NO318875B1

NO318875B1 - The ultrasound contrast agent

Info

Publication number: NO318875B1
Application number: NO19983420A
Authority: NO
Inventors: Harald Dugstad; Jo Klaveness; Pal Rongved; Jorun Undheim Braenden; Roald Skurtveit
Original assignee: Amersham Health As
Priority date: 1996-02-19
Filing date: 1998-07-24
Publication date: 2005-05-18
Also published as: GB9603466D0; NO983420L; ZA971408B; NO983420D0

Description

Ultralvdkontrastmiddel Ultrasound contrast agent

Denne oppfinnelsen omhandler nye gassholdige kontrastmidler til bruk i diagnostisk avbildning, mer spesifikt om kontrastmidler som inneholder fosfolipidstabiliserte gass-mikrobobler, og om en ny metode for fremstilling av gassholdige kontrastmidler. This invention relates to new gaseous contrast agents for use in diagnostic imaging, more specifically to contrast agents containing phospholipid-stabilized gas microbubbles, and to a new method for producing gaseous contrast agents.

Det er velkjent at ultralydavbildning er et potensielt verdifullt diagnostisk verktøy, for eksempel ved studier av karsystemet, spesielt i kardiografi, og av mikrovaskulaturen i vevet. Det er foreslått en rekke kontrastmidler for å forbedre de akustiske bildene man får på denne måten, deriblant suspensjoner av faste partikler, emulgerte små væskedråper, gassbobler og innkapslet gass eller væske. Det er anerkjent at kontrastmidler av lav tetthet som er lett å komprimere er spesielt effektive for akustisk tilbakespredning, og det har derfor blitt vist betydelig interesse for fremstilling av gassholdige og gassdannende systemer. It is well known that ultrasound imaging is a potentially valuable diagnostic tool, for example in studies of the vascular system, especially in cardiography, and of the microvasculature in the tissue. A number of contrast agents have been proposed to improve the acoustic images obtained in this way, including suspensions of solid particles, emulsified small liquid droplets, gas bubbles and encapsulated gas or liquid. It is recognized that low-density, easily compressible contrast agents are particularly effective for acoustic backscatter, and considerable interest has therefore been shown in the production of gas-containing and gas-forming systems.

Gassholdige kontrastmidler er også anerkjent effektive ved magnetisk resonans(MR)avbildning, f.eks. som susceptibilitetskontrastmidler for å redusere intensiteten av MR-signalet. Oksygenholdige kontrastmidler kan også bli nyttige paramagnetiske MR-kontrastmidler. Gaseous contrast agents are also recognized as effective in magnetic resonance (MR) imaging, e.g. as susceptibility contrast agents to reduce the intensity of the MR signal. Oxygenated contrast agents can also become useful paramagnetic MR contrast agents.

Det er dessuten observert at slike gasser som karbondioksyd kan brukes som negative orale kontrastmidler eller intravaskulære kontrastmidler ved røntgenavbildning. It has also been observed that such gases as carbon dioxide can be used as negative oral contrast agents or intravascular contrast agents in X-ray imaging.

Bruk av radioaktive gasser, f.eks. radioaktive isotoper av edelgasser som xenon, har også blitt foreslått i scintigrafi, for eksempel for blood-pool-avbildning. Use of radioactive gases, e.g. radioactive isotopes of noble gases such as xenon have also been proposed in scintigraphy, for example for blood-pool imaging.

Innledende undersøkelser som dreide seg om frie gassbobler dannet in vivo ved innsprøytning i hjertet av fysiologisk aksepterbare substanser har demonstrert den potensielle effektiviteten av slike bobler som kontrastmidler ved ekkografi. Slike teknikker begrenses imidlertid sterkt i praksis av den korte levetiden av de frie boblene. Derfor har man vist interesse for metoder for å stabilisere gassbobler til Initial investigations involving free gas bubbles formed in vivo by injection into the heart of physiologically acceptable substances have demonstrated the potential effectiveness of such bubbles as contrast agents in echography. However, such techniques are severely limited in practice by the short lifetime of the free bubbles. Therefore, interest has been shown in methods to stabilize gas bubbles

ekkokardiografi og andre ultralydstudier, for eksempel med emulgeringsmidler, oljer, fortykningsmidler eller karbohydrater, eller ved å medføre eller innkapsle gassen eller en forløper for denne i forskjellige systemer, f.eks. porøse gassholdige mikroparukler eller innkapslede gassfylte mikrobobler. echocardiography and other ultrasound studies, for example with emulsifiers, oils, thickeners or carbohydrates, or by entraining or encapsulating the gas or a precursor thereof in various systems, e.g. porous gaseous microwigs or encapsulated gas-filled microbubbles.

2 2

Det foreligger en del viten om bruk av fosfolipider som komponenter i gassholdige ultralydkontrastmidler. For eksempel presenteres bruken av ultralydkontrastmidler av fosfolipidliposomer hvor et dobbeltlag av lipider omgir en innesluttet sammensetning som inneholder en gass eller gassforløper i US-A-4900540. Det innkapslede materialet er typisk en gassforløper som vandig natriumbikarbonat, som sies å generere karbondioksyd etter innføring i individet når den utsettes for kroppens pH. Kjernen av de resulterende liposomene vil derfor ha en tendens til å inneholde væske med ytterst små mikrobobler av gass som på grunn av størrelsen bare viser en begrenset ekkogenisitet. There is some knowledge about the use of phospholipids as components in gaseous ultrasound contrast agents. For example, the use of ultrasound contrast agents by phospholipid liposomes where a bilayer of lipids surrounds an entrapped composition containing a gas or gas precursor is presented in US-A-4900540. The encapsulated material is typically a gas precursor such as aqueous sodium bicarbonate, which is said to generate carbon dioxide after introduction into the subject when exposed to the body's pH. The core of the resulting liposomes will therefore tend to contain liquid with extremely small microbubbles of gas which, due to their size, only show a limited echogenicity.

WO-A-9115244 presenterer ultralydkontrastmidler med mikrobobler av luft eller en annen gass som dannes i en suspensjon av væskefylte liposomer, hvor liposomene tilsynelatende stabiliserer mikroboblene. Slike systemer skiller seg fra de som er beskrevet i ovennevnte US-A-4900540 hvor luften eller den andre gassen befinner seg inne i liposomene. WO-A-9115244 presents ultrasound contrast agents with microbubbles of air or another gas formed in a suspension of liquid-filled liposomes, the liposomes apparently stabilizing the microbubbles. Such systems differ from those described in the above-mentioned US-A-4900540 where the air or the other gas is located inside the liposomes.

WO-A-9211873 beskriver vandige preparater som er laget for å absorbere og stabilisere mikrobobler og dermed virke som ultralydkontrastmidler. Sammensetningene inneholder polyoksyetylen-/polyoksypropylenpolymerer og negativt ladde fosfolipider. Vektforholdet mellom polymer og fosfolipid er vanligvis omtrent 3:1. WO-A-9211873 describes aqueous preparations which are designed to absorb and stabilize microbubbles and thus act as ultrasound contrast agents. The compositions contain polyoxyethylene/polyoxypropylene polymers and negatively charged phospholipids. The weight ratio of polymer to phospholipid is usually about 3:1.

Ultralydkontrastmidler som inneholder gassfylte liposomer, d.v.s. liposomer som stort sett ikke inneholder væske, og fremstilling av slike liposomer ved hjelp av gassinnpoding med vakuumtørking er beskrevet i WO-A-9222247. Fremstilling av slike gassfylte liposomer ved hjelp av gassinnpoding med risting i gelstadium beskrives i WO-A-9428780. En rapport om gassfylte dobbelte lipidlag sammensatt av dipalrnitoylfosfatidylcholin som ultralydkontrastmidler presenteres av Unger et al. i Investigative Radiology 29, Supplement 2, S134-S136 (1994). Ultrasound contrast agents containing gas-filled liposomes, i.e. liposomes which largely do not contain liquid, and the production of such liposomes by means of gas inoculation with vacuum drying is described in WO-A-9222247. Production of such gas-filled liposomes by means of gas inoculation with shaking in the gel stage is described in WO-A-9428780. A report on gas-filled lipid bilayers composed of dipalrnitoylphosphatidylcholine as ultrasound contrast agents is presented by Unger et al. in Investigative Radiology 29, Supplement 2, S134-S136 (1994).

WO-A-9409829 presenterer injiserbare suspensjoner av gassmikrobobler i en vandig bærervæske som inneholder minst en fosfolipidstabilisator, hvor konsentrasjonen av fosfolipider i bæreren er mindre enn 0,01 vektprosent, men større enn eller lik den mengden hvor fosfolipidmolekylene er til stede bare ved overgangen mellom gassboblene og væsken. Mengden av fosfolipid trenger derfor ikke å være større enn det som er nødvendig for å danne et enkelt surfaktantlag rundt 3 WO-A-9409829 presents injectable suspensions of gas microbubbles in an aqueous carrier liquid containing at least one phospholipid stabilizer, where the concentration of phospholipids in the carrier is less than 0.01% by weight, but greater than or equal to the amount where the phospholipid molecules are present only at the transition between the gas bubbles and the liquid. The amount of phospholipid therefore need not be greater than what is necessary to form a single surfactant layer around 3

gassmikroboblene, da den resulterende filmliknende strukturen hindrer at boblene kollapser eller koalescerer. Det hevdes at man ikke får mikrobobler med et liposomliknende dobbelt surfaktantlag med så lave fosfolipidkonsentrasjoner. the gas microbubbles, as the resulting film-like structure prevents the bubbles from collapsing or coalescing. It is claimed that microbubbles with a liposome-like double surfactant layer cannot be obtained with such low phospholipid concentrations.

Det foreligger en del mer viten om valg av gasser for gassmikrobobleholdige ultralydkontrastmidler for å forbedre slike egenskaper som stabiliteten og varigheten av ekkogenisiteten. F.eks. foreslår WO-A-9305819 å bruke frie mikrobobler av gasser som har en koeffisient Q større enn 5 hvor There is a lot more knowledge about the choice of gases for gas microbubble-containing ultrasound contrast agents to improve such properties as the stability and duration of echogenicity. E.g. WO-A-9305819 suggests using free microbubbles of gases having a coefficient Q greater than 5 where

(hvor A er gassens tetthet i kg/m<3>, Cs er gassens vannløselighet i mol/l og D er diffusiviteten til gassen i løsning i cm<3>/sek). Det presenteres en omfattende liste av gasser som sies å fylle dette kravet. (where A is the density of the gas in kg/m<3>, Cs is the water solubility of the gas in mol/l and D is the diffusivity of the gas in solution in cm<3>/sec). An extensive list of gases that are said to fulfill this requirement is presented.

EP-A-0554213 foreslår at man kan gjøre gassfylte mikrovesikler motstandsdyktige mot kollaps under trykk ved å føre inn i dem minst en gass med en vannløselighet, uttrykt i liter gass/liter vann under standardbetingelser, dividert med kvadratroten av molekylvekten, som ikke overstiger 0,003. Foretrukne gasser sies å innbefatte svovelheksafluorid, selenheksafluorid og forskjellige Freon®-gasser. Slike gasser kan bl.a. brukes i fosfolipidholdige sammensetninger av den typen som beskrives i den ovennevnte WO-A-9215244. EP-A-0554213 suggests that gas-filled microvesicles can be made resistant to collapse under pressure by introducing into them at least one gas with a water solubility, expressed in liters of gas/liter of water under standard conditions, divided by the square root of the molecular weight, not exceeding 0.003 . Preferred gases are said to include sulfur hexafluoride, selenium hexafluoride and various Freon® gases. Such gases can i.a. are used in phospholipid-containing compositions of the type described in the above-mentioned WO-A-9215244.

Schneider et al. beskriver i Investigative Radiology 30( 8), s. 451-457 (1995) et nytt ultrasonografisk kontrastmiddel basert på mikrobobler som er fylt med svovelheksafluorid og tilsynelatende stabiliseres av en kombinasjon av polyetylenglykol 4000 og en blanding av fosfolipidene distearoylfosfatidylcholin og dipalmitoylfosfatidylglyserol. Bruken av svovelheksafluorid i stedet for luft sies å gi en forbedret motstand mot slike trykkøkninger som opptrer i den venstre hjertehalvdelen under systolen. Schneider et al. describes in Investigative Radiology 30(8), pp. 451-457 (1995) a new ultrasonographic contrast agent based on microbubbles which are filled with sulfur hexafluoride and apparently stabilized by a combination of polyethylene glycol 4000 and a mixture of the phospholipids distearoylphosphatidylcholine and dipalmitoylphosphatidylglycerol. The use of sulfur hexafluoride instead of air is said to provide an improved resistance to such pressure increases which occur in the left half of the heart during systole.

WO-A-9503835 foreslår bruk av mikrobobler som inneholder en gassblanding av en sammensetning som baseres på betraktninger om partielle gasstrykk både innenfor og utenfor mikroboblene, for å ta hensyn til osmotiske virkninger på størrelsen av mikroboblene. Representative blandinger innbefatter en gass med lavt damptrykk og begrenset løselighet i blod eller serum (f.eks. et fluorkarbon) i kombinasjon med en annen gass som raskere byttes ut med gasser i 4 WO-A-9503835 proposes the use of microbubbles containing a gas mixture of a composition which is based on considerations of gas partial pressures both inside and outside the microbubbles, to account for osmotic effects on the size of the microbubbles. Representative mixtures include a gas with a low vapor pressure and limited solubility in blood or serum (eg, a fluorocarbon) in combination with another gas that is more rapidly exchanged with gases in 4

normalt blod eller serum (f.eks. nitrogen, oksygen, karbondioksyd eller blandinger av disse). normal blood or serum (eg nitrogen, oxygen, carbon dioxide or mixtures thereof).

