggagggac cggagcatgg cagccaggcc agcttccgtt ccggctcgct ggtggtgggg agcaccgcca gtagctacag ccaacgtcct gacgaccagg acacgggctc t;
SEQ ID NO: 6:
gttgtgccgg cgacatcgtc gacgggcagc gtccacagcc gcagtagcgc ccctgctatt ttgagggccg ccagcgcggg tgccagaagc gtgcgcagcg cccaacccgg ccccgccggg catagagcgg gcgccttcag cgtcgctggc tcggtgagac agcccagcgg gccgcctagt agcgtgagca cgcccgccgc gaccagaggg ctgacacggg accagtttga cgtcgtgaga gctagggccc gtaggaactt ggaaccggag gggtcggagc atggcagcca agccagcttc cgctccggct cgctgacggt ggggagctct gctagtagct acagccaacg ttccgacgat caggacacgg gcacc
I foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse som vedrører virus av SAV3-varianten, skal det forstås at viruset omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 98 %, 99 % eller 99,5 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1.
For den foreliggende oppfinnelsens formål er en passende test for å avgjøre om et virusisolat har genotypiske karakteristikker som er beslektet med eller ligner på de deponerte stammene ovenfor, gitt i eksempel 2: fagmannen vil innse at i foretrukne utførelsesformer er salmonid alfavirus ifølge oppfinnelsen et virus, hvilket er positivt i den SAV reverse transkriptase kvantitativ PCR (RT-QPCR)-identitetstesten som beskrevet i eksempel 2, spesielt når det anvendes et sett primere som er utviklet for å amplifisere del av en salmonid alfavirus glykoprotein E2 nukleotidsekvens, slik som primerne angitt i SEQ ID NO: 7 og 8.
Relaterte fenotypiske karakteristika:
I enda ytterligere tilfeller er viruset en stamme eller isolat med fenotypiske karakteristika som er beslektet med eller lignende de i de deponerte stammene, spesielt enhver av de deponerte SAV3-stammene.
Fenotypiske forskjeller eksisterer mellom isolater innenfor de tre SAV-gruppene, samt mellom grupper (Christie m.fl. Dis. Aquat. Org. 75: 13-22, 2007, Hodneland m.fl. 2005, Taksdal m.fl.): I en studie av Taksdal m.fl. hadde alle atlantiske laks og 76 % av regnbueørretene infisert med virus av SAV3-undertypen alvorlige pankreatiske lesjoner i sen/regenerativ fase. Dette var i motsetning til rapporter fra irske og skotske tilfeller der fisk infisert med SAV1 vanligvis hadde normalt, sannsynligvis legede, eksokrine pankreatiske vev. Et ytterligere karakteristisk trekk ved pankreatisk sykdom forårsaket av SAV3-undertypen er nærvær av tallrike celler i nyren som inneholder cytoplasmiske eosinofile granuler (EG). I Taksdals studier ble EG-inneholdende celler funnet i 40 % av regnbueørreten og i 64 % av atlantisk ørret. I tillegg er det karakteristisk at regnbueørreten og atlantisk laks er like følsomme for infeksjoner med SAV3, selv om regnbueørret synes å være litt resistent mot infeksjon med SAV1. Til slutt synes hjertet å friskne til tidligere etter infeksjoner med SAV3 sammenlignet med infeksjoner med SAV1.
I henhold til ytterligere utførelsesformer er viruset som er inkludert i sammensetningen ifølge oppfinnelsen, i stand til å fremkalle dødelighet på minst slik som minst 30 %, minst 35 %, minst 40 %, minst 45 %, minst 50 %, minst 55 % eller fortrinnsvis minst 60 % i en laboratorieutfordringsmodell, modellen omfatter smoltifisering av atlantisk laks i henhold til standardfremgangsmåter og utfordring av postsmolt ved intraperitoneal injeksjon med en SAV3-dose på minst 10<8>TCID50 pr. fisk, slik som minst 10<9>TCID50, minst 10<10>TCID50 eller fortrinnsvis minst 3,5 x 10<8 >TCID50 pr. fisk innen én dag etter overføring til sjøvann (25 ‰) på 12 <o>C.
Den nye varianten av salmonid alfavirus undertype SAV3 ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved evnen til å vokse til høye titre in vitro i kulturer av vertsceller. Således kan dette viruset ifølge oppfinnelsen være i stand til å vokse til en titer i supernantanten/vekstmediet på minst 1x10<8>, 5x10<8>, 1x10<9>, 5x10<9>, 1x10<10 >og 5x10<10 >eller slik som minst 1x10<11 >TCID50/ml når de dyrkes ved å anvende vertsceller som velges fra gruppen bestående av CHH-1-celler eller CHSE-214-celler.
Spesielt kan slike høye virustitre i følge oppfinnelsen oppnås når:
i) Celler dyrkes ved bruk av vertsceller som har blitt sådd med en tetthet på 0,1-1x10<5 >celler cm<-2>;
ii) Vertscellene dyrkes i 4-6 dager før virusinfeksjon;
iii) Vertscellene dyrkes til en tetthet fra 0,1-1,0 x10<6 >celler cm<-2 >på infeksjonstidspunktet med nevnte virusisolat;
iv) Vertscellene dyrkes i et vekstmedium som omfatter EMEM (EBSS)+ 10 % føtalt bovint serum (FBS) 2 mM L-glutamin 1 % ikkeessensielle aminosyrer (NEAA) 0,1 % gentamicin og v) De infiserte cellene dyrkes ved en temperatur på 15 ºC i en periode på 10-14 dager.
Det vil videre bli forstått at SAV1, SAV3, SAV4, SAV5 eller SAV6-viruset som er inkludert i sammensetningen, er et virus som hvis ikke det er svekket eller inaktivert er i stand til å forårsake symptomene forbundet med fiskepankreatisk sykdom. Generelle symptomer på fiskepankreatisk sykdom har blitt gjennomgått i McLoughlin og Graham, Journal of Fish Disease 2007, 30, 511-531, hvis innhold er innlemmet her i sin helhet. Symptomene inkluderer:
i) Død/dødelighet
ii) Mangel på appetitt
iii) Nedsatt svømmeferdighet
iv) Letargi
v) Pankreatisk nekrose
vi) Kardiomyopati og skjeletal myopati, inklusive øsofageale muskellesjoner
vii) Nyrelesjoner, angrepne nyrer som inneholder tallrike interstitielle celler fylt med eosinofilt materiale
viii) Fokal gliose i hjernen.
Generelt kan sykdomsforløpet som følge av infeksjoner med fiskepankreatisk sykdomsvirus karakteriseres som å omfatte en akutt fase og en sen/kronisk fase, der hver fase er forbundet med forskjellige histopatologiske symptomer. Viruset tilveiebrakt kan særlig være i stand til å forårsake minst ett av følgende histopatologiske symptomer i akuttfasen:
i) ødeleggelse av hoveddelen av pankreatisk acinærvev og en variabel inflammatorisk respons som varierer fra ingen inflammasjon til moderat inflammasjon;
ii) fibrose i periacinært vev.
Viruset tilveiebrakt kan også være i stand til å forårsake minst ett av de følgende histopatologiske symptomene i den sene/kroniske fasen.
i) signifikant tap av pankreatisk acinærvev med eller uten fibroplasi av periacinært vev;
ii) multifokal kardiomyocytisk nekrose, angrepne celler har et innskrumpet, dypt eosinofilt cytoplasma og pyknotiske kjerner.
I motsetning til infeksjoner med SAV1 og -3 er infeksjoner med SAV2 i regnbueørret rapportert å forårsake lavere dødelighet, men en dødelighet på opptil 22 % har blitt rapportert (Boucher og Baudin 1994). Sovesyke kan imidlertid forårsake at fisken ligger på siden på bunnen av tanker eller vannrenner. Dersom den forstyrres, svømmer fisken litt og returnerer deretter til bunnen. Dette tegnet skyldes primært omfattende nekrose i røde skjelettmuskler.
Makroskopiske lesjoner forekommer ikke, men av og til sekundære sår på skinnet eller petekkier på det pyloriske organ. Nekroser av røde skjelettmuskler kan forefinnes, og histopatologisk undersøkelse kan avsløre inflammasjon i eksokrin pankreas og hjerte. I den enkelte fisk kan disse lesjonene foreligge med eller uten noen atferdsendringer.
Det vil bli forstått at SAV2-viruset, som kan være inkludert i sammensetningen, er et virus som hvis det ikke er svekket eller inaktivert er i stand til å forårsake symptomene forbundet med sovesyke hos fisk.
Det skal videre forstås at viruset ifølge oppfinnelsen kan ha en synlig cytopatogen effekt under tidlig passasje i cellekultur, slik som under den første, andre, tredje eller fjerde passasjen på en kultur med CHSE-celler. Som nevnt har nåværende oppfinnere identifisert en ny variant av salmonid alfavirus undertype SAV3. Denne varianten av viruset viste synlig cytopatogen effekt under første passasje i cellekultur. Mens tidligere isolater av salmonid alfavirus ikke har hatt synlig cytopatogen effekt før de vente seg til in vitro dyrkingsbetingelsene, kan evnen til å forårsake en cytopatogen effekt uten å ha blitt passert på en cellelinje derfor brukes som enda et kjennetegn på viruset ifølge foreliggende oppfinnelse.
Det skal også forstås at de deponerte virusene kan mutere eller på annen måte endre karakteristika, for eksempel når de passeres på vertsceller in vitro (JD Watson m.fl., 1987). Fagmannen vil innse at replikasjon av RNA-virusgenomer ledsages av svært høye mutasjonsrater (Watson et al., 1987). Dette skyldes mangel på korrekturlesingsaktivitet hos RNA-viruspolymeraser, noe som fører til en konstant generering av nye genetiske varianter for eksempel under viruspropagering (Elena og Sanjuán, 2005). Domingo og Holland (1997) konkluderer dessuten med at forskjellige konstellasjoner av mutasjoner kan assosieres med en lignende biologisk atferd. Salmonid alfavirus anvendt til den foreliggende oppfinnelsens formål kan derfor være en stamme som kan oppnås ved å introdusere én eller flere substitusjoner, utelatelser og/eller tilføyelser av nukleotider i genomet til en enkelt av de deponerte stammene nevnt over. Med andre ord kan salmonid alfavirus som anvendes til den foreliggende oppfinnelsens formål være en genetisk variant av en hvilken som helst av de ovennevnte deponerte stammene.
