NO337570B1 - Preservation of spermatozoa - Google Patents
Preservation of spermatozoa Download PDFInfo
- Publication number
- NO337570B1 NO337570B1 NO20090516A NO20090516A NO337570B1 NO 337570 B1 NO337570 B1 NO 337570B1 NO 20090516 A NO20090516 A NO 20090516A NO 20090516 A NO20090516 A NO 20090516A NO 337570 B1 NO337570 B1 NO 337570B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- spermatozoa
- alginate
- particle according
- biopolymer
- insemination
- Prior art date
Links
- 238000004321 preservation Methods 0.000 title claims description 27
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 129
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 claims description 101
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims description 100
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims description 99
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 96
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 claims description 96
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 91
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 61
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 42
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 32
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 18
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 17
- AEMOLEFTQBMNLQ-BZINKQHNSA-N D-Guluronic Acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-BZINKQHNSA-N 0.000 claims description 16
- AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactopyranuronic acid Natural products OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 12
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 11
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 10
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 claims description 10
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 claims description 10
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 claims description 10
- OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L calcium;(2s,3s,4s,5s,6r)-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxy-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxylato-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Ca+2].O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H](C([O-])=O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O2)C([O-])=O)O)[C@H](C(O)=O)O1 OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L 0.000 claims description 10
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 8
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 8
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000035558 fertility Effects 0.000 claims description 7
- 230000036541 health Effects 0.000 claims description 7
- 241000283086 Equidae Species 0.000 claims description 6
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 6
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 6
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 claims description 5
- -1 antibodies Substances 0.000 claims description 5
- 229910052788 barium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 5
- 239000004255 Butylated hydroxyanisole Substances 0.000 claims description 4
- 239000004322 Butylated hydroxytoluene Substances 0.000 claims description 4
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 4
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims description 4
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N barium atom Chemical compound [Ba] DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000019282 butylated hydroxyanisole Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000010354 butylated hydroxytoluene Nutrition 0.000 claims description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 4
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 4
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 229920000371 poly(diallyldimethylammonium chloride) polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims description 3
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 3
- 102000006587 Glutathione peroxidase Human genes 0.000 claims description 3
- 108700016172 Glutathione peroxidases Proteins 0.000 claims description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 claims description 3
- CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N butylated hydroxyanisole Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(C)(C)C)=C1.COC1=CC=C(O)C=C1C(C)(C)C CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940043253 butylated hydroxyanisole Drugs 0.000 claims description 3
- 229940095259 butylated hydroxytoluene Drugs 0.000 claims description 3
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000007798 antifreeze agent Substances 0.000 claims 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 claims 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 76
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 44
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 36
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 24
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 24
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 18
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 18
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 9
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 9
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 9
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 9
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 9
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 8
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 8
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 6
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 6
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 5
- 244000309464 bull Species 0.000 description 5
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 5
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- AEMOLEFTQBMNLQ-VANFPWTGSA-N D-mannopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-VANFPWTGSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 241000282485 Vulpes vulpes Species 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 244000309465 heifer Species 0.000 description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 3
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 3
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 244000144980 herd Species 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000272194 Ciconiiformes Species 0.000 description 2
- 241000252095 Congridae Species 0.000 description 2
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 2
- 229910001422 barium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 2
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 2
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 2
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 2
- 210000000538 tail Anatomy 0.000 description 2
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000589151 Azotobacter Species 0.000 description 1
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N Lincomycin Natural products CN1CC(CCC)CC1C(=O)NC(C(C)O)C1C(O)C(O)C(O)C(SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000199919 Phaeophyceae Species 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 208000019802 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229930194936 Tylosin Natural products 0.000 description 1
- 239000004182 Tylosin Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000027326 copulation Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 231100000688 decreased sperm quality Toxicity 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001158 estrous effect Effects 0.000 description 1
- 210000001752 female genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 1
- OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N lincomycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N 0.000 description 1
- 229960005287 lincomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011169 microbiological contamination Methods 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000009597 pregnancy test Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000008010 sperm capacitation Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229920001187 thermosetting polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical group OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004059 tylosin Drugs 0.000 description 1
- WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N tylosin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)O[C@H]([C@@H]([C@H]1N(C)C)O)O[C@@H]1[C@@H](C)[C@H](O)CC(=O)O[C@@H]([C@H](/C=C(\C)/C=C/C(=O)[C@H](C)C[C@@H]1CC=O)CO[C@H]1[C@@H]([C@H](OC)[C@H](O)[C@@H](C)O1)OC)CC)[C@H]1C[C@@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)O1 WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N 0.000 description 1
- 235000019375 tylosin Nutrition 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Oppfinnelsens område Field of the invention
Foreliggende oppfinnelse gjelder biopolymerpartikler for konservering av ikke-humane spermatozoer. Foreliggende oppfinnelse gjelder også en fremgangsmåte for konservering, lagring og kontrollert tilførsel/frigjøring av ikke-humane spermatozoer og anvendelse av biopolymerpartiklene ifølge foreliggende oppfinnelse i avl. The present invention relates to biopolymer particles for the preservation of non-human spermatozoa. The present invention also applies to a method for the preservation, storage and controlled supply/release of non-human spermatozoa and the use of the biopolymer particles according to the present invention in breeding.
Oppfinnelsens bakgrunn The background of the invention
Kunstig inseminasjon (AI) er en teknikk hvor spermatozoer plasseres i uterus eller cervix hos et dyr ved kunstige midler, snarere enn ved naturlig kopulasjon. AI anvendes hyppig som en fremgangsmåte for paring og ved avl av dyr for oppformering av ønskede egenskaper, særlig når det gjelder gårdsdyr som storfe, gris, sau, fjærfe og hest, men også når det gjelder kjæledyr som hunder med stamtavle, akvatiske dyr eller utrydningstruede arter. Artificial insemination (AI) is a technique where spermatozoa are placed in the uterus or cervix of an animal by artificial means, rather than by natural copulation. AI is frequently used as a method for mating and in animal breeding for the propagation of desired characteristics, especially when it comes to farm animals such as cattle, pigs, sheep, poultry and horses, but also when it comes to pets such as pedigree dogs, aquatic animals or endangered species species.
Vanligvis oppsamles spermatozoer og fortynnes, og konserveres så ved f.eks. frysekonservering. Anvendelse av frysekonserveringsteknikker forutsetter at spermatozoer fra den angjeldende dyreart tolererer slik behandling uten at spermatozoenes kvalitet, levedyktighet og fertiliseringsevne reduseres i for stor grad. Spermatozoene transporteres så til hunndyrets lokalitet, enten frysekonservert eller lagret ferskt, avhengig av hva som er best egnet. Det er avgjørende at spermatozoene forblir levedyktige inntil inseminasjonstidspunktet og i et tilstrekkelig langt tidsrom inne i hunndyret etter inseminasjonen, inntil eggcellen eller eggcellene når fertiliseringsområdet. Usually, spermatozoa are collected and diluted, and then preserved by e.g. freeze preservation. Application of cryopreservation techniques requires that spermatozoa from the animal species in question tolerate such treatment without the spermatozoa's quality, viability and fertilizing capacity being reduced to a large extent. The spermatozoa are then transported to the female animal's location, either freeze-preserved or stored fresh, depending on what is most suitable. It is essential that the spermatozoa remain viable until the time of insemination and for a sufficiently long period of time inside the female animal after insemination, until the oocyte or oocytes reach the fertilization area.
Kunstig inseminasjon av gårdsdyr har blitt anvendt siden 1940-tallet og anvendes nå hyppig innen jordbruksindustrien, særlig for avl av melkekyr og gris. En oversikt over utviklingen av moderne AI og utfordringene som oppdretterne står overfor når det gjelder anvendelse av kunstig inseminasjon og konservering av spermatozoer beskrives i R. H. Foote (2002), American Society of Animal Science (http:www.asas.org/symposia/esuppe2/Footehist.pdf) og i "Reproduction in farm animals, utgitt av B. Hafez, E.S.E. Hafez. - 7. utgave, Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2000. - XIII, ISBN 0-683-30577-8 (ib.). Kunstig inseminasjon har blitt et viktig økonomisk middel for avl av dyr i jordbruksindustri en, både når det gjelder avl av dyr med spesifikke og foretrukne genetiske egenskaper og dyreproduksjon generelt. Artificial insemination of farm animals has been used since the 1940s and is now frequently used in the agricultural industry, particularly for the breeding of dairy cows and pigs. An overview of the development of modern AI and the challenges that breeders face in the application of artificial insemination and preservation of spermatozoa is described in R. H. Foote (2002), American Society of Animal Science (http:www.asas.org/symposia/esuppe2/ Footehist.pdf) and in "Reproduction in farm animals, published by B. Hafez, E.S.E. Hafez. - 7th edition, Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2000. - XIII, ISBN 0-683-30577-8 (ib.) Artificial insemination has become an important economic means of breeding animals in the agricultural industry, both in terms of breeding animals with specific and preferred genetic characteristics and animal production in general.
Det foreligger imidlertid noen begrensninger når det gjelder å oppnå drektighet i hunndyret ved utførelse av kunstig inseminasjon. For eksempel er lagringstiden og levedyktigheten for de oppsamlede spermatozoene, både under lagring, etter opptining når det gjelder frysekonserverte spermatozoer og etter insemineringen, avgjørende for et vellykket avlsresultat. Hvorvidt egnede konserveringsteknikker er tilgjengelige for den angjeldende dyreart varierer. For storfe anvendes hyppig frysekonserveringsteknikker. Spermatozoer fra andre arter, f.eks. gris, er derimot mindre tolerante overfor frysekonserveringsteknikker, noe som fører til mindre fleksibilitet når det gjelder prosesseringen og lagringsmulighetene for sæden. However, there are some limitations when it comes to achieving pregnancy in the female animal by performing artificial insemination. For example, the storage time and viability of the collected spermatozoa, both during storage, after thawing in the case of cryopreserved spermatozoa and after insemination, are crucial for a successful breeding result. Whether suitable conservation techniques are available for the species concerned varies. Freeze preservation techniques are frequently used for cattle. Spermatozoa from other species, e.g. pig, on the other hand, are less tolerant to cryopreservation techniques, which leads to less flexibility in terms of the processing and storage options for the semen.
For erholdelse av spermatozoer med en egnet befruktningsevne er det videre ønskelig at den benyttede konserverings fremgangsmåte også fører til bevart befruktningsevne etter insemineringen. Mye fokus har blitt rettet mot og mye forskning har blitt utført når det gjelder konserveringsfremgangsmåter, med det mål å tilveiebringe lagringsfremgangsmåter og lagringsmidler som sikrer at spermatozoene bevarer befruktningsevnen i lengre tid etter oppsamlingen og frem til inseminasjonstidspunktet. In order to obtain spermatozoa with a suitable fertilizing capacity, it is further desirable that the preservation method used also leads to preserved fertilizing capacity after insemination. Much focus has been directed towards and much research has been carried out regarding preservation methods, with the aim of providing storage methods and means of storage which ensure that the spermatozoa retain their fertilizing capacity for a longer period of time after collection until the time of insemination.
Dersom lagringstiden er kort når det gjelder opprettholdelse av befruktningsevnen etter inseminasjonen er det vanskeligere å oppnå det foretrukne inseminasjonstidspunkt relativt til ovulasjonen. Dersom lagringstiden er kort, er det avgjørende med gode konserveringsteknikker for spermatozoer som gir lengre lagringstid og følgelig en mer langvarig befruktningsevne. Foreløpig er ingen konserveringsfremgangsmåte tilgjengelig som gir en tilstrekkelig lagringstid og levedyktighet av spermatozoene over et tidsrom etter inseminasjonen som er tilstrekkelig til å oppfylle oppdretternes behov for fleksibilitet, særlig dersom det er en lang og tidkrevende transportdistanse mellom hannens lokalitet, og følgelig stedet hvor sæden oppsamles, og mottakerhunndyret. If the storage time is short in terms of maintaining the ability to fertilize after insemination, it is more difficult to achieve the preferred insemination time relative to ovulation. If the storage time is short, it is crucial to use good preservation techniques for spermatozoa that provide a longer storage time and, consequently, a longer-term fertilizing ability. Currently, no conservation method is available that provides a sufficient storage time and viability of the spermatozoa over a period of time after insemination that is sufficient to fulfill the breeders' need for flexibility, especially if there is a long and time-consuming transport distance between the male's location, and consequently the place where the semen is collected, and the recipient female animal.
Videre vil en konserveringsfremgangsmåte som gir en mer kontrollert og langvarig tilgjengelighet på spermatozoer redusere behovet for kunstig fremkalt ovulasjon ved hormonbehandling. Dette vil være gunstig, både økonomisk, ut fra forbrukernes krav og når det gjelder dyrenes helse. Furthermore, a preservation method that provides a more controlled and long-term availability of spermatozoa will reduce the need for artificially induced ovulation by hormone treatment. This will be beneficial, both financially, based on consumer requirements and when it comes to the animals' health.
Det foreligger følgelig et behov for fremgangsmåter som sikrer at spermatozoene bevarer befruktningsevnen i lengre tid etter inseminasjonen, f.eks. bevarer befruktningsevnen i lengre tid etter plassering i det mottakende hunndyr. There is consequently a need for methods which ensure that the spermatozoa retain their fertilizing capacity for a longer period of time after insemination, e.g. preserves the ability to fertilize for a longer period of time after placement in the receiving female animal.
For tiden utføres kunstig inseminasjon (AI) i storfe hyppig ved anvendelse av frysekonserverte spermatozoer. Frysekonserverte spermatozoer kan lagres i flytende nitrogen i flere tiår før de skal anvendes. Etter opptining av spermatozoene må imidlertid AI utføres i løpet av noen få timer. Etter inseminasjonen har de frysekonserverte spermatozoene befruktningsevne i tilnærmet 12-24 timer, og AI må utføres i løpet av tilnærmet 12-24 timer før ovulasjonen. Det foreligger følgelig et behov for konserveringsteknikker for avl av storfe som tilveiebringer spermatozoer som har tilstrekkelige lagringsegenskaper og som fortrinnsvis bevarer befruktningsevnen i flere dager. At present, artificial insemination (AI) in cattle is frequently performed using cryopreserved spermatozoa. Cryopreserved spermatozoa can be stored in liquid nitrogen for several decades before being used. However, after thawing the spermatozoa, AI must be performed within a few hours. After insemination, the cryopreserved spermatozoa have fertilizing capacity for approximately 12-24 hours, and AI must be performed approximately 12-24 hours before ovulation. Consequently, there is a need for conservation techniques for breeding cattle which provide spermatozoa which have sufficient storage properties and which preferably retain their fertilizing ability for several days.
I noen land anvendes væskelagrede spermatozoer fra okse for å redusere antall sædceller pr. AI-dose. Spermatozoene har befruktningsevne i tilnærmet 24-36 timer før inseminasjonen. AI må utføres i løpet av tilnærmet 24 timer etter oppsamlingen av spermatozoer. Imidlertid er væskekonserverte spermatozoer fra okse belemret med flere ulemper, f.eks. avkortet/redusert lagringstid og redusert fordelingsomfang. In some countries, liquid-stored spermatozoa from bulls are used to reduce the number of sperm cells per AI dose. The spermatozoa have fertilization capacity for approximately 24-36 hours before insemination. AI must be performed within approximately 24 hours after the collection of spermatozoa. However, liquid-preserved spermatozoa from bulls are burdened with several disadvantages, e.g. shortened/reduced storage time and reduced scope of distribution.