WO-A-9516467 foreslår bruk av ultralydkontrastmidler som inneholder en blanding av gass A og B, hvor gass B er til stede i en mengde på 0,5-41 volumprosent, har en molekylvekt større enn 80 dalton og vannløselighet under 0,0283 ml/ml vann under standardbetingelser, mens resten av blandingen er gass A. Representative A-gasser er bl.a. luft, oksygen, nitrogen, karbondioksyd og blandinger av disse. Representative B-gasser innbefatter fiuorholdige gasser som svovelheksafluorid og forskjellige perfluorerte hydrokarboner. Foretrukne stabilisatorer for slike kontrastmidler er bl.a. fosfolipider. WO-A-9516467 suggests the use of ultrasound contrast agents containing a mixture of gas A and B, where gas B is present in an amount of 0.5-41% by volume, has a molecular weight greater than 80 daltons and water solubility below 0.0283 ml /ml of water under standard conditions, while the rest of the mixture is gas A. Representative A gases are i.a. air, oxygen, nitrogen, carbon dioxide and mixtures of these. Representative B gases include fluorine-containing gases such as sulfur hexafluoride and various perfluorinated hydrocarbons. Preferred stabilizers for such contrast agents are i.a. phospholipids.

Fosfolipider som sies å være nyttige i dagens kontrastmidler kan være lecitiner (d.v.s. fosfatidylcholiner), for eksempel naturlig lecitin slik som eggeplommelecitin eller soyabønnelecitin og syntetiske eller halvsyntetiske lecitiner som dimyristoylfosfatidylcholin, dipalmitoylfosfatidylcholin eller distearoylfosfatidylcholin; fosfatidinsyrer; fosfatidyletanolaminer; fosfatidylseriner;fosfatidylglyseroler; fosfatidylinositoler; kardiolipiner; sfingomyeliner; blandinger av hvilke som helst av de foregående og blandinger med andre lipider som f.eks. kolesterol. Lecitinderivater synes generelt å være de mest vanlig brukte fosfolipidene, muligens på grunn av at de er lett tilgjengelige fra naturlige kilder. Bruken av tilsetningsstoffer som kolesterol i menger på opptil 50 vektprosent presenteres i WO-A-9115244 og WO-A-9409829, mens det foreslås i WO-A-9222247 å inkorporere i det minste en liten mengde (f.eks. ca. 1 molprosent) negativt ladd lipid (f.eks. fosfatidylserin eller en fettsyre) for å forbedre stabiliteten. En foretrukket fosfolipidsammensetning ifølge WO-A-9428780 er dipalmitoylfosfatidylcholin, dipalmitoylfosfatidyletanolamin substituert med polyetylenglykol 5000 og dipalmitoylfosfatidinsyre med molforhold på omtrent 87:8:5. Typiske blandede fosfolipidsammensetninger ifølge WO-A-9409829 og WO-A-9516467 er diarakidoylfosfatidylcholin og dipalmitoylfosfatidinsyre med vektforhold på omtrent 100:4, selv om den siste referansen også gir eksempel på bruk av like vektmengder av distearoylfosfatidylcholin og dipalmitoylfosfatidylglyserol. Phospholipids said to be useful in today's contrast agents may be lecithins (i.e. phosphatidylcholines), for example natural lecithin such as egg yolk lecithin or soybean lecithin and synthetic or semi-synthetic lecithins such as dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine or distearoylphosphatidylcholine; phosphatidic acids; phosphatidylethanolamines; phosphatidylserines; phosphatidylglycerols; phosphatidylinositols; cardiolipins; sphingomyelins; mixtures of any of the foregoing and mixtures with other lipids such as cholesterol. Lecithin derivatives generally appear to be the most commonly used phospholipids, possibly because they are readily available from natural sources. The use of additives such as cholesterol in amounts of up to 50% by weight is presented in WO-A-9115244 and WO-A-9409829, while it is suggested in WO-A-9222247 to incorporate at least a small amount (e.g. about 1 mole percent) negatively charged lipid (eg, phosphatidylserine or a fatty acid) to improve stability. A preferred phospholipid composition according to WO-A-9428780 is dipalmitoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine substituted with polyethylene glycol 5000 and dipalmitoylphosphatidic acid with a molar ratio of about 87:8:5. Typical mixed phospholipid compositions according to WO-A-9409829 and WO-A-9516467 are diarachidoylphosphatidylcholine and dipalmitoylphosphatidic acid with a weight ratio of approximately 100:4, although the latter reference also exemplifies the use of equal weight amounts of distearoylphosphatidylcholine and dipalmitoylphosphatidylglycerol.

Det vil være åpenbart utfra det foregående at i de eksisterende fosfolipidholdige mikroboblesuspensjonene som er foreslått for bruk som 5 It will be obvious from the foregoing that in the existing phospholipid-containing microbubble suspensions proposed for use as 5

kontrastmidler, er minst 50 % av fosfolipidinnholdet nøytrale fosfolipider som f.eks. lecitiner. Vanligvis er det bare en liten andel, f.eks. ca. 5 %, av ladde fosfolipider. contrast media, at least 50% of the phospholipid content is neutral phospholipids such as lecithins. Usually it is only a small proportion, e.g. about. 5%, of charged phospholipids.

Den foreliggende oppfinnelsen baserer seg på oppdagelsen av at det kan medføre verdifulle og uventede fordeler ved slike parametre som produktstabilitet og akustiske egenskaper hvis overveiende ladde fosfolipider stort sett er den eneste amflfile komponenten av de mikrobobleholdige kontrastmidlene. Selv om vi ikke ønsker å være bundet av teoretiske betraktninger kan det antas at elektrostatisk frastøtning mellom ladde fosfolipidmembraner stimulerer til dannelsen av stabile og stabiliserende enkeltlag ved overgangsflatene mellom mikroboblene og bærervæsken. Fleksibiliteten og deformerbarheten av slike tynne membraner vil forbedre ekkogenisiteten til produktene ifølge denne oppfinnelsen sammenliknet med gassfylte liposomer med et eller flere doble lipidlag. The present invention is based on the discovery that there may be valuable and unexpected advantages in such parameters as product stability and acoustic properties if predominantly charged phospholipids are largely the only amphiphilic component of the microbubble-containing contrast agents. Although we do not wish to be bound by theoretical considerations, it can be assumed that electrostatic repulsion between charged phospholipid membranes stimulates the formation of stable and stabilizing monolayers at the transition surfaces between the microbubbles and the carrier liquid. The flexibility and deformability of such thin membranes will improve the echogenicity of the products of this invention compared to gas-filled liposomes with one or more lipid bilayers.

Vi har også funnet at bruken av ladde fosfolipider kan gjøre det mulig å lage mikroboblekomtrastmidler med fordelaktige egenskaper når det gjelder f.eks. stabilitet, dispersibilitet og motstand mot koalescens uten å ty til tilsetninger som f.eks. andre surfaktanter og/eller viskositetsforhøyende midler, slik at antall komponenter som føres inn i kroppen til et individ ved injeksjon holdes på et minimum. For eksempel kan de ladde overflatene av mikroboblene minimalisere eller forhindre sammenklumping på grunn av den elektrostatiske frastøtningen. We have also found that the use of charged phospholipids can make it possible to create microbubble surfactants with advantageous properties when it comes to e.g. stability, dispersibility and resistance to coalescence without resorting to additives such as e.g. other surfactants and/or viscosity-increasing agents, so that the number of components introduced into the body of an individual by injection is kept to a minimum. For example, the charged surfaces of the microbubbles can minimize or prevent clumping due to the electrostatic repulsion.

Altså presenteres det ifølge en implementering av den foreliggende oppfinnelsen et kontrastmiddel for bruk i diagnostiske studier som innbefatter en suspensjon i en injiserbar vandig bærervæske av gassmikrobobler stabilisert av et fosfolipidholdig amfifilt materiale som erkarakterisert vedat det nevnte amfifile materialet i det vesentlige består av fosfolipid og overveiende av molekyler som individuelt har en nettoladning. Thus, according to an implementation of the present invention, a contrast medium for use in diagnostic studies is presented which includes a suspension in an injectable aqueous carrier liquid of gas microbubbles stabilized by a phospholipid-containing amphiphilic material which is characterized in that said amphiphilic material essentially consists of phospholipid and predominantly of molecules that individually have a net charge.

Det er ønskelig at minst 75 %, fortrinnsvis så godt som alt fosfolipidmaterialet i kontrastmidlene ifølge oppfinnelsen består av molekyler med nettoladning under de forhold som er til stede under fremstillingen og/eller bruken av dem. Denne ladningen kan enten være positiv eller fortrinnsvis negativ. Representative positivt ladde fosfolipider er estere av slike fosfatidinsyrer som dipalmitoylfosfatidinsyre eller distearoylfosfatidinsyre med aminoalkoholer som hydroksyetylendiamin. Eksempler på negativt ladde fosfolipider er naturlige (f.eks. It is desirable that at least 75%, preferably as much as all of the phospholipid material in the contrast agents according to the invention consists of molecules with a net charge under the conditions present during their manufacture and/or use. This charge can either be positive or preferably negative. Representative positively charged phospholipids are esters of such phosphatidic acids as dipalmitoylphosphatidic acid or distearoylphosphatidic acid with amino alcohols such as hydroxyethylenediamine. Examples of negatively charged phospholipids are natural (e.g.

6 6

fra soyabønner eller eggeplomme), halvsyntetiske (f.eks. partielt eller fullstendig from soybeans or egg yolk), semi-synthetic (e.g. partially or fully

hydrogenert) og syntetiske fosfatidylseriner, fosfatidylglyseroler, fosfatidylinositoler, fosfatidinsyrer og kardiolipiner. Fettsyreacylgruppene til slike fosfolipider vil typisk hver inneholde 14-22 karbonatomer, f.eks. slik som i palmitoyl- og stearoylgruppene. Lyso-former av slike ladde fosfolipider er også nyttige ifølge oppfinnelsen, betegnelsen "lyso" betegner fosfolipider som bare inneholder en fettsyreacylgruppe, som fortrinnsvis er esterbundet til 1-karbonet til glyserylgruppen. Slike lyso-former av ladde fosfolipider kan med fordel brukes i blanding med ladde fosfolipider som inneholder to fettsyreacylgrupper. hydrogenated) and synthetic phosphatidylserines, phosphatidylglycerols, phosphatidylinositols, phosphatidic acids and cardiolipins. The fatty acid acyl groups of such phospholipids will typically each contain 14-22 carbon atoms, e.g. such as in the palmitoyl and stearoyl groups. Lyso forms of such charged phospholipids are also useful according to the invention, the term "lyso" denotes phospholipids containing only one fatty acyl group, which is preferably ester-linked to the 1-carbon of the glyceryl group. Such lyso-forms of charged phospholipids can advantageously be used in admixture with charged phospholipids that contain two fatty acid acyl groups.

Fosfatidylseriner er spesielt foretrukne fosfolipider som kan brukes i kontrastmidler ifølge oppfinnelsen og utgjør fortrinnsvis en vesentlig andel, f.eks. minst 80 % av det opprinnelige fosfolipidinnholdet, for eksempel 85-92 %, selv om dette senere kan reduseres noe, f.eks. til ca. 70 %, ved etterbehandling, som for eksempel varmesteirlisering. Det vil være klart at slik behandling kan føre til dannelsen av nedbrytningsprodukter som ikke er fosfolipider, f.eks. frie fettsyrer, f.eks. i mengder opptil 10 %, henvisninger i dette dokumentet til amfifilt materiale som overveiende består av fosfolipid skal forstås slik at det dreier seg om fosfolipid med et innhold av slike frie fettsyrer. Selv om vi ikke ønsker å være bundet av teoretiske betraktninger, kan det være at ionebroer mellom karboksyl- og aminogruppene til seringrupper i nabostilling bidrar til stabiliteten av de fosfau^ylserinholdige systemene, som for eksempel den gode trykkstabiliteten tyder på. Foretrukne fosfatidylseriner er bl.a. mettet (f.eks. hydrogenert eller syntetisk) naturlig fosfatidylserin og syntetiske eller halvsyntetiske dialkanoylfosfatidylseriner slik som distearoylfosfatidylserin, dipalmitoylfosfatidylserin og diarakidoylfosfatidylserin. Phosphatidylserines are particularly preferred phospholipids which can be used in contrast agents according to the invention and preferably constitute a significant proportion, e.g. at least 80% of the original phospholipid content, for example 85-92%, although this may later be somewhat reduced, e.g. to approx. 70%, by post-treatment, such as heat sterilization. It will be clear that such treatment can lead to the formation of degradation products which are not phospholipids, e.g. free fatty acids, e.g. in amounts up to 10%, references in this document to amphiphilic material consisting predominantly of phospholipid are to be understood as referring to phospholipid with a content of such free fatty acids. Although we do not wish to be bound by theoretical considerations, it may be that ion bridges between the carboxyl and amino groups of neighboring serine groups contribute to the stability of the phosphoylserine-containing systems, as for example the good pressure stability indicates. Preferred phosphatidylserines are i.a. saturated (eg hydrogenated or synthetic) natural phosphatidylserine and synthetic or semi-synthetic dialkanoylphosphatidylserines such as distearoylphosphatidylserine, dipalmitoylphosphatidylserine and diarachidoylphosphatidylserine.

