NO313899B1

NO313899B1 - Method for measuring various constituents in organic and biological material

Info

Publication number: NO313899B1
Application number: NO20013387A
Authority: NO
Inventors: Tore Skjetne; Trond E Singstad; Emil Veliyulin; Henrik W Anthonsen
Original assignee: Leiv Eiriksson Nyfotek As
Priority date: 2001-07-09
Filing date: 2001-07-09
Publication date: 2002-12-16
Also published as: NO20013387D0; WO2003006974A1; NO20013387A

Description

Foreliggende oppfinnelsen angår en framgangsmåte for å måle ulike bestanddeler i organisk og biologisk materiale, i samsvar med den innledende delen av patentkrav 1. The present invention relates to a method for measuring various constituents in organic and biological material, in accordance with the introductory part of patent claim 1.

Bakgrunn Background

I ulike prosesser, for eksempel ved framstilling av næringsmiddel for mennesker eller dyr, er det en fordel å måle andelen av ulike bestanddeler, så som vann, fett, protein osv. underveis i prosessen. Dersom disse opplysningene er tilgjengelige umiddelbart, kan prosessen kontinuerlig reguleres slik at den alltid er optimal, for eksempel med hensyn på tilførsel og bruk av råvarer samt energiforbruk. Det er også en fordel å følge produktet fra produksjon til sluttbruker, slik at det i produksjonen kan tas høyde for eventuelle endringer under transport og lagring. In various processes, for example when producing food for humans or animals, it is an advantage to measure the proportion of various components, such as water, fat, protein etc. during the process. If this information is immediately available, the process can be continuously regulated so that it is always optimal, for example with regard to the supply and use of raw materials as well as energy consumption. It is also an advantage to follow the product from production to the end user, so that possible changes during transport and storage can be taken into account in production.

Det finnes flere kjente framgangsmåter for måling av de nevnte bestanddelene. Diffusjons-filtrerte NMR teknikker kan benyttes on-line, og de gir et hurtig svar. Denne framgangsmåten krever imidlertid mye av oppsettet av NMR instrumentet. Gradientene må være godt justert, og diffusjonen vil ikke nødvendigvis alltid være god nok til å skille mellom vann og fett i alle sammensetninger, hvilket vil kunne gi et unøyaktig svar. There are several known procedures for measuring the aforementioned components. Diffusion-filtered NMR techniques can be used on-line, and they give a fast answer. However, this procedure requires a lot of the setup of the NMR instrument. The gradients must be well adjusted, and the diffusion will not necessarily always be good enough to distinguish between water and fat in all compositions, which could give an inaccurate answer.

En annen kjent framgangsmåte er NIR, som også kan benyttes on-line og gir svar forholdsvis fort. I denne framgangsmåten blir det benyttet mye statistisk behandling. Framgangsmåten er imidlertid mindre nøyaktig, svaret er avhengig av at alle prøvene er omtrent like, og framgangsmåten krever svært mye og nøyaktig kalibrering. Another well-known procedure is NIR, which can also be used on-line and gives answers relatively quickly. In this procedure, a lot of statistical processing is used. However, the method is less accurate, the answer depends on all the samples being roughly the same, and the method requires a lot of precise calibration.

Den mest benyttete framgangsmåten per i dag, er sannsynligvis kjemisk analyse. Dette gir et nøyaktig svar, men er en off-line metode som krever mye bearbeiding av prøven, og dermed spesiell kunnskap hos personalet. Det benyttes også løsemidler, hvilket kan bli et miljøproblem. The most widely used procedure as of today is probably chemical analysis. This gives an accurate answer, but is an off-line method that requires a lot of processing of the sample, and thus special knowledge on the part of the staff. Solvents are also used, which can become an environmental problem.

Høy-oppløsnings NMR spektroskopi kan også benyttes, idet den gir nøyaktige svar med mange tilleggsopplysninger om molekylære og metabolske forhold. Det er imidlertid en kostbar framgangsmåte som er vanskelig å ha online. Den krever dessuten en spesialutdannet stab. High-resolution NMR spectroscopy can also be used, as it provides accurate answers with a lot of additional information about molecular and metabolic conditions. However, it is an expensive procedure that is difficult to have online. It also requires specially trained staff.