Oppfinnerne har under screeningen av nye SAV 3-isolater fra utbrudd i norske lakseoppdrettsanlegg oppdaget en variant av viruset med egenskaper som avviker signifikant fra de som tidligere er beskrevet. Funnet av at denne varianten av SAV3-undertypen viste synlig cytopatogen effekt under dens første passasjen i cellekultur, og frembrakte dødelighet da den ble injisert i atlantisk laks, var derfor høyst overraskende. I tillegg er det meget oppmuntrende at vaksiner basert på antigent materiale fra denne varianten av viruset gir en utmerket beskyttelse mot etterfølgende infeksjon med salmonid alfavirus, også når vaksinen gis som en polyvalent vaksine omfattende ytterligere antigener. I tillegg har denne nylig oppdagede varianten av viruset gode vekstegenskaper ved vekst in vitro på kulturer av vertsceller.
Det vil forstås at kulturene med salmonid alfavirus som anvendes, hovedsakelig er fri for annet viralt eller mikrobielt materiale. Spesielt er kontaminering av virusisolater med IPNV en kilde til bekymring siden fisk infisert med salmonid alfavirus, ofte også er infisert med IPNV. I løpet av isoleringen av viruset kan det derfor være nødvendig å tilsette et antistoff rettet mot IPNV for å eliminere IPNV-viruset fra isolater eller kulturer av viruset. I kulturer av virus på vertsceller vil dette antistoffet hemme infeksjon av vertscellene med IPNV.
I et spesifikt og for tiden foretrukket tilfelle, som for øyeblikket er tiltenkt for anvendelse i Nord-Europa, inkludert Norge, omfatter sammensetningen:
i) inaktivert Salmonid alfavirus, slik som undertype SAV3 i en mengde tilsvarende 7,5x10<8 >- 5x10<9 >TCID50/ml (for å fortrinnsvis gi 3,75x10<7 >– 2,5x10<8 >TCID50/dose ved et doseringsvolum på 50 μl), fortrinnsvis 1x10<9 >- 5x10<9 >TCID50/ml (for å fortrinnsvis gi 0,5x10<8 >– 2,5x10<8 >TCID50/dose ved et doseringsvolum på 50 μl),
ii) inaktivert Aeromonas salmonicida i en mengde tilsvarende 0,9 -5x10<9 >celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose),
iii) inaktivert Vibrio. salmonicida i en mengde tilsvarende 0,9 -5x10<9 >celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose ved et doseringsvolum på 50 μl),
iv) inaktivert Vibrio anguillarum i en mengde tilsvarende 0,9 -5x10<9 >celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose ved et doseringsvolum på 50 μl),
v) inaktivert Moritella viscosa i en mengde tilsvarende 0,5 -5x10<9 >celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose ved et doseringsvolum på 50 μl),
vi) inaktivert infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) i en mengde tilsvarende 1,0-5,0x10<9 >PFU/ml levende virus (for å fortrinnsvis gi 0,5 – 2,5x10<8 >PFU/dose ved et doseringsvolum på 50 μl) eller 2-8 antigenenheter (AU)/ml (for å fortrinnsvis gi 0,2-0,8 antigenenheter/dose ved et doseringsvolum på 50 μl),
vii) en adjuvans, fortrinnsvis mineralolje; og
viii) en detergent og/eller emulgator.
I alternative tilfeller som for øyeblikket er tiltenkt for anvendelse i Sør-Amerika, inkludert Chile, omfatter sammensetningen:
i) inaktivert salmonid alfavirus, slik som undertype SAV3 i en mengde tilsvarende 7,5x10<8 >- 5x10<9 >TCID50/ml (for å fortrinnsvis gi 3,75x10<7 >– 2,5x10<8 >TCID50/dose ved et doseringsvolum på 50 μl), fortrinnsvis 1x10<9 >- 5x10<9 >TCID50/ml (for å fortrinnsvis gi 0,5x10<8 >– 2,5x10<8 >TCID50/dose ved et doseringsvolum på 50 μl),
ii) inaktivert Vibrio ordali i en mengde tilsvarende 0,9 -5x10<9 >celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose ved et doseringsvolum på 50 μl),
iii) inaktivert Piscirickettsia salmonis i en mengde tilsvarende 0,9 -5x10<9 >celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose ved et doseringsvolum på 50 μl),
iv) inaktivert infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) i en mengde tilsvarende 1,0-5,0x10<9 >PFU/ml levende virus (for å fortrinnsvis gi 0,5 – 2,5x10<8 >PFU/dose ved et doseringsvolum på 50 μl) eller 2-8 antigenenheter (AU)/ml (for å fortrinnsvis gi 0,2-0,8 antigenenheter/dose ved et doseringsvolum på 50 μl),
v) en adjuvans, fortrinnsvis mineralolje; og
vi) en detergent og/eller emulgator.
I andre alternative tilfeller som for øyeblikket er tiltenkt for anvendelse i Sørøst-Asia, omfatter sammensetningen:
i) inaktivert salmonid alfavirus, slik som undertype SAV3 i en mengde tilsvarende 7,5x10<8 >- 5x10<9 >TCID50/ml (for å fortrinnsvis gi 2,5x10<7 >– 2,5x10<8 >TCID50/dose ved et doseringsvolum på 50 μl), fortrinnsvis 1x10<9 >- 5x10<9 >TCID50/ml (for å fortrinnsvis gi 0,5x10<8 >– 2,5x10<8 >TCID50/dose ved et doseringsvolum på 50 μl),
ii) inaktivert Aeromonas hydrophila i en mengde tilsvarende 0,9 -5x10<9 >celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose ved et doseringsvolum på 50 μl),
iii) inaktivert Flavobacterium columnaris i en mengde tilsvarende 0,9 -5x10<9 >celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose ved et doseringsvolum på 50 μl),
iv) inaktivert Haphnia sp. i en mengde tilsvarende 0,9 -5x10<9 >celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose ved et doseringsvolum på 50 μl),
v) inaktivert infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) i en mengde tilsvarende 1,0-5,0x10<9 >PFU/ml (for å fortrinnsvis gi 0,5 – 2,5x10<8 >PFU/dose ved et doseringsvolum på 50 μl) eller 2-8 antigenenheter (AU)/ml (for å fortrinnsvis gi 0,2-0,8 antigenenheter/dose ved et doseringsvolum på 50 μl),
vi) en adjuvans, fortrinnsvis mineralolje; og
vii) en detergent og/eller emulgator.
Doseringsform
Det er også besrkevet en doseringsform av en sammensetning.
Selv om andre doseringsformer kan være overveid, inkludert faste doseringsformer basert på fiskefôr, er doseringsformen fortrinnsvis en flytende doseringsform, mer foretrukket en flytende doseringsform for injeksjon slik som intraperitoneal injeksjon. Når doseringsformen er beregnet for injeksjon, har den fortrinnsvis et volum på 25–200 μl, mer foretrukket et volum på 40–120 μl, slik som et volum på 90–110 μl eller 45–55 μl. For tiden er et doseringsvolum på 50 μl mest foretrukket av praktiske grunner.
I forbindelse med doseringsformen gjelder de samme preferansene med hensyn til doseringsvolum og antigeninnhold som beskrevet i forbindelse med sammensetningen.
Spesielt omfatter doseringsformen fortrinnsvis salmonid alfavirus i mengder tilsvarende 0,75 x 10<7>-0,5 x 10<10 >TCID50/dose, slik som fra 0,75 x 10<7>-2,5 x 10<9>, fra 0,75 x 10<7>-0,5 x 10<9>, fra 0,75 x 10<7>-2,5 x 10<8>, fra 0,75 x 10<7>-1 x 10<8>, fra 0,75 x 10<7>-4,5 x 10<7>, fra 0,75 x 10<7>-4 x 10<7>, fra 0,75 x 10<7>-3,5 x 10<7>, 0,75 x 10<7>-3 x 10<7>, 1,25 x 10<7>-0,5 x 10<10>, 2,5 x 10<7>-0,5 x 10<10>, 3,75 x 10<8>-0,5 x 10<10>, 0,5 x 10<9>-0,5 x 10<10>, 1,25 x 10<9>-0,5 x 10<10>, 2,5 x 10<9>-0,5 x 10<10>, 3,75 x 10<9>-0,5 x 10<10>, 1,25 x 10<7>-3,75 x 10<9>, 2,5 x 10<7>-2,5 x 10<19>, 2,5 x 10<7>-3,75 x 10<8>, 2,5 x 10<7>-3 x 10<8>, 2,5 x 10<7>-2,5 x 10<8>, 2,5 x 10<7>-2 x 10<8>, 2,5 x 10<7>-1,5 x 10<8>, 2,5 x 10<7>-1 x 10<8>, fra 2,5 x 10<7>-0,5 x 10<8>, 3 x 10<7>-3,5 x 10<8>, 3 x 10<7>-3 x 10<8>, 3 x 10<7>-2,5 x 10<8>, 3 x 10<7>-2 x 10<8>, 3 x 10<7>-1,5 x 10<8>, 3 x 10<7>-1 x 10<8>, 3 x 10<7>-0,5 x 10<8>, 3,5 x 10<7>-3,5 x 10<8>, 3,5 x 10<7>-3 x 10<8>, 3,5 x 10<7>-2,5 x 10<8>, 3,5 x 10<7>-2 x 10<8>, 3,5 x 10<7>-1,5 x 10<8>, 3,5 x 10<7>-1 x 10<8>, 3,5 x 10<7>-0,5 x 10<8>, 4 x 10<7>-3,5 x 10<8>, 3,75 x 10<7>-0,5 x 10<9>, 4 x 10<7>-3 x 10<8>, 4 x 10<7>-2,5 x 10<8>, 4 x 10<7>-2 x 10<8>, 4 x 10<7>-1,5 x 10<8>, 4 x 10<7>-1 x 10<8>, 4 x 10<7>-0,5 x 10<8>, 4,5 x 10<7>-3,5 x 10<8>, 4,5 x 10<7>-3 x 10<8>, 4,5 x 10<7>-2,5 x 10<8>, 4,5 x 10<7>-2 x 10<8>, 4,5 x 10<7>-1,5 x 10<8>, eller fra 4,5 x 10<7>-1 x 10<8>, 0,5 x 10<8>-3,75 x 10<9>, 3,73 x 10<7>-2,5 x 10<9>, 0,5 x 10<8>-0,5 x 10<9>, 0,5 x 10<8>-4 x 10<8>, 0,5 x 10<8>-2,5 x 10<8>, 0,5 x 10<8>-1,25 x 10<9>, 1,25 x 10<8>-0,5 x 10<9 >eller fra 2,5 x 10<8>-3,75 x 10<8 >TCID50/dose.
Vaksine
Det er ytterligere besrkevet en vaksine omfattende en sammensetning eller en doseringsform som definert over. Det skal forstås at alle trekk som beskrevet over også vil gjelde vaksinen.
Som fagmannen vil vite, kan flere metoder og måter for administrasjon av vaksiner være anvendbare i akvakultur. Det skal derfor forstås at vaksinen kan formuleres for administrasjon ved en rute valgt fra gruppen bestående av: intraperitoneal injeksjon, bad, nedsenking, intramuskulær injeksjon og oral administrasjon eller kombinasjoner herav.
Av bekvemmelighetshensyn foretrekkes det at vaksinen administreres til parr laks, fortrinnsvis parr på 10-60 gram. Som fagmannen vil innse, kan vaksinen imidlertid også administreres til laks i andre stadier, inklusive alle saltvannsstadier.
Som vist i eksemplene tilveiebringer sammensetningene ekstremt effektiv beskyttelse mot infeksjon av salmonid alfavirus ved testing i laboratorieutfordringsforsøk hvor de vaksinerte fiskene utfordres med høye titre av høyvirulente SAV3-isolater. I området hvor fisken eksponeres for mye lavere titre av viruset forventes det at beskyttende virkning av vaksinene tilveiebrakt er enda høyere enn det som er vist i foreliggende eksempler.