En viktig fordel med bruken av slike fosfatidylserinbaserte kontrastmidler er at kroppen gjenkjenner gamle røde blodlegemer og blodplater på en høy konsentrasjon av fosfatidylserin på overflaten og kan dermed eliminere slike kontrastmidler fra blodstrømmen på en måte som likner måten de røde blodlegemene elimineres på. Dessuten, siden overflaten til slike kontrastmidler kan registreres som endogen av kroppen er det mulig å unngå at de induserer negative systemiske bivirkninger som f.eks. hemodynamiske effekter og andre anafylaktiske reaksjoner 7 An important advantage of the use of such phosphatidylserine-based contrast agents is that the body recognizes old red blood cells and platelets with a high concentration of phosphatidylserine on the surface and can thus eliminate such contrast agents from the blood stream in a manner similar to the way the red blood cells are eliminated. Moreover, since the surface of such contrast agents can be registered as endogenous by the body, it is possible to avoid that they induce negative systemic side effects such as e.g. hemodynamic effects and other anaphylactic reactions 7

som noen liposompreparater kan føre med seg når de innføres i kroppen (se f.eks. WO-A-9512386). Til støtte for dette er det ikke observert akutte giftvirkninger som f.eks. endringer i blodtrykket eller hjertefrekvensen ved dyreforsøk på hunder som har fått sprøytet inn intravenøs bolus av kontrastmiddel ifølge oppfinnelsen på opptil ti ganger en normal avbildningsdose. which some liposome preparations can carry with them when introduced into the body (see e.g. WO-A-9512386). In support of this, no acute toxic effects have been observed, such as e.g. changes in blood pressure or heart rate in animal experiments on dogs that have been injected with an intravenous bolus of contrast agent according to the invention of up to ten times a normal imaging dose.

En hvilken som helst biokompatibel gass kan brukes i oppfinnelsens kontrastmidler, når man tar i betraktning at betegnelsen "gass" her inkluderer alle substanser (deriblant blandinger) som er vesentlig eller fullstendig i gass- og/eller damp form ved normal kroppstemperatur for menneske på 37 °C. Gassen kan dermed for eksempel være luft, nitrogen, oksygen, karbondioksyd, hydrogen, lystgass, en edelgass som helium, argon, xenon eller krypton, et svovelfiuorid som svovelheksafluorid, disvoveldekafluorid eller trifluormetylsvovelpentafluorid, selenheksafluorid, et eventuelt halogenen silan som for eksempel tetrametylsilan, et lett hydrokarbon (som f.eks. inneholder opptil 7 karbonatomer), for eksempel et alkan som metan, etan, propan, et butan eller et pen tan, et cykloalkan som cyklobutan eller cyklopentan, et alken som propen eller et buten eller et alkyn som acetylen, en eter, et keton, en ester, et halogenert lett hydrokarbon (f.eks. på opptil 7 karboner), eller en blanding av hvilke som helst av de ovennevnte. Det er en fordel om i det minste noen av halogenatomene i de halogenerte gassene er fluoratomer. Dermed kan man velge biokompatible halogenerte hydrokarbongasser for eksempel blant bromklordifluormetan, klordifluormetan, diklordifluormetan, bromtrifluormetan, klortrifluormetan, klorpentafluoretan, diklortetrafluoretan og perfluorkarboner, f.eks. slike perfluoralkaner som perfluormetan, perfluoretan, perfiuorpropan, perfluorbutaner (f.eks. perfluor-n-butan, eventuelt i blanding med andre isomerer som f.eks. perfluorisobutan), perfluorpentaner, perfluorheksaner og perfluorheptaner; perfluoralkener som perfluorpropen, perfluorbutener (f.eks. perfluorbut-2-en) og perfluorbutadien; perfluoralkyner som perfluorbut-2-yn; og perfluorcykloalkaner som perfluorcyklobutan, perfluormetylcyklobutan, perfluordimetylcyklobutaner, perfluortrimetylcyklobutaner, perfluorcyklopentan, perfluormetylcyklopentan, perfluordimetylcyklopentaner, perfluorcykloheksan, perfluormetylcykloheksan og perfiuorcykloheptan. Andre halogenerte gasser er bl.a. fluorerte, f.eks. perfluorerte 8 Any biocompatible gas can be used in the contrast agents of the invention, when it is taken into account that the term "gas" here includes all substances (including mixtures) which are substantially or completely in gas and/or vapor form at normal human body temperature of 37 °C. The gas can thus be, for example, air, nitrogen, oxygen, carbon dioxide, hydrogen, nitrous oxide, a noble gas such as helium, argon, xenon or krypton, a sulfur fluoride such as sulfur hexafluoride, disulfur decafluoride or trifluoromethylsulfur pentafluoride, selenium hexafluoride, an optional halogen silane such as tetramethylsilane, a light hydrocarbon (eg containing up to 7 carbon atoms), for example an alkane such as methane, ethane, propane, a butane or a pentane, a cycloalkane such as cyclobutane or cyclopentane, an alkene such as propene or a butene or an alkyne such as acetylene, an ether, a ketone, an ester, a halogenated light hydrocarbon (eg of up to 7 carbons), or a mixture of any of the above. It is an advantage if at least some of the halogen atoms in the halogenated gases are fluorine atoms. Thus, one can choose biocompatible halogenated hydrocarbon gases for example from among bromochlorodifluoromethane, chlorodifluoromethane, dichlorodifluoromethane, bromotrifluoromethane, chlorotrifluoromethane, chloropentafluoroethane, dichlorotetrafluoroethane and perfluorocarbons, e.g. such perfluoroalkanes as perfluoromethane, perfluoroethane, perfluoropropane, perfluorobutanes (e.g. perfluoro-n-butane, possibly in a mixture with other isomers such as e.g. perfluoroisobutane), perfluoropentanes, perfluorohexanes and perfluoroheptanes; perfluoroalkenes such as perfluoropropene, perfluorobutenes (eg perfluorobut-2-ene) and perfluorobutadiene; perfluoroalkynes such as perfluorobut-2-yne; and perfluorocycloalkanes such as perfluorocyclobutane, perfluoromethylcyclobutane, perfluorodimethylcyclobutanes, perfluorotrimethylcyclobutanes, perfluorocyclopentane, perfluoromethylcyclopentane, perfluorodimethylcyclopentanes, perfluorocyclohexane, perfluoromethylcyclohexane and perfluorocycloheptane. Other halogenated gases are i.a. fluorinated, e.g. perfluorinated 8

ketoner som perfluoraceton og fluorerte, f.eks. perfluorerte etere som perfluordietyleter. ketones such as perfluoroacetone and fluorinated, e.g. perfluorinated ethers such as perfluorodiethyl ether.

I oppfinnelsens kontrastmidler kan det være fordelaktig å bruke fluorerte gasser som svovelfluorider eller fluorkarboner (f.eks. perfluorkarboner) som er kjent for å danne spesielt stabile mikroboblesuspensjoner (se for eksempel artikkelen av Schneider et al., som det er referert til ovenfor). Gassblandinger basert på betraktninger om partialtrykk både innenfor og utenfor mikroboblene og derav følgende osmotiske effekter på mikroboblestørrelsen, f.eks. som beskrevet i WO-A-9503835, kan brukes hvis det er ønskelig, for eksempel en blanding av en relativt blodløselig gass som nitrogen eller luft og en gass som er relativt uløselig i blod, f.eks. et perfluorkarbon. In the contrast agents of the invention, it may be advantageous to use fluorinated gases such as sulfur fluorides or fluorocarbons (e.g. perfluorocarbons) which are known to form particularly stable microbubble suspensions (see, for example, the article by Schneider et al., referred to above). Gas mixtures based on considerations of partial pressure both inside and outside the microbubbles and the resulting osmotic effects on the microbubble size, e.g. as described in WO-A-9503835, can be used if desired, for example a mixture of a relatively blood-soluble gas such as nitrogen or air and a gas which is relatively insoluble in blood, e.g. a perfluorocarbon.

Vi har imidlertid funnet at oppfinnelsens kontrastmidler, som for eksempel inneholder mikrobobler av et perfluoralkan som f.eks. perfluorbutan, stabilisert av fosfatidylserin, er overraskende stabile i størrelse etter å ha blitt tilført intravenøst til et individ, og viser ikke den tidligere beskrevne tendensen til mikrobobler av slike gasser til å vokse ukontrollerbart på grunn av at blodgasser som oksygen, nitrogen og karbondioksyd diffunderer inn i boblene. I stedet når de raskt en maksimumsstørrelse uten at det observeres noen ytterligere vekst. Det at man unngår en ubegrenset økning av boblediameteren, som kunne føre til uønsket og potensielt meget farlig blokkering av kapillærårer er en hovedfordel ved kontrastmidlene ifølge denne oppfinnelsen. However, we have found that the contrast agents of the invention, which for example contain microbubbles of a perfluoroalkane such as perfluorobutane, stabilized by phosphatidylserine, are surprisingly stable in size after being administered intravenously to a subject, and do not exhibit the previously described tendency of microbubbles of such gases to grow uncontrollably due to blood gases such as oxygen, nitrogen, and carbon dioxide diffusing into in the bubbles. Instead, they quickly reach a maximum size without any further growth being observed. The fact that one avoids an unlimited increase in the bubble diameter, which could lead to unwanted and potentially very dangerous blockage of capillary vessels, is a main advantage of the contrast agents according to this invention.

Kontrastmidler ifølge oppfinnelsen som inneholder perfluoralkaner som perfluorbutan har også blitt funnet å være overraskende stabile under trykk som likner det som typisk påtreffes in vivo, for eksempel viser de nesten fullstendig (f.eks. minst 90 %) gjenvinning av den normal størrelsesfordelingen og de ekkogene egenskapene etter å ha blitt utsatt for overtrykk (f.eks. av luft) på opptil 300 mmHg i 90 sekunder. Contrast agents of the invention containing perfluoroalkanes such as perfluorobutane have also been found to be surprisingly stable under pressures similar to those typically encountered in vivo, for example, exhibiting almost complete (e.g. at least 90%) recovery of the normal size distribution and the echogenic properties after exposure to overpressure (e.g. air) of up to 300 mmHg for 90 seconds.

Oppfinnelsens kontrastmidler kan brukes i en rekke diagnostiske avbildningsteknikker, deriblant scintigrafi, lysavbildning, ultralyd, MR- og røntgenavbildning (også med bløte røntgenstråler). Bruken av dem i diagnostisk ulti^ydavbildning og MR-avbildning, f.eks. som susceptibilitetskontrastmidler, utgjør foretrukne aspekter av denne oppfinnelsen. Det kan brukes en rekke avbildningsteknikker i ultralydapplikasjoner, for eksempel fundamental og 9 The contrast agents of the invention can be used in a number of diagnostic imaging techniques, including scintigraphy, light imaging, ultrasound, MR and X-ray imaging (also with soft X-rays). Their use in diagnostic ultrasound and MR imaging, e.g. as susceptibility contrast agents, constitute preferred aspects of this invention. A variety of imaging techniques can be used in ultrasound applications, such as fundamental and 9th

harmonisk B-mode-avbildning og fundamental og harmonisk doppleravbildning. Hvis man vil kan det brukes tredimensjonale avbildningsteknikker. Kontrastmidlet kan også brukes i ultralydavbildningsmetoder basert på korrelasjonsteknikker, for eksempel som beskrevet i US-A-5601085 og International Patent Application No. PCT/GB96/02413. harmonic B-mode imaging and fundamental and harmonic Doppler imaging. If desired, three-dimensional imaging techniques can be used. The contrast agent can also be used in ultrasound imaging methods based on correlation techniques, for example as described in US-A-5601085 and International Patent Application No. PCT/GB96/02413.

Ultralydtester in vivo på hunder har vist at kontrastmidlene ifølge oppfinnelsen kan fremkalle en økning i intensiteten av signalet som spres tilbake fra myokardium på 15-25 dB etter intravenøs innsprøytning av så lave doser som 1-20 ni mikrobobler/kg kroppsvekt. Signalene kan også observeres ved lavere doser når det brukes mer sensitive teknikker, som fargedoppler eller doppleravledede teknikker, f.eks. amplitydebasert doppler eller slike ikkelineære teknikker som beskrives av Tucker et al. i Lancet (1968) s. 1253, av Miller i Ultrasonics (1981) s. 217-224 og av Newhouse et al. i J. Acoust. Soc. Am. 75, s. 1473-1477 (1984). Ved slike lave doser er attenueringen i blodfylte rom som f.eks. hjertekamrene funnet å være så lav at det er mulig å visualisere interessante regioner i den myokardiale vaskulaturen. Tester har også vist at slike intravenøst innsprøytede kontrastmidler fordeles gjennom hele blodmassen og dermed forbedrer ekkogenisiteten av alle vaskulariserte vev, og de vil også bli resirkulert. De har også blitt funnet å være nyttige som generelle hjelpemidler for dopplersignalforbedring, og kan i tillegg være nyttig ved datamaskinkontroUert ultralydtomografi og ved fysiologisk gating eller intermittent avbildning. Ultrasound tests in vivo on dogs have shown that the contrast agents according to the invention can induce an increase in the intensity of the signal that is scattered back from the myocardium of 15-25 dB after intravenous injection of doses as low as 1-20 nine microbubbles/kg body weight. The signals can also be observed at lower doses when more sensitive techniques are used, such as color Doppler or Doppler-derived techniques, e.g. amplitude-based Doppler or such non-linear techniques as described by Tucker et al. in Lancet (1968) p. 1253, by Miller in Ultrasonics (1981) pp. 217-224 and by Newhouse et al. in J. Acoust. Soc. Am. 75, pp. 1473-1477 (1984). At such low doses, the attenuation in blood-filled rooms such as e.g. the heart chambers found to be so low that it is possible to visualize interesting regions of the myocardial vasculature. Tests have also shown that such intravenously injected contrast agents are distributed throughout the blood mass and thus improve the echogenicity of all vascularized tissues, and they will also be recycled. They have also been found to be useful as general aids for Doppler signal enhancement, and may additionally be useful in computer controlled ultrasound tomography and in physiological gating or intermittent imaging.