NMR analysatorer gir et vidt spekter raske og nøyaktige analyser, som ikke ødelegger prøven. Med nye automatiserte NMR instrument, kan analysene utføres av nærmest hvem som helst. De dekker omtrent alle behov for eksperimentell bestemmelse av fett, og vanninnhold. Bestemmelse av fettinnhold i prøver som inneholder lite fritt vann (for eksempel fiskefor) med et NMR instrument, baseres på det faktum at amplituden av det observerte proton-NMR signalet er direkte proporsjonal med mengden hydrogen-atomer som er tilstede i prøven. Det ukjente fettinnholdet beregnes deretter ved å kalibrere instrumentet mot referanser med kjent fettinnhold. Ved bruk av en kalibreringskurve kan fettinnholdet i en ukjent prøve enkelt og lett bestemmes på mindre enn ett minutt. En slik kjent NMR teknikk er "spin-echo" som blant annet beskrevet av H. Friebolin, "Basic One- and Two-Dimensional NMR Spectroscopy", WILEY-VCH Verlag GmbH, 1998, p.173-175, tatt med her ved referanse. NMR analyzers provide a wide range of fast and accurate analyses, which do not destroy the sample. With new automated NMR instruments, the analyzes can be performed by almost anyone. They cover almost all needs for the experimental determination of fat and water content. Determination of fat content in samples containing little free water (for example fish feed) with an NMR instrument is based on the fact that the amplitude of the observed proton NMR signal is directly proportional to the amount of hydrogen atoms present in the sample. The unknown fat content is then calculated by calibrating the instrument against references with known fat content. By using a calibration curve, the fat content of an unknown sample can be easily and easily determined in less than a minute. One such known NMR technique is "spin-echo" as described, among other things, by H. Friebolin, "Basic One- and Two-Dimensional NMR Spectroscopy", WILEY-VCH Verlag GmbH, 1998, p.173-175, included here by reference.

Den nevnte framgangsmåten er svært sensitiv, og godt egnet for system som fiskefor, som vanligvis inneholder svært lite fritt vann. En liten mengde resterende vann etter tørkingen er svært bundet til resten, og vil derfor ikke bidra til amplituden av det observerte signalet, fordi inter-aksjonen mellom vannet og de faste forbindelsene fører til at vannet får en vesentlig kortere relaksasjonstid enn fettet. Den nevnte NMR teknikken er lite egnet til å skille mellom fett og vann i biologisk materiale, i de tilfeller vann-mengden er stor. The mentioned procedure is very sensitive, and well suited for systems such as fish feed, which usually contain very little free water. A small amount of remaining water after drying is highly bound to the residue, and will therefore not contribute to the amplitude of the observed signal, because the interaction between the water and the solid compounds causes the water to have a significantly shorter relaxation time than the fat. The aforementioned NMR technique is not suitable for distinguishing between fat and water in biological material, in cases where the amount of water is large.

Deteksjon av NMR signal fra store og immobiliserte molekyler, så som proteiner, har alltid vært et utfordrende eksperimentelt arbeid. Disse store molekylene har ekstremt korte NMR relaksasjonstider, og hoveddelen av NMR instrumentene er ikke i stand til å gi pålitelige kvantitative målinger av slike signal med den enkle spin-echo teknikken beskrevet ovenfor, hoved-sakelig på grunn av fysiske begrensinger i deteksjons-elektronikken (mottaker dødtid). Detection of NMR signals from large and immobilized molecules, such as proteins, has always been a challenging experimental task. These large molecules have extremely short NMR relaxation times, and the majority of NMR instruments are unable to provide reliable quantitative measurements of such signals with the simple spin-echo technique described above, mainly due to physical limitations in the detection electronics ( recipient death time).

Ved 'HNMR (Hydrogen Nuclear Magnetic Resonance) målinger i organiske systemer, vil vann og fett opptre som løste stoffer. Dette skyldes sannsynligvis at fett vanligvis opptrer i fettperler. Proteiner og karbohydrater opptrer derimot som fastere forbindelser. Dette resulterer i at magnetisk polarisering i vann og fett vil gå tilbake til normaltilstand saktere enn magnetisk polarisering i protem og karbohydrater. During HNMR (Hydrogen Nuclear Magnetic Resonance) measurements in organic systems, water and fat will act as dissolved substances. This is probably because fat usually occurs in fat beads. Proteins and carbohydrates, on the other hand, act as firmer compounds. This results in magnetic polarization in water and fat returning to normal more slowly than magnetic polarization in proteins and carbohydrates.