Medisinsk anvendelse/fremgangsmåte for profylakse
Det er også beskrevet en anvendelse av inaktivert salmonid alfavirus i fremstillingen av et medikament, f.eks. som en immunologisk sammensetning slik som en vaksine, og/eller doseringsform for administrasjon samtidig eller i kombinasjon med én eller flere antigene komponenter valgt fra gruppen bestående av:
a) en drept bakterie,
b) et inaktivert virus som ikke er et salmonid alfavirus,
c) en sopp,
d) en parasitt og
e) et antigent og/eller immunogent materiale avledet fra nevnte bakterie i a), fra nevnte virus i b), fra nevnte sopp i c) eller fra nevnte parasitt i d).
Det skal derfor forstås at den nevnte doseringsformen fortrinnsvis inneholder inaktiverte salmonid alfavirus i en mengde som tilsvarer minst 3,75 x 10<7 >TCID50/dose. Likeledes foretrekkes det at nevnte vaksine / immunologiske sammensetning inneholder inaktivert salmonid alfavirus i en mengde som tilsvarer minst 7,5 x 10<8 >TCID50/ml.
Det er også beskrevet en anvendelse av et inaktivert salmonid alfavirus i fremstillingen av en vaksine eller en immunologisk sammensetning som er kompatibel med andre immunologiske produkter, hvori vaksinen omfatter inaktivert salmonid alfavirus i en mengde som tilsvarer minst 7,5 x 10<8 >TCID50/ml (tilsvarende 3,75 x 10<7 >TCID50/dose med et doseringsvolum på 50 μl).
Sammensetningen som beskrevet over er også for anvendelse i medisin. Spesielt kan sammensetningen være for anvendelse i forebygging, eller for å redusere forekomsten av fiskepankreatisk sykdom eller, sagt på en annen måte, for anvendelse i forebygging eller reduksjon av forekomsten av infeksjon av salmonid alfavirus. Det er også beskrevet en vaksine i henhold til enhver av trekkene beskrevet over for anvendelse i forebygging eller reduksjon av forekomsten av fiskepankreatisk sykdom.
Andre aspekter av oppfinnelsen tilveiebringer en vaksine som beskrevet over for anvendelse i forebygging eller reduksjon av forekomsten av infeksjon med salmonid alfavirus. Det vurderes om en polyvalent vaksine basert på en sammensetning som omfatter en kombinasjon av virale, bakterielle, fungale og/eller parasittiske antigener som beskrevet over, kan gi en vellykket tilnærming for å kontrollere infeksjoner med en hvilken som helst av de for tiden kjente gruppene av salmonid alfavirus, SAV1, SAV2, SAV3, SAV4, SAV5 og SAV6.
Ytterligere beskrivelser vedrører anvendelsen av en sammensetning som beskrevet over for fremstillingen av et medikament/vaksine for å forebygge eller redusere forekomsten av infeksjon med salmonid alfavirus.
Enda ytterligere beskrivelser vedrører anvendelsen av en sammensetning som beskrevet over for fremstillingen av et medikament/vaksine for å forebygge eller redusere forekomsten av fiskepankreatisk sykdom og/eller sovesyke. I enda en annen beskrivelse tilveiebringes en fremgangsmåte for å redusere forekomsten av og/eller behandle eller forebygge infeksjon med salmonid alfavirus i en fiskepopulasjon, der fremgangsmåten omfatter å administrere en sammensetning, vaksine eller doseringsform som definert over til fisken.
Fremgangsmåte for å lage en vaksine
Det beskrives også en fremgangsmåte for å fremstille en sammensetning og/eller vaksine og/eller doseringsform som definert over. Fremgangmåten omfatter å kombinere et fortrinnsvis svekket eller inaktivert salmonid alfavirus eller et antigent og/eller immunogent materiale avledet derav med én eller flere komponenter valgt fra gruppen bestående av:
a. en levende, svekket, drept eller inaktivert bakterie,
b. et virus som ikke er salmonid alfavirus, nevnte virus er fortrinnsvis svekket eller inaktivert,
c. en sopp,
d. en parasitt og
e. et antigent og/eller immunogent materiale avledet fra nevnte bakterie i a), fra nevnte virus i b), fra nevnte sopp i c) eller fra nevnte parasitt i d).
Fortrinnsvis justeres mengden med salmonid alfavirus for å tilveiebringe en sammensetning eller vaksine som omfatter minst 7,5 x 10<8 >TCID50/ml inaktivert salmonid alfavirus eller en doseringsform som omfatter minst 2,5 x 10<7 >TCID50/dose.
I denne sammenheng er fortrinnsvis de virale, bakterielle, fungale og parasittiske antigenkomponentene som spesifisert over, avhengig av fiskepatogenene som er utbredt i området hvor vaksinen skal anvendes.
Siden det salmonide alfaviruset må dyrkes på kulturer av vertsceller kan fremgangsmåten i henhold til beskrivelsen videre omfatte
a. etablering av en kultur med vertsceller;
b. infisering av vertscellene med et isolat av et virus av salmonid alfavirus og c. dyrking av infiserte celler under betingelser som tillater nevnte virus å nå en titer i supernatanten/vekstmediet på minst 7,5 x 10<8 >TCID50/ml, slik som minst 1 x 10<9>, 5 x 10<9>, 1 x 10<10 >eller minst 5 x 10<10 >TCID50/ml.
I fremgangsmåten dyrkes vertscellene enten på et fast medium eller som suspensjonskulturer.
For å gi optimale vekstbetingelser dyrkes vertscellene fortrinnsvis ved en pH mellom 6,5 og 8,5, slik som mellom 7,0 og 8,0, mellom 7,2 og 8,0, mellom 7 og 7,5 eller mellom 7,2 og 7,5.
Fremgangsmåten er utviklet for det spesielle formålet å produsere den salmonid alfavirus vaksinekomponenten i store mengder. Derfor er prosessen i de for øyeblikket foretrukne trekkene tilpasset for å produsere salmonid alfavirusmateriale i batcher på 25–2000 liter, slik som 25–1000 liter, 50–2000 liter, 50–1000 liter eller 50–500 liter.
Det er et videre særpreg ved fremgangsmåten i visse tilfeller at vertscellene sås med en tetthet på 0,1-1,5 x 10<5 >celler cm<-2>, 0,2-1,5 x 10<5 >celler cm<-2>, 0,2-1,25 x 10<5 >celler cm<-2>, 0,2-1 x 10<5 >celler cm<-2 >eller 0,2-1 x 10<5 >celler cm<-2 >når de dyrkes på en fast bærer.
I henhold til videre beskrivelse dyrkes vertscellene i 3–8 dager før virusinfisering, slik som fra 4–8 dager, 4–7 dager eller fra 4–6 dager.
I enda videre beskrivelser dyrkes nevnte vertsceller til en tetthet på 8 x 10<5 >celler cm<-2 >på infiseringstidspunktet med nevnte virusisolat.
Spesielt kan vertscellene dyrkes til en tetthet på fra 5 x 10<5 >celler cm<-2 >til 5 x 10<6 >celler cm<-2 >på infiseringstidspunktet med nevnte virusisolat.
Hva gjelder vekstmediet kan det være fortrukket at vertscellene dyrkes i et vekstmedium valgt fra gruppen bestående av EMEM (EBSS)+ 10 % føtalt bovint serum (FBS) 2 mM L-glutamin 1 % ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) 0,1 % gentamicin.
Etter infisering av cellene dyrkes de infiserte cellene fortrinnsvis ved en temperatur fra 12-16 ºC, slik som ved en temperatur på 13-16 ºC, 13-15 ºC, 14-16º C eller 14-15 ºC, og i en periode på 6-20 dager, slik som en periode på 8-20 dager, 8-18 dager, 8-16 dager, 9-20 dager, 9-18 dager, 9-16 dager, 10-20 dager, 10-18 dager, 10-16 dager eller 10-14 dager.
Dessuten kan det være foretrukket at de infiserte cellene dyrkes inntil 30 % av vertscellene er lysert eller har løsnet, slik som inntil 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % eller 90 % av vertscellene er lysert eller har en cytopatogen effekt bestående av avrundede celler.
Som forklart over kan det være foretrukket at nevnte salmonide alfavirus er et virus av SAV3-undertypen.
Hva gjelder vertscellene velges disse fortrinnsvis fra gruppen bestående av celler avledet fra hjertevev fra unge chum-laks (Onchorhynchus keta), celler avledet fra Chinook-laks (Oncorhynchus tshawytscha)-embryo.
Mer spesielt er det foretrukket å bruke vertsceller som velges fra gruppen bestående av CHH-1-celler og CHSE-214-celler, CHH-1-celler er tilgjengelige fra ATCC under deponeringsnummer CRL-1680, CHSE-214-celler er tilgjengelige fra ATCC, deponeringsnummer CRL 1681 og fra ECACC under deponeringsnummer 91041114.
Bakterielle antigener til bruk i polyvalente vaksiner kan fremstilles ved å bruke konvensjonelle teknikker, f.eks. ved å dyrke bakteriene i tryptisk soyabuljong med 2 % NaCl ved 12-15 <o>C, eller i hjerne/hjerte-infusjonsbuljong med 3 % NaCl ved 12-15 <o>C (Atlas, RM,2004, Handbook of Microbiological Media, tredje utgave, CRC press, side 1820 og 246).
Hva gjelder infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) kan dette viruset propageres i den hensikt å fremstille en vaksine i CHSE-214-celler i henhold til Dobos P og Roberts TE, 1982, Canadian Journal of Microbiology, 29, 377 – 384.
Dyrkingen av disse representative patogenene er også beskrevet på http://www.lgcpromochem-atcc.com/.
Det er videre beskrevet en fremgangsmåte for å forbedre en polyvalent vaksine. Fremgangsmåten omfatter å inkludere (en immunogen mengde av) et svekket eller inaktivert salmonid alfavirus i den polyvalente vaksinen. I en beskrivelse omfatter den polyvalente vaksine én eller flere komponenter valgt fra gruppen bestående av:
a. en levende, svekket, inaktivert eller drept bakterie,
b. et virus som ikke er salmonid alfavirus, nevnte virus er fortrinnsvis svekket eller inaktivert,
c. en sopp,
d. en parasitt og
e. et antigent og/eller immunogent materiale avledet fra nevnte bakterie i a), fra nevnte virus i b), fra nevnte sopp i c) eller fra nevnte parasitt i d).
I forbindelse med denne fremgangsmåten gjelder samme preferanser i forhold til doseringsvolum og antigeninnhold som beskrevet i forbindelse med sammensetningen.