For ultralyd, f.eks. innen ekkokardiografi, kan det være nyttig å bruke mikrobobler med gjennomsnittlig størrelse på 0,1-10 :m, f.eks. 1-7 :m, for å muliggjøre fri passasje gjennom pulmonærsystemet og for å oppnå resonans med de foretrukne avbildningsrfekvensene på omtrent 0,1-15 MHz. Vi har funnet at kontrastmidler ifølge oppfinnelsen kan produseres med en svært smal størrelsesfordeling for mikrobobledispersjonen i det området som foretrekkes for ekkokardiografi, slik at ekkogenisiteten såvel som sikkerheten in vivo forbedres betraktelig, og kontrastmidlene blir spesielt fordelaktige ved slike bruksområder som blodtrykksmåling, blodstrømningsmåling og ultralydtomografi. For eksempel kan produkter hvor over 90 % (f.eks. minst 95 %, fortrinnsvis minst 98 %) av mikroboblene har diameter i området 1-7 nm og mindre enn 5 % (f.eks. ikke mer enn 10 3 %, fortrinnsvis ikke mer enn 2 %) av mikroboblene har diameter over 7 um fremstilles uten problemer. For ultrasound, e.g. in echocardiography, it may be useful to use microbubbles with an average size of 0.1-10 :m, e.g. 1-7 :m, to allow free passage through the pulmonary system and to achieve resonance with the preferred imaging RF frequencies of approximately 0.1-15 MHz. We have found that contrast agents according to the invention can be produced with a very narrow size distribution for the microbubble dispersion in the area that is preferred for echocardiography, so that echogenicity as well as safety in vivo is improved considerably, and the contrast agents become particularly advantageous in such areas of use as blood pressure measurement, blood flow measurement and ultrasound tomography. For example, products where over 90% (e.g. at least 95%, preferably at least 98%) of the microbubbles have diameters in the range of 1-7 nm and less than 5% (e.g. no more than 10 3%, preferably no more than 2%) of the microbubbles have diameters above 7 µm are produced without problems.

Til bruk i ultralyd kan oppfinnelsens kontrastmidler for eksempel tilføres i slike doser at mengden av tilført fosfolipid ligger i området 0,1-10 ug/kg kroppsvekt, f.eks. 1-5 ug/kg for fundamental B-mode-avbildning. Det vil være klart at slike lave fosfolipidverdier er en vesentlig fordel når det gjelder å minimalisere mulige giftvirkninger. Videre kan den lave fosfolipidkonsentrasjonen i doser som er effektive muliggjøre doseringsøkninger som forlenger observasjonstiden uten negative bivirkninger. For use in ultrasound, the contrast agents of the invention can, for example, be added in such doses that the amount of added phospholipid is in the range 0.1-10 ug/kg body weight, e.g. 1-5 ug/kg for fundamental B-mode imaging. It will be clear that such low phospholipid values are a significant advantage when it comes to minimizing possible toxic effects. Furthermore, the low phospholipid concentration in doses that are effective can enable dosage increases that extend the observation time without negative side effects.

Den totale konsentrasjonen av fosfolipid i injiserbare former av kontrastmidler ifølge oppfinnelsen kan med fordel ligge i området 0,01-2 vektprosent, for eksempel 0,2-0,8 vektprosent, fortrinnsvis rundt 0,5 vektprosent. The total concentration of phospholipid in injectable forms of contrast agents according to the invention can advantageously be in the range of 0.01-2 weight percent, for example 0.2-0.8 weight percent, preferably around 0.5 weight percent.

Generelt har vi funnet det unødvendig for kontrastmidlene ifølge oppfinnelsen å bruke slike tilsetninger som emulgeringsmidler og/eller viskositetsforhøyende midler som er vanlige i mange eksisterende kontrastmiddelformuleringer. Som bemerket ovenfor er dette en fordel når det gjelder å holde antall komponenter som føres inn i kroppen på et minimum og sikre at viskositeten til kontrastmidlet er lavest mulig. Siden fremstilling av kontrastmidlene vanligvis innebærer et frysestørirngstrinn som diskutert i detalj nedenfor, kan det imidlertid vise seg fordelaktig å bruke et eller flere midler med kryoprotektiv og/eller lyoprotektiv virkning og/eller et eller flere fyllstoffer, for eksempel en alkohol som f.eks. t-butanol; en polyol som glyserol; en aminosyre som glycin; et karbohydrat, f.eks. en sukkerart som sukrose, mannitol, trehalose, glukose, laktose eller et cyklodekstrin, eller et polysakkarid som dekstran; eller en polyglykol som polyetylenglykol. En omfattende liste av midler med kryoprotektiv og/eller lyoprotektiv virkning er gitt i Acta Pharm. Technol. 34(3), s. 129-139 (1988), hvis innhold inkorporeres i dette dokumentet ved referanse. Bruk av sakkarider som tåles godt fysiologisk, som sukrose, f.eks. i en slik mengde at produktet blir isotont eller litt hypertont, er foretrukket. In general, we have found it unnecessary for the contrast agents according to the invention to use such additives as emulsifiers and/or viscosity-increasing agents which are common in many existing contrast agent formulations. As noted above, this is advantageous in keeping the number of components introduced into the body to a minimum and ensuring that the viscosity of the contrast agent is as low as possible. Since the preparation of the contrast agents usually involves a freeze-disturbing step as discussed in detail below, it may however prove advantageous to use one or more agents with cryoprotective and/or lyoprotective action and/or one or more fillers, for example an alcohol such as e.g. t-butanol; a polyol such as glycerol; an amino acid such as glycine; a carbohydrate, e.g. a sugar such as sucrose, mannitol, trehalose, glucose, lactose or a cyclodextrin, or a polysaccharide such as dextran; or a polyglycol such as polyethylene glycol. A comprehensive list of agents with cryoprotective and/or lyoprotective action is given in Acta Pharm. Technol. 34(3), pp. 129-139 (1988), the contents of which are incorporated herein by reference. Use of saccharides that are well tolerated physiologically, such as sucrose, e.g. in such an amount that the product becomes isotonic or slightly hypertonic, is preferred.

Dagens mikrobobleholdige kontrastmidler, for eksempel som beskrevet i WO-A-9409829, fremstilles vanligvis ved å bringe surfaktant i pulverform, f.eks. frysetørkede forhåndsrfemstilte liposomer eller frysetørkede eller spray-tørkede 11 Today's microbubble-containing contrast agents, for example as described in WO-A-9409829, are usually prepared by bringing surfactant into powder form, e.g. freeze-dried preformed liposomes or freeze-dried or spray-dried 11

fosfolipidløsninger, sammen med luft eller andre gasser og deretter med vandig bærer, og omrøring for å danne en mikroboblesuspensjon som så må tilføres individet kort tid etter fremstillingen. Slike prosesser lider imidlertid av de ulempene at det må tilføres en høy agitasjonsenergi for at den ønskede dispersjonen skal dannes, og at størrelsen og størrelsesfordelingen til mikroboblene avhenger av den brukte energimengden og derfor ikke kan kontrolleres. phospholipid solutions, together with air or other gases and then with an aqueous carrier, and stirring to form a microbubble suspension which must then be administered to the individual shortly after preparation. However, such processes suffer from the disadvantages that a high agitation energy must be supplied for the desired dispersion to be formed, and that the size and size distribution of the microbubbles depends on the amount of energy used and therefore cannot be controlled.

Vi har nå funnet at kontrastmidlene ifølge oppfinnelsen med fordel kan fremstilles ved å danne en gassmikrobobledispersjon i et egnet fosfolipidholdig vandig medium, som hvis det ønskes kan være autoklavert eller på annen måte sterilisert på forhånd, og deretter utsette dispersjonen for lyofilisering for å oppnå et tørket rekonstituerbart produkt. Slike produkter, som f.eks. kan være lyofiliseirngsresten av en suspensjon av gassmikrobobler i et vandig medium som inneholder amfifilt materiale hvor det amfifile materialet overveiende består av fosfolipid hvor et stort flertall av molekylene har nettoladning, er et annet aspekt ved denne oppfinnelsen. Når det tørkede produktet inneholder et eller flere kryoprotektive og/eller lyoprotektive midler, kan det for eksempel inneholde en matriks av kryoprotektant og/eller lyoprotektant (f.eks. karbohydrat) som avgir mikrobobler og inneholder gassfylte, vesentlig sfæriske hulrom eller vakuoler som er omgitt av et eller flere lag av det amfifile materialet. We have now found that the contrast agents according to the invention can be advantageously prepared by forming a gas microbubble dispersion in a suitable phospholipid-containing aqueous medium, which, if desired, can be autoclaved or otherwise sterilized in advance, and then subjecting the dispersion to lyophilization to obtain a dried reconstitutable product. Such products, such as can be the lyophilization residue of a suspension of gas microbubbles in an aqueous medium containing amphiphilic material where the amphiphilic material predominantly consists of phospholipid where a large majority of the molecules have a net charge, is another aspect of this invention. When the dried product contains one or more cryoprotective and/or lyoprotective agents, it may for example contain a matrix of cryoprotectant and/or lyoprotectant (e.g. carbohydrate) which emits microbubbles and contains gas-filled, substantially spherical cavities or vacuoles which are surrounded by of one or more layers of the amphiphilic material.

Mer spesifikt har vi funnet at tørkede produkter som er fremstilt slik er spesielt lette å rekonstituere i vandige media som f.eks. vann, en vannløsning som f.eks. en saltløsning (som med fordel kan være balansert slik at sluttproduktet for injeksjon ikke er hypotont), eller en vannløsning av en eller flere substanser for justering av tonisiteten som f.eks. salter (f.eks. av plasmakationer med fysiologisk aksepterbare motioner), eller sakkarider, sukkeralkoholer, glykoler og andre ikke-ioniske polyolmaterialer (f.eks. glukose, sukrose, sorbitol, mannitol, glyserol, polyetylenglykoler, propylenglykoler og liknende) som ikke krever mer enn en minimal agitering som kan utføres f.eks. ved lett risting med hånden. Størrelsen av mikroboblene som dannes slik er alltid reproduserbar og i praksis uavhengig av hvor mye agitasjonsenergi som brukes fordi den bestemmes av størrelsen av de mikroboblene som dannes i den opprinnelige mikrobobledispersjonen, denne størrelsesparameteren bevares overraskende nok gjennomgående i det lyofiliserte og 12 More specifically, we have found that dried products prepared in this way are particularly easy to reconstitute in aqueous media such as e.g. water, an aqueous solution such as a salt solution (which can be advantageously balanced so that the final product for injection is not hypotonic), or a water solution of one or more substances for adjusting the tonicity such as e.g. salts (e.g. of plasma cations with physiologically acceptable counterions), or saccharides, sugar alcohols, glycols and other non-ionic polyol materials (e.g. glucose, sucrose, sorbitol, mannitol, glycerol, polyethylene glycols, propylene glycols and the like) which do not require more than a minimal agitation that can be carried out e.g. by light shaking by hand. The size of the microbubbles that are formed in this way is always reproducible and in practice independent of how much agitation energy is used because it is determined by the size of the microbubbles that are formed in the original microbubble dispersion, this size parameter is surprisingly preserved throughout in the lyophilized and 12

rekonstituerte produktet. Derfor, siden størrelsen av mikroboblene i den opprinnelige dispersjonen lett kan kontrolleres ved slike prosessparametre som metoden, hastigheten og varigheten av agitasjonen, kan den endelige mikroboblestørrelsen lett kontrolleres. reconstituted product. Therefore, since the size of the microbubbles in the initial dispersion can be easily controlled by such process parameters as the method, speed and duration of agitation, the final microbubble size can be easily controlled.

Lyofiliserte produkter ifølge oppfinnelsen har vist seg å være lagringsstabile i flere måneder i romtemperatur. Mikrobobledispersjonene som dannes ved rekonstitusjon i vann eller vannløsning kan være stabile i minst 12 timer, slik at man oppnår en betydelig fleksibilitet i forhold til når det tørkede produktet skal rekonstitueres før innsprøytning. Lyophilized products according to the invention have been shown to be storage-stable for several months at room temperature. The microbubble dispersions formed by reconstitution in water or water solution can be stable for at least 12 hours, so that considerable flexibility is achieved in relation to when the dried product must be reconstituted before injection.

