NO330330B1

NO330330B1 - Process for Preparation of Branched Polymers of Glucose

Info

Publication number: NO330330B1
Application number: NO20015224A
Authority: NO
Inventors: Guy Fleche; Serge Comini; Jean-Jacques Caboche; Philippe Looten; Carole Petitjean; Daniel Backer
Original assignee: Roquette Freres
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2001-10-25
Publication date: 2011-03-28
Also published as: MXPA01011078A; KR20020010622A; CA2371185A1; AU777378B2; AU4305200A; JP4823421B2; EP1177216A1; DK1177216T3; ATE274525T1; DE60013271D1; WO2000066633A1; FR2792941A1; NO20015224D0; CA2371185C; DE60013271T2; FR2792941B1; JP2002543248A; EP1177216B1; KR100803833B1; CN1197878C

Abstract

The invention relates to glucose soluble polymers which do not substantially contain any beta glucosidic bonds, characterized in that they comprise 2.5 -10 % alpha -1,6 gluocosidic bonds, have a very low or zero tendency to retrograde in an aqueous solution determined according to a test A, possess an MP which is determined according to a test C having a median value of the distribution profile of the molecular masses ranging from 104 and 105 Daltons and have a reducing sugar content that is at most 9 %.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av forgrenede polymerer av glukose i det vesentlige ikke inneholdende P glukosidiske bindinger, med utmerket stabilitet i oppløsning uttrykt ved deres lave tendens til retrogradering og en be-merkelsesverdig molekylvektsfordeling i et område som ligger mellom IO<4>og IO<8>dalton. The present invention relates to a process for the production of branched polymers of glucose essentially not containing P glucosidic bonds, with excellent stability in solution expressed by their low tendency to retrogradation and a remarkable molecular weight distribution in a range between 10<4> and 10<8>daltons.

Disse oppløselige, forgrenede polymerer av glukose som oppnås ifølge oppfinnelsen har videre et lavt innhold av reduserende sukker og lav viskositet. These soluble, branched polymers of glucose which are obtained according to the invention further have a low content of reducing sugar and low viscosity.

Slike oppløselige, forgrenede polymerer av glukose som kan finne anvendelse for mange industrielle anvendelser og særlig i næringsmiddelindustrien. Such soluble, branched polymers of glucose which can be used for many industrial applications and especially in the food industry.

Innenfor rammen av oppfinnelsen er de oppløselige, forgrenede polymerer av glukose som i det vesentlige ikke inneholder noen P-glukosidiske bindinger, polymerer av a-1,4 bundet glukose og oppviser mange a-1,6 forgreningspunkter og mindre enn 5 % P-forgrening, det vil si 0-1,2-, (3-1,3-, 0-1,4- eller P-l,6-forgrening. Within the scope of the invention, the soluble branched polymers of glucose containing essentially no β-glucosidic bonds are polymers of α-1,4 linked glucose and exhibit many α-1,6 branching points and less than 5% β-branching , that is, 0-1,2-, (3-1,3-, 0-1,4- or P-1,6-branching.

De glukosepolymerer som vanligvis er tilgjengelige industrielt stammer særlig fra na-turlige eller hybride stivelser eller derivater derav. The glucose polymers that are usually available industrially originate in particular from natural or hybrid starches or derivatives thereof.

Generelt består stivelse av to polymerer, amylose og amylopektin. Amylose er den frak-sjon som inneholder lineære a-1,4 forbundne homopolymerer av glukose og noen a-1,6 forgreningspunkter. In general, starch consists of two polymers, amylose and amylopectin. Amylose is the fraction containing linear α-1,4 linked homopolymers of glucose and some α-1,6 branching points.

Amylopektin er den forgrenede del bestående av lineære a-1,4 kjeder av glukose forbundet til andre lineære a-1,4 kjeder av glukose ved a-1,6 forgreningspunkter. Amylopectin is the branched part consisting of linear α-1,4 chains of glucose joined to other linear α-1,4 chains of glucose at α-1,6 branch points.

Kombinasjonen av disse to homopolymerer, pakket i form av meget godt strukturerte granuler av stivelse, utgjør karbonkildereserven i planter. The combination of these two homopolymers, packed in the form of very well structured granules of starch, constitutes the carbon source reserve in plants.

Den stivelse som produseres i hver plante består av en variabel prosentandel av hver av bestanddelene amylose og amylopektin eller også en spesiell fordeling av molekylvek-tene for hver av de nevnte homopolymerer av glukose. Dette forklarer hvorfor de forskjellige stivelser og derivater derav vanligvis klassifiseres på basis av den botaniske opprinnelse. Videre er de funksjonelle egenskaper for stivelser og derivater derav direkte avhengig av deres innhold av amylose og amylopektin. Når således en suspensjon av stivelse oppvarmes til over geldannelsestemperaturen sveller stivelsesgranulene og amy- losen oppløseliggjøres preferensielt. Ved avkjøling av suspensjonen retrograderer imidlertid homopolymerene av glukose, hurtig for amylose, (noen få timer) og langsommere for amylopektin (noen dager). The starch produced in each plant consists of a variable percentage of each of the components amylose and amylopectin or also a special distribution of the molecular weights for each of the aforementioned homopolymers of glucose. This explains why the various starches and their derivatives are usually classified on the basis of their botanical origin. Furthermore, the functional properties of starches and their derivatives are directly dependent on their content of amylose and amylopectin. Thus, when a suspension of starch is heated above the gelation temperature, the starch granules swell and the amylose is preferentially solubilized. On cooling the suspension, however, the homopolymers of glucose retrograde, rapidly for amylose (a few hours) and more slowly for amylopectin (a few days).

Spesialister på område anvendelse av stivelser og derivater derav i næringsmiddelindustrien er enige om at dette retrogradeirngsfenomen påvirker teksturen for næringsmid-ler og reduserer deres levetid. Det er kjent at disse produkter gjøres mer akseptable ved å fremstille dem fra stivelsesprodukter som er rike på amylopektin og således for eksempel fra voksaktige varianter. Imidlertid er stabiliteten for de geler og bindemidler som oppnås fra disse stivelsesprodukter som er rike på amylopektin, ikke tilstrekkelig for kravene som stilles i næringsmiddelindustrien, der det noen ganger er nødvendig å ha lagringstider på flere måneder. Specialists in the area of application of starches and their derivatives in the food industry agree that this retrograde aging phenomenon affects the texture of foodstuffs and reduces their lifespan. It is known that these products are made more acceptable by preparing them from starch products that are rich in amylopectin and thus, for example, from waxy varieties. However, the stability of the gels and binders obtained from these starch products rich in amylopectin is not sufficient for the requirements of the food industry, where it is sometimes necessary to have storage times of several months.

En første løsning består i å stabilisere glukosehomopolymerene ved hjelp av kjemiske midler. Denne operasjon bevirkes for det meste ved anvendelse av forestring eller forestringsreaksjoner. Disse kan særlig være acetylerings- eller hydroksypropylerings-reaksjoner. For videre å oppnå de ønskede egenskaper når det gjelder tekstur og viskositet er disse reaksjoner ofte kombinert med en tverrbindingsreaksjon. A first solution consists in stabilizing the glucose homopolymers using chemical means. This operation is mostly effected by the use of esterification or esterification reactions. These can in particular be acetylation or hydroxypropylation reactions. In order to further achieve the desired properties in terms of texture and viscosity, these reactions are often combined with a cross-linking reaction.

Disse modifikasjoner gir så fremragende reologiske egenskaper til stivelsene, gjør dem mer resistente mot mekaniske prosesser som skjærpåvirkning, eller mot sure media. Acetylering eller hydroksypropylering gir videre god lagringsstabilitet etter koking, særlig ved lav temperatur. These modifications then give excellent rheological properties to the starches, making them more resistant to mechanical processes such as shearing, or to acidic media. Acetylation or hydroxypropylation also provides good storage stability after boiling, especially at low temperatures.