Et eksempel på en slik polyvalent vaksine som fordelaktig kunne forbedres ved å inkludere et antigenpreparat av salmonid alfavirus, er AJ 6-2 allerede markedsført av den nåværende søkeren.
Det bør bemerkes at utførelsesformer og trekk beskrevet i sammenheng med ett av aspektene av foreliggende oppfinnelse også gjelder for de andre aspektene av oppfinnelsen.
Alle patent- og ikke-patentreferanser sitert i foreliggende søknad innlemmes herved ved referanse i sin helhet.
Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet i ytterligere detaljer i de følgende ikkebegrensende eksemplene.ju
Eksempler
Eksempel 1: Isolasjon av PD-virus fra fisk med klinisk PD-infeksjon (ALV-405, ALV 406 og ALV-407)
Materialer
Organmateriale
Hjerter ble tatt fra fisk med kliniske symptomer på pankreassykdom i kommersielle fiskeoppdrettsanlegg. Hjertene ble holdt kalde ved 4 <º>C.
Cellekulturer
● CHH-1, 145. passasje
● CHSE-214, 36. passasje
● GF-1, 4. passasje
Celler ble sådd to – tre dager før bruk.
Vekstmedia
● CHH-1-vekstmedium: EMEM (Sigma M7278), 10 % FBS (Sigma F-3885), 1 % L-glutamin (Sigma G-7513), 1 % NEAA (Sigma M-7145), 0,1 % gentamicin (Sigma G1397).
● CHSE-214-vekstmedium: EMEM (Sigma M7278), 10 % FBS (Sigma F-3885), 1 % L-glutamin (Sigma G-7513), 0,1 % gentamicin (Sigma G1397). ● GF-1 vekstmedium: L-15 (Sigma L-5520 lot), 10 % FBS (Sigma F-3885), 1 % L-glutamin (Sigma G-7513), 0,1 % gentamicin (Sigma G1397).
Filter:
Minisart plus (Sartorius #17829)
Anti-IPNV-antistoffer: Kanin-anti-IPNV-antiserum (CP54/1996)
Hjerter fra atlantisk laks ble homogenisert ved bruk av en porselensmorter og kvartssand med noe tilsatt medium (ca 8-20 ml). Homogenatet ble sentrifugert ved 2000 x g i 10 minutter ved 4 <o>C før filtrering gjennom et sprøytefilter på 0,45 μm. Homogenatene ble fordelt i kryoflasker og frosset ved –80 <o>C.
Prøver av noen av organhomogenatene ble blandet 1:100 med anti-IPNV-antiserum og inkubert i to timer ved 15 °C. Deretter ble 50-200 μl homogenat med eller uten tilsatt anti-IPNV-antiserum inokulert i de forskjellige cellekulturene (50-90 % konfluent) i 75/175 cm<2 >Nunc-celleflasker med 15/50 ml av passende medium i henhold til tabell 1.
Ved passering av viruset i nye cellekulturer ble 1 ml supernatant overført til nye cellekulturflasker.
Tabell 1
,++,+++ betegner gradene av cytopatogen effekt observert i cellene
X X dpi; x x dager etter infisering når cytopatogen effekt ble observert i cellene X : X x 10 <x >TCID50 Titreringsresultat av supernatant fra den spesifikke flasken.
Konklusjoner
● SAV3 ble isolert fra hjerter samlet fra atlantisk laks med pankreassykdom ● Cytopatogen effekt var synlig i cellekulturene fra passasje 1
● Passasje 1-SAV3-isolatene hadde en titer på opptil 1,3 x 10<8 >TCID50 ● SAV3 kan isoleres i passasje 1 på flere forskjellige cellelinjer
Eksempel 2: Identitetstest for SAV3, og test for fravær av IPNV i SAV3-isolater
For å bekrefte identiteten til forskjellige isolater av SAV3 og for å teste dem for fravær av infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), ble en revers transkripsjonkvantitativ PCR (RTQPCR)-prosedyre som bruker primere spesifikke for SAV og IPNV anvendt.
Materialer
Virusisolater: ALV-405 p5 og p6, ALV 407 p1, ALV 408 p1, ALV 4091pA og 1pB (to separate isolasjoner). Positiv kontroll: IPNV ALV 103.
RNA-isolasjon: QIAamp Viral RNA Mini Spin Protocol
Revers transkripsjon og QPCR: Brilliant® II QPCR og QRT-PCR-reagenser fra Stratagene.
Tabell 2: Primere
RT-PCR-betingelser:
IPNV-test: 50 <o>C, 30 min – 95 <o>C, 10 min –(95 <o>C, 30 sek - 57 <o>C, 60 sek - 72 <o>C, 30 sek)*40
SAV3-test: 50 <o>C, 30 min - 95 <o>C, 10 min –(95 <o>C, 30 sek - 57 <o>C, 60 sek -72 <o>C,30 sek)*40
Resultater: Alle SAV3-isolater var positive i SAV RT-QPCR og negative i IPNV RT-QPCR. Disse testene viser at alle SAV3-isolatene virkelig er SAV og ikke kontaminert med IPNV.
Eksempel 3: Titrering av salmon pancreas disease virus ved bruk av ulike cellelinjer.
SAV3 ble titrert på to ulike cellelinjer; CHH og CHSE som beskrevet i henholdsvis eksempel 4 og 5. TCID50-verdiene oppnådd med de to cellelinjene vises i tabell 3. CHH-cellelinjen er ca. dobbelt så sensitiv for viruset som CHSE-cellelinjen.
Tabell 3:
Eksempel 4: Dyrking av SAV3 i CHH-1-cellekulturflasker med høy celletetthet.
Intensjon
Hensikten var å evaluere potensielle PD-utbytter for forskjellige virusisolater i CHH-1-cellekulturflasker med høy celletetthet.
Materialer og fremgangsmåter
Cellekulturer og vekstmedier
3 x 175 cm<2 >flasker, CHH-1, 160. passasje med 100 x 10<6 >celler pr. flaske (5,7 x 10<5 >C/cm<2>)
CHH-1-vekstmedium: EMEM (Sigma M7278), 10 % FBS (Invitrogen), 1 % L-glutamin (Sigma G-7513), 1 % NEAA (Sigma M-7145), 0,1 % gentamicin (Sigma G1397).
Virus/infeksjonsmateriale
ALV-405, p6, titer: 5,01 x 10<8 >TCID50/ml
ALV-407, p1, titer: 3,41 x 10<7 >TCID50/ml
ALV-407, p4, titer: 4,14 x 10<7 >TCID50/ml
Tabell 4. Cellekulturer og eksperimentelle data.
Rett før infisering ble vekstmediet i flaskene erstattet med 50 ml friskt vekstmedium, og deretter ble de respektive infeksjonsmaterialene tilsatt (tabell 1). Alle flasker ble inkubert ved 15 °C med tett lukkede korker.
Prøvetaking, titrering og mikroskopiske observasjoner
Mikroskopiske observasjoner og titrering av prøver ble utført 7, 10, 13 og
18 dager pi på CHH-1.
Resultater/diskusjon
Mikroskopiske observasjoner
Løsning og avrunding av celler viste seg ca. en uke pi i alle flasker. Ved slutten av observasjonsperioden (18 dager pi) hadde flaske 2 mest fremtredende CPE med 80 % av cellene løsnet mens flaske 1 og 3 hadde henholdsvis 20 % og 40 % løsnede celler.
Titreringsresultater
De tre isolatene/passasjene hadde alle titre på 10<9 >TCID50/ml eller høyere.
Overraskende var utbyttene høyest i flasken infisert med den 1. passasjen av ALV-407 (figur 1, ALV-407 p2), men denne flasken hadde også den mest fremtredende CPE. Resultatene bekrefter at CHH-1-celler frembringer høye SAV3-utbytter også fra virusstammer med få passasjer. Resultater er vist i figur 1.
Konklusjoner
● De høyeste utbyttene var 1,78 x 10<9 >TCID50/ml i en prøve oppnådd 13 dager etter inokulasjon med ALV-407 p1 ved MOI 0,2.
● Fremstilling av SAV3 med få passasjer i CHH-1-celler gir et godt utbytte av SAV3.
Eksempel 5: Dyrking av SAV3 i CHSE-celler.
Intensjon
Hensikten var å evaluere de potensielle SAV3-utbyttene for forskjellige virusstammer i CHSE-214-cellekulturer.
Materialer og fremgangsmåter
Cellekultur og vekstmedium
● CHSE-214: 19. passasje med ca. 80 % konfluens.
● CHSE-214 vekstmedium: EMEM (Sigma M7278), 10 % FBS (Invitrogen), 1 % L-glutamin (Sigma G-7513), 0,1 % gentamicin (Sigma G1397).
Virusstamme
● ALV-404, 8p.
Tabell 5. Cellekulturer og eksperimentelle data. Alle flasker var 75 cm<2>, hadde 20 ml vekstmedium og var inokulert med 100 µl av virusstammen.
Flaskene ble avkjølt til 15 °C før de ble infisert uten endring av medium. Alle flasker ble inkubert ved 15 °C med tett lukkede korker.
Prøver av virussåmaterialene ble titrert på 96-brønns plater.
Mikroskopisk observasjon og titrering av prøver fra alle flasker ble utført 6, 12, 15, 20 og 27 dager pi.
Resultater/diskusjon
Mikroskopiske observasjoner
Infeksjonen (lysering og løsning av celler) utviklet seg raskt i CHSE-kulturene, med mer enn 90 % lysering 12 dager pi. Prøver fra de to flaskene ble samlet og titrert på 96-brønns plater på dag 6, 12, 15, 20 og 27 dager etter infisering.
Gjennomsnittsverdiene fra de to parallelle flaskene er vist i figur 2.
Dette eksperimentet viser at CHSE-214 er en passende cellelinje for produksjon av SAV3 siden høye virustitre produseres fra stammer av SAV3 med få passasjer.
Eksempel 6: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved bruk av en polyvalent vaksine omfattende SAV3
Foreliggende eksempel presenterer en multivalent vaksine mot pankreassykdom basert på salmonid alfavirus undertype 3-antigent materiale og viser utmerket beskyttelse i en eksperimentell utfordringsmodell med høy dødelighet i den uvaksinerte kontrollgruppen.
Tabell 6: Hovedtrekk ved eksperimentet
Atlantisk unglaks (parr) med en gjennomsnittsvekt på 25,7 gram ble vaksinert med 0,1 ml av en polyvalent vann-i-olje vaksine. Vaksinen inneholdt inaktivert antigen fra følgende patogener:
Tabell 7: Vaksinekomponenter
Alle komponentene ble inaktivert ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 <º>C.
Tabell 8: Merking og vaksinasjon
Etter smoltifisering ble fisken fordelt i to tanker inneholdende sjøvann (25 ‰) og utfordret ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt ALV-407. Utfordringsdosen var 5,36 x 10<8 >TCID50 pr fisk. I utfordringstankene nådde dødeligheten 86 % i kontrollgruppen i tank 1 og 66 % i tank 2, mens ingen dødelighet ble registrert i gruppene vaksinert med den polyvalente vaksinen som beskytter mot salmonid pankreassykdom. Resultater vises i figur 3. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine virkelig kan beskytte mot salmonid pankreassykdom.
Eksempel 7: Dose/respons – vaksinasjon med monovalent og polyvalent SAV3-vaksine.