I gris anvendes frysekonserverte spermatozoer kun for spesielle formål, f.eks. eksport, transport over lengre avstander og for kontroll av smittsomme sykdommer. AI i gris utføres vanligvis med væskekonservert sæd. Lagringstiden for væskekonservert sæd (spermatozoer) vil avhenge av det benyttede fortynningsmiddel. Spermatozoer fortynnet med fortynningsmidler med kort levetid bevarer befruktningsevnen i tilnærmet 2-3 dager, mens spermatozoer fortynnet med fortynningsmidler med lang levetid kan bevare befruktningsevnen i opptil 5-6 dager. Etter inseminasjonen varer spermatozoenes befruktningsevne i tilnærmet 12-24 timer. De fleste sugger insemineres to ganger mens de er brunstige med et mellomrom på tilnærmet 24 timer. Med et mer fleksibelt system som tilveiebringer en lengre lagringstid før inseminasjonen (f.eks. 1 uke) og/eller forlenget lagring og frigjøring av spermatozoer etter inseminasjon (f.eks. mer enn 24 timer) vil avlsindustrien ha en mer effektiv produksjon og distribusjon, og oppdretterne vil ha mindre behov for nøyaktig tidfestelse av inseminasjonen relativt til ovulasjonen. I avl av hester er oppdretteren mest avhengig av ferske spermatozoer, grunnet mangelen på egnede konserveringsteknikker for spermatozoer fra hest. Dette er et stort problem i hesteavls- og veddeløpsindustrien, siden den foretrukne hingst for en spesifikk avlshoppe ofte befinner seg i et annet land, noe som krever en lang transporttid. Grunnet mangelen på egnede konserveringsfremgangsmåter for spermatozoer fra hest må i tillegg AI med ferske hestespermatozoer utføres i løpet av 24 timer etter oppsamlingen av spermatozoene. Hesteavl er følgelig forbundet med et uønsket tidspress som ofte fører til en redusert sædkvalitet eller redusert befruktning grunnet ukorrekt inseminasjon med hensyn til ovulasjonen. In pigs, cryopreserved spermatozoa are only used for special purposes, e.g. export, transport over long distances and for the control of infectious diseases. AI in pigs is usually performed with liquid-preserved semen. The storage time for liquid-preserved semen (spermatozoa) will depend on the diluent used. Spermatozoa diluted with short-lived diluents retain their fertilizing ability for approximately 2-3 days, while spermatozoa diluted with long-lived diluents can retain their fertilizing ability for up to 5-6 days. After insemination, the fertilizing ability of the spermatozoa lasts for approximately 12-24 hours. Most sows are inseminated twice while they are in heat with an interval of approximately 24 hours. With a more flexible system that provides a longer storage time before insemination (e.g. 1 week) and/or prolonged storage and release of spermatozoa after insemination (e.g. more than 24 hours), the breeding industry will have a more efficient production and distribution , and breeders will have less need for accurate timing of insemination relative to ovulation. In breeding horses, the breeder is mostly dependent on fresh spermatozoa, due to the lack of suitable preservation techniques for spermatozoa from horses. This is a major problem in the horse breeding and racing industry, as the stallion of choice for a specific broodmare is often located in another country, requiring a long transport time. Due to the lack of suitable preservation methods for horse spermatozoa, AI with fresh horse spermatozoa must also be performed within 24 hours after the collection of the spermatozoa. Horse breeding is therefore associated with an unwanted time pressure which often leads to a reduced sperm quality or reduced fertilization due to incorrect insemination with regard to ovulation.
Det foreligger følgelig et behov for konserveringsfremgangsmåter som sikrer både en lengre lagringstid når det gjelder den nødvendige transporttid for tilførselen og en lengre levetid etter inseminasjonen. En egnet konserveringsfremgangsmåte for hestesæd vil være av stor økonomisk og praktisk verdi og vil muligens kunne revolusjonere hesteavlsindustrien. Consequently, there is a need for conservation methods which ensure both a longer storage time in terms of the necessary transport time for the supply and a longer lifespan after insemination. A suitable conservation method for horse semen will be of great economic and practical value and will possibly revolutionize the horse breeding industry.
Et konserveringssystem for spermatozoer som gir en tilstrekkelig levedyktighet både under lagring og før og etter inseminasjonen vil være gunstig for avlsindustrien generelt. Et mer fleksibelt konserveringssystem vil gjøre avlsarbeidet enklere for alle dyrearter og føre til en økt frekvens av vellykket befruktning. Et system hvor oppdretteren er mindre avhengig av å treffe det mest foretrukne inseminasjonstidspunkt relativt til ovulasjonen gir større fleksibilitet. A conservation system for spermatozoa that provides sufficient viability both during storage and before and after insemination will be beneficial to the breeding industry in general. A more flexible conservation system will make breeding work easier for all animal species and lead to an increased frequency of successful fertilization. A system where the breeder is less dependent on hitting the most preferred insemination time relative to ovulation provides greater flexibility.
For å utvide befruktningsevnen til ejakulerte spermatozoer har flere konserveringsfremgangsmåter, innbefattet frysekonservering og væskekonservering, blitt undersøkt. To extend the fertilizing capacity of ejaculated spermatozoa, several preservation methods, including cryopreservation and liquid preservation, have been investigated.
Flere undersøkelser av lagring av spermatozoer i kapsler har blitt publisert. Disse undersøkelsene har anvendt innkapslingsfremgangsmåter som fører til en partikkel hvor spermatozoene foreligger i en flytende kjerne omgitt av en semipermeabel membran. Several investigations into the storage of spermatozoa in capsules have been published. These investigations have used encapsulation methods that lead to a particle where the spermatozoa are present in a liquid core surrounded by a semipermeable membrane.
Nebel et al. (1985), Microencapsulation of bovine spermatozoa. J. Anim. Sei. 1985 60(6): 1631-39, beskriver en fremgangsmåte for innkapsling av spermatozoer fra storfe i kapsler fremstilt av alginat i kombinasjon med polylysin. Denne fremgangsmåten bygger på en tidligere offentliggjort fremgangsmåte fra Lim og Sun (1980), Microencapsulated islets as bioartifical endocrine pancreas. Science 1980 210(4472):908-10, som arbeidet med produksjon av insulin fra innkapslede langerhans celler. Nebel et al. (1985) rapporterte resultater både fra lagring ved 37°C og fra 335 inseminasjoner, og resultatene for innkapslede spermatozoer ble sammenlignet med ikke-innkapslede kontrollprøver. Ingen viktige forskjeller mellom innkapslede prøver og kontrollprøver ble rapportert i denne undersøkelsen. Andre publiserte undersøkelser har også vist at spermatozoer kan innkapsles i kapsler ved hjelp av lignende fremgangsmåter og bevarer sin funksjonalitet in vivo (Munkittrick et al. (1992) Accessory sperm numbers for cattle inseminated with protamine sulfate microcapsules. J. Dairy Sei., 75(3):725-31 (Bovine), Vishwanata et al. (1997) Selected times of insemination with microencapsulated bovine spermatozoa affect pregnancy rates of synchronized heifers. Theriogenology, 48: 369-76 (Bovine og Maxwell et al. (1996). Survival and fertility of microencapsulated ram spermatozoa stored at 5°C. Reprod. Dom. Anim., 31:665-73 Nebel et al. (1985), Microencapsulation of bovine spermatozoa. J. Anim. Pollock. 1985 60(6): 1631-39, describes a method for encapsulating spermatozoa from cattle in capsules made from alginate in combination with polylysine. This method is based on a previously published method from Lim and Sun (1980), Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas. Science 1980 210(4472):908-10, who worked on the production of insulin from encapsulated Langerhans cells. Nebel et al. (1985) reported results both from storage at 37°C and from 335 inseminations, and the results for encapsulated spermatozoa were compared with non-encapsulated control samples. No significant differences between encapsulated samples and control samples were reported in this study. Other published investigations have also shown that spermatozoa can be encapsulated in capsules using similar methods and preserve their functionality in vivo (Munkittrick et al. (1992) Accessory sperm numbers for cattle inseminated with protamine sulfate microcapsules. J. Dairy Sei., 75( 3):725-31 (Bovine), Vishwanata et al. (1997) Selected times of insemination with microencapsulated bovine spermatozoa affect pregnancy rates of synchronized heifers. Theriogenology, 48: 369-76 (Bovine and Maxwell et al. (1996). Survival and fertility of microencapsulated ram spermatozoa stored at 5°C. Reprod. Dom. Anim., 31:665-73
(Sheep). Minkittrick et al. (1992) og Vishwanath et al. (1997) rapporterer imidlertid at innkapslede spermatozoer ikke var like effektive som ubehandlede spermatozoer ved samtidig inseminasjon. Dette ble forklart med at innkapslede spermatozoer kan trenge en viss tid for frigjøring fra kapslene før befruktning kan skje. (Sheep). Minkittrick et al. (1992) and Vishwanath et al. (1997), however, report that encapsulated spermatozoa were not as effective as untreated spermatozoa at simultaneous insemination. This was explained by the fact that encapsulated spermatozoa may need a certain time to be released from the capsules before fertilization can occur.
Conte et al. (1998), har i EP 0 922 451 Bl, tildelt Universitå di Pavia og Universitå Degli Studi Di Milano, og Torre et al. (2002), Boar sem en controlled delivery system: storage and in vitro spermatozoa release. J. Contol. Release, 85:83-89, utviklet en alternativ fremgangsmåte for innkapsling av galtespermatozoer. I denne fremgangsmåten tilsettes spermatozoene til en løsning som inneholder kalsium eller barium, og denne suspensjonen dryppes inn i en løsning som inneholder alginat. En kapsel av kalsium- eller bariumalginat dannes spontant rundt dråpen når denne treffer alginatløsningen. Denne fremgangsmåten hevdes å være mer skånsom overfor cellene enn fremgangsmåten som beskrives av Nebel et al. (1985). En annen fordel er at denne fremgangsmåten medfører svært liten fortynning av spermatozoløsningen, noe som hevdes å være gunstig for cellenes levedyktighet. Conte et al. (1998), have in EP 0 922 451 Bl, assigned to the Universitå di Pavia and Universitå Degli Studi Di Milano, and Torre et al. (2002), Boar sem en controlled delivery system: storage and in vitro spermatozoa release. J. Contol. Release, 85:83-89, developed an alternative method for encapsulation of boar spermatozoa. In this method, the spermatozoa are added to a solution containing calcium or barium, and this suspension is dripped into a solution containing alginate. A capsule of calcium or barium alginate forms spontaneously around the drop when it hits the alginate solution. This method is claimed to be more gentle on the cells than the method described by Nebel et al. (1985). Another advantage is that this method results in very little dilution of the spermatozoa solution, which is claimed to be beneficial for the viability of the cells.
Fustini et al. (2004), Boar spermatozoa encapsulated in barium alginate membranes: a microdensitometric evaluation of some enzymatic activities during storage at 18°C, Theriogenology, 61(1): 173-184 rapporterer en significant høyere andel av spermatozoer med intact akrosom og mindre lekkasje av enzymer fra spermatozoer som er lagret innkapslet med denne fremgangsmåten, sammenlignet med ubehandlede spermatozoer lagret under de same betingelser. Fustini et al. (2004), Boar spermatozoa encapsulated in barium alginate membranes: a microdensitometric evaluation of some enzymatic activities during storage at 18°C, Theriogenology, 61(1): 173-184 report a significantly higher proportion of spermatozoa with intact acrosome and less leakage of enzymes from spermatozoa stored encapsulated with this method, compared to untreated spermatozoa stored under the same conditions.
I en nylig artikkel beskriver Weber et al. (2006), Design of high-throughput-compatible protocols for microencapsulation, cryopreservation and release of bovine spermatozoa. Journ. Biotechnol., 123:155-163, også et nytt system for innkapsling av spermatozoer fra storfe. Dette systemet er utformet for fremstilling av store mengder innkapslede spermatozoer ved anvendelse av Ca-alginat- eller cellulosesulfat-poly-diallyldimetylammoniumklorid (pDADMAC)-kapsler. In a recent article, Weber et al. (2006), Design of high-throughput-compatible protocols for microencapsulation, cryopreservation and release of bovine spermatozoa. Journal. Biotechnol., 123:155-163, also a new system for encapsulating bovine spermatozoa. This system is designed for the preparation of large quantities of encapsulated spermatozoa using Ca-alginate or cellulose sulfate-poly-diallyldimethylammonium chloride (pDADMAC) capsules.
Endelig beskriver Chou et al., US patentskrift nr. 6 596 310 Bl (2003) en fremgangsmåte for kunstig inseminasjon ved tidsstyrt frigjøring av sædceller fra kapsler eller faste kuler, hvori sædcellen holdes i en ikke-kapasitert tilstand grunnet anvendelsen av en energikilde som ikke understøtter kapasitering. Finally, Chou et al., US Patent No. 6,596,310 B1 (2003) describes a method for artificial insemination by time-controlled release of sperm cells from capsules or solid spheres, in which the sperm cell is kept in a non-capacitated state due to the use of an energy source that does not supports capacitation.
Oppsummering av oppfinnelsen Summary of the invention
Foreliggende oppfinnelse bygger på det overraskende funn at innstøping av spermatozoer i biopolymerstøttemidler hvori biopolymerstøttemidlet består av et alginat som er rikt på guluronsyre fører til spermatozoer med overlegne konserveringsegenskaper når det gjelder lagringstid, levedyktighet og befruktning. Biopolymerpartiklene og spermatozoene i disse kan følgelig anvendes for kunstig befruktning av dyr. The present invention is based on the surprising discovery that embedding spermatozoa in biopolymer support agents in which the biopolymer support agent consists of an alginate that is rich in guluronic acid leads to spermatozoa with superior conservation properties in terms of storage time, viability and fertilization. The biopolymer particles and the spermatozoa in them can therefore be used for artificial fertilization of animals.
En ikke-begrensende fordel ved det her beskrevne biopolymersystem for konservering av spermatozoer er at det gir fordeler ved at spermatozoene for befruktningsevne over et lengre tidsrom etter inseminasjonen, noe som gjør inseminasjonstidspunktet relativt til ovulasjonen mindre avgjørende. A non-limiting advantage of the biopolymer system described here for the preservation of spermatozoa is that it provides advantages in that the spermatozoa remain fertile over a longer period of time after insemination, which makes the time of insemination relative to ovulation less crucial.
Biopolymerpartiklene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i avl og for produksjon av dyr i jordbruksindustri en. Biopolymerpartiklene er følgelig anvendbare dersom formålet er å tilveiebringe dyr med spesifikt ønskelige egenskaper. Biopolymerpartiklene er også anvendbare dersom formålet er å produsere dyr generelt, f.eks. for produksjon av slaktekveg. The biopolymer particles according to the present invention can be used in breeding and for the production of animals in the agricultural industry. The biopolymer particles are consequently usable if the purpose is to provide animals with specifically desirable properties. The biopolymer particles are also applicable if the purpose is to produce animals in general, e.g. for the production of beef cattle.
Ifølge den foreliggende oppfinnelse kan biopolymerpartiklene anvendes direkte og insemineres som de er i mottakerdyret dersom biopolymerpartikkelen, f.eks. alginatpartiklene, vil oppløses under fysiologiske betingelser i mottakerdyret (dvs. i uterus eller cervix). Biopolymerpartiklene ifølge oppfinnelsen tilveiebringer følgelig en kontrollert frigjøring av spermatozoene. Spermatozoene kan også oppløses fra biopolymerpartikkelen før inseminasjonen av spermatozoene. According to the present invention, the biopolymer particles can be used directly and inseminated as they are in the recipient animal if the biopolymer particle, e.g. the alginate particles will dissolve under physiological conditions in the recipient animal (ie in the uterus or cervix). The biopolymer particles according to the invention therefore provide a controlled release of the spermatozoa. The spermatozoa can also be dissolved from the biopolymer particle before the insemination of the spermatozoa.
Som diskutert ovenfor antyder teknikkens stand hovedsakelig innkapsling av spermatozoer i biopolymerkapsler hvori spermatozoene foreligger i en flytende kjerne i en biopolymerkapsel. Kun én referanse (Chou et al., US patentskrift nr. 6 596 310 Bl) nevner muligheten for å innstøpe spermatozoer i et fast, polymert støttemiddel, selv om ingen eksempler på de faste kulene som beskrives deri vises. De foreliggende oppfinnere har i stedet funnet en annen tilnærming til immobilisering av ikke-humane spermatozoer. Ifølge den foreliggende oppfinnelse innstøpes ikke-humane spermatozoene i et fast gelnettvek dannet av alginatgeler, hvori alginatet som anvendes er rikt på guluronsyre. De foreliggende oppfinnere har funnet at immobilisering i et fast gelnettverk byr på flere fordeler sammenlignet med den innkapsling i kapsler og kuler som beskrives innen teknikkens stand. As discussed above, the prior art mainly suggests encapsulation of spermatozoa in biopolymer capsules in which the spermatozoa are present in a liquid core in a biopolymer capsule. Only one reference (Chou et al., US Patent No. 6,596,310 B1) mentions the possibility of embedding spermatozoa in a solid polymeric support, although no examples of the solid spheres described therein are shown. The present inventors have instead found another approach to the immobilization of non-human spermatozoa. According to the present invention, the non-human spermatozoa are embedded in a solid gel net fold formed by alginate gels, in which the alginate used is rich in guluronic acid. The present inventors have found that immobilization in a solid gel network offers several advantages compared to the encapsulation in capsules and spheres described in the prior art.