Imidlertid har de således oppnådde produkter den mangel at de er behandlet kjemisk, noe som ofte er ugunstig sett fra forbrukernes synspunkt. However, the products thus obtained have the disadvantage of being chemically treated, which is often unfavorable from the consumer's point of view.

En andre løsning består i å isolere stivelsen fra planter hvori noen gener som er involvert i stivelsesbiosyntese er endret, noe som gir spesielle egenskaper hos den således modifiserte stivelse. A second solution consists in isolating the starch from plants in which some genes involved in starch biosynthesis have been changed, which gives special properties to the thus modified starch.

Dette kan være mutanter eller hybridvarieteter, på hvilke det er innvirket på voks-(wx)-, amyloseforlenger (ae)-, dull (du)-, opak (o)-, krympe (sh)-, sprø (bf)- eller sukker (su)- genene. These can be mutants or hybrid varieties, on which wax (wx), amylose extender (ae), dull (du), opaque (o), shrink (sh), brittle (bf) or the sugar (su) genes.

Således beskriver US 4 767 849 stivelse som er ekstrahert fra en maisvariant som er homozygotisk for genotypen voks/krympet-1, som gir de således oppnådde granulære stivelser stabilitetsegenskaper mot retrogradering i dypfryse/tinesykler (vanligvis kalt fryse-tinesykler) som er ekvivalent med de kjemisk modifiserte stivelser. Imidlertid har disse varianter som oppnås ved krysning mellom to varianter av voks- og krympet geno-type kun et stivelsesinnhold som ligger mellom 1 og 20 % av det stivelsesinnhold som vanligvis syntetiseres for såkalte villtypevarianter. Thus, US 4,767,849 describes starch extracted from a maize variety homozygous for the wax/shrink-1 genotype, which gives the granular starches thus obtained stability properties against retrogradation in deep freeze/thaw cycles (usually called freeze-thaw cycles) which are equivalent to the chemically modified starches. However, these variants obtained by crossing between two variants of the waxy and shrunken genotype only have a starch content that lies between 1 and 20% of the starch content usually synthesized for so-called wild-type variants.

De kan også være genetisk modifiserte planter, oppnådd ved målrettet modifisering av et gen eller av en gruppe gener som koder for enzymer involvert i biosyntesen av stivelse. Strategiene for genekstinksjon eller genetisk amplifikasjon i planten, gener som koder for eksempel for stivelsesavgrenings- eller forgreningsenzym som er tilhørige til planten, eller av eksogen opprinnelse, som glykogenbiosyntesegenene hos bakterier, er rikelig beskrevet. They can also be genetically modified plants, obtained by targeted modification of a gene or of a group of genes that code for enzymes involved in the biosynthesis of starch. The strategies for gene extinction or genetic amplification in the plant, genes encoding for example starch debranching or branching enzyme belonging to the plant, or of exogenous origin, such as the glycogen biosynthesis genes in bacteria, are abundantly described.

Imidlertid må det sies, slik tilfelle er i mutante eller hybride planter, at hvis de således modifiserte stivelser har egenskaper ekvivalente med de kjemisk modifiserte stivelser, er stivelsesinnholdet i de således oppnådde planter langt fra industrielt tilfredsstillende. However, it must be said, as is the case in mutant or hybrid plants, that if the starches thus modified have properties equivalent to the chemically modified starches, the starch content in the plants thus obtained is far from industrially satisfactory.

Et første alternativ til disse prosesser består i å benytte enzymer av a-amylase-, oc-amylase-, pullulanase- eller iso-amylasetypen for å modifisere native stivelser in vitro for å gi dem visse av egenskapene til kjemisk modifiserte stivelser. Det er således vanligvis ikke lenger problemer forbundet med de benyttede mengder. A first alternative to these processes consists in using enzymes of the α-amylase, oc-amylase, pullulanase or iso-amylase type to modify native starches in vitro to give them certain of the properties of chemically modified starches. There are thus usually no longer any problems associated with the amounts used.

Således beskriver EP 539 910 en fremgangsmåte for fremstilling av granuler av stivelse modifisert ved en a-amylasebehandling for å oppnå produkter med lavere viskositet. Imidlertid tar denne prosess kun sikte på å endre strukturen av stivelsesgranulen uten i vesentlig grad å modifisere dens bestanddeler. Thus, EP 539 910 describes a method for producing granules of starch modified by an α-amylase treatment to obtain products with a lower viscosity. However, this process only aims to change the structure of the starch granule without significantly modifying its constituents.

US 4 454 161 vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av forgrenet enzym (EC 2.4.1.18) og fremstillingen av matprodukter. De nevnte matproduktene fremstilles med, eller tilsettes til, et reaksjonsprodukt som kan oppnås ved å utsette et stivelsesholdig stoff for virkningen av et forgreningsenzym. US 4,454,161 relates to a method for the production of branched enzyme (EC 2.4.1.18) and the production of food products. The aforementioned food products are prepared with, or added to, a reaction product which can be obtained by exposing a starch-containing substance to the action of a branching enzyme.

EP 574 721 beskriver fremstilling av et stivelsesaktig produkt med et høyt innhold av stabilt amylopektin uten bruk av kjemisk behandling som sådan, men ved å gjennomfø-re en kontrollert hydrolysereaksjon med Ø-amylase på en nativ, granulær stivelse. EP 574 721 describes the preparation of a starchy product with a high content of stable amylopectin without the use of chemical treatment as such, but by carrying out a controlled hydrolysis reaction with Ø-amylase on a native, granular starch.

Det således fremstilte produkt viser så et fravær av synerese og av viskositetsendring med tiden og er stabilt ved frysing/tining. Imidlertid nødvendiggjør denne prosess en forutgående varmebehandling ved en temperatur mellom 65 og 75 °C for å gelatinisere stivelsen før man gjennomfører den enzymatiske hydrolysen som sådan. Videre er det fremfor alt nødvendig å kontrollere hydrolysenivået for å begrense dette til en verdi mellom 5 og 20 %. The thus produced product then shows an absence of syneresis and viscosity change with time and is stable during freezing/thawing. However, this process necessitates a preliminary heat treatment at a temperature between 65 and 75 °C to gelatinize the starch before carrying out the enzymatic hydrolysis as such. Furthermore, it is above all necessary to control the level of hydrolysis in order to limit this to a value between 5 and 20%.

Et annet alternativ til prosessene som tar sikte på å modifisere native stivelser kjemisk, eller å ekstrahere native stivelser med egenskaper til modifiserte stivelser fra mutant, hybrid eller genetisk modifiserte planter, består i å innføre nye forgreningspunkter i stivelsen in vitro. Another alternative to the processes aimed at chemically modifying native starches, or extracting native starches with properties of modified starches from mutant, hybrid or genetically modified plants, consists in introducing new branching points into the starch in vitro.

Dette involverer så å gjennomføre en modifikasjon av amylopektin- eller amylosekjeden fremfor å benytte stabiliserings- og eller tverrbindingsreaksjoner som antydet tidligere. This then involves carrying out a modification of the amylopectin or amylose chain rather than using stabilization and or cross-linking reactions as suggested earlier.

Det benyttes vanligvis to teknikker. Den første benytter termiske midler og den andre rensede enzymer for biosyntese av glykogen og/eller stivelse som glykogen- eller stivelsesforgreningsenzymer, respektivt ansvarlige for syntesen av a-1,6 forgreningspunktene i glykogen eller a-1,6 forgreningspunktene i amylopektin, og ansvarlige for enkelte forgreningspunkter hos amylose. Two techniques are usually used. The first uses thermal means and the second purified enzymes for the biosynthesis of glycogen and/or starch such as glycogen or starch branching enzymes, respectively responsible for the synthesis of the α-1,6 branch points in glycogen or the α-1,6 branch points in amylopectin, and responsible for individual branching points in amylose.