En annen kjent teknikk for måling av singelkvante-overganger, er "solid-echo" som blant annet beskrevet av Paul T. Callaghan, "Principles of NMR Microscopy", Clarendon Press, Oxford, 1991, p.84-85, tatt med her ved referanse. I "solid-echo" sendes to pulser etter hverandre så snart som systemet tillater. Deretter tas det opp et NMR signal. Denne teknikken gir et godt definert 'HNMR-signal, hvor høyden av 'HNMR-signalet er direkte proporsjonal med den totale mengden forbindelser i prøven (både faste og mobile). Samtidig tillater formen på kurven av det observerte NMR signalet å skille mellom respons av fastere molekyler som proteiner og karbohydrater og respons av mobile molekyler som vann og fett, og kan derfor benyttes for å kvantifisere begge. Another known technique for measuring single quantum transitions is "solid-echo" as described, among others, by Paul T. Callaghan, "Principles of NMR Microscopy", Clarendon Press, Oxford, 1991, p.84-85, incorporated herein by reference. In "solid-echo", two pulses are sent one after the other as soon as the system allows. An NMR signal is then recorded. This technique provides a well-defined 'HNMR signal, where the height of the 'HNMR signal is directly proportional to the total amount of compounds in the sample (both fixed and mobile). At the same time, the shape of the curve of the observed NMR signal allows to distinguish between the response of more solid molecules such as proteins and carbohydrates and the response of mobile molecules such as water and fat, and can therefore be used to quantify both.

I 'HNMR-undersøkelser vil begge hydrogenatomene i vann opptre identiske så lenge molekylet har frihet til bevegelse (på molekylært nivå). Det gjør at vann bare har en kvante-overgang og derved bare gir signal ved singel-kvante 'HNMR som er det vanlige eksperimentet. Flere påfølgende eksitasjoner kan indusere overganger av høyere orden. For molekyler med hydrogen i ulike magnetiske omgivelser, slik det vil være for CH2-grupper blant annet i fett og proteiner, er det mulig å skape flere kvantesprang. Den enkleste teknikken er dobbel-kvanter eller to endringer av spinn-kvante-nummeret i samme molekylsystem, som for eksempel oppnås med "double quantum" teknikken, som blant annet beskrevet av P. Granger and R. Harris, "Multinuclear Magnetic Resonance in Liquids and Solids - Chemical Applications", Kluwer Academic Publishers, 1990, p. 103-129, tatt med her ved referanse. Denne teknikken lukker for observasjon av singelkvante-overganger og åpner for observasjon av alle høyere kvantesprang. Enkle kvante-signaler eller koherens oppstår med én hastighet etter eksitasjon, doble kvante-signal utvikles med to ganger denne hastigheten, og derfor vil disse signalene separeres på et ordnet sett, som kan benyttes for å se det ene og ikke det andre. Derved er det mulig å skille vann-signalet fra signalet fra resten av molekylmassen i en rekke stoffer fra næringsmidler (animalske og vegetabile), petroleums-produkter, kjemiske produkter o.s.v. Teknikken kan også benyttes in vivo i mennesker og dyr. In HNMR investigations, both hydrogen atoms in water will behave identically as long as the molecule has freedom of movement (at the molecular level). This means that water only has one quantum transition and thereby only gives a signal in single-quantum HNMR, which is the usual experiment. Several successive excitations can induce higher order transitions. For molecules with hydrogen in different magnetic environments, as will be the case for CH2 groups in fats and proteins, for example, it is possible to create several quantum leaps. The simplest technique is double-quantum or two changes of the spin-quantum number in the same molecular system, which is for example achieved with the "double quantum" technique, as described among others by P. Granger and R. Harris, "Multinuclear Magnetic Resonance in Liquids and Solids - Chemical Applications", Kluwer Academic Publishers, 1990, pp. 103-129, incorporated herein by reference. This technique closes the observation of single quantum transitions and opens the observation of all higher quantum leaps. Single quantum signals or coherence occur at one speed after excitation, double quantum signals develop at twice this speed, and therefore these signals will be separated on an ordered set, which can be used to see one and not the other. Thereby, it is possible to separate the water signal from the signal from the rest of the molecular mass in a number of substances from foodstuffs (animal and vegetable), petroleum products, chemical products, etc. The technique can also be used in vivo in humans and animals.