Den prosessen som beskrives over for fremstilling av kontrastmidler ifølge oppfinnelsen kan generelt brukes til å fremstille kontrastmidler som innbefatter suspensjoner i en injiserbar vandig bærervæske av gassmikrobobler som er stabilisert av membrandannende lipider, som kan være både nøytrale og ladde lipider (f.eks. fosfolipider) såvel som blandinger av disse. En prosess for å danne et kontrastmiddel i følge oppfinnelsen omfatter trinnene: i) danne en dispersjon av gassmikrobobler i et vandig medium som inneholder et amfifilt materiale som i det vesentlige består av fosfolipider oog overveiende av molekyler som individuelt har en nettoladning, The process described above for the production of contrast agents according to the invention can generally be used to produce contrast agents that include suspensions in an injectable aqueous carrier liquid of gas microbubbles that are stabilized by membrane-forming lipids, which can be both neutral and charged lipids (e.g. phospholipids) as well as mixtures of these. A process for forming a contrast agent according to the invention comprises the steps: i) forming a dispersion of gas microbubbles in an aqueous medium containing an amphiphilic material which essentially consists of phospholipids and predominantly of molecules which individually have a net charge,

ii) lyofilisere den resulterende gassdispersjonen i nærvær av en kryoprotektant og/eller lyoprotektant for å oppnå et tørket produkt omfattende en kryoprotektant- og/eller lyoprotektant-matriks som inneholder biokompatible gassfylte, hovedsakelig sfæriske hulrom eller vakuoler omgitt av et eller flere lag av nevnte amfifile materiale, og ii) lyophilizing the resulting gas dispersion in the presence of a cryoprotectant and/or lyoprotectant to obtain a dried product comprising a cryoprotectant and/or lyoprotectant matrix containing biocompatible gas-filled, substantially spherical cavities or vacuoles surrounded by one or more layers of said amphiphiles material, and

iii) rekonstituere dette tørkede produktet i en injiserbar vandig bærervæske, utgjør et annet aspekt av denne oppfinnelsen, og det gjør også et rekonstituerbart tørket produkt som kan fås ifølge trinn (i) og (ii) av denne prosessen, for eksempel et produkt som inneholder en matriks som frigjør mikrobobler (f.eks. en matriks av kryoprotektant/lyoprotektant) og inneholder gassfylte, stort sett sfæriske hulrom eller vakuoler omgitt av lag av membrandannende lipidmateriale. iii) reconstituting this dried product in an injectable aqueous carrier fluid constitutes another aspect of this invention, and so does a reconstituted dried product obtainable according to steps (i) and (ii) of this process, for example a product containing a matrix that releases microbubbles (eg a matrix of cryoprotectant/lyoprotectant) and contains gas-filled, largely spherical cavities or vacuoles surrounded by layers of membrane-forming lipid material.

13 13

Trinn (i) kan for eksempel realiseres ved å utsette det lipidholdige vannmediet for en hvilken som helst egnet emulsjonsdannende teknikk, for eksempel ultralydbehandling, risting, høytrykkshomogenisering, høyhastighetsomrøring eller høyskjærblanding, f.eks. ved hjelp av en rotor-stator homogenisator, i nærvær av den valgte gassen. Det vandige mediet kan hvis man ønsker det inneholde tilsetninger som øker viskositeten og/eller øker løseligheten av lipidet, for eksempel alkoholer eller polyoler, f.eks. glyserol og/eller propylenglykol. For example, step (i) can be realized by subjecting the lipid-containing aqueous medium to any suitable emulsifying technique, such as sonication, shaking, high-pressure homogenization, high-speed stirring or high-shear mixing, e.g. using a rotor-stator homogenizer, in the presence of the selected gas. The aqueous medium can, if desired, contain additives that increase the viscosity and/or increase the solubility of the lipid, for example alcohols or polyols, e.g. glycerol and/or propylene glycol.

Gassen som brukes i emulgeringstrinnet må ikke nødvendigvis være den samme som man vil ha i sluttproduktet. Det meste av dette gassinnholdet kan derfor fjernes under det etterfølgende lyofiliseirngstrinnet og det som er igjen av gassen ved vakuumbehandling av det tørkede produktet, kan så tilføres en atmosfære av den gassen man vil ha i sluttproduktet. Emulgeringsgassen kan derfor velges utelukkende for å optimalisere parametrene til emulgeringsprosessen, uten å ta sluttproduktet i betraktning. Vi har funnet at emulgering i nærvær av et svovelfluorid som svovelheksafluorid eller en fluorert hydrokarbongass som f.eks. et perfluoralkan eller perfluorcykloalkan som fortrinnsvis inneholder 4 eller 5 karbonatomer, er spesielt fordelaktig for å oppnå sluttprodukter med konsistent og smalt fordelt mikroboblestørrelse. The gas used in the emulsification step does not necessarily have to be the same as what you want in the final product. Most of this gas content can therefore be removed during the subsequent lyophilization step and what is left of the gas during vacuum treatment of the dried product can then be supplied with an atmosphere of the gas you want in the final product. The emulsifying gas can therefore be chosen solely to optimize the parameters of the emulsifying process, without taking the final product into account. We have found that emulsification in the presence of a sulfur fluoride such as sulfur hexafluoride or a fluorinated hydrocarbon gas such as e.g. a perfluoroalkane or perfluorocycloalkane preferably containing 4 or 5 carbon atoms is particularly advantageous for obtaining end products with a consistent and narrowly distributed microbubble size.

Emulgeringen kan med fordel utføres omtrent ved romtemperatur, f.eks. ved ca. 25±10 °C. Det kan være nødvendig å oppvarme det vandige mediet i begynnelsen for å gjøre hydreringen og dermed dispergeringen av fosfolipidet lettere og deretter la det avkjøles til omgivelsestemperaturen før man begynner med emulgeringen. The emulsification can advantageously be carried out at approximately room temperature, e.g. at approx. 25±10 °C. It may be necessary to heat the aqueous medium initially to facilitate the hydration and thus dispersion of the phospholipid and then allow it to cool to ambient temperature before starting the emulsification.

Gassdispersjoner som fremstilles ifølge trinn (i), spesielt vandige dispersjoner av gassmikrobobler stabilisert av amfifilt materiale som overveiende består av fosfolipid hvor et stort flertall av molekylene har nettoladning, utgjør et aspekt av denne oppfinnelsen. Visse slike dispersjoner er presentert i vår internasjonale patentsøknad Gas dispersions prepared according to step (i), especially aqueous dispersions of gas microbubbles stabilized by amphiphilic material consisting predominantly of phospholipid where a large majority of the molecules have a net charge, form an aspect of this invention. Certain such dispersions are presented in our international patent application

WO-A-9640275 som mellomtrinn forbruk ved fremstillingen av diagnostiske kontrastmidler som inneholder mikrobobler av gass stabilisert av et eller flere membranlipider som er kryssbundet eller polymerisert i den hydrofile delen. Patentkravet for disse intermediære dispersjonene hvor det amfifile materialet innbefatter dipalmitoylfosfatidylserin, mer spesifikt i form av natriumsaltet, enten 14 WO-A-9640275 as intermediate consumption in the production of diagnostic contrast agents containing microbubbles of gas stabilized by one or more membrane lipids which are cross-linked or polymerized in the hydrophilic part. The patent claim for these intermediate dispersions where the amphiphilic material includes dipalmitoylphosphatidylserine, more specifically in the form of the sodium salt, either 14

alene eller i kombinasjon med dipalmitoylfosfatidylcholin, og gassen er en blanding av luft og perfluorpentan, en blanding av luft og perfluorheksan eller en blanding av perfluorbutan og perfluorheksan, fravikes herved. alone or in combination with dipalmitoylphosphatidylcholine, and the gas is a mixture of air and perfluoropentane, a mixture of air and perfluorohexane or a mixture of perfluorobutane and perfluorohexane, is hereby waived.

Det vil være klart at siden de er mellomtrinn vil ikke disse dispersjonene være fremstilt i steril, fysiologisk aksepterbar form, mens gassdispersjoner som får ifølge trinn (i) ifølge den foreliggende oppfinnelsen vil fremstilles i steril, fysiologisk aksepterbar form (f.eks. ved hjelp av sterilt, pyrogenfritt vann eller saltløsning som den vandige bærervæsken) hvis de er ment for bruk som kontrastmidler som sådan. It will be clear that since they are intermediate stages, these dispersions will not be prepared in sterile, physiologically acceptable form, while gas dispersions obtained according to step (i) according to the present invention will be prepared in sterile, physiologically acceptable form (e.g. by of sterile, pyrogen-free water or saline as the aqueous carrier fluid) if they are intended for use as contrast agents as such.

Dispersjoner som fremstilles ifølge trinn (i) kan med fordel vaskes en eller flere ganger før kontrastmidlet brukes eller lyofiliseirngstrinnet (ii) begynner, for å skille ut og fjerne substanser som er tilsatt for å øke viskositeten eller løseligheten, såvel som uønskede substanser som gassfrie kolloidpartikler og for små eller for store mikrobobler. De vaskede mikrobobledispersjonene som fås på denne måten utgjør et aspekt av denne oppfinnelsen. Slik vasking kan utføres på en ellers kjent måte, hvor mikroboblene skilles ut med slike teknikker som fiotasjon eller sentrifugering. Muligheten til å fjerne tilsetninger på denne måten og også oppnå mikrobobledispersjoner med en spesielt smal størrelsesdistribusjon representerer viktige fordeler ved prosessen ifølge oppfinnelsen, særlig fordi den resulterende størrelsesfordelingen som bemerket ovenfor opprettholdes overveiende uendret etter lyofilisering og rekonstitusjon. Derfor foretrekkes det i særlig grad at man bruker en prosess som omfatter trinnene gassdispersjon, vasking/separasjon, lyofilisering og rekonstitusjon. Dispersions prepared according to step (i) can advantageously be washed one or more times before the contrast medium is used or the lyophilization step (ii) begins, in order to separate and remove substances added to increase viscosity or solubility, as well as unwanted substances such as gas-free colloidal particles and too small or too large microbubbles. The washed microbubble dispersions thus obtained form an aspect of this invention. Such washing can be carried out in an otherwise known manner, where the microbubbles are separated out with such techniques as fiotation or centrifugation. The possibility of removing additives in this way and also obtaining microbubble dispersions with a particularly narrow size distribution represent important advantages of the process according to the invention, in particular because the resulting size distribution as noted above is maintained predominantly unchanged after lyophilization and reconstitution. Therefore, it is particularly preferred to use a process that includes the steps of gas dispersion, washing/separation, lyophilization and reconstitution.

Det kan fremstilles støirelsesfraksjonerte mikrobobledispersjoner hvor minst 90 % av mikroboblene har en størrelse innenfor et område på 2fim, hvor mikroboblene fortrinnsvis har en volummiddeldiameter i området 2-5 um. Slike dispersjoner og frosne og lyofiliserte produkter som er avledet av dem, f.eks. som beskrevet nedenfor, er andre aspekter av denne oppfinnelsen. Disturbance-fractionated microbubble dispersions can be produced where at least 90% of the microbubbles have a size within a range of 2 µm, where the microbubbles preferably have a volume mean diameter in the range 2-5 µm. Such dispersions and frozen and lyophilized products derived from them, e.g. as described below, are other aspects of this invention.

Hvis det brukes et eller flere kryoprotektive og/eller lyoprotektive midler kan disse med fordel tilsettes etter vasketrinnene og før lyofiliseringen. If one or more cryoprotective and/or lyoprotective agents are used, these can advantageously be added after the washing steps and before lyophilization.

Lyofilisering av gassdispersjonen kan for eksempel utføres ved først å fryse den og deretter lyofilisere den frosne gassdispersjonen, for eksempel med en som sådan generelt velkjent metode. Slike frosne gassdispersjoner, d.v.s. frosne vandige 15 Lyophilization of the gas dispersion can be carried out, for example, by first freezing it and then lyophilizing the frozen gas dispersion, for example with a generally well-known method as such. Such frozen gas dispersions, i.e. frozen watery 15

dispersjoner som frigjør mikrobobler og inneholder gassmikrobobler stabilisert av amiifilt materiale som overveiende består av fosfolipid hvor et stort flertall av de individuelle molekylene har en nettoladning, utgjør nok et aspekt av denne oppfinnelsen. Mikroboblene kan med fordel størrelsesfraksjoneres før de fryses ned, slik at de frigjorte mikroboblene helst har en volummiddeldiameter innenfor området 2-5 nm. Slike produkter kan lagres frosne og tines opp hvis nødvendig, f.eks. ved enkel oppvarming og/eller ved tilsetning av en bærervæske, for å regenerere mikrobobledispersjoner som er nyttige som kontrastmidler ifølge oppfinnelsen. dispersions which release microbubbles and contain gas microbubbles stabilized by amiphilic material consisting predominantly of phospholipid where a large majority of the individual molecules have a net charge constitute another aspect of this invention. The microbubbles can advantageously be size-fractionated before they are frozen, so that the freed microbubbles preferably have a volume mean diameter within the range of 2-5 nm. Such products can be stored frozen and thawed if necessary, e.g. by simple heating and/or by adding a carrier liquid, to regenerate microbubble dispersions which are useful as contrast agents according to the invention.

Siden det tørkede produktet normalt vil rekonstitueres ifølge trinn (iii) ovenfor før bruk kan gassdispersjonen med fordel fylles på glass som kan forsegles før lyofilisering slik at hver av glassene inneholder en passende mengde, f.eks. en enkelt dose, av lyofilisert tørket produkt for rekonstituering i injiserbar form. Ved å lyofilisere gassdispersjonen i individuelle glass i stedet for samlet, unngår man manipulering av den ømtålige bikake-liknende strukturen til det lyofiliserte produktet, med risiko for i det minste å delvis nedbryte denne strukturen. Etter lyofilisering og eventuell ytterligere gassfjeming samt innføring i luftrommet over produktet av slik gass som man ønsker å ha som mikrobobler i det endelig formulerte kontrastmidlet, kan glassene forsegles ved en egnet metode. Det vil være klart at muligheten til å velge gassinnhold i sluttproduktet, sammen med den uavhengige muligheten til å kontrollere mikroboblestørrelsen i sluttproduktet ved å velge passende prosessparametre under det første dispergeringstrinnet og eventuelle senere vaske-/separasjonstrinn, gjør det mulig med fritt valg av mikroboblestørrelse og gassinnhold, slik at produktene kan tilpasses bestemte bruksmåter. Since the dried product will normally be reconstituted according to step (iii) above before use, the gas dispersion can advantageously be filled into glasses which can be sealed before lyophilization so that each of the glasses contains a suitable amount, e.g. a single dose, of lyophilized dried product for reconstitution in injectable form. By lyophilizing the gas dispersion in individual glasses instead of collectively, one avoids manipulation of the delicate honeycomb-like structure of the lyophilized product, with the risk of at least partially degrading this structure. After lyophilization and any further gas blowing as well as introduction into the air space above the product of such gas as you want to have as microbubbles in the finally formulated contrast agent, the glasses can be sealed by a suitable method. It will be clear that the ability to select gas content in the final product, together with the independent ability to control microbubble size in the final product by selecting appropriate process parameters during the first dispersing step and any subsequent washing/separation steps, allows for free choice of microbubble size and gas content, so that the products can be adapted to specific uses.