WO 95/22562 beskriver for eksempel dekstriner av stivelsestypen som kjennetegnes ved at deres molekylvekt ligger mellom 15 x 10<3>og 10<7>dalton og en forgreningsgrad som ligger mellom 2 og 8 %, oppnådd ved behandling av nativ, granulær stivelse, særlig potetstivelse, under sure betingelser (0,17 vekt-% ortofosforsyre, beregnet på stivelse) og ved en temperatur som ligger mellom 110 og 140 °C i 1 til 15 timer. WO 95/22562 describes, for example, dextrins of the starch type which are characterized by their molecular weight being between 15 x 10<3> and 10<7>daltons and a degree of branching which is between 2 and 8%, obtained by treating native, granular starch, in particular potato starch, under acidic conditions (0.17% by weight orthophosphoric acid, calculated on starch) and at a temperature between 110 and 140 °C for 1 to 15 hours.

Det således oppnådde preparat er ment for sportsfolk som en energitilførsel etter fysiske anstrengelser. Imidlertid er denne behandling lang og meget arbeidsom å implementere og fører til glukosepolymerer som, bortsett fra et høyt innhold av a-1,6 bindinger (fortrinnsvis mellom 3 og 7 %), inneholder nye typer bindinger som vanligvis ikke eksisterer i nativ stivelse. Således avslører NMR-analyser bindinger av 0-1,4 og 0-1,6 typen og a-bindinger andre enn a-1,4 og a-1,6. The preparation thus obtained is intended for sportsmen as an energy supply after physical exertion. However, this treatment is long and very laborious to implement and leads to glucose polymers which, apart from a high content of α-1,6 bonds (preferably between 3 and 7%), contain new types of bonds that do not usually exist in native starch. Thus, NMR analyzes reveal bonds of the 0-1,4 and 0-1,6 type and α-bonds other than α-1,4 and α-1,6.

Fra det foregående fremgår det at det derfor er et utilfredsstilt behov for å ha tilgjengelig for det første glukosepolymerer med fremragende egenskaper, særlig når det gjelder stabilitet, oppløselighet og eventuelt viskositet og som samtidig gir forbedret levetids- og fordøyelsesegenskaper for produkter som inneholder dem, og for det andre å oppnå disse uten bruk av kjemiske eller fysikalske teknikker eller ved å søke tilflukt i ekstrahe-ring fra mutante eller genetisk modifiserte planter. From the foregoing it appears that there is therefore an unsatisfied need to have available, firstly, glucose polymers with outstanding properties, particularly in terms of stability, solubility and possibly viscosity, and which at the same time provide improved shelf life and digestion properties for products containing them, and secondly, to achieve these without the use of chemical or physical techniques or by taking refuge in extraction from mutant or genetically modified plants.

Foreliggende søkere har kommet frem til alle disse mål, som hittil har vært ansett vans-kelige å oppnå ved å designe og å utvikle, ved hjelp av meget forskning, en fremgangsmåte for fremstilling av nye typer av produkter, nemlig nye, oppløselige, forgrenede polymerer av glukose som i det vesentlige ikke inneholder noen p-glukosidiske bindinger. The present applicants have achieved all these goals, which have hitherto been considered difficult to achieve, by designing and developing, with the help of much research, a process for the production of new types of products, namely new soluble branched polymers of glucose containing essentially no β-glucosidic bonds.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av forgrenede polymerer av glukose som i det vesentlige ikke inneholder noen p-glukosidiske bindinger, det vil si som inneholder mindre enn 5% P-forgrening, fra en vandig oppløsning av stivelse eller stivelsesderivat med et tørrstoff på minst 1 vekt-% og fortrinnsvis 2 til 50 vekt-%, kjennetegnet ved at - en slik suspensjon av stivelse eller stivelsesderivat underkastes en temperatur høyere enn 130 °C og fortrinnsvis mellom 140 og 150 °C under et trykk på mer enn 3,5 bar, som fortrinnsvis ligger mellom 4 og 5 bar, i minst 2 minutter og fortrinnsvis i 2 til 5 minutter, Accordingly, the present invention provides a method for the production of branched polymers of glucose which contain essentially no p-glucosidic bonds, i.e. which contain less than 5% P-branching, from an aqueous solution of starch or starch derivative with a dry matter of at least 1% by weight and preferably 2 to 50% by weight, characterized in that - such a suspension of starch or starch derivative is subjected to a temperature higher than 130 °C and preferably between 140 and 150 °C under a pressure of more than 3.5 bar, which is preferably between 4 and 5 bar, for at least 2 minutes and preferably for 2 to 5 minutes,

- den således oppnådde stivelsen eller stivelsesderivatet behandles med 50 til - the starch or starch derivative thus obtained is treated with 50 to

2 000 enheter renset forgreningsenzym, idet forgreningsenzymet er ekstrahert fra 2,000 units of purified debranching enzyme, the debranching enzyme being extracted from

organismer og/eller fra mikroorganismer valgt fra gruppen bestående av høyere planter, gjær, bakterier og unicellulære alger, og er fortrinnsvis ekstrahert fra unicellulære alger, ved en temperatur som ligger mellom 25 og 50 °C, for-trinnvis ved en temperatur på 30 °C, i en varighet fra 10 minutter til 24 timer, og organisms and/or from microorganisms selected from the group consisting of higher plants, yeast, bacteria and unicellular algae, and is preferably extracted from unicellular algae, at a temperature between 25 and 50°C, preferably at a temperature of 30° C, for a duration from 10 minutes to 24 hours, and

- de således oppnådde forgrenede polymerer av glukose samles. - the thus obtained branched polymers of glucose are collected.

De oppløselige, forgrenede polymerer av glukose som i det vesentlige ikke inneholder The soluble, branched polymers of glucose which essentially do not contain

noen P-glukosidiske bindinger, som oppnås ifølge oppfinnelsen, har mellom 2, 5 og 10 % a-1,6 glukosidiske bindinger, en meget lav til ingen tendens til retrogradering i vandig oppløsning, bestemt i henhold til en test A, og en Mw bestemt i henhold til en test C ved en midlere verdi for molekylvektsfordelingsprofilen på mellom IO<4>og IO<8>dalton. some β-glucosidic bonds, which are obtained according to the invention, have between 2.5 and 10% α-1,6 glucosidic bonds, a very low to no tendency to retrogradation in aqueous solution, determined according to a test A, and a Mw determined according to a test C at a mean value for the molecular weight distribution profile of between 10<4> and 10<8>daltons.

De forgrenede polymerer av glukose som fremstilles ifølge oppfinnelsen har også et lavt innhold av reduserende sukker, på høyst 9 %, og en viskositet bestemt i henhold til en test B, for 3 g tørrstoff på høyst 5 000 cP. The branched polymers of glucose produced according to the invention also have a low content of reducing sugars, of no more than 9%, and a viscosity determined according to a test B, for 3 g of dry matter, of no more than 5,000 cP.

Innholdet av a-1,6 glukosidiske bindinger i de oppløselige, forgrenede polymerer av glukose, bestemt ved proton NMR analyse, er fra 2,5 til 10 %, uttrykt som antallet a-1,6 bindinger i forhold til det totale antall a-1,4- og a-l,6-glukosidiske bindinger i de forgrenede polymerer av glukose. The content of α-1,6 glucosidic bonds in the soluble, branched polymers of glucose, determined by proton NMR analysis, is from 2.5 to 10%, expressed as the number of α-1,6 bonds in relation to the total number of α- 1,4- and α-1,6-glucosidic bonds in the branched polymers of glucose.

Dette innhold av a-1,6 glukosidiske bindinger gir enhver glukosepolymer som oppnås ifølge oppfinnelsen en spesiell struktur, uttrykt ved graden av forgrening og/eller leng-den av forgrenede kjeder sammenlignet med stivelsen eller stivelsesderivatet hvorfra de avledes. This content of α-1,6 glucosidic bonds gives any glucose polymer obtained according to the invention a special structure, expressed by the degree of branching and/or the length of branched chains compared to the starch or starch derivative from which they are derived.