Foreliggende eksempel presenterer et dose–responseksperiment med monovalent og multivalent vaksine mot pankreassykdom.
Tabell 9: Hovedtrekk ved eksperimentet
Atlantisk unglaks (parr) med en gjennomsnittsvekt på 25,7 gram ble vaksinert med 0,1 ml av en polyvalent vann-i-olje vaksine. Vaksinen inneholdt inaktivert antigen fra følgende patogener:
Tabell 10: Vaksinekomponenter, multivalente vaksiner.
Tabell 11: Vaksinekomponenter, monovalente vaksiner.
Alle komponentene ble inaktivert ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 <º>C.
Merking og vaksinasjon
For hver gruppe ble 40 fisk merket ved klipping av finnen og vaksinert med 0,05 ml vaksine eller 0,05 ml PBS og etterlatt for immunisering og smoltifisering. Etter smoltifisering ble fisken fordelt i to tanker inneholdende sjøvann (25 ‰) og utfordret ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt ALV-407. Utfordringsdosen var 6,5 x 10<8 >TCID50 pr fisk.
Resultater:
Tabell 12:
I utfordringen ga den polyvalente vaksinen bedre beskyttelse enn den monovalente vaksinen ved de laveste antigendosene. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine med et PD-antigeninnhold på 1 x 10<9 >TCID50 /ml effektivt kan beskytte mot salmonid pankreassykdom når den gis i doser på 0,5 x 10<8 >TCID50 /dose. Ettersom vaksinen gir noe beskyttelse mot senere infeksjon, selv når den gis i doser på 10<6 >TCID50, er det rimelig å konkludere med at en tilfredsstillende grad av beskyttelse også kan oppnås når vaksinen administreres i doser som inneholder noe mindre enn 0,5 x 10<8 >TCID50 /dose.
Eksempel 8: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved bruk av en polyvalent vaksine omfattende SAV1
Foreliggende eksempel presenterer en multivalent vaksine mot pankreassykdom inneholdende SAV1-antigent materiale. Vaksinen viser god beskyttelse i en eksperimentell utfordringsmodell med høy dødelighet i den uvaksinerte kontrollgruppen.
Et isolat av salmonid alfavirus undertype 1 isoleres fra utbrudd av pankreatisk sykdom i atlantisk laks i Skottland. SAV1-antigent materiale fremstilles fra en kultur med dette viruset, dyrket på CHSE-celler i henhold til en lignende prosedyre som beskrevet i foregående eksempler.
En vaksine inneholdende de følgende komponentene fremstilles:
Tabell 13: Vaksinekomponenter
SAV1-viruset ble inaktivert ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 <º>C.
Vaksinen administreres til atlantisk unglaks (parr). Fisken vaksineres og merkes, og vaksinert fisk og kontrollfisk smoltifiseres deretter som beskrevet i foregående eksempel.
Etter smoltifisering fordeles fisken i tanker inneholdende sjøvann (25 ‰) og utfordres ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt SAV3. Utfordringsdosen er 3-6 x 10<8 >TCID50 pr fisk. Dette eksperimentet viser at polyvalent vaksine omfattende salmonid alfavirus type 1-antigent materiale virkelig kan beskytte mot salmonid pankreassykdom SAV3.
Eksempel 9: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved anvendelse av en vaksine omfattende SAV1
Foreliggende eksempel presenterer en multivalent vaksine mot pankreassykdom inneholdende SAV1-antigent materiale. Vaksinen viser god beskyttelse i en eksperimentell utfordringsmodell med høy dødelighet i den uvaksinerte kontrollgruppen.
Et isolat av salmonid alfavirus undertype 1 isoleres fra utbrudd av pankreatisk sykdom i atlantisk laks i Skottland. SAV1-antigent materiale ble fremstilt fra en kultur av dette viruset i henhold til en lignende prosedyre som beskrevet i foregående eksempler.
En vaksine inneholdende de følgende komponentene ble fremstilt:
Tabell 14: Vaksinekomponenter
Vaksine A:
Vaksine B og C:
SAV1-viruset ble inaktivert ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 <º>C. Vaksinene ble formulert som vann-i-olje-emulsjoner ved å anvende standardmetoder.
60 fisk ble merket ved finneklipping og vaksinert med 0,05 ml vaksine eller 0,05 ml PBS og etterlatt for immunisering og smoltifisering som beskrevet i foregående eksempel.
Etter smoltifisering ble fisken fordelt i en tank inneholdende sjøvann (25 ‰) og utfordret ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt SAV3. Utfordringsdosen var 3,01 x 10<8 >TCID50 pr fisk.
Tabell 15: Resultater.
Dødeligheten i kontrollgruppen nådde 70 %, mens dødeligheten i gruppen vaksinert med en polyvalent vaksine omfattende 2 x 10<9 >TCID50 /ml inaktivert SAV1, nådde 3,3 %, noe som gir en relativ overlevelsesprosent på 95,2. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine omfattende salmonid alfavirus type 1-antigent materiale virkelig kan beskytte mot salmonid pankreassykdom. I dette eksperimentet er SAV1-antigendosen doblet sammenlignet med den monovalente SAV1 vaksine C, og det er en økning i observert RPS. Dette antyder at den samme antigendosen kan anvendes i polyvalente PD-vaksiner som fremkaller den samme beskyttelsen som monovalente PD-vaksiner. Dette er i motsetning til konvensjonell kunnskap på området for fiskevaksinologi.
Eksempel 10: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved bruk av en polyvalent vaksine omfattende SAV2
Foreliggende eksempel presenterer en multivalent vaksine mot pankreassykdom inneholdende SAV2-antigent materiale. Vaksinen viser god beskyttelse i en eksperimentell utfordringsmodell med høy dødelighet i den uvaksinerte kontrollgruppen.
Et isolat av salmonid alfavirus undertype 2 isoleres fra utbrudd av sovesyke hos regnbueørret oppdrettet i ferskvann i Frankrike. SAV2-antigent materiale fremstilles fra en kultur av dette viruset dyrket på CHSE-celler i henhold til en lignende prosedyre som beskrevet i foregående eksempler.
En vaksine inneholdende de følgende komponentene fremstilles:
Tabell 16: Vaksinekomponenter
SAV2-viruset inaktiveres ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 <º>C.
Vaksinen administreres til atlantisk unglaks (parr). Fisken vaksineres og merkes, og vaksinert fisk og kontrollfisk smoltifiseres deretter som beskrevet i foregående eksempel.
Etter smoltifisering fordeles fisken i tanker inneholdende sjøvann (25 ‰) og utfordres ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt SAV3. Utfordringsdosen er 3-6 x 10<8 >TCID50 pr fisk. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine omfattende salmonid alfavirus type 2-antigent materiale virkelig kan beskytte mot etterfølgende infeksjon med salmonid alfavirus SAV3.
Eksempel 11: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved bruk av en polyvalent vaksine omfattende SAV3
Foreliggende eksempel presenterer en multivalent vaksine mot pankreassykdom inneholdende SAV3-antigent materiale. Vaksinen viser god beskyttelse i en eksperimentell utfordringsmodell med høy dødelighet i den uvaksinerte kontrollgruppen.
Et isolat av salmonid alfavirus undertype 3 isoleres fra utbrudd av pankreatisk sykdom i atlantisk laks i Skottland. SAV3-antigent materiale fremstilles fra en kultur av dette viruset dyrket på CHSE-celler i henhold til en lignende prosedyre som beskrevet i foregående eksempler.
En vaksine inneholdende de følgende komponentene fremstilles:
Tabell 17: Vaksinekomponenter
SAV3-viruset ble inaktivert ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 <º>C. Bakterielle antigener ble inaktivert ved tilsetting av 4 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 1,5 timer ved en temperatur på 20 <º>C.
En vann-i-olje-emulsjon lages i henhold til standardmetoder.
Vaksinen administreres til atlantisk unglaks (parr). Fisken vaksineres og merkes, og vaksinert fisk og kontrollfisk smoltifiseres deretter som beskrevet i foregående eksempel.
Etter smoltifisering fordeles fisken i tanker inneholdende sjøvann (25 ‰) og utfordres ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt SAV3. Utfordringsdosen er 3-6 x 10<8 >TCID50 pr fisk. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine omfattende salmonid alfavirus antigent materiale og flere bakterielle antigener virkelig kan beskytte mot salmonid pankreassykdom.
Eksempel 12: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved bruk av en polyvalent vaksine omfattende SAV3
Foreliggende eksempel presenterer en multivalent vaksine mot pankreassykdom inneholdende SAV3-antigent materiale. Vaksinen viser god beskyttelse i en eksperimentell utfordringsmodell med høy dødelighet i den uvaksinerte kontrollgruppen.
Et isolat av salmonid alfavirus undertype 3 isoleres fra utbrudd av pankreatisk sykdom i atlantisk laks i Skottland. SAV3-antigent materiale fremstilles fra en kultur av dette viruset dyrket på CHSE-celler i henhold til en lignende prosedyre som beskrevet i foregående eksempler.
En vaksine inneholdende de følgende komponenter fremstilles:
Tabell 18: Vaksinekomponenter
SAV3-virus ble inaktivert ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 <º>C. Bakterielle antigener ble inaktivert ved tilsetting av 4 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 1,5 timer ved en temperatur på 20 <º>C.
En vann i oljeemulsjon lages i henhold til standardmetoder.
Vaksinen administreres til atlantisk unglaks (parr). Fisken vaksineres og merkes, og vaksinert fisk og kontrollfisk smoltifiseres deretter som beskrevet i foregående eksempel.