Generelt kan den frosne gassdispersjonen eller det tørkede produktet fra trinn (ii), f.eks. etter nødvendig og/eller ønsket supplementering eller utskifting av gassinnholdet, rekonstitueres ved tilsetning av en passende steril, vandig injiserbar bærervæske, f.eks. sterilt pyrogenfritt vann for injeksjon, en vandig løsning som f.eks. en saltløsning (som med fordel kan balanseres slik at sluttproduktet for injeksjon ikke er hypotont), eller en vandig løsning av en eller flere substanser for justering av tonisiteten (f.eks. som beskrevet ovenfor). Hvis det tørkede produktet befinner seg i et glass er det praktisk om dette forsegles med et septum som bærervæsken kan sprøytes inn gjennom med en kanyle som eventuelt er fylt på 16 In general, the frozen gas dispersion or the dried product from step (ii), e.g. after necessary and/or desired supplementation or replacement of the gas content, reconstituted by adding a suitable sterile, aqueous injectable carrier liquid, e.g. sterile pyrogen-free water for injection, an aqueous solution such as a salt solution (which can advantageously be balanced so that the final product for injection is not hypotonic), or an aqueous solution of one or more substances for adjusting the tonicity (e.g. as described above). If the dried product is in a glass, it is practical if this is sealed with a septum through which the carrier liquid can be injected with a needle that may be filled with 16

forhånd. Alternativt kan det tørkede produktet og bærervæsken tilføres samtidig i en innretning med to kamre, som f.eks. en tokammersprøyte. Det kan være en fordel å blande eller riste produktet lett etter rekonstituering. Som nevnt over kan imidlertid størrelsen av gassmikroboblene i de stabiliserte kontrastmidlene ifølge oppfinnelsen i det vesentlig være uavhengig av hvor mye agitasjonsenergi som tilføres det rekonstituerte tørkede produktet. Derfor vil det neppe være nødvendig med noe mer enn en lett risting med hånden for å oppnå reproduserbare produkter med konsistent mikroboblestørrelse. in advance. Alternatively, the dried product and the carrier liquid can be supplied simultaneously in a device with two chambers, such as e.g. a two-chamber syringe. It may be advantageous to mix or shake the product lightly after reconstitution. As mentioned above, however, the size of the gas microbubbles in the stabilized contrast agents according to the invention can essentially be independent of how much agitation energy is supplied to the reconstituted dried product. Therefore, it is unlikely that anything more than a light shake by hand will be required to achieve reproducible products with consistent microbubble size.

De følgende ikke-begrensende eksemplene tjener til å illustrere oppfinnelsen. The following non-limiting examples serve to illustrate the invention.

Kort beskrivelse av illustrasjonene Brief description of the illustrations

På de medfølgende illustrasjonene er On the accompanying illustrations are

Fig. 1 en graf av prosent overlevelses av volumkonsentrasjonen etter lyofilisering og rekonstitusjon mot den relative mengden av ladd fosfolipid i membranene til kontrastmidler ifølge eksempel 1; Fig. 2 er grafer over attenueringsspektra for frekvensområdet 1,5-8 MHz av kontrastmiddel ifølge eksempel 2(a) målt a) før trykktesting, b) under trykktesting og c) etter trykktesting som beskrevet i eksempel 6; Fig. 1 a graph of percent survival of the volume concentration after lyophilization and reconstitution against the relative amount of loaded phospholipid in the membranes of contrast agents according to example 1; Fig. 2 are graphs of attenuation spectra for the frequency range 1.5-8 MHz of contrast agent according to example 2(a) measured a) before pressure testing, b) during pressure testing and c) after pressure testing as described in example 6;

Fig. 3 viser prosentandel restitusjon av attenueringen ved 3,5 MHz for Fig. 3 shows percentage recovery of the attenuation at 3.5 MHz for

kontrastmiddel ifølge eksempel 2(a) etter 90 sekunders overtrykk på 0-300 mmHg som beskrevet i eksempel 6; og contrast agent according to example 2(a) after 90 seconds of positive pressure of 0-300 mmHg as described in example 6; and

Fig 4 viser volumstørrelsesfordelinger for kontrastmiddel ifølge eksempel 2(a) målt ved Coulteranalyse a) uten bruk av overtrykk (♦), b) etter 90 sekunders overtrykk på 150 mmHg (A) og c) etter 90 sekunders overtrykk på 300 mmHg (O), som beskrevet i eksempel 6. Fig 4 shows volume size distributions for contrast agent according to example 2(a) measured by Coulter analysis a) without the use of overpressure (♦), b) after 90 seconds of overpressure of 150 mmHg (A) and c) after 90 seconds of overpressure of 300 mmHg (O) , as described in example 6.

17 17

Eksempel 1 Example 1

Virkningen av relative meneder ladde fosfolipider The effect of relative perjury charged phospholipids

Ifølge den generelle fremgangsmåten som er beskrevet under og med prosessparametrene i tabell 1.1 nedenfor ble det laget dispersjoner av mikrobobler stabilisert av forskjellige fosfolipider eller fosfolipidblandinger. According to the general method described below and with the process parameters in table 1.1 below, dispersions of microbubbles stabilized by different phospholipids or phospholipid mixtures were made.

Det ble fremstilt løsninger av de valgte fosfolipidene eller fosfolipidblandingene i vann som inneholdt 5,4 vektprosent av en blanding av propylenglykol og glyserol (vektforhold 3:10) med en fosfolipidkonsentrasjon på 2-5 mg/ml (for fosfatidyletanolamin ble vannet justert til pH = 10,5 med natriumhydroksyd), fosfolipidet ble hydratisert ved ultralydbehandling og/eller oppvarming til omtrent 80 °C tid som angitt (tabell 1.1) og avkjølt til romtemperatur før bruk. Et gitt volum av denne løsningen ble fordelt mellom flere 2 ml kromatografiglass med 0,8-1 ml løsning pr. glass. Luften i hvert glass ble erstattet med perfluorbutangass, og glassene ble tett tillukket og ristet i 45 sekunder med en Espe CapMix® (blandeapparat for dental-materialer). De resulterende mikrobobledispersjonene ble overført til et større glass og sentrifugert ved 2000 rpm i 5 minutter, slik at man fikk en turbid infranatant under et flytende lag av mikrobobler. Infranatanten ble fjernet med en kanyle og erstattet med et tilsvarende volum vann av nøytral pH. Vasketrinnet ble gjentatt, men nå ble infranatanten erstattet med en 10 vektprosent sukroseløsning. Porsjoner på 2 ml av den vaskede dispersjonen ble fordelt mellom flatbunnede 10 ml lyoflliseringsglass, og glassene ble nedkjølt til -47 °C og lyofilisert i omtrent 48 timer, med en hvit, luftig fast substans som resultat. Glassene ble overført til et vakuumkammer, og luften ble fjernet med vakuumpumpe og erstattet med perfluorbutangass. Før bruk ble det tilsatt vann og glassene ble lett ristet med hånden i flere sekunder for å lage mikroboblesuspensjoner som er egnet som ultralydkontrastmidler. Solutions of the selected phospholipids or phospholipid mixtures were prepared in water containing 5.4% by weight of a mixture of propylene glycol and glycerol (weight ratio 3:10) with a phospholipid concentration of 2-5 mg/ml (for phosphatidylethanolamine, the water was adjusted to pH = 10.5 with sodium hydroxide), the phospholipid was hydrated by ultrasound treatment and/or heating to approximately 80 °C time as indicated (table 1.1) and cooled to room temperature before use. A given volume of this solution was distributed between several 2 ml chromatography glasses with 0.8-1 ml solution per. glass. The air in each jar was replaced with perfluorobutane gas, and the jars were tightly closed and shaken for 45 seconds with an Espe CapMix® (mixer for dental materials). The resulting microbubble dispersions were transferred to a larger beaker and centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes to obtain a turbid infranatant below a floating layer of microbubbles. The infranatant was removed with a cannula and replaced with an equal volume of water of neutral pH. The washing step was repeated, but now the infranatant was replaced with a 10% by weight sucrose solution. Aliquots of 2 ml of the washed dispersion were distributed between flat-bottomed 10 ml lyophilization vials, and the vials were cooled to -47°C and lyophilized for approximately 48 hours, resulting in a white fluffy solid. The glasses were transferred to a vacuum chamber, and the air was removed with a vacuum pump and replaced with perfluorobutane gas. Before use, water was added and the jars were gently shaken by hand for several seconds to create microbubble suspensions suitable as ultrasound contrast agents.

Mikroboblenes størrelsesfordeling og volumkonsentrasjon ble målt med et Coulter Counter Mark E-apparat med 50 :m apertur og måleområde 1-30 :m. Prøver på 20 18 The microbubbles' size distribution and volume concentration were measured with a Coulter Counter Mark E apparatus with a 50 :m aperture and measuring range 1-30 :m. Try on 20 18

:1 ble fortynnet i 200 ml saltløsning som var mettet med luft ved romtemperatur og sto 3 minutter for å oppnå likevekt før måling. Målingene ble gjort på mikrobobledispersjonene før lyofilisering (vasket bobledispersjon) og etter lyofilisering (rekonstituert med vann til samme volum som før lyofiliseringen). Dataene er presentert i tabell 1.2 nedenfor. :1 was diluted in 200 ml of saline saturated with air at room temperature and stood for 3 minutes to achieve equilibrium before measurement. The measurements were made on the microbubble dispersions before lyophilization (washed bubble dispersion) and after lyophilization (reconstituted with water to the same volume as before lyophilization). The data is presented in table 1.2 below.

Effektiviteten av lyofiliseringen for de forskjellige fosfolipidstabiliserte mikrobobledispersjonene ble beregnet som overlevelsesprosent av volumkonsentrasjonen etter lyofilisering og rekonstituering. En graf (se fig. 1) viser hvordan denne parameteren varierer med den relative mengden ladd fosfolipid i membranen. Som man kan se øker effektiviteten av lyofiliseringen med økt mengde av ladd fosfolipid i membranen, og er høyest for membraner som bare inneholder ladde fosfolipider. The efficiency of the lyophilization for the different phospholipid-stabilized microbubble dispersions was calculated as survival percentage of the volume concentration after lyophilization and reconstitution. A graph (see fig. 1) shows how this parameter varies with the relative amount of charged phospholipid in the membrane. As can be seen, the efficiency of the lyophilization increases with an increased amount of charged phospholipid in the membrane, and is highest for membranes that only contain charged phospholipids.

Eksempel 2 Example 2

a) Fremstillin<g>av perfluorbutarmiikrobobledispersjoner ved risting 25,3 mg hydrogenert fosfatidylserin fra egg ble tilsatt til 12,5 ml vann som inneholdt a) Preparation<g>of perfluorobutarmic microbubble dispersions by shaking 25.3 mg of hydrogenated phosphatidylserine from eggs was added to 12.5 ml of water containing

5,4 vektprosent av en blanding av propylenglykol og glyserol (vektforhold 3:10). Fosfolipidmaterialet ble hydratisert ved oppvarming til 70 °C i omtrent 30 minutter og deretter avkjølt til romtemperatur. 11 ml av dispersjonen ble fordelt i 11 porsjoner på 1 ml i 2 ml glass, og luften i glassene ble erstattet med perfluor-n-butangass. Glassene ble tett tillukket og ristet i 45 sekunder med en Espe CapMix® 5.4% by weight of a mixture of propylene glycol and glycerol (weight ratio 3:10). The phospholipid material was hydrated by heating to 70°C for approximately 30 minutes and then cooled to room temperature. 11 ml of the dispersion was divided into 11 portions of 1 ml in 2 ml glasses, and the air in the glasses was replaced with perfluoro-n-butane gas. The glasses were tightly closed and shaken for 45 seconds with an Espe CapMix®

(blandeapparat for dental- materialer). De resulterende mikrobobledispersjonene ble slått sammen i fire større glass og sentrifugert ved 2000 rpm i 5 minutter, med en turbid infranatant under et flytende lag av mikrobobler som resultat. Infranatanten ble (mixing device for dental materials). The resulting microbubble dispersions were pooled into four larger beakers and centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes, resulting in a turbid infranatant beneath a floating layer of microbubbles. The infranatant was

fjernet med en kanyle og erstattet med et tilsvarende volum vann av nøytral pH. Vasketrinnet ble gjentatt, men nå ble infranatanten erstattet med 10 vektprosent sukrose. Det ble tatt ut porsjoner på 2 ml av den resulterende dispersjonen som ble fordelt mellom et antall 10 ml flatbunnede lyofiliseirngsglass, og glassene ble kjølt ned til -47 °C og lyofilisert i omtrent 48 timer med en hvit, luftig fast substans som resultat. Glassene ble overført til et vakuumkammer og luften ble fjernet med en vakuumpumpe og erstattet med perfluor-n-butangass. Før bruk ble det tilsatt vann og glassene ble ristet lett med hånden i flere sekunder for å lage mikrobobledispersjoner som var egnet som ultralydkontrastmidler. removed with a cannula and replaced with an equal volume of water of neutral pH. The washing step was repeated, but now the infranatant was replaced with 10% by weight sucrose. Aliquots of 2 ml of the resulting dispersion were taken and distributed among a number of 10 ml flat-bottomed lyophilization vials, and the vials were cooled to -47°C and lyophilized for approximately 48 hours to yield a white fluffy solid. The glasses were transferred to a vacuum chamber and the air was removed with a vacuum pump and replaced with perfluoro-n-butane gas. Before use, water was added and the jars were shaken lightly by hand for several seconds to create microbubble dispersions suitable as ultrasound contrast agents.