De oppløselige, forgrenede polymerer av glukose viser også en lav tendens til retrogradering i vandig oppløsning, bestemt i henhold til en test A. Denne test består i å fastslå tilbøyeligheten for et gitt produkt til retrogradering i løpet av gjentatte fryse/tinesykler. The soluble branched polymers of glucose also show a low tendency to retrograde in aqueous solution, as determined according to a test A. This test consists in determining the propensity of a given product to retrograde during repeated freeze/thaw cycles.

Den observerte retrogradering av produktet og entalpien for destrukturering av produktet som var i stand til retrogradering, bestemt ved differensialkalorimetrisk analyse, gir således informasjon om stabiliteten av produktet som undersøkes. The observed retrogradation of the product and the enthalpy of destructuring of the product capable of retrogradation, determined by differential calorimetric analysis, thus provide information about the stability of the product under investigation.

Mer spesielt omfatter test A å tilveiebringe et vandig preparat av produktet som skal testes med 40 % tørrstoffinnhold. Forskjellige prøver tildannes i hermetisk lukkede digler. Alle diglene oppvarmes til en temperatur på 100 °C i 15 minutter for å bevirke gela-tinisering eller oppløsning, og disse digler underkastes så en behandling med fryse/tinesykler der hver av syklene omfatter å bringe og å holde preparatet i 15 minutter ved en temperatur på - 20 °C, så til en temperatur på + 20 °C, og så å holde den ved denne temperatur i 1 time 30 minutter. More specifically, test A involves providing an aqueous preparation of the product to be tested with a 40% solids content. Different samples are formed in hermetically sealed crucibles. All the crucibles are heated to a temperature of 100°C for 15 minutes to effect gelatinization or dissolution, and these crucibles are then subjected to treatment with freeze/thaw cycles where each of the cycles comprises bringing and holding the preparation for 15 minutes at a temperature of - 20 °C, then to a temperature of + 20 °C, and then to keep it at this temperature for 1 hour 30 minutes.

Deretter gjennomføres en differensialkalorimetrisk analyse i hver syklus, på et Perkin Eimer utstyr, for bestemmelse av destruktureirngsentalpien for produktet som har vært i stand til retrogradering. A differential calorimetric analysis is then carried out in each cycle, on a Perkin Eimer equipment, to determine the enthalpy of destruction for the product which has been capable of retrogradation.

Stabiliteten mot fryse/tinesykler estimeres således først ved antallet fryse/tinesykler ut over hvilke denne måling av entalpiverdien som er nødvendig for å destrukturere stivel-sesgelen som så er retrogradert, kan gjennomføres. The stability against freeze/thaw cycles is thus first estimated by the number of freeze/thaw cycles beyond which this measurement of the enthalpy value, which is necessary to destructure the starch gel which is then retrograded, can be carried out.

Glukosepolymerene som oppnås ifølge oppfinnelsen, som er underkastet disse gjentatte fryse/tinesykler, viser overraskende og uventet en "lav tendens til retrogradering", det vil her si et delvis eller totalt fravær av retrogradering i henhold til test A og avhengig av deres innhold av a-1,6 glukosidiske bindinger. The glucose polymers obtained according to the invention, which are subjected to these repeated freeze/thaw cycles, surprisingly and unexpectedly show a "low tendency to retrogradation", that is to say here a partial or total absence of retrogradation according to test A and depending on their content of a -1,6 glucosidic bonds.

Således starter glukosepolymerene som har et innhold av a-1,6 glukosidiske bindinger som ligger mellom 2,5 og 5 %, først å retrogradere signifikant ut over den åttende fryse/tinesyklus og viser en lav retrograderingsentalpiverdi slik det skal eksemplifiseres nedenfor. Thus, the glucose polymers which have a content of α-1,6 glucosidic bonds between 2.5 and 5%, first start to retrograde significantly beyond the eighth freeze/thaw cycle and show a low retrogradation enthalpy value as will be exemplified below.

De beskrives som forgrenede polymerer av glukose som viser en "meget lav tendens til retrogradering". They are described as branched polymers of glucose that show a "very low tendency to retrogradation".

Når det gjelder glukosepolymerene fremstilt ifølge oppfinnelsen som har et innhold av a-1,6 glukosidiske bindinger mellom 5 og 10 % observeres ingen retrogradering av oppløsningen selv etter 12 fryse/tinesykler, noe som forklarer hvorfor det ikke kan fast-legges noen destruktureringsentalpi. In the case of the glucose polymers produced according to the invention which have a content of α-1,6 glucosidic bonds between 5 and 10%, no retrogradation of the solution is observed even after 12 freeze/thaw cycles, which explains why no destructuring enthalpy can be determined.

Det er spesielt overraskende at glukosepolymerene som oppnås ifølge oppfinnelsen kan oppvise en slik stabilitet. Således retrograderer målingen som foretas med test A på voksstivelser og tverrbundede og acetylerte voksstivelser (som de som fremstilles ved å følge læren i US 2 928 828) mellom den fjerde og sjette fryse/tinesyklus slik det vises i eksempel 2. It is particularly surprising that the glucose polymers obtained according to the invention can exhibit such stability. Thus, the measurement made by Test A on wax starches and cross-linked and acetylated wax starches (such as those prepared following the teachings of US 2,928,828) retrogrades between the fourth and sixth freeze/thaw cycles as shown in Example 2.

Så vidt søkeren kjenner til eksisterer det ingen glukosepolymerer som har en slik stabilitet. To the applicant's knowledge, no glucose polymers exist that have such stability.

Denne egenskap gjør helt naturlig de forgrenede glukosepolymerer som fremstilles iføl-ge oppfinnelsen velegnet for preparater for anvendelse i næringsmiddelindustrien som så oppnår høye lagringsstabiliteter. This property quite naturally makes the branched glucose polymers produced according to the invention suitable for preparations for use in the food industry, which then achieve high storage stabilities.

En annen fordel ved oppfinnelsen er at den gjør det mulig å oppnå et ferdig produkt som kan anvendes for eksempel som øyeblikksbindemiddel i kjøle- eller dypfryste produkter. Another advantage of the invention is that it makes it possible to obtain a finished product that can be used, for example, as an instant binding agent in refrigerated or deep-frozen products.

Bestemmelsen av den midlere verdi av molekylvektsfordelingsprofilen for de oppløseli-ge, forgrenede polymerer av glukose som oppnås ifølge oppfinnelsen gjennomføres ved måling av den vektmidlere molekylvekt (Mw). The determination of the average value of the molecular weight distribution profile for the soluble, branched polymers of glucose obtained according to the invention is carried out by measuring the weight average molecular weight (Mw).

I praksis blir Mw verdiene ikke beregnet men måles ved forskjellige teknikker. For eksempel benyttes det en målemetode som er egnet for glukosepolymerer som er basert på gelpermeasjonskromatografi på kromatografikolonner som er standardisert med pullu-laner med kjente molekylvekter. In practice, the Mw values are not calculated but are measured by different techniques. For example, a measurement method suitable for glucose polymers is used which is based on gel permeation chromatography on chromatography columns which are standardized with pullulans of known molecular weights.

Test C som er utviklet av søkerne for å bestemme den midlere verdi for molekylvektsfordelingsprofilen som er karakteristisk for de oppløselige, forgrenede polymerer av glukose omfatter: - å opprette den molare fordelingsprofil for de kromatografiske fraksjoner av de oppløselige forgrenede polymerer av glukose, - å bestemme verdien kalt "midlere verdi for molekylvektsfordelingsprofilen" som tilsvarer den verdi av den midlere molekylvektsfordelingstopp av populasjonen som representerer mer enn 90 % av de kromatografiske fraksjoner som oppnås fra den separative gelpermeasjonskromatografi. Test C developed by the applicants to determine the average value of the molecular weight distribution profile characteristic of the soluble branched polymers of glucose includes: - establishing the molar distribution profile for the chromatographic fractions of the soluble branched polymers of glucose, - determining the value called the "mean value of the molecular weight distribution profile" which corresponds to the value of the mean molecular weight distribution peak of the population representing more than 90% of the chromatographic fractions obtained from the separative gel permeation chromatography.