Alle molekyler kan imidlertid ikke gi kvante-koherens av høyere grad. Molekyl som vann, hydrogengass, metan, og etan, hvor hvert hydrogen-atom er kjemisk og magnetisk likt, kan bare oppvise enkle eller ingen kvante-eksitasjoner. Molekyler som fett, olje, karbohydrater, proteiner osv, hvor molekylet inneholder et antall forskjellige kjerner, vil kunne gi overganger av høyere orden, og kan gi observerbare flerkvante 'HNMR-signal dersom observasjonen blir korrekt utformet. However, not all molecules can provide quantum coherence of a higher order. Molecules such as water, hydrogen gas, methane, and ethane, where each hydrogen atom is chemically and magnetically identical, can exhibit only single or no quantum excitations. Molecules such as fat, oil, carbohydrates, proteins, etc., where the molecule contains a number of different nuclei, will be able to produce transitions of a higher order, and can produce an observable multi-quantum HNMR signal if the observation is designed correctly.

Siden dobbelkvantesprang er sjeldnere enn enkeltkvantesprang, blir signal/støy forholdet i teknikken lavere enn ved enkeltoverganger, og selektiviteten gjør at teknikken har stort kommersielt potensiale. Når metoden bygges sammen med dedikert opptaksutstyr kan dette bli en kraftfull teknikk for industri og diagnostisering. Since double quantum leaps are rarer than single quantum leaps, the signal/noise ratio in the technique is lower than with single transitions, and the selectivity means that the technique has great commercial potential. When the method is built together with dedicated recording equipment, this can become a powerful technique for industry and diagnostics.

Formål Purpose

Hovedformålet med foreliggende oppfinnelse er å framskaffe en framgangsmåte for å måle mengden av ulike bestanddeler i organisk og biologisk materiale raskt og nøyaktig. Det er videre et formål at framgangsmåten ikke krever spesialutdannet personale, kostbart utstyr, eller er plasskrevende. The main purpose of the present invention is to provide a method for measuring the amount of various constituents in organic and biological material quickly and accurately. It is also an aim that the procedure does not require specially trained staff, expensive equipment, or is space-consuming.

Oppfinnelse Invention

Formålet nås med en framgangsmåte i samsvar med den karakteriserende delen av patentkrav 1. Ytterligere fordelaktige trekk framgår av de uselvstendige kravene. The purpose is achieved with a procedure in accordance with the characterizing part of patent claim 1. Further advantageous features appear from the non-independent claims.

Oppfinnelsen vil i det følgende beskrives nærmere med henvisning til vedlagte figurer, hvor The invention will be described in more detail below with reference to the attached figures, where

- figur 1 viser 'HNMR "solid-echo" puls-sekvensen og tilhørende NMR-signal, - figure 1 shows the 'HNMR "solid-echo" pulse sequence and associated NMR signal,

- figur 2 viser 'HNMR puls-sekvensen og tilhørende respons for dobbel kvante-eksitasjon, ("double quantum" teknikk), - figur 3 viser en kurve over fett-innhold i et antall melkeprøver, hvor 'HNMR "double quantum" målinger og konvensjonelle målinger er plottet mot hverandre, - figur 4 viser en kurve over fett-innhold i et antall prøver, hvor 'HNMR spin-echo målinger og konvensjonelle målinger er plottet mot hverandre, - figur 5 viser en kurve over protein-innhold i et antall prøver, hvor 'HNMR "solid-echo" målinger og konvensjonelle målinger er plottet mot hverandre, - figur 6 viser en kurve over vann-innhold i et antall prøver, hvor vanninnhold beregnet ut fra en 'HNMR "solid-echo" puls-sekvens og en 'HNMR "spin-echo" puls-sekvens, er plottet mot konvensjonelle målinger. - figure 2 shows the 'HNMR pulse sequence and associated response for double quantum excitation, ("double quantum" technique), - figure 3 shows a curve of fat content in a number of milk samples, where 'HNMR "double quantum" measurements and conventional measurements are plotted against each other, - figure 4 shows a curve over fat content in a number of samples, where 'HNMR spin-echo measurements and conventional measurements are plotted against each other, - figure 5 shows a curve over protein content in a number samples, where 'HNMR "solid-echo" measurements and conventional measurements are plotted against each other, - figure 6 shows a curve of water content in a number of samples, where water content is calculated from a 'HNMR "solid-echo" pulse sequence and a 'HNMR "spin-echo" pulse sequence, are plotted against conventional measurements.