bj Fremstilling av dispersjoner av perfluorbutanmikrobobler ved hielp av rotor-stator- blanding bj Production of dispersions of perfluorobutane microbubbles with the help of a rotor-stator mixture

500,4 mg hydrogenert fosfatidylserin fra egg ble tilsatt til 100 ml vann som inneholdt 5,4 vektprosent av en blanding av propylenglykol og glyserol (vektforhold 3:10). Blandingen ble ristet og oppvarmet til 80 °C i fem minutter, avkjølt til romtemperatur, ristet igjen og satt til side over natten før bruk. 50 ml av den resulterende løsningen ble overført til en rundbunnet flaske med konisk hals. Flasken var utstyrt med glasskappe med temperaturkontrolleit innløp og utløp koblet til et vannbad som holdt en stabil temperatur på 25 °C. Et rotor-stator røreverk ble ført inn i løsningen og for å unngå gasslekkasje ble rommet mellom halsveggen og røreverket forseglet med en spesialkonstruert metallplugg utstyrt med gassinnløp-/utløpsitlkobling for trykkontroll og justering av gassinnholdet. Gassutløpet ble koblet til en vakuumpumpe og løsningen ble avgasset i et minutt. En atmosfære av perfluor-n-butan ble så tilført gjennom gassinnløpet. 500.4 mg of hydrogenated phosphatidylserine from eggs was added to 100 ml of water containing 5.4% by weight of a mixture of propylene glycol and glycerol (weight ratio 3:10). The mixture was shaken and heated to 80°C for five minutes, cooled to room temperature, shaken again and set aside overnight before use. 50 ml of the resulting solution was transferred to a round-bottom flask with a conical neck. The bottle was equipped with a glass cover with a temperature-controlled inlet and outlet connected to a water bath which maintained a stable temperature of 25 °C. A rotor-stator agitator was introduced into the solution and, to avoid gas leakage, the space between the throat wall and the agitator was sealed with a specially designed metal plug equipped with a gas inlet/outlet connection for pressure control and adjustment of the gas content. The gas outlet was connected to a vacuum pump and the solution was degassed for one minute. An atmosphere of perfluoro-n-butane was then supplied through the gas inlet.

Løsningen ble homogenisert ved 23000 rpm i 10 minutter mens rotor-stator-røreverket ble holdt med åpningene litt over væskeoverflaten. Resultatet var en hvitfarget kremaktig dispersjon, som ble overført til en beholder som kunne forsegles og skylt med perfluor-n-butan. Dispersjonen ble så overført til en skilletrakt og sentrifugert ved 12000 rpm i 30 minutter, slik at man fikk et kremaktig lag av mikrobobler øverst og en turbid infranatant. Infranatanten ble fjernet og erstattet med vann. Sentrifugeringen ble så gjentatt to ganger, men nå ved 12000 rpm i 15 minutter. Etter den siste sentrifugeringen ble supernatanten byttet ut med 10 vektprosent sukrose. Porsjoner på 2 ml av den resulterende dispersjonen ble fordelt på et antall 10 ml flatbunnede lyofiliseirngsglass, og glassene ble nedkjølt til -47 °C og lyofilisert i omtrent 48 timer, med en hvit, luftig fast substans som resultat. Glassene ble overført til et vakuumkammer og luften ble fjernet med en vakuumpumpe og erstattet med perfluor-n-butangass. Før bruk ble det tilsatt vann og glassene ble ristet lett med hånden i flere sekunder for å lage mikrobobledispersjoner som var egnet som ultralydkontrastmidler. The solution was homogenized at 23000 rpm for 10 minutes while the rotor-stator agitator was held with the openings slightly above the liquid surface. The result was a white colored creamy dispersion, which was transferred to a sealable container and rinsed with perfluoro-n-butane. The dispersion was then transferred to a separatory funnel and centrifuged at 12,000 rpm for 30 minutes, so that a creamy layer of microbubbles was obtained at the top and a turbid infranatant. The infranatant was removed and replaced with water. The centrifugation was then repeated twice, but now at 12,000 rpm for 15 minutes. After the last centrifugation, the supernatant was exchanged with 10 wt% sucrose. Aliquots of 2 mL of the resulting dispersion were dispensed into a number of 10 mL flat-bottomed lyophilization vials, and the vials were cooled to -47°C and lyophilized for approximately 48 hours, resulting in a white, fluffy solid. The glasses were transferred to a vacuum chamber and the air was removed with a vacuum pump and replaced with perfluoro-n-butane gas. Before use, water was added and the jars were shaken lightly by hand for several seconds to create microbubble dispersions suitable as ultrasound contrast agents.

c) Fremstilling av dispersjoner av<p>erfluorbutanmikrobobler ved ultralvdbehandling c) Production of dispersions of <p>erfluorobutane microbubbles by ultra-low frequency treatment

500,4 mg hydrogenert fosfatidylserin fra egg ble tilsatt til 100 ml vann som inneholdt 5,4 vektprosent av en blanding av propylenglykol og glyserol (vektforhold 3:10). Blandingen ble ristet og oppvarmet til 80 °C i fem minutter, avkjølt til romtemperatur, ristet igjen og satt til side over natten før bruk. 500.4 mg of hydrogenated phosphatidylserine from eggs was added to 100 ml of water containing 5.4% by weight of a mixture of propylene glycol and glycerol (weight ratio 3:10). The mixture was shaken and heated to 80°C for five minutes, cooled to room temperature, shaken again and set aside overnight before use.

Denne løsningen ble pumpet gjennom en 4 ml sonikator gjennomstrømningscelle og utsatt for ultralyd ved 20 kHz med amplityde 90 :m. Diameteren til sonikatorhomet var 1,3 cm, den indre diameteren av cellen var 2,1 cm og avstanden mellom hornet og bunnen av cellen var 1 cm. Lipidløsningen ble blandet med perfluor-n-butan til et volumforhold på 1:2 før den ble ført inn i sonikatorcellen (20 ml/min lipidløsning og 40 ml/min perfluor-n-butangass). Temperaturen ble holdt stabil ved 33 °C. Resultatet var en hvit, kremaktig dispersjon som ble fylt på en beholder og skylt med perfluor-n-butan. This solution was pumped through a 4 ml sonicator flow cell and subjected to ultrasound at 20 kHz with amplitude 90 µm. The diameter of the sonicator home was 1.3 cm, the inner diameter of the cell was 2.1 cm, and the distance between the horn and the bottom of the cell was 1 cm. The lipid solution was mixed with perfluoro-n-butane to a volume ratio of 1:2 before being introduced into the sonicator cell (20 ml/min lipid solution and 40 ml/min perfluoro-n-butane gas). The temperature was kept stable at 33 °C. The result was a white, creamy dispersion which was filled into a container and rinsed with perfluoro-n-butane.

Karakterisering Characterization

Mikroboblenes størrelsesfordeling og volumkonsentrasjon ble målt med et Coulter Counter Mark H-apparat med 50 :m apertur og måleområde 1-30 :m. Prøver på 20:1 ble fortynnet i 200 ml saltløsning som var mettet med luft ved romtemperatur og fikk stå 3 minutter for å oppnå likevekt før måling. The microbubbles' size distribution and volume concentration were measured with a Coulter Counter Mark H apparatus with a 50 :m aperture and measuring range 1-30 :m. Samples were diluted 20:1 in 200 mL of saline saturated with air at room temperature and allowed to stand for 3 minutes to equilibrate before measurement.

Ultralydkarakteriseringen ble utført med en eksperimentell oppsats som var litt modifisert fra den som beskrives av de Jong, N. og Hoff, L. i "Ultrasound scattering properties of Albunex microspheres", Ultrasonics 31( 3), s. 175-181 (1993). Denne instrumenteringen måler effektiviteten av attenueringen i ultralydfrekvensområdet 2-8 MHz for en fortynnet suspensjon av kontrastmiddel. Under måling av attenueringen ble det utført en test på trykkstabilitet ved å utsette prøven for et overtrykk på 120 mmHg i 90 sekunder. Typisk ble 2-3 :1 av prøven fortynnet i 55 ml Isoton II og den fortynnede prøvesuspensjonen ble omrørt i 3 minutter før analysen. Som primær responsparameter bruktes attenueringen ved 3,5 MHz, sammen med verdien av restitusjonsattenueringen ved 3,5 MHz etter frigjøring av overtrykket. The ultrasound characterization was performed with an experimental setup slightly modified from that described by de Jong, N. and Hoff, L. in "Ultrasound scattering properties of Albunex microspheres", Ultrasonics 31(3), pp. 175-181 (1993) . This instrumentation measures the effectiveness of the attenuation in the ultrasound frequency range 2-8 MHz for a dilute suspension of contrast agent. During measurement of the attenuation, a pressure stability test was performed by exposing the sample to an overpressure of 120 mmHg for 90 seconds. Typically 2-3:1 of the sample was diluted in 55 ml of Isoton II and the diluted sample suspension was stirred for 3 minutes before analysis. As the primary response parameter, the attenuation at 3.5 MHz was used, together with the value of the recovery attenuation at 3.5 MHz after release of the overpressure.

Eksempel 3 Virkninger av å bvtte ut gassen Example 3 Effects of venting the gas

Gassinnholdet i fem prøver som var fremstilt som i eksempel 2(b) ovenfor ble 24 The gas content in five samples prepared as in example 2(b) above was 24

erstattet med h.h.v. luft, perfluorbutan, svovelheksafluorid, replaced with h.h.v. air, perfluorobutane, sulfur hexafluoride,

trifluormetylsvovelpentafluorid og tetrametylsilan, etter følgende fremgangsmåte: To prøver som inneholdt lyofilisert produkt fra eksempel 2(b) ble plassert i en desiccator med innløp og utløp for gass. Desiccatoren ble forbundet med en Btichi 168 vakuum/destillator-kontroll for å kunne tilføre prøvene en utvalgt gass og kontrollere evakueringen. Trykket over prøvene ble senket til omtrent 10 mbar og holdt der i 5 minutter, deretter ble det økt til atmosfæretrykk ved å tilføre den utvalgte gassen. Prøveglassene ble så tett tillukket. Prosedyren ble gjentatt med nye prøvepar for hver av de utvalgte gassene. trifluoromethylsulfur pentafluoride and tetramethylsilane, according to the following procedure: Two samples containing lyophilized product from example 2(b) were placed in a desiccator with inlet and outlet for gas. The desiccator was connected to a Btichi 168 vacuum/distillator control in order to supply the samples with a selected gas and control the evacuation. The pressure above the samples was lowered to approximately 10 mbar and held there for 5 minutes, then it was increased to atmospheric pressure by adding the selected gas. The test tubes were then tightly closed. The procedure was repeated with new sample pairs for each of the selected gases.

Det ble tilsatt 2 ml destillert vann til hvert glass og glassene ble lett ristet med hånden før bruk. De resulterende mikrobobledispersjonene blekarakterisert vedmålinger av størrelsesfordelingen som beskrevet i eksempel 2. Resultatene er oppsummert i tabell 3.1. 2 ml of distilled water was added to each glass and the glasses were lightly shaken by hand before use. The resulting microbubble dispersions were characterized by measurements of the size distribution as described in example 2. The results are summarized in table 3.1.

Som man ser av resultatene ovenfor var det ingen signifikante forskjeller i størrelsesfordelingen for de forskjellige gassene. As can be seen from the results above, there were no significant differences in the size distribution for the different gases.

Resultater in vivo Results in vivo

En porsjon som var produsert med hver av de fem gassene ble testet in vivo for å registrere forbedringer i doppleravbildningen ved 10 MHz. Dispersjonene ble sprøytet inn i chinchillakaniner via en vene i øret og målt ved hjelp av en dopplerteknikk med ultralydsonde direkte på en karotidpulsåre. Registrering av signalintensitet og varighet ble foretatt og integralet av dopplerkurven ble beregnet. Resultatene (se tabell 3.2 nedenfor) viste at mikrobobler som inneholdt perfluorbutan ga den sterkeste dopplerintensitetsøkningen. Mikrobobler som inneholdt svovelheksafluorid, trifluormetylsvovelpentafluorid eller tetrametylsilan ga ikke vesentlig dårligere dopplerforbedrering enn de som inneholdt perfluorbutan, med integraler på rundt 60-80 % av verdiene for perfluorbutan. An aliquot produced with each of the five gases was tested in vivo to record improvements in Doppler imaging at 10 MHz. The dispersions were injected into chinchilla rabbits via a vein in the ear and measured using a Doppler technique with an ultrasound probe directly on a carotid artery. Recording of signal intensity and duration was carried out and the integral of the Doppler curve was calculated. The results (see Table 3.2 below) showed that microbubbles containing perfluorobutane produced the strongest Doppler intensity increase. Microbubbles containing sulfur hexafluoride, trifluoromethylsulfur pentafluoride or tetramethylsilane did not give significantly worse Doppler enhancement than those containing perfluorobutane, with integrals of around 60-80% of the values for perfluorobutane.