De forgrenede polymerer av glukose fremstilt ifølge oppfinnelsen har så en justert mo-lekylvektsfordelingsprofilverdi Mw som ligger mellom IO<4>og IO<9>dalton. The branched polymers of glucose produced according to the invention then have an adjusted molecular weight distribution profile value Mw which lies between 10<4> and 10<9>daltons.

Det er fordelaktig at de oppløselige, forgrenede polymerer av glukose kan klassifiseres i to familier, den første familie med en midlere Mw verdi for molekylvektsfordelingsprofilen som ligger mellom 10<5>og IO<6>dalton og den andre familie med en midlere Mw verdi for molekylvektsfordelingsprofilen som ligger mellom IO<7>og 10<8>dalton. Advantageously, the soluble branched polymers of glucose can be classified into two families, the first family with an average Mw value for the molecular weight distribution profile that lies between 10<5> and 10<6>daltons and the second family with an average Mw value for the molecular weight distribution profile lying between 10<7>and 10<8>daltons.

I tillegg har de oppløselige, forgrenede polymerer av glukose fremstilt ifølge oppfinnelsen et lavt innhold av reduserende sukker. In addition, the soluble, branched polymers of glucose produced according to the invention have a low reducing sugar content.

Bestemmelsen av reduksjonskraften for de forgrenede polymerer av glukose fremstilt ifølge oppfinnelsen fører, ved en hvilken som helst for fagmannen kjent metode, til verdier på høyst 9 %. The determination of the reducing power for the branched polymers of glucose produced according to the invention leads, by any method known to the person skilled in the art, to values of at most 9%.

Fortrinnsvis kan de forgrenede polymerer av glukose klassifiseres i to underfamilier på basis av deres innhold av reduserende sukker. Preferably, the branched polymers of glucose can be classified into two subfamilies on the basis of their reducing sugar content.

Den første underfamilie har et innhold av reduserende sukker på høyst 1 %. The first subfamily has a reducing sugar content of no more than 1%.

Den andre underfamilie har et innhold av reduserende sukker mellom 5,5 og høyst 9 %. The second subfamily has a reducing sugar content of between 5.5 and a maximum of 9%.

Søkerne har videre funnet at de forgrenede polymerer av glukose som er fremstilt ifølge oppfinnelsen har meget eksepsjonelle, reologiske egenskaper. The applicants have further found that the branched polymers of glucose produced according to the invention have very exceptional rheological properties.

Viskositetsanalysen for de forgrenede polymerer av glukose gjennomføres ved hjelp av en test B som er utviklet av søkerne for dette spesielle produktområdet. The viscosity analysis for the branched polymers of glucose is carried out using a test B developed by the applicants for this particular product area.

Disse er således ikke granulære produkter som vanligvis beskrevet og analysert i den kjente teknikk, men forgrenede polymerer av glukose som overraskende og uventet viser en fremragende oppløselighet i kaldt vann. These are thus not granular products as usually described and analyzed in the prior art, but branched polymers of glucose which surprisingly and unexpectedly show excellent solubility in cold water.

Test B består i først å fremstille produktet som skal analyseres ved presipitering med etanol, tørking under vakuum og så oppmaling i en morter og til slutt sikting på en 125 jim duk. En masse på mellom 3 og 15 g av det tørre produkt som skal analyseres, oppnådd på denne måte, innføres så med 6,75 g 98 %ig glycerol i skålen i en Rapid Visco Analyzer (RVA - NewPort Scientific), og det hele homogeniseres forsiktig ved bruk av en mikrospatel. Test B consists of first preparing the product to be analyzed by precipitation with ethanol, drying under vacuum and then grinding in a mortar and finally sieving on a 125 jim cloth. A mass of between 3 and 15 g of the dry product to be analyzed, obtained in this way, is then introduced with 6.75 g of 98% glycerol into the bowl of a Rapid Visco Analyzer (RVA - NewPort Scientific) and the whole is homogenized carefully using a micro spatula.

Deretter tilsettes en mengde demineralisert vann for å oppnå en sluttvekt på 28 g. Det hele omrøres så umiddelbart. Tids-/temperatur- og hastighetsanalyseprofilen i RVA gjennomføres så som følger: Prøven omrøres ved 100 omdreininger per minutt ved en temperatur på 25 °C i 5 sekunder og så ved 500 omdreininger per minutt i 25 sekunder. Omrøringen opprettholdes så ved 160 omdreininger per minutt under resten av profilen. Initialtemperaturen på 25 °C opprettholdes i 10 minutter og økes så til 90 °C i 8 minutter. Denne temperatur på 90 °C holdes så i 3 minutter og reduseres til 30 °C i 8 minutter og holdes så ved denne verdi på 30 °C i 5 minutter. A quantity of demineralized water is then added to achieve a final weight of 28 g. The whole is then stirred immediately. The time/temperature and speed analysis profile in the RVA is carried out as follows: The sample is stirred at 100 revolutions per minute at a temperature of 25 °C for 5 seconds and then at 500 revolutions per minute for 25 seconds. Agitation is then maintained at 160 revolutions per minute during the remainder of the profile. The initial temperature of 25 °C is maintained for 10 minutes and then increased to 90 °C for 8 minutes. This temperature of 90°C is then held for 3 minutes and reduced to 30°C for 8 minutes and then held at this value of 30°C for 5 minutes.

Viskositeten som bibeholdes er viskositeten i centipoises, cP, målt ved slutten av analy-seprofilen, etter 34 minutter. The viscosity retained is the viscosity in centipoises, cP, measured at the end of the analysis profile, after 34 minutes.

De forgrenede polymerer av glukose fremstilt ifølge oppfinnelsen har så en viskositet på høyst 5 000 cP for 3 g tørt produkt. The branched polymers of glucose produced according to the invention then have a viscosity of no more than 5,000 cP for 3 g of dry product.

Søkerne har også funnet at disse viskositetsverdier for de forgrenede polymerer av glukose fremstilt ifølge oppfinnelsen er av samme størrelsesorden som viskositetsverdiene, bestemt ved å følge den samme test B, for voksstivelser som er fluidisert ved syrebe-handling. The applicants have also found that these viscosity values for the branched polymers of glucose produced according to the invention are of the same order of magnitude as the viscosity values, determined by following the same test B, for wax starches that are fluidized by acid treatment.

Imidlertid viste supplerende viskositetsmålingsanalyser, gjennomført etter 7 dagers lagring ved 4 °C, overraskende og uventet en utmerket stabilitet for viskositeten hos de forgrenede polymerer av glukose i motsetning til de nevnte fluidiserte voksstivelser med den samme viskositet slik det skal forklares nedenfor. However, supplementary viscometry analyses, carried out after 7 days of storage at 4°C, surprisingly and unexpectedly showed an excellent stability of the viscosity of the branched polymers of glucose in contrast to the aforementioned fluidized wax starches of the same viscosity as will be explained below.

Disse produkter kan derfor for eksempel med fordel benyttes for fremstilling av flytende ferdige næringspreparater og de gjør det fremfor alt mulig å garantere langtidslagring ved lav temperatur. These products can therefore, for example, be advantageously used for the production of liquid ready-to-eat nutritional preparations and they above all make it possible to guarantee long-term storage at a low temperature.

De forgrenede polymerer av glukose fremstilt ifølge oppfinnelsen er således spesielt egnet for preparater ment for bruk særlig i papir-, papp-, tekstil-, den farmasøytiske, kosmetikk- og særlig næringsmiddelindustrien. The branched polymers of glucose produced according to the invention are thus particularly suitable for preparations intended for use particularly in the paper, cardboard, textile, pharmaceutical, cosmetic and especially food industries.

Ved fremstillingen ifølge oppfinnelsen blir stivelsen, som nevnt, innført i vandig opp-løsning med minst 1 vekt-%, fortrinnsvis 2 til 50 vekt-%, tørrstoff. Valget av kilde eller kvalitet for stivelsen eller det spesielle derivat derav er kun av relativ betydning. In the preparation according to the invention, the starch is, as mentioned, introduced into an aqueous solution with at least 1% by weight, preferably 2 to 50% by weight, of dry matter. The choice of source or quality for the starch or the particular derivative thereof is only of relative importance.