Dersom en prøve innholder både fast protein og fett (som vil opptre som løst), representerer det observerte "solid-echo" 'HNMR-signalet en overlagring det vil si en kombinasjon av bidragene. 'HNMR puls-sekvensen og en slik blandings-respons (både ekko fra "fast" og "flytende") er vist skjematisk i figur 1. Figuren viser "solid-echo" 'HNMR, omfattende to { k/ 2) pulser med henholdsvis 0° og 90° faser, med en tid x mellom pulsene. Det kan selvsagt benyttes andre pulser og faser for å oppnå det samme resultatet, hvilket vil være kjent for en fagperson, x-tiden skal være så kort som mulig, men ikke kortere enn dødtiden på NMR instrumentet (x =28 s i et instrument som ble brukt i foreliggende oppfinnelse). Dødtiden er den tiden man bør vente etter en RF puls før NMR signal kan detekteres. Deteksjon av signalet er ikke mulig på et tidligere tidspunkt pga utslag av eksitasjonspuls som fortsetter å "leve" i dødtidsperioden og dette kan ødelegge det observerte signalet. Dødtiden vil variere fra 'HNMR-system til 'HNMR-system. If a sample contains both solid protein and fat (which will act as dissolved), the observed "solid-echo" HNMR signal represents a superimposition, that is to say a combination of the contributions. The 'HNMR pulse sequence and such a mixture response (both echoes from "solid" and "liquid") is shown schematically in figure 1. The figure shows "solid-echo" 'HNMR, comprising two { k/ 2) pulses with respectively 0° and 90° phases, with a time x between the pulses. Of course, other pulses and phases can be used to achieve the same result, which will be known to a professional, the x time must be as short as possible, but not shorter than the dead time on the NMR instrument (x =28 s in an instrument that was used in the present invention). The dead time is the time one should wait after an RF pulse before the NMR signal can be detected. Detection of the signal is not possible at an earlier time due to the effect of the excitation pulse which continues to "live" during the dead time period and this can destroy the observed signal. The dead time will vary from 'HNMR system to 'HNMR system.

'HNMR signalet fra solid-echo teknikken er som nevnt en kombinasjon av signalet fra faste forbindelser (protein) og flytende forbindelser (fett og vann) (se figur 1). Signalet vil i de fleste tilfeller først øke litt, deretter i kort tid flate ut, og endelig avta forholdsvis raskt. Etter en tid oppstår en endring i hastigheten hvorved signalet avtar, og følgelig oppstår et knekkpunkt 1 i signal versus tid kurven. Mengden faste forbindelser vil være proporsjonal med høyden 2 av signalet fra knekkpunkt til max-verdi, mens mengden flytende forbindelser vil være proporsjonal med høyden 3 av signalet ved knekkpunkt. For de fleste prøver vil mengden flytende forbindelser være summen av fett og vann, og høyden 3 av signalet vil dermed være proporsjonal med summen av mengden fett- og vann. As mentioned, the HNMR signal from the solid-echo technique is a combination of the signal from solid compounds (protein) and liquid compounds (fat and water) (see figure 1). In most cases, the signal will first increase slightly, then flatten out for a short time, and finally decrease relatively quickly. After a time, a change occurs in the speed whereby the signal decreases, and consequently a breaking point 1 occurs in the signal versus time curve. The amount of solid compounds will be proportional to the height 2 of the signal from breaking point to max value, while the amount of liquid compounds will be proportional to the height 3 of the signal at breaking point. For most samples, the amount of liquid compounds will be the sum of fat and water, and the height 3 of the signal will thus be proportional to the sum of the amount of fat and water.

Signalet fra de faste forbindelsene vil ofte være signal fra proteiner, men kan også inneholde signal fra andre fast-fase komponenter, så som karbohydrater. Å skille mellom proteiner og andre faste forbindelser kan være nødvendig for å følge ekstra godt med i noen produksjons-systemer, og resultatene i samsvar med foreliggende oppfinnelse har vist seg å være gode for bestemmelse av protein f.eks. i fiskefor. The signal from the solid compounds will often be a signal from proteins, but may also contain a signal from other solid-phase components, such as carbohydrates. Distinguishing between proteins and other solid compounds may be necessary to monitor extra closely some production systems, and the results in accordance with the present invention have proven to be good for determining protein, e.g. in fish feed.