Uten ønske om å være bundet til en gitt teori antas det at innstøpingen ved anvendelse av biopolymerpartiklene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse fører til en immobilisering, dvs. at spermatozoenes naturlige bevegelser er begrenset grunnet innsperringen i gelnettverket. En fysisk begrensning av bevegelsen grunnet høy cellekonsentrasjon og nærvær av polymerer med høy viskositet kan være én av faktorene som påvirker spermatozoenes overlevelse og bevarelse av funksjonalitet i cauda epididymidis (Watson, 1993). Spermatozoer lagres over lengre tidsrom (mer enn 1 uke) i cauda epididymidis (Watson, 1993). Anvendelsen av alginat som er rikt på glukuronsyre gjør det mulig å tilveiebringe biopolymerpartikler som omfatter innstøpte spermatozoer som er anvendbare i praksis som et konservasjonssystem og som kan anvendes i kunstig befruktning, f.eks. i dyreavl. Without wishing to be bound to a given theory, it is assumed that the embedding using the biopolymer particles and the methods according to the present invention leads to an immobilization, i.e. that the spermatozoa's natural movements are limited due to the confinement in the gel network. A physical limitation of movement due to high cell concentration and the presence of polymers with high viscosity may be one of the factors that affect the spermatozoa's survival and preservation of functionality in the cauda epididymidis (Watson, 1993). Spermatozoa are stored for longer periods of time (more than 1 week) in the cauda epididymidis (Watson, 1993). The use of alginate which is rich in glucuronic acid makes it possible to provide biopolymer particles comprising embedded spermatozoa which are applicable in practice as a conservation system and which can be used in artificial insemination, e.g. in animal breeding.
Ifølge ett aspekt tilveiebringer følgelig oppfinnelsen en biopolymerpartikkel for konservering av ikke-humane spermatozoer, hvori de ikke-humane spermatozoene er innstøpt i et biopolymergelnettverk og hvori biopolymerpartikkelen som omslutter de ikke-humane spermatozoene omfatter alginat som er rikt på glukuronsyre. Accordingly, according to one aspect, the invention provides a biopolymer particle for the preservation of non-human spermatozoa, wherein the non-human spermatozoa are embedded in a biopolymer gel network and wherein the biopolymer particle enclosing the non-human spermatozoa comprises alginate rich in glucuronic acid.
Ifølge et annet aspekt av oppfinnelsen omfatter biopolymeren som innleirer de ikke-humane spermatozoene kalsiumalginat. According to another aspect of the invention, the biopolymer which embeds the non-human spermatozoa comprises calcium alginate.
Ifølge et annet aspekt omfatter biopolymeren alginat med lav viskositet. According to another aspect, the biopolymer comprises low viscosity alginate.
Ifølge nok et aspekt av oppfinnelsen er alginatkonsentrasjonen i biopolymerpartiklene ifølge oppfinnelsen minst 0,1 %. According to yet another aspect of the invention, the alginate concentration in the biopolymer particles according to the invention is at least 0.1%.
Ifølge nok et aspekt av oppfinnelsen er alginatkonsentrasjonen i biopolymerpartiklene ifølge oppfinnelsen mellom minst 0,1 % og 6 % alginat. According to yet another aspect of the invention, the alginate concentration in the biopolymer particles according to the invention is between at least 0.1% and 6% alginate.
Ifølge ytterligere et aspekt av oppfinnelsen er alginatkonsentrasjonen i biopolymerpartiklene ifølge oppfinnelsen minst 1 %. According to a further aspect of the invention, the alginate concentration in the biopolymer particles according to the invention is at least 1%.
Videre er ifølge ett aspekt av oppfinnelsen spermatozokonsentrasjonen i biopolymerpartiklene minst 0,1 x IO<6>ikke-humane spermatozoer/ml, f.eks. minst 100 x IO<6>ikke-humane spermatozoer/ml, f.eks. opptil minst 2,5 x IO<9>spermatozoer/ml. Furthermore, according to one aspect of the invention, the spermatozoa concentration in the biopolymer particles is at least 0.1 x 10<6>non-human spermatozoa/ml, e.g. at least 100 x IO<6>non-human spermatozoa/ml, e.g. up to at least 2.5 x IO<9>spermatozoa/ml.
Ifølge ytterligere et aspekt lagres partiklene ifølge foreliggende oppfinnelse i en løsning, f.eks. hvori forholdet mellom lagringsløsning og biopolymerpartikler er minst mellom 1:1 og 1:100. According to a further aspect, the particles according to the present invention are stored in a solution, e.g. wherein the ratio of storage solution to biopolymer particles is at least between 1:1 and 1:100.
Ifølge nok et aspekt kan de ikke-humane spermatozoene innstøpes sammen med forbindelser eller midler som er gunstige i lys av befruktningsevnen og/eller dyrehelsen, f.eks. én eller flere forbindelser eller midler utvalgt fra den ikke-begrensede gruppe som består av fortynningsmidler, frysebeskyttende midler, antibiotika, antistoffer, antioksidanter, proteiner og hormoner. According to yet another aspect, the non-human spermatozoa can be embedded with compounds or agents that are beneficial in terms of fertility and/or animal health, e.g. one or more compounds or agents selected from the non-limiting group consisting of diluents, cryoprotectants, antibiotics, antibodies, antioxidants, proteins and hormones.
Ifølge et annet aspekt av oppfinnelsen innstøpes spermatozoene sammen med én eller flere antioksidanter utvalgt fra gruppen som består av pyruvat, 2,2,6,6-tetrametylpeperidin-1 -oksyl, 4-hydroksy-2,2,6,6-tetra-metyl-peperidin-1 -okyl, superoksid-dismutase, katalase, glutationperoksydase, butylert hydroksytoluen og butylert hydroksyanisol. According to another aspect of the invention, the spermatozoa are embedded together with one or more antioxidants selected from the group consisting of pyruvate, 2,2,6,6-tetramethylpeperidine-1-oxyl, 4-hydroxy-2,2,6,6-tetra- methyl-peperidine-1-ocyl, superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, butylated hydroxytoluene and butylated hydroxyanisole.
Ifølge ett aspekt er biopolymerpartiklene belagte. Belegget kan være utvalgt fra den ikke-begrensede gruppen som består av polylysin, chitosan, cellulosesulfat, hydroksypropylmetylcellulose og polydiallyldimetylammoniumklorid. According to one aspect, the biopolymer particles are coated. The coating may be selected from the non-limiting group consisting of polylysine, chitosan, cellulose sulfate, hydroxypropylmethylcellulose, and polydiallyldimethylammonium chloride.
Biopolymerpartiklene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter ikke-humane spermatozoer som er oppsamlet fra et dyr som er utvalgt fra den ikke-begrensede gruppen som består av gris, storfe, hest, sau, geit, kanin, fjærfe, kjæledyr, f.eks. hunder med stamtre, vanndyr og utrydningstruede dyrearter, fortrinnsvis gris, storfe, pelsdyr og hest. Biopolymerpartiklene ifølge foreliggende oppfinnelse kan følgelig anvendes for å oppnå befruktning i et tilhørende hunndyr ved alminnelige fremgangsmåter for kunstig befruktning som AI, IVF og ICSI. The biopolymer particles of the present invention comprise non-human spermatozoa collected from an animal selected from the non-limiting group consisting of pig, cattle, horse, sheep, goat, rabbit, poultry, pet, e.g. pedigree dogs, aquatic animals and endangered animal species, preferably pigs, cattle, fur animals and horses. The biopolymer particles according to the present invention can consequently be used to achieve fertilization in an associated female animal by general methods for artificial fertilization such as AI, IVF and ICSI.
Ifølge ett aspekt av oppfinnelsen foreligger de ikke-humane spermatozoene som anvendes for dannelse av partikkelen i sædvæske. According to one aspect of the invention, the non-human spermatozoa used to form the particle are present in seminal fluid.
Om ønskelig kan biopolymerpartikkelen behandles videre ved dehydratisering, frysekonservering eller frysetørking. If desired, the biopolymer particle can be further processed by dehydration, freeze preservation or freeze drying.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av partiklene ifølge oppfinnelsen hvori en blanding av alginat som er rikt på guluronsyre og ikke-humane spermatozoer dråpevis tilsettes til en geldannende løsning. Den geldannende løsningen omfatter ifølge ett aspekt av oppfinnelsen ett eller flere av følgende ioner utvalgt fra den ikke-begrensende gruppen som består av kalsiumioner, natriumioner, bariumioner og magnesiumioner, fortrinnsvis kalsium-og natriumioner. The invention also provides a method for producing the particles according to the invention in which a mixture of alginate rich in guluronic acid and non-human spermatozoa is added dropwise to a gel-forming solution. According to one aspect of the invention, the gel-forming solution comprises one or more of the following ions selected from the non-limiting group consisting of calcium ions, sodium ions, barium ions and magnesium ions, preferably calcium and sodium ions.
Videre kan biopolymerpartiklene om ønskelig dannes direkte i en sædbeholder. Furthermore, if desired, the biopolymer particles can be formed directly in a seed container.
Ifølge ett aspekt av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen behandles partiklene videre ved dehydrati sering, frysekonservering eller frysetørking. According to one aspect of the method according to the invention, the particles are further processed by dehydration, freeze preservation or freeze drying.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også anvendelse av biopolymerpartiklene ifølge oppfinnelsen ved avl av dyr, f.eks. gris, storfe, hest, sau, geit, kanin, fjærfe, kjæledyr, f.eks. hunder med stamtavle, pelsdyr, vanndyr og utrydningstruede dyrearter. Ifølge ett aspekt av oppfinnelsen anvendes biopolymerpartiklene ved avl av gris, storfe eller hest. Ifølge ett aspekt insemineres partiklene direkte. Ifølge ytterligere et aspekt oppløses partiklene før inseminasjonen. Ifølge nok et aspekt anvendes partiklene ifølge oppfinnelsen sammen med frie, immobiliserte, ikke-humane spermatozoer. The present invention also provides for the use of the biopolymer particles according to the invention in animal breeding, e.g. pig, cattle, horse, sheep, goat, rabbit, poultry, pets, e.g. pedigree dogs, fur animals, aquatic animals and endangered animal species. According to one aspect of the invention, the biopolymer particles are used in the breeding of pigs, cattle or horses. According to one aspect, the particles are inseminated directly. According to a further aspect, the particles are dissolved before insemination. According to yet another aspect, the particles according to the invention are used together with free, immobilized, non-human spermatozoa.
Endelig beskrives en fremgangsmåte for befruktning av et dyr hvori ikke-humane spermatozoer som er konservert i partikler ifølge foreliggende oppfinnelse innføres i et mottakerhunndyr. Finally, a method for fertilization of an animal is described in which non-human spermatozoa which are preserved in particles according to the present invention are introduced into a recipient female animal.
Kort beskrivelse av figurene Brief description of the figures
Fig. 1 viser in vitro-lagring av spermatozoer fra storfe (felt A) og galte (felt B) ved romtemperatur (storfe ved 20°C, galte ved 18°C). Motilitetsverdiene er gitt som funksjon av lagringstiden for referanseprøver og prøver med immobiliserte spermatozoer. Fig. 2 viser in vitro-lagring av spermatozoer fra storfe (felt A) og galte (felt B) ved 37°C. Motilitetsverdiene er gitt som funksjon av lagringstiden for referanseprøver og prøver med immobiliserte spermatozoer. Fig. 3 viser in vitro-lagring av galtespermatozoer ved romtemperatur (18°C). Motilitetsverdier er gitt som funksjon av lagringstiden for referanseprøver og prøver med immobiliserte spermatozoer. Forskjellige mengder av lagringsmedium relativt til kulemengden har blitt anvendt i lagringseksperimentene, som angitt ut fra seriebetegnelsen. Spermatozoene er immobilisert i kuler med en diameter på 1 mm ved en konsentrasjon på 1 x IO<9>spermatozoer/ml. Fig. 4: in vitro-lagring av galtespermatozoer ved romtemperatur (18°C). Motilitetsverdier er gitt som funksjon av lagringstiden for prøver med immobiliserte spermatozoer. Kuler med forskjellige konsentrasjoner av immobiliserte spermatozoer anvendes i lagringseksperimentene, som angitt i seriebetegnelsen. Spermatozoene er immobilisert i kuler med en diameter på 3 mm. Fig. 1 shows in vitro storage of spermatozoa from cattle (field A) and boars (field B) at room temperature (cattle at 20°C, boars at 18°C). The motility values are given as a function of the storage time for reference samples and samples with immobilized spermatozoa. Fig. 2 shows in vitro storage of spermatozoa from cattle (field A) and boars (field B) at 37°C. The motility values are given as a function of the storage time for reference samples and samples with immobilized spermatozoa. Fig. 3 shows in vitro storage of boar spermatozoa at room temperature (18°C). Motility values are given as a function of storage time for reference samples and samples with immobilized spermatozoa. Different amounts of storage medium relative to the amount of balls have been used in the storage experiments, as indicated by the series designation. The spermatozoa are immobilized in spheres with a diameter of 1 mm at a concentration of 1 x 10<9> spermatozoa/ml. Fig. 4: in vitro storage of boar spermatozoa at room temperature (18°C). Motility values are given as a function of storage time for samples with immobilized spermatozoa. Beads with different concentrations of immobilized spermatozoa are used in the storage experiments, as indicated in the series designation. The spermatozoa are immobilized in spheres with a diameter of 3 mm.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen Detailed description of the invention
Som tidligere beskrevet har hovedfokus for forskningen tidligere vært rettet mot innkapsling av spermatozoer for å forenkle in vitro-fertilisering og kunstig inseminasjon. De foreliggende oppfinnere har tatt en fundamentalt forskjellig tilnærming til immobilisering av spermatozoer, hvori spermatozoene innstøpes i en gel eller et biopolymernettverk inne i en fast gelpartikkel og hvori biopolymernettverket består av alginat som er rikt på guluronsyre. Denne tilnærmingen er fundamentalt forskjellig fra den innkapsling av spermatozoer som er beskrevet innen teknikkens stand, hvori spermatozoer foreligger i en kapsel med en flytende kjerne hvori spermatozoene kan bevege seg rundt, som i sitt naturlige miljø. Biopolymerpartiklene som omslutter spermatozoene ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke avhengige av anvendelse av løsninger som sikrer at spermatozoene forblir i en ikke-kapasitert tilstand. As previously described, the main focus of the research has previously been aimed at encapsulating spermatozoa to facilitate in vitro fertilization and artificial insemination. The present inventors have taken a fundamentally different approach to the immobilization of spermatozoa, in which the spermatozoa are embedded in a gel or a biopolymer network inside a solid gel particle and in which the biopolymer network consists of alginate which is rich in guluronic acid. This approach is fundamentally different from the encapsulation of spermatozoa described in the prior art, in which spermatozoa are contained in a capsule with a liquid core in which the spermatozoa can move around, as in their natural environment. The biopolymer particles which enclose the spermatozoa according to the present invention do not depend on the use of solutions which ensure that the spermatozoa remain in a non-capacitated state.
Begrepet "innstøpe" eller "innstøping" skal som det anvendes heri forstås som immobilisering av spermatozoer som følge av at spermatozoene forhindres fra å ha sin naturlige mulighet til bevegelse. Immobiliseringsgraden vil variere avhengig av biopolymerpartikkelens egenskaper, f.eks. mekanisk styrke og typen av polymer som anvendes. Det skal imidlertid forstås at spermatozoene som er innstøpt i biopolymerpartiklene ifølge foreliggende oppfinnelse er forhindret fra å ha den naturlige mulighet for bevegelse som spermatozoene ellers ville ha dersom de var lagret i væske, f.eks. i en flytende kjerne i en kapsel. The term "embedding" or "embedding" as used herein shall be understood as immobilization of spermatozoa as a result of the spermatozoa being prevented from having their natural opportunity for movement. The degree of immobilization will vary depending on the properties of the biopolymer particle, e.g. mechanical strength and the type of polymer used. However, it should be understood that the spermatozoa embedded in the biopolymer particles according to the present invention are prevented from having the natural possibility of movement that the spermatozoa would otherwise have if they were stored in liquid, e.g. in a liquid core in a capsule.
Begrepet "biopolymerpartikkel" betyr som anvendt heri en partikkel som når den omfatter spermatozoer fører til redusert mulighet til bevegelse. Biopolymerpartiklene ifølge foreliggende oppfinnelse består av et materiale som danner et nettverk som består av en alginatgel som er rik på guluronsyre. Biopolymerpartikkelens funksjon når det gjelder konservering av spermatozoer er uavhengig av den tredimensjonale form til biopolymerpartiklene ifølge foreliggende oppfinnelse. Biopolymerpartiklene ifølge foreliggende oppfinnelse kan følgelig ha forskjellige former, f.eks. kuleformet eller sylindrisk form. The term "biopolymer particle" as used herein means a particle which, when it includes spermatozoa, leads to a reduced possibility of movement. The biopolymer particles according to the present invention consist of a material which forms a network consisting of an alginate gel which is rich in guluronic acid. The biopolymer particle's function in terms of preservation of spermatozoa is independent of the three-dimensional shape of the biopolymer particles according to the present invention. The biopolymer particles according to the present invention can therefore have different shapes, e.g. spherical or cylindrical shape.