Søkerne har funnet at de forgrenede polymerer av glukose fremstilt ifølge oppfinnelsen lett kan syntetiseres fra stivelser eller fra derivater derav som allerede har et forgre-ningsforhold på minst 1 %. The applicants have found that the branched polymers of glucose produced according to the invention can be easily synthesized from starches or from derivatives thereof which already have a branching ratio of at least 1%.

Denne suspensjon av stivelser eller av derivater av stivelse underkastes deretter en spesiell kokebehandling som består i å behandle den ved en temperatur over 130 °C, fortrinnsvis mellom 140 og 150 °C, under et trykk over 3, 5 bar og fortrinnsvis mellom 4 og 5 bar, i minst 2 minutter og fortrinnsvis 2 til 5 minutter. Denne behandling gjennomfø-res fortrinnsvis i en dobbelt-kappe rørkoker som varmes med et varmeoverføirngsfluid, et utstyr fagmannen på området lett kan oppnå. This suspension of starches or of derivatives of starch is then subjected to a special cooking treatment which consists in treating it at a temperature above 130 °C, preferably between 140 and 150 °C, under a pressure above 3.5 bar and preferably between 4 and 5 bar, for at least 2 minutes and preferably 2 to 5 minutes. This treatment is preferably carried out in a double-jacketed tube boiler which is heated with a heat transfer fluid, an equipment that the person skilled in the field can easily obtain.

Det andre trinn i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter behandling av den således oppnådde stivelse med 50 til 2000 enheter renset, forgreningsenzym ved en temperatur mellom 25 og 50 °C og fortrinnsvis ved en temperatur på 30 °C i et tidsrom på 10 minutter til 24 timer. The second step in the method according to the invention comprises treatment of the thus obtained starch with 50 to 2000 units of purified branching enzyme at a temperature between 25 and 50 °C and preferably at a temperature of 30 °C for a period of 10 minutes to 24 hours.

Forgreningsenzymene velges fra gruppen omfattende glykogenforgreningsenzymer og stivelsesforgreningsenzymer. Mer spesielt velges glykogenforgreningsenzymet av The debranching enzymes are selected from the group comprising glycogen debranching enzymes and starch debranching enzymes. More particularly, the glycogen branching enzyme is selected by

Escherichia coli og forgreningsenzymene av unicellulær algestivelse, for eksempel de fra grønnalgene Chlamydomonas reinhardtii. Escherichia coli and the debranching enzymes of unicellular algal starch, such as those from the green alga Chlamydomonas reinhardtii.

Isoleringen av nevnte glykogen- eller stivelsesforgreningsenzymer kan gjennomføres ved en hvilken som helst metode som per se er kjent for fagmannen. The isolation of said glycogen or starch branching enzymes can be carried out by any method known per se to the person skilled in the art.

Når det gjelder forgreningsenzymene av unicellulære alger anbefaler imidlertid søkerne anvendelse av det preparat som er beskrevet i fransk søknad 98/12051 i foreliggende søkers navn. However, with regard to the branching enzymes of unicellular algae, the applicants recommend the use of the preparation described in French application 98/12051 in the present applicant's name.

Tilgang til de rensede enzymer kan oppnås fra blandingen av algeenzymer som oppnås på denne måte ved direkte å anvende kromatografiske separasjonsteknikker som i seg selv er kjente, eller ved anvendelse av rekombinante DNA teknikker. Access to the purified enzymes can be obtained from the mixture of algal enzymes obtained in this way by directly using chromatographic separation techniques which are known per se, or by using recombinant DNA techniques.

Det kan være fordelaktig å isolere og å uttrykke genene som koder for de unicellulære algestivelsesforgreningsenzymer i en mikroorganisme som er lettere å manipulere enn de unicellulære alger. It may be advantageous to isolate and to express the genes encoding the unicellular algal starch branching enzymes in a microorganism that is easier to manipulate than the unicellular algae.

Teknikken, i seg selv kjent for fagmannen, kan så for eksempel bestå i: The technique, known in itself to the person skilled in the art, can for example consist of:

- å produsere polyklonale anti-stoffer som er spesifikke for hvert av algeforgre-ningssystemene som er renset tidligere, - screening, med de nevnte spesifikke anti-stoffer, av en ekspresjonsbank av genomisk DNA fra de angjeldende unicellulære alger, - isolering av DNA fragmenter fra klonene av ekspresjonsbanken av genomisk DNA som har reagert med et og/eller et annet av de spesifikke, polyklonale anti-stoffer, og - å innføre nevnte DNA fragmenter tilsvarende genene som koder for de unicellulære, algestivelsesforgreningsenzym i bakterier som tillater deres ekspresjon. - to produce polyclonal antibodies specific for each of the algal branching systems that have been purified previously, - screening, with the said specific antibodies, of an expression bank of genomic DNA from the unicellular algae in question, - isolation of DNA fragments from the clones of the expression bank of genomic DNA that have reacted with one and/or another of the specific, polyclonal antibodies, and - to introduce said DNA fragments corresponding to the genes that code for the unicellular algal starch debranching enzymes into bacteria that allow their expression.

De algestivelsesforgreningsenzymer som produseres ved denne prosess kalles rekombinante forgreningsenzymer fordi de er avledet fra en unicellulær alge og så overført genetisk og uttrykt i en mikroorganisme av en annen spesie, i det foreliggende tilfelle en bakterie. The algal starch debranching enzymes produced by this process are called recombinant debranching enzymes because they are derived from a unicellular alga and then transferred genetically and expressed in a microorganism of another species, in this case a bacterium.

For å fremstille de oppløselige, forgrenede polymerer av glukose kan så et renset, re-kombinant algestivelsesforgreningsenzym bringes til å virke på en voksmaisstivelses-pasta som er fremstilt i henhold til trinn a) i nevnte prosess. To prepare the soluble branched polymers of glucose, a purified, recombinant algal starch branching enzyme can then be acted upon a waxy maize starch paste prepared according to step a) of said process.

Det siste trinn i prosessen ifølge oppfinnelsen består så i å samle de således oppnådde, forgrenede polymerer av glukose. The last step in the process according to the invention then consists in collecting the branched polymers of glucose thus obtained.

Produktene presipiteres med 3 volumer etanol, renses og tørkes under vakuum i 24 timer eller forstøves på annen måte ved en hvilken som helst for fagmannen kjent teknikk. The products are precipitated with 3 volumes of ethanol, purified and dried under vacuum for 24 hours or otherwise atomized by any technique known to those skilled in the art.

Andre karakteristika og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå av et studium av de føl-gende eksempler. Other characteristics and advantages of the invention will be apparent from a study of the following examples.

EKSEMPEL 1 EXAMPLE 1

Fremstillingen av de forgrenede polymerer av glukose gjennomføres som følger. En suspensjon av voksmaisstivelse med et tørrstoffinnhold på 2,5 vekt-% fremstilles. Denne suspensjon behandles så i en dobbelt-kappe laboratorierørkoker oppvarmet ved var-meoverføirngsfluid, ved en temperatur på 145 °C og under et trykk på 4 bar. Mate-hastigheten er 40 ml/min for en oppholdstid på 3 minutter i kokeren. The preparation of the branched polymers of glucose is carried out as follows. A suspension of waxy maize starch with a solids content of 2.5% by weight is prepared. This suspension is then treated in a double-jacketed laboratory tube cooker heated by heat transfer fluid, at a temperature of 145°C and under a pressure of 4 bar. The feed rate is 40 ml/min for a residence time of 3 minutes in the cooker.