Etter smoltifisering fordeles fisken i tanker inneholdende sjøvann (25 ‰) og utfordres ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt SAV3. Utfordringsdosen er 3-6 x 10<8 >TCID50 pr fisk. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine omfattende salmonid alfavirus antigent materiale og flere bakterielle antigener virkelig kan beskytte mot salmonid pankreassykdom.
Eksempel 13: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved bruk av en polyvalent vaksine omfattende SAV3
Foreliggende eksempel presenterer en multivalent vaksine mot pankreassykdom inneholdende SAV3-antigent materiale. Vaksinen viser god beskyttelse i en eksperimentell utfordringsmodell med høy dødelighet i den uvaksinerte kontrollgruppen.
Et isolat av salmonid alfavirus undertype 3 isoleres fra utbrudd av pankreatisk sykdom i atlantisk laks i Skottland. SAV3-antigent materiale fremstilles fra en kultur av dette viruset dyrket på CHSE-celler i henhold til en lignende prosedyre som beskrevet i foregående eksempler.
En vaksine inneholdende de følgende komponentene fremstilles:
Tabell 19: Vaksinekomponenter
SAV3-viruset inaktiveres ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 <º>C. Bakterielle antigener ble inaktivert ved tilsetting av 4 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 1,5 timer ved en temperatur på 20 <º>C.
En vann-i-olje-emulsjon lages i henhold til standardmetoder.
Vaksinen administreres til atlantisk unglaks (parr). Fisken vaksineres og merkes, og vaksinert fisk og kontrollfisk smoltifiseres deretter som beskrevet i foregående eksempel.
Etter smoltifisering fordeles fisken i tanker inneholdende sjøvann (25 ‰) og utfordres ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt SAV3. Utfordringsdosen er 3-6 x 10<8 >TCID50 pr fisk. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine omfattende salmonid alfavirus antigent materiale og Montanid ISA 736 B virkelig kan beskytte mot salmonid pankreassykdom.
Kvitteringer for deponeringer av mikroorganismer:
Health Protection Agency, Porton Down and
European Collection of Cell Cultures
This document certifies that
Virus Salmon Alphavirus 3 ALV-407 Deposit Reference 07121202
has been accepted as a patent deposit, in accordance with The Budapest Treaty of 1977,
with the European Collection of Cell Cultures on
12 December 2007
Health Protection Agency, Porton Down and
European Collection of Ceil Cultures
This document certifies that
Virus Salmon alphavirus 3 ALV-409 Deposit Reference 07121203
has been accepted as a patent deposit, in accordance with The Budapest Treaty of 1977,
with the European Collection of Cell Cultures on
12 December 2007
Health Protection Agency, Porton Down and
European Collection of Cell Cultures
This document certifies that
Virus HEART & SKELETAL MUSCLE INFLAMMATION VIRUS (HSMI) Deposit Reference 04050401 has been accepted as a patent deposit, in accordance with The Budapest Treaty of 1977, with the European Collection of Cell Cultures on
04 May 2004
Health Protection Agency, Porton Down and
European Collection of Cell Cultures
This document certifies that
Virus Cardiomyopathy syndrome virus (CMS) Deposit Reference 07032902
has been accepted as a patent deposit, in accordance with
The Budapest Treaty of 1977,
with the European Collection of Cell Cultures on
29 March 2007
Health Protection Agency, Porton Down and
European Collection of Cell Cultures
This document certifies that
Bacteria AL10005
Deposit Reference 06050901
has been accepted as a patent deposit, in accordance with The Budapest Treaty of 1977,
with the European Collection of Cell Cultures on 09 May 2006
Health Protection Agency, Porton Down and
European Collection of Cell Cultures
This document certifies that
Bacteria AL10007
Deposit Reference 06050902
has been accepted as a patent deposit, in accordance with The Budapest Treaty of 1977,
with the European Collection of Cell Cultures on 09 May 2006
Health Protection Agency, Porton Down and
European Collection of Cell Cultures
This document certifies that
Bacteria AL 10008
Deposit Reference 06050903
has been accepted as a patent deposit, in accordance with The Budapest Treaty of 1977,
with the European Collection of Cell Cultures on 09 May 2006
Health Protection Agency, Porton Down and
European Collection of Cell Cultures
This document certifies that
Bacteria Piscirickettsia salmonis Deposit Reference 07032110
has been accepted as a patent deposit, in accordance with The Budapest Treaty of 1977,
with the European Collection of Cell Cultures on 21 March 2007
Referanser
Aguilar JC og Rodriguez EG (2007), Vaccine adjuvants revisited, Vaccine 2007, 25, 3752 - 3762, 2007.
Alderborn G og Aulton M (2002) Pharmaceutics; The Science of Dosage Form Design, 2002, Elsevier Science
Castric J, baudin Laurencin F, Bremont M, jeffroy J, Le Ven A og Bearzotti M (1997) Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 17, 27-30, 1997.
Boucher P og Baudin Laurencin F (1994) Sleeping disease (SD) of salmonids, Bull of the European Association of Fish Pathologists, 14, 179-180
Castric J, baudin Laurencin F, Bremont M, jeffroy J, Le Ven A og Bearzotti M (1997) Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 17, 27-30, 1997.
Christie KE, Koumans JTM, Fyrand K, Goovaerts D og Rødseth OM (1999A) Vaccination against pancreas disease in Atlantic salmon (Salmo salar L). IXth International Conference of the European Association of Fish Pathologists, Rohdes, September 1999, muntlig presentasjon med sammendrag
Christie KE, Fyrand K og Rødseth OM (1999B) Vaksine mot pancreas disease hos laks og ørret, møte Frisk Fisk, Tromsø januar 1999, muntlig presentasjon med sammendrag.
Hodneland K, Bratland A, Christie KE, Endresen C, Nylund A. (2005), New subtype of salmonid alphavirus (SAV), Togaviridae, from Atlantic salmon Salmo salar and rainbow trout Oncorhynchus mykiss in Norway, Dis Aquat Organ. 2005 Sep 5;66(2):113-20 (Rettelser i: Dis Aquat Organ. 2005 Nov 9; 67(1-2):181).
Intervet Newsletter, March 2002.
López-Dóriga MV, Smail DA, Smith RJ, Doménech A, Castric J, Smith PD, Ellis AE. Isolation of salmon pancreas disease virus (SPDV) in cell culture and its ability to protect against infection by the 'wild-type' agent. Fish Shellfish Immunol. 2001 Aug;11(6):505-22.
McLoughlin MF og Graham DA (2007), Alphavirus infections in salmonids – a review, Journal of Fish Diseases 2007, 30, 511-531.
Nelson RT, McLoughlin MF, Rowley HM, Platten MA og McCormick JI (1995) Isolation of a toga-like virus from Atlantic salmon Salmo salar with pancreas disease (1995) Diseases of Aquatic Organisms, 22, 25-32, 1995.
Powers AM, Brault AC, Shirako Y, Strauss EG, kang W, Strauss JH og Weaver SC (2001) Evolutionary relationships and systematics of the alphaviruses, Virology 75, 10118-10131 2001.
Raa J (1996), Reviews in Fisheries Science 4(3):229-228 1996.
Rognes T ( 2001), ParAlign: a parallel sequence alignment algorithm for rapid and sensitive database searches, Nucleic Acids Research, 29, 1647-1652 2001.
Smith TF og Waterman MS (1981) Identification of common molecular subsequences. Journal of Molecular Biology, 147, 195-197.
Taksdal T, Olsen, A B, Bjerkås I, Hjortaas M J, Dannevig B H, Graham D A, McLoughlin M F (2007), Pancreas disease in farmed Atlantic salmon, Salmo salar L., and rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), in Norway, Journal of Fish Disease 2007, 30, 545-558.
Watson JD, Hopkins NH, Roberts JW, Steitz JA, Weiner AM (1987)
Molecular biology of the gene, kapittel 24 The extraordinary diversity of eucaryotic viruses (898-961)
Rodger, H & Mitchell, S. Pancreas disease in Ireland: Epidemiological survey results for 2003 and 2004 in Ruane N, Rodger H, Graham D, Foyle L, Norris A, Ratcliff J, Murphy K, Mitchell S, Staples C, Jewherst H, Todd D, Geoghegan F og Cinneide MO: Marine Environment and health service No 222005 Research on Pancreas disease in Irish farmed Salmon 2004/2005 – Current and Future in initiatives. 2005.
André, E F: Development and clinical application of new polyvalent combined paediatric vaccines, Vaccine 17(1999), 1620-1627
O,Meara m.fl.: Recombinant vaccines against ovine footrot, Immunology and Cell Biology (1993) 71, 473-488.
Elena, SF og Sanjuán, R m.fl.: Adaptive Value of High Mutation Rates of RNA viruses: Separating Causes from Consequences (2005), Journal of Virology, 79, 11555-11558.
Domingo, E og Holland, JJ m.fl.: RNA virus mutations and fitness for survival (1997), Annu. Rev. Microbiol., 51, 151-78.
Watson JD, Hopkins NH, Roberts JW, Steitz JA, Weiner AM (1987), Molecular biology of the gene, kapittel 24 The extraordinary diversity of eucaryotic viruses (898-961)
Karlsen M. et al. Genetic stability within the Norwegian subtype of salmonid alphavirus (family Togaviridae). Arch Virol. 2006, vol. 151, no. 5, side 861-874.
Andersen L. et al. Tissue tropism of salmonid alphaviruses (subtypes SAV1 and SAV3) in experimentally challenged Atlantic salmon (Salmo salar L.). Arch Virol.
2007, vol. 152, no. 10, side 1871-1883.
WO2007031572 A1