Alginat er en polymer som består av guluronsyre (G) og mannuronsyre (M). Alginat er en alminnelig bestanddel av celleveggen hos alle arter av bruntang ( Pheophyceae) og ekstraheres vanligvis med en alkalisk løsning. Forholdet mellom mannuronsyre og guluronsyre (M/G) i alginat varierer innen vide grenser avhengig av de spesifikke alginofytene (alginatproduserende tang) og gjennom de forskjellige årstidene. Alginate is a polymer consisting of guluronic acid (G) and mannuronic acid (M). Alginate is a common component of the cell wall of all species of brown seaweed (Pheophyceae) and is usually extracted with an alkaline solution. The ratio between mannuronic acid and guluronic acid (M/G) in alginate varies within wide limits depending on the specific alginophytes (alginate-producing seaweeds) and through the different seasons.
Alginat syntetiseres også av Pseudomonas- og Azotobacter-bakterier (Svanem et al., Alginate is also synthesized by Pseudomonas and Azotobacter bacteria (Svanem et al.,
(2001), The Journal of Biological Chemistry, bind 276:34, 31542-31550, Jain et al., (2001), The Journal of Biological Chemistry, Vol 276:34, 31542-31550, Jain et al.,
(2003), Molecular Microbiology, 47(4), 1123-1133, Scott og Quatrano (1982), Applied and Environmental Microbiology, 44:3, 754-756. (2003), Molecular Microbiology, 47(4), 1123-1133, Scott and Quatrano (1982), Applied and Environmental Microbiology, 44:3, 754-756.
Alginater anvendes hyppig i f.eks. matindustrien som f.eks. stabilisatorer og for viskositetskontroll, og i den farmasøytiske og kosmetiske industri som f.eks. desintegrasjonsmiddel. For de forskjellige formål er både alginater som er rike på guluronsyre og alginater som er rike på mannuronsyre tilgjengelige (Mancini et al., Alginates are frequently used in e.g. the food industry such as stabilizers and for viscosity control, and in the pharmaceutical and cosmetic industry such as e.g. disintegration agent. For the different purposes, both alginates rich in guluronic acid and alginates rich in mannuronic acid are available (Mancini et al.,
(1999), Journal of Food Engineering 39, 369-378) og forskjellige fremgangsmåter for fremstilling av alginater som er rike på guluronsyre er kjent, se WO 8603781, US patentskrift nr. 4 990 601 og US patentskrift nr. 5 639 467). (1999), Journal of Food Engineering 39, 369-378) and various methods for preparing alginates rich in guluronic acid are known, see WO 8603781, US Patent No. 4,990,601 and US Patent No. 5,639,467).
Begrepet "alginat som er rikt på guluronsyre" eller "G-rikt alginat" betyr som anvendt heri alginat som omfatter en høyere mengde av guluronsyre enn mannuronsyre i polymerkjedene som utgjør polysakkaridet. Eksempler på forståelsen av begrepet "G-rikt", slik dette alminnelig anvendes av fagpersoner, er åpenbare ut fra teknikkens stand, slik denne er beskrevet i de to avsnittene ovenfor. The term "alginate rich in guluronic acid" or "G-rich alginate" as used herein means alginate which comprises a higher amount of guluronic acid than mannuronic acid in the polymer chains that make up the polysaccharide. Examples of the understanding of the term "G-rich", as it is commonly used by professionals, are obvious from the state of the art, as described in the two paragraphs above.
Alginatgeler dannes grunnet interaksjoner mellom divalente ioner, f.eks. Ca<2+>, og blokkstrukturer av guluronsyre i alginatpolymerkjeden. Dannelsen av alginatgeler kan følgelig skje ved svært milde betingelser og er egnet for immobilisering av en celle. Alginatgeler har følgelig hyppig blitt anvendt for immobilisering av forskjellige celletyper. Immobilisering i alginat anvendes imidlertid hyppigst som et utgangspunkt for senere dannelse av forskjellige typer av kapsler med en flytende kjerne. Alginate gels are formed due to interactions between divalent ions, e.g. Ca<2+>, and block structures of guluronic acid in the alginate polymer chain. The formation of alginate gels can therefore take place under very mild conditions and is suitable for the immobilization of a cell. Alginate gels have consequently been frequently used for the immobilization of different cell types. However, immobilization in alginate is most frequently used as a starting point for later formation of different types of capsules with a liquid core.
Når det i det påfølgende vises til alginat, alginatgel, alginatnettverk eller biopolymerpartikkel ifølge foreliggende oppfinnelse skal det forstås at alginatet, alginatgelen, alginatpartikkelen, biopolymernettverket eller partikkelen ifølge foreliggende oppfinnelse er rik på guluronsyre. In the following, when reference is made to alginate, alginate gel, alginate network or biopolymer particle according to the present invention, it should be understood that the alginate, alginate gel, alginate particle, biopolymer network or particle according to the present invention is rich in guluronic acid.
Ikke-begrensende eksempler på egnede alginattyper er FMC LF 10/40, FMC LF 10/60 og FMC LF 20/60, som er tilgjengelige fra FMC Biopolymer AS, Drammen, Norge, eller A2033 fra Sigma, Oslo, Norge. Non-limiting examples of suitable alginate types are FMC LF 10/40, FMC LF 10/60 and FMC LF 20/60, which are available from FMC Biopolymer AS, Drammen, Norway, or A2033 from Sigma, Oslo, Norway.
Begrepet "lagringstid" betyr som anvendt heri tidsrommet hvor spermatozoene bevarer befruktningsevnen, både når det gjelder in vitro-lagring før inseminasjonen og in vivo etter inseminasjon i mottakerdyret. Den spesifikke lagringstid for spermatozoer av forskjellig opphav kan variere. Ikke desto mindre tilveiebringer det her beskrevne konserveringsssystem, hvori spermatozoer er innstøpt i biopolymerpartikler ifølge foreliggende oppfinnelse, lengre lagringstid etter inseminasjonen sammenlignet med spermatozoer som insemineres etter konvensjonelle lagringsfremgangsmåter etter sædoppsamlingen. Ifølge ett eksempel på oppfinnelsen bevarer spermatozoer fra gris en utmerket befruktningsevne i mer enn 12 timer etter inseminasjonen, mer foretrukket mer enn 24 timer etter inseminasjonen. Ifølge ytterligere et eksempel på oppfinnelsen bevarer oksespermatozoer en utmerket befruktningsevne i mer enn 12 timer etter inseminasjonen, mer foretrukket mer enn 24 timer etter inseminasjonen. The term "storage time" as used herein means the period of time during which the spermatozoa retain their fertilizing capacity, both when it comes to in vitro storage before insemination and in vivo after insemination in the recipient animal. The specific storage time for spermatozoa of different origins can vary. Nevertheless, the preservation system described here, in which spermatozoa are embedded in biopolymer particles according to the present invention, provides a longer storage time after insemination compared to spermatozoa which are inseminated by conventional storage methods after the semen collection. According to one example of the invention, porcine spermatozoa retain excellent fertilizing ability for more than 12 hours after insemination, more preferably more than 24 hours after insemination. According to a further example of the invention, bull spermatozoa retain excellent fertilizing ability for more than 12 hours after insemination, more preferably more than 24 hours after insemination.
Begrepet "avl" betyr som anvendt heri hvilken som helst fremgangsmåte som anvendes for å oppnå drektighet i et hunndyr. En ikke-begrensende liste over slike fremgangsmåter omfatter IVF, kunstig inseminasjon og ICSI. Videre omfatter avl for tilveiebringelse av dyr med spesifikke, ønskede egenskaper og når det gjelder kommersiell produksjon. The term "breeding" as used herein means any method used to achieve pregnancy in a female animal. A non-limiting list of such procedures includes IVF, artificial insemination and ICSI. Furthermore, it includes breeding for the provision of animals with specific, desired characteristics and when it comes to commercial production.
Begrepet "spermatozo" omfatter som anvendt heri spermatozoer som sådanne, og også spermatozoer som foreligger i sædvæske, dvs. sæd som kan anvendes direkte ved dannelse av biopolymerene ifølge foreliggende oppfinnelse. Imidlertid kan også spermatozoer som er isolert fra sædvæsken og som om ønskelig foreligger i andre egnede lagringsløsninger anvendes for dannelse av biopolymerpartiklene ifølge foreliggende oppfinnelse. The term "spermatozoa" as used herein includes spermatozoa as such, and also spermatozoa present in seminal fluid, i.e. sperm which can be used directly in the formation of the biopolymers according to the present invention. However, spermatozoa which have been isolated from the seminal fluid and which, if desired, are present in other suitable storage solutions can also be used to form the biopolymer particles according to the present invention.
Begrepet "sædbeholder" omfatter som anvendt heri alle emballasjeformer som er egnet for oppbevaring og lagring av spermatozoer. The term "semen container" as used herein includes all forms of packaging that are suitable for the storage and storage of spermatozoa.
De tidligere innkapslingsfremgangsmåtene som er beskrevet innen teknikkens stand og som er diskutert ovenfor er arbeidskrevende, og The previous encapsulation methods described in the prior art and discussed above are labor intensive, and
immobiliseringsfremgangsmåtene omfatter normalt flere trinn. Derimot kan fremstillingen av biopolymerpartikler ifølge foreliggende oppfinnelse utføres i en ett-trinns fremgangsmåte. Nærmere bestemt dannes kalsiumalginatpartikler som inneholder spermatozoer lett, med minimalt fysiologisk og kjemisk stress for de immobiliserte cellene. Alginatpartikler kan fremstilles i forskjellige størrelser og former og med varierende alginattyper, alginatkonsentrasjoner og konsentrasjoner av immobiliserte spermatozoer. the immobilization procedures normally involve several steps. In contrast, the production of biopolymer particles according to the present invention can be carried out in a one-step process. Specifically, calcium alginate particles containing spermatozoa are readily formed, with minimal physiological and chemical stress to the immobilized cells. Alginate particles can be produced in different sizes and shapes and with varying alginate types, alginate concentrations and concentrations of immobilized spermatozoa.
For det formål å innstøpe spermatozoer ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendelsen av alginat som biopolymermateriale spesielt godt egnet, grunnet det faktum at i) man kan danne geler under milde betingelser, ii) alginat er ikke-toksisk, både for spermatozoer og mottakerdyret, og iii) alginat oppløses under fysiologiske betingelser og kan følgelig frigjøre spermatozoene i uterus eller cervix. For the purpose of embedding spermatozoa according to the present invention, the use of alginate as a biopolymer material is particularly well suited, due to the fact that i) gels can be formed under mild conditions, ii) alginate is non-toxic, both for spermatozoa and the recipient animal, and iii) alginate dissolves under physiological conditions and can consequently release the spermatozoa in the uterus or cervix.
Ifølge ett aspekt av den foreliggende oppfinnelse fremstilles alginatpartiklene ved å tilsette en løsning som omfatter alginat og spermatozoer dråpevis til en geldannende løsning, noe som fører til dannelse av alginatkuler med innstøpte spermatozoer. According to one aspect of the present invention, the alginate particles are produced by adding a solution comprising alginate and spermatozoa dropwise to a gel-forming solution, which leads to the formation of alginate balls with embedded spermatozoa.
Fremstillingen av alginatkuler er kjent blant fagfolk, f.eks. som beskrevet i Smidsrød, O. og Skjåk-Bræk, G. (1990) Alginate as immobilization matrix for cells. Trends in Biotechnology, 8, 71-78 og US patentskrift nr. 6 497 902. The production of alginate beads is known to those skilled in the art, e.g. as described in Smidsrød, O. and Skjåk-Bræk, G. (1990) Alginate as immobilization matrix for cells. Trends in Biotechnology, 8, 71-78 and US Patent No. 6,497,902.
Forskjellige gelløsninger kan anvendes for dannelse av biopolymerpartikler, f.eks. alginatkuler. De forskjellige løsningene som er egnet for dannelse av forskjellige biopolymerpartikler ligger innenfor kunnskapsområdet til fagpersonen. Ifølge den foreliggende oppfinnelse kan bivalente ioner (også heri betegnet geldannende ioner), f.eks. kalsium og barium, anvendes for dannelse av alginatpartiklene, f.eks. for å oppnå geldannelse av alginatet. Alginat danner geler i nærvær av mange bivalente ioner og multivalente ioner. Anvendelse av kalsiumioner fører til hurtig geldannelse og relativt sterke partikler. På den annen side fører anvendelse av bariumioner til enda sterkere partikler som er mer stabile under fysiologiske betingelser. Det skal forstås at typen av geldannende ion og mengden av det som anvendes for dannelse av biopolymerpartikler ifølge foreliggende oppfinnelse kan variere avhengig av blant annet den ønskede styrke av den dannede gel, typen av alginat som anvendes og konsentrasjonen av det, guluronsyreinnholdet og G-blokklengden i alginatet, typen spermatozoer som anvendes og kilden for disse, typen av andre midler som skal innføres i partiklene (f.eks. antibiotika, fortynnignsmidler, antioksidanter, osv.), og at slike modifikasjoner ligger innenfor foreliggende oppfinnelses omfang. Basert på teknikkens stand og retningslinjene i den foreliggende beskrivelse vil fagpersonen uten omfattende belastning kunne identifisere og fastsette forskjellige forbindelser som kan innstøpes sammen med spermatozoene i biopolymerpartiklene ifølge foreliggende oppfinnelse. Different gel solutions can be used for the formation of biopolymer particles, e.g. alginate balls. The different solutions which are suitable for the formation of different biopolymer particles are within the knowledge of the person skilled in the art. According to the present invention, bivalent ions (also referred to herein as gel-forming ions), e.g. calcium and barium, are used to form the alginate particles, e.g. to achieve gelation of the alginate. Alginate forms gels in the presence of many bivalent ions and multivalent ions. Application of calcium ions leads to rapid gel formation and relatively strong particles. On the other hand, the use of barium ions leads to even stronger particles that are more stable under physiological conditions. It should be understood that the type of gel-forming ion and the amount of it used for the formation of biopolymer particles according to the present invention may vary depending, among other things, on the desired strength of the gel formed, the type of alginate used and its concentration, the guluronic acid content and the G-block length in the alginate, the type of spermatozoa used and the source of these, the type of other agents to be introduced into the particles (e.g. antibiotics, diluents, antioxidants, etc.), and that such modifications are within the scope of the present invention. Based on the state of the art and the guidelines in the present description, the expert will be able to identify and determine different compounds that can be embedded together with the spermatozoa in the biopolymer particles according to the present invention without extensive burden.
Ifølge ett aspekt av den foreliggende oppfinnelse anvendes kalsiumioner og natriumioner for dannelse av biopolymerpartikler. Ved å variere alginatkonsentrasjonen og graden av kryssbinding kan man følgelig erholde partikler med forskjellige frigjøringsegenskaper for spermatozoer og som f.eks. er tilpasset spesifikke dyrearter eller spesifikke ovulasjonsbetingelser i forskjellige dyr. According to one aspect of the present invention, calcium ions and sodium ions are used to form biopolymer particles. By varying the alginate concentration and the degree of cross-linking, one can consequently obtain particles with different release properties for spermatozoa and which, e.g. are adapted to specific animal species or specific ovulation conditions in different animals.
I tillegg påvirker alginatkonsentrasjonen biopolymerpartiklenes mekaniske egenskaper, og følgelig også partiklenes oppløsningsegenskaper. Alginatkonsentrasjonen kan følgelig variere avhengig av de oppløsningsegenskaper som er nødvendige i hvert tilfelle, avhengig av f.eks. mottakerdyret. Fagpersonen vil, basert på sine generelle kunnskaper og retningslinjene som gis heri, og uten omfattende belastning fastsette de forskjellige anvendbare konsentrasjoner av G-rikt alginat som skal anvendes ved fremstilling av biopolymerpartikler ifølge foreliggende oppfinnelse. Ifølge ett aspekt av oppfinnelsen er alginatkonsentrasjonen i biopolymerpartiklene ifølge foreliggende oppfinnelse mellom minst 0,1 og 6 %. In addition, the alginate concentration affects the biopolymer particles' mechanical properties, and consequently also the particles' dissolution properties. The alginate concentration can therefore vary depending on the dissolution properties that are necessary in each case, depending on e.g. the recipient animal. The professional will, based on his general knowledge and the guidelines given herein, and without extensive burden, determine the different applicable concentrations of G-rich alginate to be used in the production of biopolymer particles according to the present invention. According to one aspect of the invention, the alginate concentration in the biopolymer particles according to the present invention is between at least 0.1 and 6%.