1,5 liter av dette preparat avkjøles til omgivelsestemperatur og anbringes i et medium som er bufret til en pH verdi lik 7 med 0,1 M endelig Tris HC1 buffer for et totalvolum på 3,750 liter. 19 ml (av en enzymoppløsning inneholdende 1,8 mg/ml proteiner og i tillegg med en spesifikk aktivitet på 1 100 U/mg, en aktivitet som måles ved fosforylase A estimeringsmetoden som velkjent for fagmannen) av en oppløsning av på forhånd renset rekombinante stivelsesforgreningsenzymer fra algen Chlamydomonas reinhardtii tilsettes og denne tillates å innvirke ved 30 °C i 30 minutter for å oppnå forgrenede polymerer av glukose og med et innhold av a-1,6 glukosidiske bindinger på 4,3 % (produkt A), og i 2 timer, for å oppnå forgrenede polymerer av glukose, med et innhold av a-1,6 glukosidiske bindinger på 6 % (produkt B). Hvert av produktene presipiteres så med etanol, filtreres, skylles og tørkes under vakuum i 24 timer. 1.5 liters of this preparation is cooled to ambient temperature and placed in a medium which has been buffered to a pH value equal to 7 with 0.1 M final Tris HC1 buffer for a total volume of 3.750 litres. 19 ml (of an enzyme solution containing 1.8 mg/ml proteins and in addition with a specific activity of 1,100 U/mg, an activity measured by the phosphorylase A estimation method well known to those skilled in the art) of a solution of pre-purified recombinant starch debranching enzymes from the algae Chlamydomonas reinhardtii is added and this is allowed to react at 30 °C for 30 minutes to obtain branched polymers of glucose and with a content of α-1,6 glucosidic bonds of 4.3% (product A), and for 2 hours , to obtain branched polymers of glucose, with a content of α-1,6 glucosidic bonds of 6% (product B). Each of the products is then precipitated with ethanol, filtered, rinsed and dried under vacuum for 24 hours.

De respektive verdier av den midlere Mw for molekylvektsfordelingsprofilen av produktene A og B er respektivt 1,5 x IO<7>dalton og 2,2 x IO7 dalton. Deres innhold av reduserende sukker er respektivt 0,05 % og 0,07 %. The respective values of the mean Mw for the molecular weight distribution profile of products A and B are 1.5 x 10<7>dalton and 2.2 x 107 dalton, respectively. Their reducing sugar content is respectively 0.05% and 0.07%.

EKSEMPEL 2 EXAMPLE 2

Bestemmelsen av stabiliteten for de forgrenede polymerer av glukose fremstilt ifølge oppfinnelsen gjennomføres ved måling av entalpien for destrukturering av det retrogra-derte produkt, hvis det er et retrogradert produkt, ved differensialkalorimetrisk analyse, under gjentatte fryse-/tinesykler. The determination of the stability of the branched polymers of glucose produced according to the invention is carried out by measuring the enthalpy for destructuring the retrograded product, if it is a retrograded product, by differential calorimetric analysis, during repeated freeze/thaw cycles.

To forgrenede polymerer av glukose ifølge oppfinnelsen med respektivt et innhold av a-1,6 glukosidiske bindinger i størrelsesorden 4,3 % (produkt A) og i størrelsesorden 6 % (produkt B) fremstilles som antydet i eksempel 1. Analysen gjennomføres også på to andre prøver; voksmaisstivelse (produkt C) og en tverrbundet og acetylert voksstivelse med en acetylindeks på 1,8 (produkt D). Two branched polymers of glucose according to the invention with respectively a content of α-1,6 glucosidic bonds in the order of 4.3% (product A) and in the order of 6% (product B) are prepared as indicated in example 1. The analysis is also carried out on two other samples; waxy maize starch (product C) and a cross-linked and acetylated waxy starch with an acetyl index of 1.8 (product D).

Som antydet i test A tildannes det et vandig preparat av hver av de 4 prøver med 40 % tørrstoff, anbrakt i en gruppe hermetisk lukkede digler, og disse oppvarmes i 15 minutter til 100 °C i en Perkin Eimer DSC4 ovn. For hver digel gjennomføres det 2,4, 6, 8, 10 eller 12 suksessive fryse-/tinesykler i henhold til den følgende protokoll: 15 minutter ved - 22 °C, så 1 time 30 minutter ved 20 °C. En retrograderingsentalpimåling gjennom-føres på hver digel ved å anbringe den i Perkin Eimer differensialkalorimeteret. As indicated in test A, an aqueous preparation is made of each of the 4 samples with 40% dry matter, placed in a group of hermetically sealed crucibles, and these are heated for 15 minutes to 100 °C in a Perkin Eimer DSC4 oven. For each crucible, 2,4, 6, 8, 10 or 12 successive freeze/thaw cycles are carried out according to the following protocol: 15 minutes at -22 °C, then 1 hour 30 minutes at 20 °C. A retrogradation enthalpy measurement is carried out on each crucible by placing it in the Perkin Eimer differential calorimeter.

Tabell 1 viser retrograderingsentalpimålingene, bestemt for hvert av de 4 produkter som ble testet i løpet av 12 suksessive fryse-/tinesykler. Table 1 shows the retrogradation enthalpy measurements, determined for each of the 4 products tested during 12 successive freeze/thaw cycles.

De forgrenede polymerer av glukose viser således fremragende stabilitet, selv etter 12 fryse-/tinesykler. Mens voksstivelsen (produkt C) og den tverrbundede og acetylerte voksstivelse (produkt D) starter å retrogradere fra den fjerde fryse-/tinesyklus gjelder dette ikke noen av de forgrenede polymerer av glukose oppnådd ifølge oppfinnelsen, fremstilt fra nevnte voksstivelse. Den enzymatiske prosedyre som ble benyttet for å mo difisere stivelsene og stivelsesderivatene gjør det således mulig å sikre en utmerket stabilitet, idet de er svært overlegne de stabiliserte og/eller fornettede voksstivelser. The branched polymers of glucose thus show excellent stability, even after 12 freeze/thaw cycles. While the wax starch (product C) and the cross-linked and acetylated wax starch (product D) start to retrograde from the fourth freeze/thaw cycle, this does not apply to any of the branched polymers of glucose obtained according to the invention, prepared from said wax starch. The enzymatic procedure that was used to modify the starches and starch derivatives thus makes it possible to ensure excellent stability, as they are far superior to the stabilized and/or cross-linked wax starches.

EKSEMPEL 3 EXAMPLE 3

De reologiske karakteristika for de forgrenede polymerer av glukose fremstilt ifølge oppfinnelsen tilveiebringes ved bruk av en Rapid Visco Analyzer (RVA). Produktene ifølge oppfinnelsen viser fremragende oppløselighet i kaldt vann. Det var derfor nød-vendig å utvikle en viskositetsbestemmelsesmetode som var velegnet for denne type produkt. Som antydet i test B ble 4,5 g av det tørre produkt som skulle undersøkes blan-det med glycerol og vann til en sluttvekt på 28 g. The rheological characteristics of the branched polymers of glucose produced according to the invention are provided using a Rapid Visco Analyzer (RVA). The products according to the invention show excellent solubility in cold water. It was therefore necessary to develop a viscosity determination method that was suitable for this type of product. As indicated in test B, 4.5 g of the dry product to be examined was mixed with glycerol and water to a final weight of 28 g.

De analyserte produkter er for det første produktene A, B og C som beskrevet i eksempel 2 og to ytterligere produkter E og F tilsvarende voksmaisstivelser som er fluidisert til to fluidiseringsnivåer (verdi estimert ved standardmålingen av fluiditeten i vann, det vil si "vannfluiditets" indeksen eller WF), oppnådd ved behandling under sure betingelser som i og for seg kjent av fagmannen, hvorved produkt E har en WF på 50 og produkt F har en WF på 65. The analyzed products are, firstly, products A, B and C as described in example 2 and two further products E and F corresponding to waxy maize starches that have been fluidized to two fluidization levels (value estimated by the standard measurement of the fluidity in water, i.e. the "water fluidity" index or WF), obtained by treatment under acidic conditions as per se known to the person skilled in the art, whereby product E has a WF of 50 and product F has a WF of 65.