Eksempel 4 Example 4

Frosne dispersjoner og Ivofiliserte produkter Frozen dispersions and Ivophilized products

250 mg hydrogenert fosfatidylserin fra egg ble tilsatt til 50 ml vann for injeksjon som inneholdt 5,4 vektprosent av en blanding av propylenglykol og glyserol (vektforhold 7:20). Blandingen ble ristet og oppvarmet til 80 °C i fem minutter, avkjølt til romtemperatur, ristet igjen og satt til side over natten før bruk. 250 mg of hydrogenated phosphatidylserine from eggs was added to 50 ml of water for injection containing 5.4% by weight of a mixture of propylene glycol and glycerol (weight ratio 7:20). The mixture was shaken and heated to 80°C for five minutes, cooled to room temperature, shaken again and set aside overnight before use.

100 ml av den resulterende løsningen ble overført til en rundbunnet flaske med konisk hals og behandlet etter den fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel 2(b). Det ble dannet en hvitfarget kremaktig dispersjon. Denne dispersjonen ble overført til 100 ml of the resulting solution was transferred to a round-bottomed bottle with a conical neck and treated according to the procedure described in Example 2(b). A white colored creamy dispersion was formed. This dispersion was transferred to

26 26

en skilletrakt og sentrifugert ved 12000 rpm i 30 minutter, slik at man fikk et kremaktig lag av mikrobobler over en turbid infranatant. Infranatanten ble fjernet og erstattet med 50 ml vann for injeksjon. Sentrifugeringen ble så gjentatt to ganger, a separatory funnel and centrifuged at 12,000 rpm for 30 minutes, so that a creamy layer of microbubbles was obtained over a turbid infranatant. The infranatant was removed and replaced with 50 ml water for injection. The centrifugation was then repeated twice,

men nå ved 12000 rpm i 15 minutter. 6 ml av den resulterende dispersjonen ble tilsatt 6 ml av en 30 vektprosent trehaloseløsning. Porsjoner på 2 ml av denne dispersjonen ble fordelt på et antall flatbunnede 10 ml lyofiliseirngsglass, og glassene ble nedkjølt til -47 °C og lagret ved denne temperaturen i et døgn. but now at 12000 rpm for 15 minutes. To 6 ml of the resulting dispersion was added 6 ml of a 30% by weight trehalose solution. Portions of 2 ml of this dispersion were distributed among a number of flat-bottomed 10 ml lyophilization glasses, and the glasses were cooled to -47 °C and stored at this temperature for 24 hours.

Halvparten av porsjonene ble tint opp etter et døgn ved -47 °C og ga homogene kremaktige hvite dispersjoner av gassmikrobobler som egnet seg som ultralydkonstrastmidler. De opprinte dispersjonene blekarakterisert vedmåling av størrelsesfordelingen som beskrevet i eksempel 2 ovenfor (se tabell 4.1). De resterende porsjonene ble lyofilisert i omtrent 48 timer med en luftig hvit fast substans som resultat. Glassene ble overført til vakuumkammer, luften ble pumpet ut med en vakuumpumpe og erstattet med perfluor-n-butangass. Før bruk ble de tilsatt vann og glassene ble lett ristet med hånden i flere sekunder for å lage bobledispersjoner som egnet seg som dtralydkonti^tmidler. De rekonstituerte produktene blekarakterisert vedmåling av størrelsesfordelingen og den akustiske attenueringen med de metodene som er beskrevet i eksempel 2 ovenfor. Resultatene er presentert i tabell 4.1. Half of the portions were thawed after 24 hours at -47 °C and gave homogeneous creamy white dispersions of gas microbubbles which were suitable as ultrasound contrast agents. The printed dispersions were characterized by measuring the size distribution as described in example 2 above (see table 4.1). The remaining portions were lyophilized for approximately 48 hours, resulting in a fluffy white solid. The glasses were transferred to a vacuum chamber, the air was pumped out with a vacuum pump and replaced with perfluoro-n-butane gas. Before use, they were added to water and the jars were lightly shaken by hand for several seconds to create bubble dispersions suitable as ultrasound agents. The reconstituted products were characterized by measuring the size distribution and the acoustic attenuation with the methods described in example 2 above. The results are presented in table 4.1.

Eksempel 5 Example 5

Dispersjon av mikrobobler med<p>erfluorbutan eksponert for luftmettet væske Et glass som inneholdt lyofilisert materiale under en atmosfære av perfluorbutan ble fremstilt som beskrevet i eksempel 2(b). Det ble tilsatt vann til glasset like før bruk for å lage en mikrobobledispersjon. Dispersion of microbubbles with <p>erfluorobutane exposed to air-saturated liquid A glass containing lyophilized material under an atmosphere of perfluorobutane was prepared as described in Example 2(b). Water was added to the glass just before use to make a microbubble dispersion.

200 ml Isoton n-væske ble utsatt for luft i flere dager ved romtemperatur slik at løsningen ble fullstendig mettet med luft. En annen porsjon på 200 ml av væsken ble avgasset i en vakuumflaske ved 60 °C i en time og avkjølt til romtemperatur under vakuum. Det ble sluppet luft inn i flasken like før bruk. 200 ml of Isoton n liquid was exposed to air for several days at room temperature so that the solution was completely saturated with air. Another portion of 200 ml of the liquid was degassed in a vacuum bottle at 60 °C for one hour and cooled to room temperature under vacuum. Air was released into the bottle just before use.

Porsjoner på 10 :1 av mikroboblesuspensjonen ble tilsatt til hver av væskeprøvene og de resulterende blandingene ble inkubert i 5 minutter før størrelseskarakterisering (Coulter Multisizer Mark II). Aliquots of 10:1 of the microbubble suspension were added to each of the liquid samples and the resulting mixtures were incubated for 5 min before size characterization (Coulter Multisizer Mark II).

I det avgassede miljøet, hvor det ikke var noen grunn til å vente gassdifrusjon fra væsken inn i mikroboblene, var middeldiameteren til mikroboblene l,77:m, og 0,25 % av mikroboblene var større enn 5 :m. I den luftmettede væsken var de tilsvarende verdiene 2,43 :m og 0,67 %. Nye målinger som ble gjort etter 5 minutter tydet på at mikroboblestørrelsen hadde nådd en stabil verdi. In the degassed environment, where there was no reason to expect gas diffusion from the liquid into the microbubbles, the mean diameter of the microbubbles was 1.77 µm, and 0.25% of the microbubbles were larger than 5 µm. In the air-saturated liquid, the corresponding values were 2.43 :m and 0.67%. New measurements taken after 5 minutes indicated that the microbubble size had reached a stable value.

Denne undersøkelsen viser at gjennomsnittsdiameteren til mikroboblene bare økte med 37 % da de ble utsatt for en luftmettet væske tilsvarende arterieblod, og svært få 28 This investigation shows that the average diameter of the microbubbles only increased by 37% when exposed to an air-saturated fluid equivalent to arterial blood, and very few 28

mikrobobler fikk en størrelse som kunne føre til blokkering av kapillærårer. Dette kan sammenliknes med fordoblingen av størrelsen til perfluorheksanholdige mikrobobler i tilsvarende miljø (d.v.s. en sterkt fortynnet dispersjon av mikrobobler i vann med oppløst luft), som er rapportert i eksempel II i WO-A-9503835. microbubbles reached a size that could lead to blockage of capillaries. This can be compared to the doubling of the size of perfluorohexane-containing microbubbles in a similar environment (i.e. a highly dilute dispersion of microbubbles in water with dissolved air), which is reported in Example II of WO-A-9503835.

Eksempel 6 Example 6

Trykkstabiliteten til en dispersjon av perfluorbutanmikrobobler The pressure stability of a dispersion of perfluorobutane microbubbles

Det ble tillaget glass som beskrevet i eksempel 2(a) med lyofilisert materiale under en atmosfære av perfluorbutan. Like før bruk ble det tilsatt vann (2 ml) til glassene for å lage mikrobobledispersjoner. Glass was prepared as described in example 2(a) with lyophilized material under an atmosphere of perfluorobutane. Just before use, water (2 ml) was added to the vials to make microbubble dispersions.

Det ble tatt opp attenueringsspektra for 1,5-8 MHz før, under og etter at det ble satt på overtrykk av luft på 300 mmHg. Trykket ble fjernet etter 90 sekunder. Resultatene er vist på fig. 2 av illustrasjonene, og viser at selv om attenueringen ved 4 MHz (toppen for kontrastmiddel uten trykkbelastning) falt til mindre enn en tredjedel ved overtrykk, ble den nesten fullstendig (85%-95%) gjenopprettet da overtrykket ble fjernet. Attenuation spectra were recorded for 1.5-8 MHz before, during and after an overpressure of air of 300 mmHg was applied. The pressure was removed after 90 seconds. The results are shown in fig. 2 of the illustrations, showing that although the attenuation at 4 MHz (the contrast agent peak without pressure loading) dropped to less than one-third with overpressure, it was almost completely (85%-95%) restored when the overpressure was removed.

Det ble brukt overtrykk av luft på opptil 300 mmHg i 90 sekunders varighet. Attenueringen ble målt ved 3,5 MHz. Resultatene er vist i fig. 3 og tyder på at attenueringen ble godt restituert (minst ca. 95%) etter at trykket ble fjernet for alle de brukte overtrykkverdiene. Overpressure of air of up to 300 mmHg was used for a duration of 90 seconds. The attenuation was measured at 3.5 MHz. The results are shown in fig. 3 and indicates that the attenuation was well restored (at least approx. 95%) after the pressure was removed for all the overpressure values used.

Størrelsesfordelingene ble bestemt ved Coulter-analyse for en prøve som ikke sto under trykk og for prøver som var utsatt for overtrykk av luft på 150 og 300 mmHg i en varighet av 90 sekunder. Resultatene er vist i fig. 4 og tyder på at det ikke var noen signifikante forskjeller mellom fordelingskurvene i området 1-10 :m. The size distributions were determined by Coulter analysis for a sample that was not under pressure and for samples that were exposed to overpressure of air of 150 and 300 mmHg for a duration of 90 seconds. The results are shown in fig. 4 and indicates that there were no significant differences between the distribution curves in the range 1-10 :m.

Claims

1. Contrast agent for use in diagnostic examinations, comprising a dispersion in an injectable aqueous carrier containing microbubbles of biocompatible gas stabilized by amphiphilic material characterized in that the amphiphilic material essentially consists of phospholipids and predominantly of molecules that individually have a net charge.

2. Contrast agent according to claim 1, characterized in that at least 75% of the phospholipid consists of molecules that individually have a net charge.

3. Contrast agent according to claim 1 or 2, characterized in that one or more phosphatidylserines make up at least 70% of the phospholipid.

4. Contrast agent according to one or more of the preceding claims, characterized in that the gas comprises sulfur hexafluoride or a fluorinated hydrocarbon, containing up to 7 carbon atoms.

5. Contrast agent according to claim 4, characterized in that the said gas is perfluorobutane.

6. A process for the production of a contrast agent according to claim 1, characterized in that it consists of the following steps: i) gas is dispersed in an aqueous medium containing an amphiphilic material that essentially consists of phospholipids and predominantly of molecules that individually have a net charge, to form a dispersion of gas microbubbles stabilized by said amphiphilic material, ii) said dispersion is lyophilized in the presence of a cryoprotectant and/or lyoprotectant to obtain a dried product comprising a cryoprotectant and/or lyoprotectant matrix containing biocompatible gas-filled, mainly spherical cavities or vacuoles surrounded by one or more layers of said amphiphilic material and iii) said dried product is reconstituted in an aqueous injectable carrier liquid.

7. A process according to claim 6, characterized in that one or more phosphatidylserines make up at least 70% of the phospholipid.

8. A process according to claim 6 or 7, characterized in that the gas used in step (i) is sulfur hexafluoride or a fluorinated hydrocarbon, containing up to 7 carbon atoms.

9. A process according to claim 8, characterized in that the said gas is perfluorobutane.

10. A process according to one or more of claims 6 to 9, characterized in that the aqueous medium used in step (i) also contains one or more additives selected from among alcohols and polyols.

11. A process according to one or more of claims 6 to 10, characterized in that the dispersion of gas microbubbles formed in step (i) is washed and size fractionated before step (ii).

12. A process according to one or more of claims 6 to 11, characterized in that the said cryoprotectant and/or lyoprotectant is a physiologically acceptable sugar.

13. A process according to claim 12, characterized in that the cryoprotectant and/or the lyoprotectant is sucrose.

14. A freeze-dried microbubble-releasing matrix characterized in that it contains matrix structure material containing a large amount of biocompatible gas-filled predominantly spherical cavities or vacuoles surrounded by one or more layers of amphiphilic material consisting essentially of phospholipids and predominantly of molecules that individually have a net charge .

15. A matrix according to claim 14, characterized in that the structural material in the matrix is a carbohydrate.

16. A matrix according to claim 14 or 15, characterized in that at least 75% of the phospholipid consists of molecules that individually have a net charge.

17. A matrix according to claim 16, characterized in that one or more phosphatidylserines make up at least 70% of the phospholipid.

18. A matrix according to claims 14 to 17, characterized in that the gas comprises sulfur hexafluoride or a fluorinated hydrocarbon, containing up to 7 carbon atoms.

19. A matrix according to claim 18, characterized in that the said gas is perfluorobutane.

20. A contrast agent composition comprising as a first component a matrix as given in claim 17 where the matrix structure material is sucrose and the gas is perfluorobutane, and as a second component an injectable aqueous carrier liquid, and the first and second components are stored respectively in the first and the second chamber of a dual-chamber storage means.