Konsentrasjonen av spermatozoer som er innstøpt i biopolymerpartiklene ifølge foreliggende oppfinnelse kan avhenge av f.eks. typen av spermatozoer og kilden for dem, rase, mottakerdyret, inseminasjonsteknikken eller -systemet, fertiliseringsteknikker eller -systemer, nærvær av andre midler som inngår i partiklene (antibiotika, antioksidanter, fortynningsmidler, proteiner, osv.). I prinsippet er det ingen lavere grense for spermatozokonsentrasjonen, og konsentrasjonen kan variere avhengig av f.eks. fertiliseringsfremgangsmåten, spermatozoenes opphav, mottakerdyret, biopolymerpartiklenes oppløsningsegenskaper, osv. Ved hjelp av retningslinjene ifølge den foreliggende beskrivelse og generelle kunnskaper kan fagpersonen uten omfattende eksperimentering fastsette den egnede spermatozokonsentrasjonen som skal anvendes i hvert tilfelle, basert på den ønskede fertiliseringsfremgangsmåte, spermatozoenes opphav, mottakerdyret, osv. Det skal forstås at lavere mengder av spermatozoer kan anvendes dersom ICSI anvendes som den ønskede fertiliseringsfremgangsmåte, sammenlignet med f.eks. kunstig inseminasjon. The concentration of spermatozoa embedded in the biopolymer particles according to the present invention may depend on e.g. the type of spermatozoa and their source, breed, recipient animal, insemination technique or system, fertilization techniques or systems, presence of other agents included in the particles (antibiotics, antioxidants, diluents, proteins, etc.). In principle, there is no lower limit for the spermatozoa concentration, and the concentration can vary depending on e.g. the method of fertilization, the origin of the spermatozoa, the recipient animal, the dissolution properties of the biopolymer particles, etc. With the help of the guidelines according to the present description and general knowledge, the person skilled in the art can determine, without extensive experimentation, the suitable spermatozoa concentration to be used in each case, based on the desired method of fertilization, the origin of the spermatozoa, the recipient animal, etc. It should be understood that lower amounts of spermatozoa can be used if ICSI is used as the desired fertilization method, compared to e.g. artificial insemination.
Ifølge ett aspekt av oppfinnelsen er følgelig spermatozokonsentrasjonen minst 0,1 x IO<6>spermatozoer/ml. Accordingly, according to one aspect of the invention, the spermatozoa concentration is at least 0.1 x 10<6> spermatozoa/ml.
Funnene i den foreliggende oppfinnelse viser at for noen dyr forlenges overlevelsen av spermatozoene i stor grad med økende spermatozokonsentrasjon. Ifølge ett eksempel på den foreliggende oppfinnelse innstøpes følgelig minst 2,5 x IO<9>grisespermatozoer/ml i biopolymerpartikkelen (jfr. fig. 4). Imidlertid fører også 100 x IO<6>grisespermatozoer/ml til drektighet i hunndyret. For oksespermatozoer kan det samme konsentrasjonsområdet som for grisespermatozoer anvendes. The findings in the present invention show that for some animals the survival of the spermatozoa is extended to a large extent with increasing spermatozoa concentration. According to one example of the present invention, at least 2.5 x 10<9> pig spermatozoa/ml are consequently embedded in the biopolymer particle (cf. Fig. 4). However, 100 x IO<6>pig spermatozoa/ml also lead to pregnancy in the female animal. For bull spermatozoa, the same concentration range as for pig spermatozoa can be used.
Konsentrasjonen av spermatozoene i biopolymerpartiklene kan videre modifiseres ved å endre spermatozomengden relativt til alginatmengden før geldannelsen eller ved å oppkonsentrere eller fortynne spermatozoløsningen før alginatløsningen og løsningen som omfatter spermatozoer sammenblandes. Siden modifikasjonen av mengden av spermatozoer til syvende og sist fører til en modifikasjon av alginatkonsentrasjonen i de erholdte partikler må imidlertid alginatkonsentrasjonen i utgangsalginatløsningen justeres dersom alginatkonsentrasjonen i biopolymerpartiklene skal opprettholdes. Grunnet den høye viskositet av alginat i løsning kan det være praktisk vanskelig å anvende en alginatløsning med mer enn 4-6 % alginat. Ifølge ett aspekt av oppfinnelsen består følgelig biopolymerpartiklene av alginat med lav viskositet. The concentration of the spermatozoa in the biopolymer particles can be further modified by changing the amount of spermatozoa relative to the amount of alginate before gel formation or by concentrating or diluting the spermatozoa solution before the alginate solution and the solution comprising spermatozoa are mixed together. However, since the modification of the amount of spermatozoa ultimately leads to a modification of the alginate concentration in the particles obtained, the alginate concentration in the starting alginate solution must be adjusted if the alginate concentration in the biopolymer particles is to be maintained. Due to the high viscosity of alginate in solution, it can be practically difficult to use an alginate solution with more than 4-6% alginate. Accordingly, according to one aspect of the invention, the biopolymer particles consist of low viscosity alginate.
I tillegg er spermatozoene som er innstøpt i biopolymerpartiklene ifølge foreliggende oppfinnelse i en viss grad isolert fra det omgivende miljø og frigjøres ikke før kalsiumalginatgelnettverket oppløses. Videre oppløses kalsiumalginatgelnettverket langsomt under fysiologiske betingelser, noe som fører til en langsom frigjøring av spermatozoer fra immobiliseringsstøttemidlet. Grunnet denne virkningen kan spermatozoer med befruktende evne foreligge over et lenger tidsrom. Oppløsningshastigheten kan kontrolleres ved å anvende forskjellige typer av belegg på immobiliseringsstøttemidlet. Forskjellige anvendbare belegg er kjente, innbefattet, men ikke begrenset til, polylysin, chitosan, cellulosesulfat, hydroksypropylmetylcellulose eller polydiallyldimetylammoniumklorid. In addition, the spermatozoa embedded in the biopolymer particles according to the present invention are to a certain extent isolated from the surrounding environment and are not released until the calcium alginate gel network dissolves. Furthermore, the calcium alginate gel network dissolves slowly under physiological conditions, leading to a slow release of spermatozoa from the immobilization support. Due to this effect, spermatozoa with fertilizing ability can be present over a longer period of time. The dissolution rate can be controlled by applying different types of coatings to the immobilization support. Various useful coatings are known, including, but not limited to, polylysine, chitosan, cellulose sulfate, hydroxypropylmethylcellulose, or polydiallyldimethylammonium chloride.
For ytterligere å forbedre spermatozokvaliteten kan spermatozoene innstøpes sammen med forskjellige løsninger av betydning for overlevelse og vitalitet av spermatozoer. Ifølge én utførelse av oppfinnelsen inngår et fortynningsmiddel i biopolymerpartiklene ifølge foreliggende oppfinnelse. To further improve spermatozoa quality, the spermatozoa can be embedded together with different solutions of importance for the survival and vitality of the spermatozoa. According to one embodiment of the invention, a diluent is included in the biopolymer particles according to the present invention.
Fortynningsmidler for spermatozoer anvendes hyppig av flere grunner: Diluents for spermatozoa are frequently used for several reasons:
- for å øke volumet - to increase the volume
- for å standardisere sædcelletallet i AI-dosen - to standardize the sperm count in the AI dose
- for å oppnå bufferkapasitet - to achieve buffer capacity
- for å oppnå et fysiologisk miljø når det gjelder osmolaritet - to achieve a physiological environment in terms of osmolarity
- for å tilføre næring til sædcellene - to supply nutrition to the sperm cells
- for å kontrollere mikrobiologisk kontaminering (antibiotika), eller, når det gjelder frysekonservering: - to control microbiological contamination (antibiotics), or, in the case of cryopreservation:
- for å beskytte sædcellene mot fryse- og tineskader. - to protect the sperm from freezing and thawing damage.
Det ligger godt innenfor kunnskapsområdet for fagpersonen å utvelge et egnet fortynningsmiddel som kan anvendes i biopolymerpartikler ifølge foreliggende oppfinnelse basert på f.eks. spermatozotypen (opphavet), arten, konserveringsfremgangsmåten, lagringstemperaturen, It is well within the scope of knowledge for the professional to select a suitable diluent that can be used in biopolymer particles according to the present invention based on e.g. the spermatozoon type (origin), the species, the preservation method, the storage temperature,
inseminasjonsfremgangsmåten, dyresanitære krav og internasjonal lovgivning. Melkefortynningsmidler og TRIS er bare noen få ikke-begrensende eksempler på fortynningsmidler blant et stort antall anvendbare, kommersielt tilgjengelige fortynningsmidler for spermatozoer. Et annet anvendbart fortynningsmiddel er fortynningsmidlet som rapporteres i Aalbers, JG, Rademaker, JHM, Grooten, HJG og Johnson, LA, 1983: Fecundity of boar sem en stored in BTS, Kiev, Zorlezco and Modena extenders under filed conditions. J. Anim. Sei. 75 (Suppl. 1), 314-315 og Aalbers, JG, Johnson, LA, Rademaker, JHM og Grooten HJG, 1984: Use of boar spermatozoa for AI: fertility and morphology of semen diluted in BTS and used for insemination within 24 hrs or 25 til 48 hrs after collection. Proe. 10* Int Congr. Anim. Reprod and Artif. Insemin. Urbana IL, bind II, nr. 180, s. 1-3, som hyppig betegnes BTS. BTS er kommersielt tilgjengelig fra Minitub i Tyskland. (Minitub Abfull- und Labortechnik GmbH & Co., Hauptstrasse 41, D-84184, Tiefenbach, Tyskland. ;Nok et anvendbart fortynningsmiddel er fortynningsmidlet Tri X-Cell™, som er kommersielt tilgjengelig fra IMV (Instrument de Medecine Veterinaire, 10, rue Georges Clemenceau, B.P. 81, FR-61302 L'AIGLE Cedex, Frankrike). ;De forskjellige fortynningsmidlene skiller seg fra hverandre når det gjelder sammensetning, pH, bufferkapasitet, osmolaritet og antibiotika. Mange er offentliggjort, mens andre er kommersielle hemmeligheter. De enkleste fortynningsmidlene består kun av forskjellige sukkerløsninger, f.eks. laktose og glukose. Basert på fagpersonens generelle kunnskaper innen feltet konservering av sædceller vil det forstås at forskjellige fortynningsmidler kan anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse. Typen av fortynningsmidler som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse kan variere avhengig av sædcellenes opphav, typen av polymer som anvendes, konserveringsfremgangsmåten, lagringstemperaturen, osv. Det ligger godt innenfor fagpersonens kunnskapsområde å fastsette og utvelge typen av fortynningsmiddel som skal anvendes og en egnet mengde, uten å avvike fra omfanget av oppfinnelsen som den er beskrevet i beskrivelsen og i de vedlagte krav. ;Biopolymerpartiklene ifølge foreliggende oppfinnelse kan dannes i forskjellige størrelser ifølge fremgangsmåter som er kjent innen teknikkens stand. Hvilken størrelse som er egnet avhenger av forskjellige faktorer, f.eks. spermatozokilden, typen av befruktningsinnretning som anvendes og dens størrelse, størrelsen og formen på den anvendte sædbeholder, osv. Biopolymerpartiklene ifølge foreliggende oppfinnelse kan dannes med en diameter som er egnet for alle inseminasjonsteknikker innen teknikkens stand for å muliggjøre enkel manipulering, håndtering, transport og konservering. ;Ifølge nok et aspekt av oppfinnelsen dannes biopolymerpartiklene i en beholder, f.eks. et inseminasjonsrør, noe som fører til partikler som er perfekt justert til beholderens størrelse. For dannelse av biopolymerpartiklene inne i en beholder er det ikke nødvendigvis behov for en annen lagringsløsning. ;Ifølge ett aspekt av oppfinnelsen omfatter biopolymerpartiklene spermatozoer som er oppsamlet fra storfe. Ifølge nok et aspekt av oppfinnelsen omfatter de her beskrevne biopolymerpartiklene spermatozoer oppsamlet fra gris. ;Selv om den foreliggende oppfinnelse illustreres ved hjelp av alginatpartikler som omfatter spermatozoer oppsamlet fra storfe henholdsvis gris, kan biopolymerpartilene også inneholde spermatozoer fra andre dyrearter. Uten å være begrenset til disse, kan biopolymerpartiklene også omfatte spermatozoer oppsamlet for f.eks. hest, sau, geit, kanin, fjærfe, kjæledyr, f.eks. hunder med stamtavle, akvatiske dyr og forskjellige utrydningstruede arter. ;I tillegg er det over hodet ingen indikasjoner på at de her beskrevne biopolymere partiklene ikke kan være anvendbare for konservering av humane spermatozoer, og følgelig være anvendbare ved behandling av barnløshet. Det skal følgelig forstås at begrepet "dyr" som det anvendes heri også omfatter mennesker. ;I tillegg er det også et stort behov for konserveringsteknikker for spermatozoer innen akvakulturindustrien. Følgelig kan også spermatozoer med opphav i akvatiske dyr innstøpes i biopolymerpartiklene ifølge foreliggende oppfinnelse, og sike dyr omfattes følgelig også av begrepet "dyr" som det anvendes heri. ;Immobilisering av spermatozoer i et biopolymergelnettverk kan også anvendes for å danne et mikromiljø som er gunstig for lagring av spermatozoer, selv i hunnlige kjønnsorganer. Dette kan gjøres ved samtidig innstøping av løsninger som er gunstige for spermatozoene, fertiliseringsgraden, dyrehelsen, osv. F.eks. er ikke-begrensende eksempler på forbindelser som forbedrer levedyktigheten under lagring antioksidanter eller proteiner, hormoner, osv. Spermatozoene kan også innstøpes sammen med andre midler eller forbindelser som er gunstige når det gjelder befruktningsevnen eller dyrehelsen. Slike midler eller forbindelser kan f.eks. være antibiotika, f.eks. streptomycin, neomycin, gentamycin, penicillin, linkomycin, spektinomycin, amoksysilin, tylosin, osv., som kan anvendes for å kontrollere eller forhindre kjønnssykdommer, frysebeskyttende midler, antistoffer, hormoner eller forbindelser som forhøyer reproduksjonseffektiviteten, f.eks. forbindelsene som er kjente fra US patentskrift nr. 5 972 592. ;Ifølge nok et aspekt av oppfinnelsen omfatter følgelig biopolymerpartiklene i tillegg til spermatozoer forbindelser som er gunstige når det gjelder befruktningsevnen eller dyrehelsen, f.eks. antioksidanter, antibiotika, antistoffer, hormoner eller midler som forhøyer reproduksjonseffektiviteten, eller kombinasjoner av disse. Ifølge en foretrukket utførelse av den foreliggende oppfinnelse omfatter biopolymerpartiklene antioksidanter, f.eks. pyruvat. ;Biopolymerpartiklene ifølge foreliggende oppfinnelse kan om ønskelig lagres i velkjente lagringsløsninger for spermatozoer, f.eks. melkebaserte fortynningsmidler, PBS (fosfatbufret saltvann), BTS, Tri X-Cell™, EDTA-baserte fortynningsmidler, Kiev-fortynnignsmidler, Modena, MR-A, Androhep, Acromax, Triladyl<®>, Biladyl<®>, Bioxcell, Biociphos plus, osv., med eller uten antioksidanter som f.eks. pyruvat, 2,2,6,6-tetrametylpiperidin-l-oksyl (ofte forkortet til Tempo), 4-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylpiperidin-l-oksyl (ofte forkortet til Tempol), superoksiddismutase, katalase, glutationperoksidase, butylert hydroksytoluen (ofte forkortet til BHT) og butylert hydroksyanisol (ofte forkortet til BHA). Valget av lagringsløsning er ikke avgjørende, så lenge som lagringsløsningen ikke omfatter forbindelser som på negativ måte kan påvirke biopolymerpartiklenes egenskaper. Når det f.eks. gjelder alginatpartikler bør lagringsløsningen ikke omfatte for mange gelatorer, noe som vil føre til tilbaketrekning av de bivalente ionene og følgelig oppløsning av gelen. ;Under lagring kan andelen av biopolymerpartikler relativt til lagringsløsningen variere avhengig av typen av G-rikt alginat og konsentrasjonen av det, spermatozokilden, den anvendte fertiliseringsfremgangsmåte, osv. Ifølge eksempler på den foreliggende oppfinnelse er forholdet mellom lagringsløsning og biopolymerpartikler minst 1:1, f.eks. minst 1:2, minst 1:3, minst 1:4, minst 1:5, minst 1:6, minst 1:7, minst 1:8, minst 1:9 eller minst 1:10. Et forhold mellom lagringsløsning og biopolymerpartikler på opptil minst 1:100 kan anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelse. ;Videre kan biopolymerpartriklene ifølge foreliggende oppfinnelse om ønskelig lagres både ved romtemperatur, f.eks. 18°C eller 20°C, ved fysiologisk temperatur (37°C) eller avkjølt, f.eks. ved 5°C. I tillegg kan biopolymerpartiklene videre behandles ved dehydrati sering, frysekonservering eller frysetørking. Biopolymerpartiklene vil når det gjelder frysekonservering opptines før inseminasjonen. ;Spermatozoer, som vanligvis konserveres i væske, kan lagres over et lengre tidsrom når de er innstøpt i en biopolymerpartikkel ifølge foreliggende oppfinnelse. Ifølge en annen utførelse av oppfinnelsen anvendes biopolymerpartiklene direkte for inseminasjon av et mottakerdyr. Om ønskelig kan biopolymerpartiklene oppløses for frigjøring av spermatozoene før inseminasjonen. Imidlertid kan biopolymerpartiklene ifølge nok en utførelse anvendes sammen og i kombinasjon med frie spermatozoer. ;Selv om den foreliggende oppfinnelse har blitt beskrevet i forbindelse med spesifikke utførelser av den, vil det forstås at den kan modifiseres ytterligere. Den foreliggende patentsøknad er ment å omfatte alle variasjoner, anvendelser eller tilpasninger av oppfinnelsen som generelt følger oppfinnelsens prinsipper, og innbefatter slike avvik fra den foreliggende