Tids-/temperatur-/ og hastighetsanalyseprofilen i RVA gjennomføres så som følger: Prøven omrøres ved 100 omdreininger per minutt ved en temperatur på 25 °C i 5 sekunder og så ved 500 omdreininger per minutt i 25 sekunder. Omrøringen holdes så ved 160 omdreininger per minutt under resten av profilen. The time/temperature/ and speed analysis profile in RVA is carried out as follows: The sample is stirred at 100 revolutions per minute at a temperature of 25 °C for 5 seconds and then at 500 revolutions per minute for 25 seconds. The stirring is then maintained at 160 revolutions per minute during the rest of the profile.

Initialtemperaturen på 25 °C holdes i 10 minutter og økes deretter til 90 °C i 8 minutter. The initial temperature of 25 °C is maintained for 10 minutes and then increased to 90 °C for 8 minutes.

Denne temperatur på 90 °C holdes så i 3 minutter, reduseres til 30 °C i 8 minutter og holdes så ved denne verdi på 30 °C i 5 minutter. This temperature of 90°C is then held for 3 minutes, reduced to 30°C for 8 minutes and then held at this value of 30°C for 5 minutes.

Tabell II viser viskositetsresultatene for produktene A, B, C, E og F, uttrykt i centipoises (cP). Table II shows the viscosity results for products A, B, C, E and F, expressed in centipoises (cP).

De forgrenede polymerer av glukose fremstilt ifølge oppfinnelsen viser fremdeles en viss viskositet, men bemerkelsesmessig lavere enn den til kontrollvoksstivelsen (C). The branched polymers of glucose produced according to the invention still show a certain viscosity, but remarkably lower than that of the control wax starch (C).

Man kan se at disse viskositetsverdier er av samme størrelsesorden som de fluidiserte voksstivelser. It can be seen that these viscosity values are of the same order of magnitude as the fluidized wax starches.

En ytterligere studie gjennomføres ved måling av viskositeten etter lagring i 7 dager ved 4°C. A further study is carried out by measuring the viscosity after storage for 7 days at 4°C.

Denne studie gjør det mulig å karakterisere stabiliteten for de således oppnådde pastaer med tiden og å bestemme hvorvidt de forgrenede polymer av glukose oppnådd ifølge oppfinnelsen skiller seg fra fluidiserte voksstivelser. This study makes it possible to characterize the stability of the thus obtained pastes over time and to determine whether the branched polymer of glucose obtained according to the invention differs from fluidized wax starches.

RVA skålene inneholdende hvert av de fem produkter lagres ved 4 °C. The RVA dishes containing each of the five products are stored at 4 °C.

Viskositeten bestemmes så igjen ved RVA. Tid/temperatur- og hastighetsprofilen karak-teriseres så ved en hastighet og en temperatur holdt respektivt ved 160 og 30 °C i 20 minutter. Den bibeholdte viskositet er den midlere viskositet i cP, målt mellom 15 og 20 minutter. The viscosity is then determined again by RVA. The time/temperature and speed profile is then characterized at a speed and a temperature held respectively at 160 and 30 °C for 20 minutes. The retained viscosity is the mean viscosity in cP, measured between 15 and 20 minutes.

Tabell III viser viskositetsresultatene som oppnås etter 7 dagers lagring av produktene A, B, C,EogFved4°C. Table III shows the viscosity results obtained after 7 days of storage of products A, B, C, E and F at 4°C.

Resultatene viser klart at de forgrenede polymerer av glukose fremstilt ifølge oppfinnelsen viser fremragende stabil viskositet selv etter lagring ved 4 °C. Denne lave viskositet kan derfor med fordel utnyttes for næringspreparater som nødvendiggjør at stivelsesbe-standdelene som inneholder dem har lav viskositet (som for eksempel flytende ferdig-preparater) og som må lagres i lang tid ved lave temperaturer. The results clearly show that the branched polymers of glucose prepared according to the invention show excellent stable viscosity even after storage at 4 °C. This low viscosity can therefore be advantageously utilized for nutritional preparations which require that the starch components that contain them have a low viscosity (such as liquid ready-made preparations) and which must be stored for a long time at low temperatures.

EKSEMPEL 4 EXAMPLE 4

Oppløselig, forgrenede polymerer av glukose fremstilles ved å bringe et glykogenfor-greningsenzym, isolert fra E. coli, til å virke på forskjellige oppløsninger av stivelser og stivelsesderivater i 21 timers reaksjon ved 30 °C og i henhold til de andre betingelser som er beskrevet i eksempel 1. Soluble, branched polymers of glucose are prepared by bringing a glycogen debranching enzyme, isolated from E. coli, to act on different solutions of starches and starch derivatives in a 21-hour reaction at 30 °C and according to the other conditions described in example 1.

I det foreliggende tilfelle er disse suspensjoner av standardmaisstivelse (G), voksmaisstivelse (I), amylose-rik stivelse, markedsført av søkerne under varemerket EURYLON® 7 (K) og et maltodekstrin som markedsføres av søkerne under varemerket In the present case, these are suspensions of standard maize starch (G), waxy maize starch (I), amylose-rich starch, marketed by the applicants under the trade mark EURYLON® 7 (K) and a maltodextrin marketed by the applicants under the trade mark

GLUCIDEX® 2 (M). GLUCIDEX® 2 (M).

Tabell IV viser de resultater som oppnås uttrykt ved innholdet av a-1,6 glukosidisk bin-ding, verdien av den midlere Mw for molekylvektsfordelingsprofilen, innholdet av reduserende sukker og retro-graderingsoppførselen etter 10 fryse-/tinesykler. Table IV shows the results obtained in terms of the α-1,6 glucosidic bond content, the value of the mean Mw for the molecular weight distribution profile, the reducing sugar content and the retrogradation behavior after 10 freeze/thaw cycles.

De oppløselige, forgrenede polymerer av glukose fremstilt ifølge oppfinnelsen viser således fremragende fryse-/tineytelse og en justert molekylvektsfordeling over et fint intervall av verdier som ligger mellom 1,4 og 5,8 x IO<5>dalton, mens utgangssubstratene på den annen side viser en sterk tendens til retrogradering og molekylvektsfordelings-profiler i området IO<3>til IO8 dalton. The soluble, branched polymers of glucose prepared according to the invention thus show excellent freeze/thaw performance and an adjusted molecular weight distribution over a fine range of values lying between 1.4 and 5.8 x 10<5>daltons, while the starting substrates, on the other hand shows a strong tendency to retrogradation and molecular weight distribution profiles in the range 10<3> to 108 daltons.

Claims

1. Process for the preparation of branched polymers of glucose containing essentially no (3-glucosidic linkages, i.e. containing less than 5% p-branching) from an aqueous solution of starch or starch derivative with a dry matter of at least 1 % by weight and preferably 2 to 50% by weight, characterized in that: - such a suspension of starch or starch derivative is subjected to a temperature higher than 130 °C and preferably between 140 and 150 °C under a pressure of more than 3.5 bar, which is preferably between 4 and 5 bar, for at least 2 minutes and preferably for 2 to 5 minutes, - the starch or starch derivative water thus obtained is treated with 50 to 2,000 units of purified debranching enzyme, the debranching enzyme being extracted from organisms and/or from microorganisms selected from the group consisting of higher plants, yeast, bacteria and unicellular algae, and is preferably extracted from unicellular algae, at a temperature between 25 and 50 °C, for - stepwise at a temperature of 30 °C, for a duration from 10 minutes to 24 hours, and - the branched polymers of glucose thus obtained are collected.

2. Process for producing soluble branched polymers of glucose according to claim 1, in which the branching enzyme is selected from the group consisting of glycogen degradation enzymes of Escherichia Coli, and the branching enzymes of unicellular algal starch, for example those from the green algae Chlamydomonas reinhardtii.

3. Method for producing soluble branched polymers of glucose according to claim one of claims 1 or 2, in which the branching enzyme extracted from algae is obtained by isolation from a genetically modified organism capable of expressing the enzyme.