Claims (10)

Nye patentkrav
1. Et isolert salmonid alfavirus av undertype SAV3 som omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 90 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1 og er videre karakterisert ved
a. en synlig cytopatogen effekt under tidlig passasje i cellekultur, og
b. evnen til å fremkalle dødelighet på minst 30 % i en laboratoriesmittemodell, modellen omfatter smoltifisering av atlantisk laks i henhold til standardfremgangsmåter og utfordring av postsmolt ved intraperitonal injeksjon med en SAV3-dose på minst 10<8>TCID50 pr. fisk, slik som minst 10<9>TCID50, minst 10<10>TCID50 eller fortrinnsvis minst 3,5 x 10<8 >TCID50 pr. fisk innen én dag etter overføring til sjøvann på 12 <o>C, og
c. evnen til å vokse in vitro til en titer på minst 1x10<8 >TCID50/ml i supernatanten/vekstmediet kulturer av CHH-1-celler eller CHSE-214-celler.
2. Isolert virus ifølge krav 1, hvor virus har en synlig cytopatogen effekt under den første, andre, tredje eller fjerde passasjen på en kultur med CHSE-celler.
3. Isolert virus ifølge krav 1 eller 2, hvor nevnte titer på minst 1x10<8 >TCID50/ml oppnås når:
i) Celler dyrkes ved bruk av vertsceller som har blitt sådd med en tetthet på 0,1-1x10<5 >celler cm<-2>;
ii) Vertscellene dyrkes i 4-6 dager før virusinfeksjon;
iii) Vertscellene dyrkes til en tetthet fra 0,1-1,0 x10<6 >celler cm<-2 >på infeksjonstidspunktet med nevnte virusisolat;
iv) Vertscellene dyrkes i et vekstmedium som omfatter EMEM (EBSS)+ 10 % føtalt bovint serum (FBS) 2 mM L-glutamin 1 % ikkeessensielle aminosyrer (NEAA) 0,1 % gentamicin og
v) De infiserte cellene dyrkes ved en temperatur på 15 ºC i en periode på 10-14 dager.
4. Isolert virus ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, hvor viruset omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 80 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 4.
5. Isolert virus ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, hvor viruset omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 98 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1.
6. Isolert virus ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, hvor virus er positive i en SAV reverse transkriptase kvantitativ PCR-identitetstest ved anvendelse et sett primere slik som primerne angitt i SEQ ID NO: 7 og 8 og betingelsene 50 <o>C, 30 min - 95 <o>C, 10 min –(95 <o>C, 30 sek - 57 <o>C, 60 sek -72 <o>C,30 sek)*40.
7. Isolert virus ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6, hvor viruset er en genetisk variant av en enkelt av virusstammene deponert under Budapestkonvensjonen ved European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 0JG UK 12. desember 2007 under deponeringsnumre 07121201 og 07121202.
8. Anvendelse av et inaktivert salmonid alfavirus av undertype SAV3, hvor virus omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 90 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1 og er videre karakterisert ved
a. en synlig cytopatogen effekt under tidlig passasje i cellekultur, og b. evnen til å fremkalle dødelighet på minst 30 % i en laboratoriesmittemodell, modellen omfatter smoltifisering av atlantisk laks i henhold til standardfremgangsmåter og utfordring av postsmolt ved intraperitonal injeksjon med en SAV3-dose på minst 10<8>TCID50 pr. fisk, slik som minst 10<9>TCID50, minst 10<10>TCID50 eller fortrinnsvis minst 3,5 x 10<8 >TCID50 pr. fisk innen én dag etter overføring til sjøvann på 12 <o>C, og
c. evnen til å vokse in vitro til en titer på minst 1x10<8 >TCID50/ml i supernatanten/vekstmediet kulturer av CHH-1-celler eller CHSE-214-celler;
i fremstillingen av en vaksine som er for forebygging eller reduksjon av forekomsten av infeksjon av salmonid alfavirus.
9. Anvendelse ifølge krav 8, hvori det salmonide alfaviruset er inaktivert ved tilsetting av formaldehyd.
10. Anvendelse ifølge krav 9, hvori det salmonide alfaviruset er inaktivert ved anvendelse av en prosedyre omfattende tilsetting av 1,5-2,5 g/kg, formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 48–96 timer ved en temperatur fra 14–17 <º>C.
NO20191081A 2008-02-08 2019-09-09 Isolert salmonid alfavirus og anvendelse derav NO346254B1 (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NO20080711 2008-02-08