beskrivelse som ligger innenfor kjent og sedvanlig praksis innen feltet som oppfinnelsen tilhører og som kan benyttes på de essensielle egenskaper som er beskrevet ovenfor og i samsvar med omfanget av de vedlagte krav. ;Beskrivelsen ovenfor av de forskjellige aspekter av den foreliggende oppfinnelse avslører oppfinnelsens generelle natur, og fagpersonen vil ved å benytte generelle kunnskaper innen feltet kunstig inseminasjon og avlsteknologi (innbefattet innholdet av referansene som siteres heri) lett kunne modifisere og/eller tilpasse de her beskrevne biopolymerpartikler og fremstillingen og anvendelsen av dem for forskjellige anvendelsesområder, uten omfattende eksperimentering og uten å avvike fra den foreliggende oppfinnelses generelle konsept og omfanget av de vedlagte krav. Slike tilpasninger eller modifikasjoner er følgelig ment å ligge innenfor betydningen av et område av ekvivalenter av de beskrevne utførelser basert på den lære og de retningslinjer som gis heri. Det skal forstås at terminologien som anvendes heri er ment å være beskrivende, og ikke begrensende. Terminologien i den foreliggende beskrivelse skal følgelig tolkes av fagpersonen i lys av den lære og de retningslinjer som gis heri i kombinasjon med fagpersonens kunnskaper. ;De påfølgende, ikke-begrensende eksemplene illustrerer den foreliggende oppfinnelse ytterligere. ;Eksempler ;Eksempel 1 Immobilisering av spermatozoer i alginat ;MATERIALER OG FREMGANGSMÅTER ;Materialer ;Følgende kjemikalier ble anvendt CaCl2H20, K2HP02, NaH2P04, NaCl, og natrumsitrat fra Ri edel de Haén (Seelze, Tyskland), glukosemonohydrat fra Norsk Medisinaldepot (Oslo, Norge), natriumalginat (PROTANAL LF 10/60) levert fra FMC Biopolymer A/S (Drammen, Norge). ;Spermatozokilder ;Spermatozoer fra storfe ble oppsamlet ved Geno-anlegget ved Hallsteingård i Trondheim, Norge. Galtespermatozoene ble oppsamlet i Norsvin-anlegget ved Hamar, Norge. Spermatozoer fra storfe ble fortynnet 1+2 med melkebasert fortynningsmiddel kort tid etter ejakulasjonen. Galtespermatozoer ble fortynnet 1+4 med TRI X-CELL™ (IMV Technologies, L'Aigle Cedex, Frankrike). Verken fortynningen eller valget av fortynningsbuffere er avgjørende for immobiliseringsfremgangsmåten eller langtidsoverlevelsen av spermatozoene etter immobiliseringen, men utføres kun for å forenkle lagringen inntil spermatozoene kunne prosesseres videre. ;Bufferløsninger ;Følgende dyrkningsmedier ble anvendt: Modifisert IVT: 3 g l"<1>glukose, 20 g l'"<1>natriumsitrat, 2,1 g 1_<1>NaHC03, 1,16 g l1 NaCl, 3 g 1_<1>ED TA, pH 7,35. BTS (med 3 mM Ca): 37 g l"<1>glukose, 0,44 g l"<1>CaCl2, 4,5 g l"<1>natriumsitrat, 1,25 g l"<1>NaHC03, 1,25 g 1_<1>EDTA, 0,74 g 1_<1>KC1, 1 g l"<1>Neomycin, pH 7,2. Kulegeldanningsløsning: 7,3 g l"<1>CaCh, 5,96 g l"<1>NaCl. Melkebasert fortynningsmiddel: 110 g l"<1>Molico skummet melk, 120 ml l"<1>eggeplomme, 6,25 g l"<1>streptomycin, 1,5 millioner I.E. I"<1>penicillin. ;Immobilisering av celler ;Spermatozoceller ble høstet ved Geno- eller Norsvin-anlegget og fortynnet som beskrevet ovenfor. Før immobiliseringen ble spermatozoene oppkonsentrert ved sentrifugering (800 g, 20 min., 20°C). Mengden av supernatant som skal fjernes for hver porsjon avhenger av den ønskede konsentrasjon av spermatozoer i de ferdige kulene. Etter fjerning av overskudd av supernatant resuspenderes de nedsentrifugerte cellene forsiktig ved mild omrysting. Cellesuspensjonen blandes så forsiktig med steril 6 % (vekt/vol) natriumalginatløsning. Alginatløsningen tilsettes i et volumetrisk forhold på 2 deler cellesuspensjon til 1 del alginatløsning (et stort antall forskjellige kombinasjoner av alginatkonsentrasjoner og volumetriske forhold mellom alginatløsningen og cellesuspensjonen har blitt undersøkt. Typiske verdier og fremgangsmåter gis her). ;Blandingen av alginat og celler tilsettes dråpevis til kulegeldannende løsning (se ovenfor). For fremstilling av kuler med en diameter på 3 mm tilsettes løsningen via en kanylespiss med en indre diameter på 0,5 mm. For fremstilling av kuler med lavere diameter (ned til under 1 mm i diameter) anvendes et system basert på bruk av en luftstrøm for å begrense dråpestørrelsen som dannes på kanylene. Natriumklorid anvendes i den geldannende løsning for å sikre en homogen polysakkaridkonsentrasjon i kulene (Smidsrød, O. og Skjåk-Bræk, G. (1990) Alginate as immobilization matrix for cells. Trends in Biotechnology 8, 71-78). For å begrense Ca<2+->mengden i kulene omrøres kulene i ikke mer enn 8 min. i den kulegeldannende løsning. Hele immobiliseringsfremgangsmåten utføres ved romtemperatur. ;Lagring av immobiliserte spermatozoer in vitro ved romtemperatur ;Ett formål med immobiliseringsfremgangsmåten er å forlenge tiden som spermatozoene kan lagres før inseminasjonen. Det ble følgelig utført eksperimenter i hvilke spermatozoene lagres in vitro ved romtemperatur i bufferløsninger. Referanseprøver med ikke-immobiliserte spermatozoer fra samme ejakulat inngår i alle eksperimenter. Spermatozoenes kvalitet evalueres ved å måle motiliteten på forskjellige tidspunkter i løpet av lagringstiden. For hvert tidspunkt analyseres prøver, og motiliteten av de immobiliserte spermatozoene og motiliteten av kontrollprøvene noteres. En rekke kombinasjoner av lagringsvolumer og celletettheter har blitt undersøkt for å optimalisere det eksperimentelle system ;(resultater ikke vist). De eksperimentelle betingelsene som beskrives nedenfor er typiske og ble anvendt i eksperimentene som er rapportert nedenfor. ;I eksperimenter med spermatozoer fra storfe ble tilnærmet 2 ml kuler med immobiliserte spermatozoer overført til 13 ml sentrifugerør og tilsatt melkebasert fortynningsmiddel i et volumetrisk forhold på 1 + 2. Kontrollprøver med fritt suspenderte spermatozoer ble fremstilt ved å utføre en totalfortynning på 1 + 15 i 13 ml sentrifugerør (et volum på tilnærmet 6 ml anvendes i alle rør). Denne fortynningen har i tidligere eksperimenter vist seg å være nærmest optimal for å bevare motiliteten under lagring av referanseprøvene (resultater ikke vist). ;I eksperimenter med galtespermatozoer ble spermatozoene lagret ved 18°C i BTS (med 3 mM Ca). I eksperimentene som er rapporter nedenfor ble kontrollprøvene fortynnet 1 + 10 i alle eksperimenter, noe som gir et totalvolum på 20 i 50 ml sentrifugerør (denne fortynningen har tidligere blitt vist å være optimal for å bevare motiliteten under lagring). Kuler som inneholdt immobiliserte spermatozoer ble overført til 50 ml sentrifugerør og tilsatt BTS (med 3 mM CaCb) i et forhold på 1 + 3. Kuler som inneholdt immobiliserte spermatozoer ble vasket med lagringsløsningen før overføring til lagringsløsningen. ;Lagring av immobiliserte spermatozoer ved 37°C ;For å vurdere overlevelsen av spermatozoene ved fysiologisk temperatur ble spermatozoenes motilitet målt under lagring av spermatozoer ved 37°C. ;Spermatozoer fra storfe ble overført til en bufferløsning før lagringseksperimentene ved 37°C. Som beskrevet ovenfor inngikk referanseprøver fra samme ejakulat i alle eksperimenter. Forsøkene ble utført i 13 ml sentrifugerør med et totalvolum på 8 ml i hvert rør. Referanseprøvene ble fortynnet 1 + 4 i lagringsløsningen. For immobiliserte spermatozoer ble 3 ml kuler som inneholdt spermatozoer tilsatt til 6 ml bufferløsning og lagret i et 13 ml sentrifugerør. Galtespermatozoer ble behandlet på en lignende måte, bortsett fra at normal BTS (med 3 mM Ca) ble anvendt. ;Vurdering av motilitet ;Spermatozoenes motilitet ble evaluert ved hjelp av mikroskopisk evaluering. Prøver (typisk 1 ml) ble fjernet fra lagringsbeholderne og overført til 1,5 ml Eppendorfrør. Rørene ble forvarmet i minst 15 min. i en varmeblokk ved 37°C før vurderingen. På måletidspunktet ble 2,5 ul prøve overført til et forvarmet objektglass og undersøkt umiddelbart etter ved anvendelse av et lysmikroskop. Antall motile spermatozoer i hver prøve ble estimert til nærmeste 5 % intervall. Dersom det var praktisk mulig ble analysepersonen holdt uvitende om prøvens identitet under vurderingen. ;Immobiliserte spermatozoer må frigjøres fra kulene før motiliteten kan evalueres. For å oppløse alginatkulene ble 1 del kuler tilsatt til 3 deler IVT-løsning i et 13 ml sentrifugerør. Rørene ble så plassert i en vippemekanisme for rør og ble blandet i tilnærmet 30 min. før vurderingen. ;Resultater og diskusjon ;Overlevelse av immobiliserte spermatozoer ;Resultater fra eksperimenter med lagring av spermatozoer i referanseprøver (med ikke-immobiliserte spermatozoer) og prøver med immobiliserte spermatozoer vises i fig. 1 for både spermatozoer fra storfe og galte. For galtespermatozoer vises resultater for to forskjellige kulestørrelser. Grunnen til dette er at kulestørrelsen må være under 1 mm for å kunne anvende kuler for intrauterin inseminasjon med det foreliggende tilgjengelige utstyr. ;Som man kan se fra resultatene som vises i fig. 1 ser de immobiliserte spermatozoene ut til å ha en noe lavere motilitet enn spermatozoene i referanseprøvene kort tid etter immobiliseringen. Denne forskjellen i motilitet kan skyldes både immobiliseringsfremgangsmåten og oppløsningsfremgangsmåten, siden kulene som inneholder immobiliserte spermatozoer må oppløses før motiliteten kan anslås. Det er imidlertid ikke nødvendig å oppløse kulene før inseminasjonen, siden kulene vil oppløses langsomt ved fysiologiske betingelser (resultater ikke vist). ;Forskjellen i motilitet mellom referanseprøvene og de immobiliserte spermatozoene reduseres under lagringstiden, siden motiliteten i referanseprøvene ser ut til å avta hurtigere enn for de immobiliserte prøvene, særlig for galtespermatozoer. For immobiliserte galtespermatozoer ble en motilitet på tilnærmet 50 % målt etter 5 dagers lagring i kuler med 3 mm diameter i dette spesielle eksperimentet. På dette tidspunkt ble en motilitet på 10 % notert for referanseprøvene. Disse resultatene viser at immobilisering påvirker cellene eller cellenes lokale miljø på en måte som er gunstig for cellenes evne til å tolerere in vitro-lagring ved 18°C. ;For spermatozoer fra storfe er det ingen signifikant forskjell i motiliteten til referanseprøvene og de immobiliserte spermatozoene på de siste tidspunktene i det viste eksperiment. ;Den ytterligere optimalisering av lagringsbetingelsene og ;immobiliseringsfremgangsmåten kan imidlertid forbedre lagringstiden for immobiliserte spermatozoer fra storfe. En måling av glukoseforbruket og laktatdannelsen for immobiliserte spermatozoer fra storfe og ikke-immobiliserte spermatozoer i referanseprøvene viser at spermatozoer lagret i et kalsiumalginatgelnettverk har redusert metabolsk aktivitet (jfr. eksempel 2). ;For å evaluere hvorvidt immobiliserte spermatozoer vil overleve ved fysiologiske betingelser, dvs. betingelser ved hvilke spermatozoenes aktivitet bør være maksimal, ble det utført lagringseksperimenter ved en temperatur på 37°C. Resultater fra eksperimenter med in vitro-lagring av spermatozoer fra storfe og gris under lagring ved 37°C vises i fig. 2. ;Som observert i eksperimentene med in vitro-lagring ved romtemperatur er det en forskjell i motiliteten mellom referanseprøvene og prøvene med alginatimmobiliserte spermatozoer etter fremstilling av prøvene. For både spermatozoer fra storfe- og galtespermatozoer avtar imidlertid motiliteten relativt hurtig i referanseprøvene med ikke-immobiliserte spermatozoer under lagring ved 37°C. I prøvene med immobiliserte spermatozoer avtar motiliteten signifikant langsommere. Etter 15 timer in vitro-lagring ved 37°C er motiliteten for galtespermatozoer i begge kulestørrelser fortsatt over 50 %. Faktisk er motiliteten fortsat tilnærmet 30 % etter 60 timers lagring ved 37°C i kuler med 3 mm diameter. ;For spermatozoer fra storfe ser motiliteten ut til å avta hurtigere enn for galtespermatozoer i dette eksperimentelle system. Som for galtespermatozoene er det imidlertid en signifikant forskjell mellom hastigheten som motiliteten avtar med under lagring i dette eksperimentet for spermatozoer fra storfe. Etter 24 timers lagring har de immobiliserte spermatozoene fra storfe fortsatt en motilitet på 45 %, mens ingen motilitet ble notert for referanseprøvene. ;Det bør huskes at resultatene som presenteres i fig. 2 er erholdt ved anvendelse av et kunstig eksperimentelt system som ikke er representativt for in vivo-situasjonen i hunndyret. Resultatene som presenteres i fig. 2 viser imidlertid at spermatozoer fra både storfe og gris overlever og kan bevare motiliteten i relativt lang tid når de er immobilisert i et kalsiumalginatgelnettverk, selv ved fysiologisk temperatur. Resultatene kan også tyde på at immobilisering med kalsiumalginatgelnettverk kan anvendes for å bevare motiliteten av spermatozoer under lagring ved fysiologisk temperatur. Dette kan være av spesiell betydning, siden inseminasjonstidspunktet er avgjørende for å oppnå gode befruktningsresultater. Inseminasjonstidspunktet er avgjørende, siden spermatozoene har begrenset overlevelsestid etter inseminasjonen. Resultatene kan følgelig tyde på at immobilisering av spermatozoer kombinert med en kontrollert frigjøring etter inseminasjonen kan anvendes for å utvide tidsrommet fra inseminasjon til befruktning. ;Inseminasjonsforsøk ;Inseminasjonsforsøk har blitt utført i i alt ni purker fra samme flokk. Purkene skulle oppsamles direkte etter avvenningen av forrige kull av grisunger, men oppsamlingen ble utsatt til tilnærmet fire uker etter inseminasjonen. ;I slakteriet ble kjønnsorganer oppsamlet direkte etter oppskjæringen og undersøkt i løpet av 15 min. Antall corpora lutea i ovariene og antall embryoer (om noen) i uterushornene ble talt og notert. Ved å interferere i dette tidlige drektighetsstadium er sannsynligheten for å observere alle foreliggende embryoer (selv degenererte) relativt høy. Ved å observere antall grisunger som fødes ved fullført drektighet er det høy risiko for å miste en høy prosentandel av embryoene, siden befruktede egg og embryoer som dør før beindannelsen vil observeres av morsystemet, og ingen rester vil være synlige ved avsluttet drektighet. Opptil 30 % av alle befruktede griseegg kan dø og forsvinne i tidsrommet fra befruktning til beindannelse. I våre forsøk kan et godt estimat av befruktningsfrekvensen beregnes for hver purke ved å telle antall embryoer og antall corpora lutea etter fire uker. ;Tidspunktet for inseminasjonen varierte fra normalt til 1 dag tidligere enn normalt, og både enkeltvise og dobbelte inseminasjoner har blitt utført. Resultatene fra disse inseminasjonsforsøkene vises i tabell 1. ; Inseminasjonsforsøk har også blitt utført med spermatozoer fra storfe. Disse forsøkene er vanskeligere å kvantifisere, siden ingen store forsøksflokker er tilgjengelige. Disse forsøkene har blitt utført i én flokk med 20 tilgjengelige kviger. Kvigene ble østerussynkronisert før inseminasjonen. Gode befruktningsfrekvenser har blitt oppnådd ved anvendelse av immobiliserte spermatozoer fra storfe. I undersøkelsen ble 6 av 12 kviger som ble inseminert med immobiliserte spermatozoer som var lagret i 24 timer befruktet, noe som ble bekreftet ved en drektighetskontroll. ;Spermatozoene hadde blitt immobilisert i alginat, lagret immobilisert ved romtemperatur over forskjellige tidsrom og inseminert oppløst eller ikke oppløst. Inseminasjonstidspunktet varierte fra normalt til 1 dag tidligere enn normalt, og kun enkeltvise inseminasjoner har blitt utført. Drektige dyr ble bekreftet ved rektal undersøkelse 5-7 uker etter inseminasjonen. Resultatene fra disse forsøkene vises i tabell 2. ;<*>Dag 1 = dagen for oppsamling av spermatozoer the insemination procedure, animal health requirements and international legislation. Milk diluents and TRIS are only a few non-limiting examples of diluents among a large number of useful commercially available diluents for spermatozoa. Another applicable diluent is the diluent reported in Aalbers, JG, Rademaker, JHM, Grooten, HJG and Johnson, LA, 1983: Fecundity of boar semen stored in BTS, Kyiv, Zorlezco and Modena extenders under filed conditions. J. Anim. Pollock. 75 (Suppl. 1), 314-315 and Aalbers, JG, Johnson, LA, Rademaker, JHM and Grooten HJG, 1984: Use of boar spermatozoa for AI: fertility and morphology of semen diluted in BTS and used for insemination within 24 hrs or 25 to 48 hours after collection. Pro. 10* Int Congr. Animation Reprod and Artif. Insemin. Urbana IL, volume II, no. 180, pp. 1-3, which is often referred to as BTS. BTS is commercially available from Minitub in Germany. (Minitub Abfull- und Labortechnik GmbH & Co., Hauptstrasse 41, D-84184, Tiefenbach, Germany. ;Another useful diluent is the diluent Tri X-Cell™, which is commercially available from IMV (Instrument de Medecine Veterinaire, 10, rue Georges Clemenceau, B.P. 81, FR-61302 L'AIGLE Cedex, France). ;The different diluents differ from each other in terms of composition, pH, buffer capacity, osmolarity and antibiotics. Many are published, while others are trade secrets. The simplest the diluents only consist of different sugar solutions, e.g. lactose and glucose. Based on the specialist's general knowledge in the field of sperm conservation, it will be understood that different diluents can be used according to the present invention. The type of diluents used according to the present invention may vary depending on the sperm cells origin, type of polymer used, preservation method, storage temperature n, etc. It is well within the specialist's area of knowledge to determine and select the type of diluent to be used and a suitable amount, without deviating from the scope of the invention as described in the description and in the attached claims. The biopolymer particles according to the present invention can be formed in different sizes according to methods known in the state of the art. Which size is suitable depends on various factors, e.g. the spermatozoa source, the type of insemination device used and its size, the size and shape of the sperm container used, etc. The biopolymer particles of the present invention can be formed with a diameter suitable for all state-of-the-art insemination techniques to enable easy manipulation, handling, transport and preservation . According to yet another aspect of the invention, the biopolymer particles are formed in a container, e.g. an insemination tube, which leads to particles that are perfectly adjusted to the size of the container. For the formation of the biopolymer particles inside a container, there is not necessarily a need for another storage solution. According to one aspect of the invention, the biopolymer particles comprise spermatozoa collected from cattle. According to yet another aspect of the invention, the biopolymer particles described here comprise spermatozoa collected from pigs. Although the present invention is illustrated by means of alginate particles which comprise spermatozoa collected from cattle or pigs, the biopolymer particles can also contain spermatozoa from other animal species. Without being limited to these, the biopolymer particles can also include spermatozoa collected for e.g. horse, sheep, goat, rabbit, poultry, pets, e.g. pedigree dogs, aquatic animals and various endangered species. In addition, there are no indications that the biopolymeric particles described here cannot be used for the preservation of human spermatozoa, and consequently be used in the treatment of infertility. Accordingly, it should be understood that the term "animal" as used herein also includes humans. In addition, there is also a great need for conservation techniques for spermatozoa within the aquaculture industry. Consequently, spermatozoa originating in aquatic animals can also be embedded in the biopolymer particles according to the present invention, and aquatic animals are consequently also covered by the term "animal" as used herein. ;Immobilization of spermatozoa in a biopolymer gel network can also be used to form a microenvironment favorable for the storage of spermatozoa, even in female genitalia. This can be done by simultaneously injecting solutions that are favorable for the spermatozoa, the fertilization rate, the animal's health, etc. E.g. non-limiting examples of compounds that improve storage viability are antioxidants or proteins, hormones, etc. The spermatozoa can also be embedded with other agents or compounds that are beneficial in terms of fertility or animal health. Such agents or compounds can e.g. be antibiotics, e.g. streptomycin, neomycin, gentamycin, penicillin, lincomycin, spectinomycin, amoxycillin, tylosin, etc., which can be used to control or prevent sexually transmitted diseases, cryoprotectants, antibodies, hormones or compounds that increase reproductive efficiency, e.g. the compounds which are known from US Patent No. 5 972 592. According to yet another aspect of the invention, the biopolymer particles consequently comprise, in addition to spermatozoa, compounds which are favorable in terms of fertility or animal health, e.g. antioxidants, antibiotics, antibodies, hormones or agents that increase reproductive efficiency, or combinations thereof. According to a preferred embodiment of the present invention, the biopolymer particles comprise antioxidants, e.g. pyruvate. The biopolymer particles according to the present invention can, if desired, be stored in well-known storage solutions for spermatozoa, e.g. milk-based diluents, PBS (phosphate-buffered saline), BTS, Tri X-Cell™, EDTA-based diluents, Kyiv diluents, Modena, MR-A, Androhep, Acromax, Triladyl<®>, Biladyl<®>, Bioxcell, Biociphos plus , etc., with or without antioxidants such as e.g. pyruvate, 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-l-oxyl (often abbreviated to Tempo), 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-l-oxyl (often abbreviated to Tempol), superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, butylated hydroxytoluene (often abbreviated to BHT) and butylated hydroxyanisole (often abbreviated to BHA). The choice of storage solution is not decisive, as long as the storage solution does not include compounds that can negatively affect the properties of the biopolymer particles. When it e.g. in the case of alginate particles, the storage solution should not include too many gelators, which will lead to withdrawal of the bivalent ions and consequently dissolution of the gel. ;During storage, the proportion of biopolymer particles relative to the storage solution may vary depending on the type of G-rich alginate and its concentration, the spermatozoa source, the fertilization method used, etc. According to examples of the present invention, the ratio between storage solution and biopolymer particles is at least 1:1, f .ex. at least 1:2, at least 1:3, at least 1:4, at least 1:5, at least 1:6, at least 1:7, at least 1:8, at least 1:9 or at least 1:10. A ratio between storage solution and biopolymer particles of up to at least 1:100 can be used according to the present invention. Furthermore, the biopolymer particles according to the present invention can, if desired, be stored both at room temperature, e.g. 18°C or 20°C, at physiological temperature (37°C) or cooled, e.g. at 5°C. In addition, the biopolymer particles can be further processed by dehydration, freeze preservation or freeze drying. When it comes to freezing, the biopolymer particles will be thawed before insemination. Spermatozoa, which are usually preserved in liquid, can be stored over a longer period of time when they are embedded in a biopolymer particle according to the present invention. According to another embodiment of the invention, the biopolymer particles are used directly for insemination of a recipient animal. If desired, the biopolymer particles can be dissolved to release the spermatozoa before insemination. However, according to another embodiment, the biopolymer particles can be used together and in combination with free spermatozoa. Although the present invention has been described in connection with specific embodiments thereof, it will be understood that it may be further modified. The present patent application is intended to include all variations, applications or adaptations of the invention which generally follow the principles of the invention, and includes such deviations from the present description which are within known and customary practice in the field to which the invention belongs and which can be used on the essential properties which is described above and in accordance with the scope of the attached requirements. ;The above description of the various aspects of the present invention reveals the general nature of the invention, and the person skilled in the art, by using general knowledge in the field of artificial insemination and breeding technology (including the content of the references cited herein), will easily be able to modify and/or adapt the biopolymer particles described here and the production and application of them for different fields of application, without extensive experimentation and without deviating from the general concept of the present invention and the scope of the appended claims. Accordingly, such adaptations or modifications are intended to be within the meaning of a range of equivalents of the described embodiments based on the teachings and guidelines provided herein. It is to be understood that the terminology used herein is intended to be descriptive, and not restrictive. The terminology in the present description must therefore be interpreted by the professional in the light of the teachings and guidelines given herein in combination with the professional's knowledge. The following non-limiting examples further illustrate the present invention. ;Examples ;Example 1 Immobilization of spermatozoa in alginate ;MATERIALS AND METHODS ;Materials ;The following chemicals were used: CaCl2H20, K2HP02, NaH2P04, NaCl, and sodium citrate from Riedel de Haén (Seelze, Germany), glucose monohydrate from Norsk Medisinaldepot (Oslo, Norway ), sodium alginate (PROTANAL LF 10/60) supplied from FMC Biopolymer A/S (Drammen, Norway). ;Spermatozoa sources ;Spermatozoa from cattle were collected at the Geno facility at Hallsteingård in Trondheim, Norway. The boar spermatozoa were collected in the Norsvin plant near Hamar, Norway. Bovine spermatozoa were diluted 1+2 with milk-based diluent shortly after ejaculation. Boar spermatozoa were diluted 1+4 with TRI X-CELL™ (IMV Technologies, L'Aigle Cedex, France). Neither the dilution nor the choice of dilution buffers is decisive for the immobilization procedure or the long-term survival of the spermatozoa after immobilization, but is only performed to facilitate storage until the spermatozoa could be further processed. ;Buffer solutions ;The following culture media were used: Modified IVT: 3 g l"<1>glucose, 20 g l'"<1>sodium citrate, 2.1 g 1_<1>NaHC03, 1.16 g l1 NaCl, 3 g 1_< 1>ED TA, pH 7.35. BTS (with 3 mM Ca): 37 g l"<1>glucose, 0.44 g l"<1>CaCl2, 4.5 g l"<1>sodium citrate, 1.25 g l"<1>NaHCO3, 1.25 g 1_<1>EDTA, 0.74 g 1_<1>KC1, 1 g l"<1>Neomycin, pH 7.2. Sphere gel forming solution: 7.3 g l"<1>CaCh, 5.96 g l"<1>NaCl .Milk-based diluent: 110 g l"<1>Molico skimmed milk, 120 ml l"<1>egg yolk, 6.25 g l"<1>streptomycin, 1.5 million I.U. I"<1>penicillin. ;Immobilization of cells ;Spermatozoa cells were harvested at the Geno or Norsvin facility and diluted as described above. Before immobilization, the spermatozoa were concentrated by centrifugation (800 g, 20 min., 20°C). The amount of supernatant to be removed for each portion depends on the desired concentration of spermatozoa in the finished beads. After removal of excess supernatant, the centrifuged cells are carefully resuspended by gentle shaking. The cell suspension is then carefully mixed with sterile 6% (w/v) sodium alginate solution. The alginate solution is added in a volumetric ratio of 2 parts cell suspension to 1 part alginate solution (a large number of different combinations of alginate concentrations and volumetric ratios between the alginate solution and the cell suspension have been investigated. Typical values and methods are given here). ;The mixture of alginate and cells is added dropwise until sphere gel-forming solution (see above).For making spheres with a diameter of 3 mm, the solution is added via a needle tip with an inner diameter of 0.5 mm. For the production of spheres with a lower diameter (down to less than 1 mm in diameter), a system based on the use of an air stream is used to limit the droplet size that forms on the needles. Sodium chloride is used in the gel-forming solution to ensure a homogeneous polysaccharide concentration in the spheres (Smidsrød, O. and Skjåk-Bræk, G. (1990) Alginate as immobilization matrix for cells. Trends in Biotechnology 8, 71-78). To limit the amount of Ca<2+->in the spheres, the spheres are stirred for no more than 8 min. in the spheroid-forming solution. The entire immobilization procedure is carried out at room temperature. ;Storage of immobilized spermatozoa in vitro at room temperature ;One purpose of the immobilization procedure is to extend the time that the spermatozoa can be stored before insemination. Consequently, experiments were carried out in which the spermatozoa are stored in vitro at room temperature in buffer solutions. Reference samples with non-immobilized spermatozoa from the same ejaculate are included in all experiments. The quality of the spermatozoa is evaluated by measuring the motility at different times during the storage period. For each time point, samples are analyzed and the motility of the immobilized spermatozoa and the motility of the control samples are noted. A number of combinations of storage volumes and cell densities have been investigated to optimize the experimental system (results not shown). The experimental conditions described below are typical and were used in the experiments reported below. ;In experiments with bovine spermatozoa, approximately 2 ml pellets of immobilized spermatozoa were transferred to 13 ml centrifuge tubes and milk-based diluent was added in a volumetric ratio of 1 + 2. Control samples with freely suspended spermatozoa were prepared by performing a total dilution of 1 + 15 in 13 ml centrifuge tubes (a volume of approximately 6 ml is used in all tubes). This dilution has in previous experiments been shown to be almost optimal for preserving motility during storage of the reference samples (results not shown). ;In experiments with boar spermatozoa, the spermatozoa were stored at 18°C in BTS (with 3 mM Ca). In the experiments reported below, the control samples were diluted 1 + 10 in all experiments, giving a total volume of 20 in 50 ml centrifuge tubes (this dilution has previously been shown to be optimal for preserving motility during storage). Beads containing immobilized spermatozoa were transferred to 50 ml centrifuge tubes and BTS (with 3 mM CaCb) was added at a ratio of 1 + 3. Beads containing immobilized spermatozoa were washed with the storage solution before transfer to the storage solution. ;Storage of immobilized spermatozoa at 37°C ;To assess the survival of the spermatozoa at physiological temperature, the motility of the spermatozoa was measured during storage of the spermatozoa at 37°C. ;Spermatozoa from cattle were transferred to a buffer solution before the storage experiments at 37°C. As described above, reference samples from the same ejaculate were included in all experiments. The experiments were carried out in 13 ml centrifuge tubes with a total volume of 8 ml in each tube. The reference samples were diluted 1 + 4 in the storage solution. For immobilized spermatozoa, 3 ml beads containing spermatozoa were added to 6 ml buffer solution and stored in a 13 ml centrifuge tube. Boar spermatozoa were treated in a similar manner, except that normal BTS (with 3 mM Ca) was used. ;Evaluation of motility ;The motility of the spermatozoa was evaluated by means of microscopic evaluation. Samples (typically 1 ml) were removed from the storage containers and transferred to 1.5 ml Eppendorf tubes. The tubes were preheated for at least 15 min. in a heating block at 37°C before the assessment. At the time of measurement, 2.5 ul of sample was transferred to a pre-heated slide and examined immediately afterwards using a light microscope. The number of motile spermatozoa in each sample was estimated to the nearest 5% interval. If it was practically possible, the person analyzing was kept unaware of the sample's identity during the assessment. ;Immobilized spermatozoa must be released from the spheres before motility can be evaluated. To dissolve the alginate beads, 1 part beads were added to 3 parts IVT solution in a 13 ml centrifuge tube. The tubes were then placed in a tube tilting mechanism and were mixed for approximately 30 min. before the assessment. ;Results and discussion ;Survival of immobilized spermatozoa ;Results from experiments with storage of spermatozoa in reference samples (with non-immobilized spermatozoa) and samples with immobilized spermatozoa are shown in fig. 1 for both spermatozoa from cattle and boars. For boar spermatozoa, results are shown for two different globule sizes. The reason for this is that the ball size must be below 1 mm to be able to use balls for intrauterine insemination with the currently available equipment. ;As can be seen from the results shown in fig. 1, the immobilized spermatozoa appear to have a somewhat lower motility than the spermatozoa in the reference samples shortly after immobilization. This difference in motility may be due to both the immobilization procedure and the dissolution procedure, since beads containing immobilized spermatozoa must be dissolved before motility can be estimated. However, it is not necessary to dissolve the beads before insemination, since the beads will dissolve slowly under physiological conditions (results not shown). ;The difference in motility between the reference samples and the immobilized spermatozoa is reduced during the storage period, since the motility in the reference samples appears to decrease faster than that of the immobilized samples, especially for boar spermatozoa. For immobilized boar spermatozoa, a motility of approximately 50% was measured after 5 days of storage in 3 mm diameter beads in this particular experiment. At this time, a motility of 10% was noted for the reference samples. These results show that immobilization affects the cells or the cells' local environment in a way that is beneficial to the cells' ability to tolerate in vitro storage at 18°C. ;For spermatozoa from cattle, there is no significant difference in the motility of the reference samples and the immobilized spermatozoa at the last time points in the experiment shown. However, the further optimization of the storage conditions and the immobilization procedure can improve the storage time of immobilized bovine spermatozoa. A measurement of glucose consumption and lactate formation for immobilized spermatozoa from cattle and non-immobilized spermatozoa in the