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20191081A1 NO20191081A1 (no) 2009-08-10
NO346254B1 true NO346254B1 (no) 2022-05-16

Family

ID=51302828

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20130833A NO346489B1 (no) 2008-02-08 2013-06-13 Anvendelse av inaktivert SAV i fremstilling av en vaksine.
NO20191081A NO346254B1 (no) 2008-02-08 2019-09-09 Isolert salmonid alfavirus og anvendelse derav
NO2022047C NO2022047I1 (no) 2008-02-08 2022-11-15 Formaldehyde inactivated culture of: Salmon Pancreas Disease Virus (SPDV) strain AL V405

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20130833A NO346489B1 (no) 2008-02-08 2013-06-13 Anvendelse av inaktivert SAV i fremstilling av en vaksine.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO2022047C NO2022047I1 (no) 2008-02-08 2022-11-15 Formaldehyde inactivated culture of: Salmon Pancreas Disease Virus (SPDV) strain AL V405

Country Status (1)

Country Link
NO (3) NO346489B1 (no)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007031572A1 (en) * 2005-09-16 2007-03-22 Intervet International B.V. Fish vaccine

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT712926E (pt) * 1994-10-18 2004-02-27 Akzo Nobel Nv Virus da doenca pancreatica do peixe

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007031572A1 (en) * 2005-09-16 2007-03-22 Intervet International B.V. Fish vaccine

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Andersen L. et al. Tissue tropism of salmonid alphaviruses (subtypes SAV1 and SAV3) in experimentally challenged Atlantic salmon (Salmo salar L.).Arch Virol. 2007, vol. 152, no. 10, side 1871-1883., Dated: 01.01.0001 *
Hodneland K. et al. New subtype of salmonid alphavirus (SAV), Togaviridae, from Atlantic salmon Salmo salar and rainbow trout Oncorhynchus mykiss in Norway. Diseases of Aquatic Organisms. 2005, vol. 66; no. 2, side 113-120., Dated: 01.01.0001 *
Karlsen M. et al. Genetic stability within the Norwegian subtype of salmonid alphavirus (family Togaviridae).Arch Virol. 2006, vol. 151, no. 5, side 861-874. , Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
NO20130833L (no) 2010-07-21
NO20191081A1 (no) 2009-08-10
NO2022047I1 (no) 2022-11-15
NO346489B1 (no) 2022-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Boshra et al. Rift valley fever: recent insights into pathogenesis and prevention
Jarosinski et al. Marek’s disease virus: lytic replication, oncogenesis and control
Armesto et al. A recombinant avian infectious bronchitis virus expressing a heterologous spike gene belonging to the 4/91 serotype
Hsieh et al. DNA-mediated vaccination conferring protection against infectious bursal disease in broiler chickens in the presence of maternal antibody
Van de Water et al. VP2 exchange and NS3/NS3a deletion in African horse sickness virus (AHSV) in development of disabled infectious single animal vaccine candidates for AHSV
US10537631B2 (en) Tilapia lake virus vaccines
CA3090088C (en) Polyvalent vaccine against salmonid alphavirus infections
US20210269488A1 (en) Recombinant rotavirus expression system and recombinant rotaviruses
Mikalsen et al. Protective effects of a DNA vaccine expressing the infectious salmon anemia virus hemagglutinin-esterase in Atlantic salmon
Rong et al. Development of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens
US20160122728A1 (en) Ipn vaccine
CN110438090A (zh) 鳞片脱落疾病(sdd)致病病毒及其衍生物
CN106794242B (zh) 针对禽类呼肠孤病毒的广谱疫苗
Naylor et al. Charged amino acids in the AMPV fusion protein have more influence on induced protection than deletion of the SH or G genes
JP7350864B2 (ja) 異種スパイクタンパク質を有するh52 ibvワクチン
NO336878B1 (no) Inaktivert piscine viralt nervenekrosevirus stamme, vaksine og anvendelse derav.
Kim et al. Stability and efficacy of the 3′-UTR A4G-G5A variant of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) as a live attenuated immersion VHSV vaccine in olive flounder (Paralichthys olivaceus)
NO346254B1 (no) Isolert salmonid alfavirus og anvendelse derav
NO346576B1 (no) Isolated salmonid alpha virus of the subtype SAV3, and the use thereof
Rimstad Vaccination against infectious pancreatic necrosis
JP4373916B2 (ja) ニワトリ2型アストロウイルス
US20050169939A1 (en) Chicken anemia virus vaccine from cell line
AU2014201189B2 (en) Method for producing vaccinal viral strain of a virus of the Reoviridae family
EP2640832B1 (en) New ethiological agent
Sharma Development and Evaluation of Vaccine Candidates for Senecavirus A

Legal Events

Date Code Title Description
SPCF Filing of supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: FORMALDEHYDE INACTIVATED CULTURE OF: SALMON PANCREAS DISEASE VIRUS (SPDV) STRAIN AL V405; REG. NO/DATE: 14-10332 20151127

Spc suppl protection certif: 2022047

Filing date: 20221115