reference samples shows that spermatozoa stored in a calcium alginate gel network have reduced metabolic activity (cf. example 2). ;In order to evaluate whether immobilized spermatozoa will survive under physiological conditions, i.e. conditions at which the spermatozoa's activity should be maximal, storage experiments were carried out at a temperature of 37°C. Results from experiments with in vitro storage of spermatozoa from cattle and pigs during storage at 37°C are shown in fig. 2. ;As observed in the experiments with in vitro storage at room temperature, there is a difference in the motility between the reference samples and the samples with alginate immobilized spermatozoa after preparation of the samples. However, for both bovine and boar spermatozoa, motility decreases relatively quickly in the reference samples with non-immobilized spermatozoa during storage at 37°C. In the samples with immobilized spermatozoa, motility decreases significantly more slowly. After 15 hours of in vitro storage at 37°C, the motility of boar spermatozoa in both ball sizes is still above 50%. In fact, the motility is still approximately 30% after 60 hours of storage at 37°C in 3 mm diameter spheres. ;For bovine spermatozoa, motility appears to decrease more rapidly than for boar spermatozoa in this experimental system. As with the boar spermatozoa, however, there is a significant difference between the rate at which motility declines during storage in this experiment for bovine spermatozoa. After 24 hours of storage, the immobilized bovine spermatozoa still have a motility of 45%, while no motility was noted for the reference samples. ;It should be remembered that the results presented in fig. 2 has been obtained using an artificial experimental system that is not representative of the in vivo situation in the female animal. The results presented in fig. 2 shows, however, that spermatozoa from both cattle and pigs survive and can retain motility for a relatively long time when immobilized in a calcium alginate gel network, even at physiological temperature. The results may also indicate that immobilization with calcium alginate gel network can be used to preserve the motility of spermatozoa during storage at physiological temperature. This can be of particular importance, since the timing of insemination is crucial to achieving good fertilization results. The time of insemination is crucial, since the spermatozoa have a limited survival time after insemination. The results may therefore indicate that immobilization of spermatozoa combined with a controlled release after insemination can be used to extend the time from insemination to fertilization. ;Insemination trials ;Insemination trials have been carried out in a total of nine sows from the same herd. The sows were to be collected directly after the weaning of the previous litter of piglets, but the collection was postponed until approximately four weeks after insemination. ;In the slaughterhouse, genitals were collected directly after cutting up and examined within 15 minutes. The number of corpora lutea in the ovaries and the number of embryos (if any) in the uterine horns were counted and noted. By interfering at this early stage of pregnancy, the probability of observing all available embryos (even degenerated ones) is relatively high. By observing the number of piglets born at the end of pregnancy, there is a high risk of losing a high percentage of embryos, since fertilized eggs and embryos that die before ossification will be observed by the maternal system, and no remains will be visible at the end of pregnancy. Up to 30% of all fertilized pig eggs can die and disappear in the time from fertilization to bone formation. In our experiments, a good estimate of the fertilization rate can be calculated for each sow by counting the number of embryos and the number of corpora lutea after four weeks. ;The time of insemination varied from normal to 1 day earlier than normal, and both single and double inseminations have been performed. The results from these insemination trials are shown in Table 1. ; Insemination experiments have also been carried out with bovine spermatozoa. These trials are more difficult to quantify, as no large trial herds are available. These experiments have been carried out in one herd with 20 available heifers. The heifers were estrous synchronized before insemination. Good fertilization rates have been achieved using immobilized bovine spermatozoa. In the study, 6 out of 12 heifers that were inseminated with immobilized spermatozoa that had been stored for 24 hours fertilized, which was confirmed by a pregnancy test. The spermatozoa had been immobilized in alginate, stored immobilized at room temperature for various periods of time and inseminated dissolved or not dissolved. The time of insemination varied from normal to 1 day earlier than normal, and only individual inseminations have been carried out. Pregnant animals were confirmed by rectal examination 5-7 weeks after insemination. The results of these experiments are shown in table 2.;<*>Day 1 = day of collection of spermatozoa
Disse resultatene viser at spermatozoer som er immobilisert i kalsiumalginatkuler ikke bare bevarer motiliteten, men også bevarer alle funksjonelle egenskaper som er nødvendige for befruktning. Følgelig har Geno og Norsvin vist at spermatozoer immobilisert i kalsiumalginatgel kan anvendes for inseminasjon og føre til befruktning av både storfe og gris. These results show that spermatozoa immobilized in calcium alginate beads not only preserve motility, but also preserve all functional properties necessary for fertilization. Consequently, Geno and Norsvin have shown that spermatozoa immobilized in calcium alginate gel can be used for insemination and lead to fertilization of both cattle and pigs.
Eksempel 2. Energiforbruk for immobiliserte spermatozoer Example 2. Energy consumption for immobilized spermatozoa
Uten ønske om å være begrenset til en gitt teori antas det at immobilisering av spermatozoer fører til at spermatozoene forbruker mindre energi, og at dette er gunstig når det gjelder lagringstiden og befruktningsevnen. Without wishing to be limited to a given theory, it is believed that immobilization of spermatozoa causes the spermatozoa to consume less energy, and that this is beneficial in terms of storage time and fertilizing ability.
For å undersøke denne teorien ble følgelig spermatozoer fra storfe immobilisert i alginatkuler i en konsentrasjon på tilnærmet 150 x IO<6>spermatozoer/ml og tilsatt til 2 ganger kulevolumet av melkebasert fortynningsbuffer. Referanseprøver med fritt suspenderte spermatozoer ble fremstilt fra det samme ejakulat og inneholdt den samme totalkonsentrasjonen av spermatozoer pr. totalvolum i melkebasert fortynningsbuffer. Prøvene ble gjort anaerobe ved gjennombobling av N2før lagring ved 20°C. Prøver av melkefortynningsbufferen ble uttatt under lagringstiden, og dannelsen av laktat fra spermatozoene i prøvene ble målt ved HPLC. Resultatene vises i tabell 3: Accordingly, to investigate this theory, bovine spermatozoa were immobilized in alginate beads at a concentration of approximately 150 x 10<6>spermatozoa/ml and added to 2 times the bead volume of milk-based dilution buffer. Reference samples with freely suspended spermatozoa were prepared from the same ejaculate and contained the same total concentration of spermatozoa per total volume in milk-based dilution buffer. The samples were made anaerobic by bubbling through N2 before storage at 20°C. Samples of the milk dilution buffer were taken during the storage period, and the formation of lactate from the spermatozoa in the samples was measured by HPLC. The results are shown in Table 3:
Eksempel 3: Immobilisering av sædceller fra sølvrev ( vulpes vulpes) Example 3: Immobilization of sperm cells from silver foxes (vulpes vulpes)
Blandet sæd med god kvalitet fra tre voksne sølvrevhanner (Vulpes vulpes) ble fortynnet med EDTA-basert fortynningsmiddel til 228 x IO<6>sædceller pr. ml og transportert til laboratoriet. 3 timer etter oppsamlingen og fortynningen ble et uttak av sæden sentrifugert ved 2000 rpm i 10 min. Det sentrifugerte materialet ble blandet med alginat (LF 10/60) og kuler dannet som beskrevet i den foreliggende patentsøknad. Kulene ble lagret i modifisert Biladyl ved 18°C. Gjenværende sædceller ble lagret i EDTA ved 18°C som kontroll. Mixed semen of good quality from three adult male silver foxes (Vulpes vulpes) was diluted with EDTA-based diluent to 228 x 10<6> sperm cells per ml and transported to the laboratory. 3 hours after collection and dilution, a sample of the semen was centrifuged at 2000 rpm for 10 min. The centrifuged material was mixed with alginate (LF 10/60) and spheres formed as described in the present patent application. The spheres were stored in modified Biladyl at 18°C. Remaining sperm were stored in EDTA at 18°C as a control.
Kulene ble oppløst etter 48 timer. Både de oppløste sædcellene og kontrollsædcellene ble oppvarmet til 35°C i 20 min. før motiliteten ble evaluert som prosent motile sædceller ved fasemikroskopi ved 10 x og 25 x forstørring på en oppvarmet plate ved 38°C. The beads dissolved after 48 hours. Both the dissolved sperm cells and the control sperm cells were heated to 35°C for 20 min. before motility was evaluated as percent motile spermatozoa by phase microscopy at 10x and 25x magnification on a heated plate at 38°C.
Eksempel 4: Smågris født ved termin etter en enkelt intrauterin inseminasjon med algnatimmobiliserte galte sædceller Example 4: Piglet born at term after a single intrauterine insemination with algnathimmobilized bad sperm
Blandet sæd fra tre voksne galter ble behandlet ifølge foreliggende oppfinnelse, og kulene ble anvendt for intrauterin inseminasjon av en purke, som senere fødte et kull av smågris etter fullført drektighet. Purken hadde blitt avvent fra det foregående kull den 8. februar 2007 og ble inseminert én gang med sædceller immobilisert i alginatkuler den 12. februar 2007. Purken fødte 16 levende smågris den 10. juni 2007. Det var ingen dødfødte smågris i kullet, og alle smågrisene så normale ut ved klinisk undersøkelse. Mixed semen from three adult boars was treated according to the present invention, and the pellets were used for intrauterine insemination of a sow, which later gave birth to a litter of piglets after completion of pregnancy. The sow had been weaned from the previous litter on 8 February 2007 and inseminated once with sperm immobilized in alginate beads on 12 February 2007. The sow gave birth to 16 live piglets on 10 June 2007. There were no stillborn piglets in the litter, and all the piglets appeared normal on clinical examination.
Eksempel 5: Immobilisering av bukkesædceller i alginat Example 5: Immobilization of buck sperm cells in alginate
Sæd fra to AI-bukker ble oppsamlet med en kunstig vagina og fraktet til laboratoriet i løpet av 10 min. Sæden ble fortynnet 1+3 med fortynningsmiddel basert på skummet melk (Curtis PG, Forteath AD, Polge C. Survival of bull sperm frozen in milk diluents containing varying concentrations of glycerol and fructose. Proe IVth Int Congr Anim Reprod 1961; 3:952-956), før tilsetning av alginate og dannelse av kuler som beskrevet i patentsøknad 0613288.0, eksempel 1. Kulene ble lagret i fortynningsmiddel basert på skummet melk ved enten 5°C eller romtemperatur. Immobiliserte spermatozoer ble frigjort fra kulene før mikroskopisk evaluering av motiliteten som prosent motile sædceller 24 og 48 timer etter immobiliseringen. Av praktiske grunner inngikk ikke kontroller i denne undersøkelsen. Viabilitetsparametere, innbefattet motilitet, vil imidlertid svekkes under lagring av flytende bukkesæd ved 5°C eller 20°C i 30 timer (Paulenz H, Soderquist L, Perez-Pe R, Berg KA. Effect of different extenders and storage temperatures on sperm viability of liquid ram semen. Theriogenology 2002: 57(2):823-36). Semen from two AI bucks were collected with an artificial vagina and transported to the laboratory within 10 min. The sperm was diluted 1+3 with a diluent based on skimmed milk (Curtis PG, Forteath AD, Polge C. Survival of bull sperm frozen in milk diluents containing varying concentrations of glycerol and fructose. Proe IVth Int Congr Anim Reprod 1961; 3:952- 956), before addition of alginate and formation of spheres as described in patent application 0613288.0, example 1. The spheres were stored in diluent based on skimmed milk at either 5°C or room temperature. Immobilized spermatozoa were released from the beads prior to microscopic evaluation of motility as percent motile sperm 24 and 48 hours after immobilization. For practical reasons, controls were not included in this investigation. However, viability parameters, including motility, will be impaired during storage of liquid buck sperm at 5°C or 20°C for 30 hours (Paulenz H, Soderquist L, Perez-Pe R, Berg KA. Effect of different extenders and storage temperatures on sperm viability of liquid ram semen. Theriogenology 2002: 57(2):823-36).
Claims (22)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO20090516A NO337570B1 (en) | 2006-07-04 | 2009-02-02 | Preservation of spermatozoa |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0613288A GB0613288D0 (en) | 2006-07-04 | 2006-07-04 | Preservation and controlled delivery/release of spermatoza |
| US80771606P | 2006-07-19 | 2006-07-19 | |
| PCT/NO2007/000256 WO2008004890A2 (en) | 2006-07-04 | 2007-07-03 | Preservation and controlled delivery/release of spermatozoa |
| NO20090516A NO337570B1 (en) | 2006-07-04 | 2009-02-02 | Preservation of spermatozoa |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20090516L NO20090516L (en) | 2009-03-31 |
| NO337570B1 true NO337570B1 (en) | 2016-05-09 |
Family
ID=40786761
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20090516A NO337570B1 (en) | 2006-07-04 | 2009-02-02 | Preservation of spermatozoa |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| NO (1) | NO337570B1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6596310B1 (en) * | 2000-08-23 | 2003-07-22 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Method of artificial insemination by timed release of sperm from capsules or solid beads |
-
2009
- 2009-02-02 NO NO20090516A patent/NO337570B1/en unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6596310B1 (en) * | 2000-08-23 | 2003-07-22 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Method of artificial insemination by timed release of sperm from capsules or solid beads |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO20090516L (en) | 2009-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8178130B2 (en) | Preservation and controlled delivery / release of spermatozoa | |
| Morrell | Artificial insemination: current and future trends | |
| Morrell et al. | Reproduction biotechnologies in germplasm banking of livestock species: a review | |
| Nunes et al. | Strategies to improve the reproductive efficiency of goats in Brazil | |
| US6596310B1 (en) | Method of artificial insemination by timed release of sperm from capsules or solid beads | |
| DK2048943T3 (en) | Preservation and controlled delivery / release of spermatozoa | |
| Singh et al. | Artificial insemination in pig, its status and future perspective in India: A review | |
| Bertol | Cryopreservation of epididymal sperm | |
| Di Iorio | Cryopreservation of rabbit semen: effectiveness of different permeable and non-permeable cryoprotectants on post-thaw sperm quality and reproductive performances | |
| Lindeberg et al. | Surgical recovery and successful surgical transfer of conventionally frozen–thawed embryos in the farmed European polecat (Mustela putorius) | |
| Faustini et al. | Enhancing insemination performance in pigs through controlled release of encapsulated spermatozoa | |
| US20140039246A1 (en) | Mammalian reproduction | |
| Faustini | New aspects of boar sperm encapsulation | |
| NO337570B1 (en) | Preservation of spermatozoa | |
| Karim et al. | Fact findings about the frozen buck semen characters freezing with EYC and Tris extender and productivity of Black Bengal does as the potential genetic resource in Bangladesh | |
| Perea et al. | A field study to compare post-thaw sperm progressive motility and pregnancy rate using Brahman bull semen frozen in milk based extender containing egg yolk or soybean lipids extract | |
| Lindeberg | embryo technology in the farmed european polecat (Mustela putorius) | |
| Kalobo | Presevation of boer goat semen in liquid nitrogen vapour in comparison to the conventional freezing method using different extenders, freezing and thawing regimes | |
| Faria et al. | Fixed-time artificial insemination in the bovine'Lydia Brava dos Açores' using frozen semen. | |
| Khuong et al. | Improving Rabbit Fertility: The Relationship Between Semen Dilution Rate and Artificial Insemination Effectiveness | |
| Grobler | The influence of superstimulation protocol on oocyte developmental competence in dairy cattle | |
| Tkachev et al. | Efficiency of house poultry sperm cryopreservation by the Kharkiv technology | |
| Koçyi̇Ğit et al. | Effect of SpermVital® technology on conception rate in repeat breeder multiparous dairy cows: preliminary results | |
| Al-Faruque et al. | Fertilizing capacity of buck (Capra hircus) semen frozen with different concentrations of egg yolk | |
| RIZAL et al. | Quality of Epididymal and Ejaculated Sperms of Spotted Buffalo in Dextrose Supplemented Extender |