Deteksjon av 'HNMR signal fra fett i et system med høyt vanninnhold krever en annen teknikk. Når en puls-sekvens utformes med egnete forsinkelser, vil et flerkvante 'HNMR-signal bare inneholde signal fra mobile molekyler med magnetisk forskjellige kjerner. Dette vil, for et stort antall produkter, gi et svært nøyaktig mål for fett, selv i nærvær av mye vann. En slik teknikk er "double quantum", som omtalt ovenfor. Denne teknikken kan ha to ulike modifikasjoner, den ene benytter sykling av faser på RF pulser (16 ulike kombinasjoner) for å undertrykke vannsignal fra prøven, mens den andre modifikasjonen benytter eksterne magnetiske gradienter for å oppnå samme resultat. I de tilfeller forskjellige 'HNMR-signal blir summert sammen, må fasene for pulsene endres for å fa dobbelt kvante koherensen uten forstyrrelse fra andre signal. Dersom magnetfelt-gradienter er tilgjengelig, kan antallet 'HNMR-signal reduseres uten at det forstyrrer resultatet. Et mulig prosessforløp med magnet-gradienter er vist i figur 2. Den teknikken som benytter eksterne magnetiske gradienter, er mindre krevende for utstyrets hardware og er derfor mer robust og enklere å implementere på et lavfelt NMR imstrument. Detection of the HNMR signal from fat in a system with a high water content requires a different technique. When a pulse sequence is designed with suitable delays, a multiquantum 'HNMR signal will only contain signal from mobile molecules with magnetically different nuclei. This will, for a large number of products, give a very accurate measure of fat, even in the presence of a lot of water. One such technique is "double quantum", as discussed above. This technique can have two different modifications, one uses cycling of phases on RF pulses (16 different combinations) to suppress water signal from the sample, while the other modification uses external magnetic gradients to achieve the same result. In the cases where different 'HNMR signals are summed together, the phases of the pulses must be changed to obtain double quantum coherence without interference from other signals. If magnetic field gradients are available, the number of HNMR signals can be reduced without disturbing the result. A possible process sequence with magnetic gradients is shown in figure 2. The technique that uses external magnetic gradients is less demanding on the equipment's hardware and is therefore more robust and easier to implement on a low-field NMR instrument.

Prossessforløpet, slik det er vist i figur 2, omfatter to (7i/2) RF pulser med mellomrom på d0=l/(4J) (J er koplingskonstant i fettmolekyler i Hz) med følgende ( n) , ( n/ 2) og ( n) RF pulser som alle har lik tidsavstand d, fra hverandre (alle pulser ved 0° phase). Etter tidsforsinkelse d, observeres det ett signal/ekko, hvor høyden 4 av amplituden er proporsjonal med fett/olje mengde i prøven. Mellom tredje og fjerde puls i puls-sekvensen er det en magnetisk gradient Gl som slås på og av. Samme magnetiske gradient slås på og av mellom siste (femte) RF puls og observerte signal. The process sequence, as shown in Figure 2, comprises two (7i/2) RF pulses with an interval of d0=l/(4J) (J is the coupling constant in fat molecules in Hz) with the following ( n) , ( n/ 2) and ( n) RF pulses that all have the same time distance d, from each other (all pulses at 0° phase). After a time delay d, one signal/echo is observed, where the height 4 of the amplitude is proportional to the amount of fat/oil in the sample. Between the third and fourth pulse in the pulse sequence, there is a magnetic gradient Gl which is switched on and off. The same magnetic gradient is switched on and off between the last (fifth) RF pulse and the observed signal.

En kombinasjon av teknikkene, dvs. "spin-echo" 'HNMR, for måling av summen av fett og A combination of the techniques, i.e. "spin-echo" 'HNMR, for measuring the sum of fat and

vann (eller mengden fett i de prøver det er lite fritt vann), "double quantum" 'HNMR for måling av bare fett, og "solid-echo" 'HNMR for måling av protein og karbohydrater (og samtidig summen av vann og fett), samt riktig valg av forsinkelser i puls-sekvensene, tillater bestemmelse av mengden fett, vann, protein og karbohydrater i et stort antall produkter før, under og etter et prosess-trinn i en framstillingsprosess. Dette er vist i sammendrag i tabell 1. Tilsvarende for andre NMR-system, må høyden av signal-amplitudene regnes om til mengde av forbindelsene ved hjelp av kalibrerings-kurver. water (or the amount of fat in samples with little free water), "double quantum" 'HNMR for measuring only fat, and "solid-echo" 'HNMR for measuring protein and carbohydrates (and at the same time the sum of water and fat) , as well as the correct choice of delays in the pulse sequences, allow determination of the amount of fat, water, protein and carbohydrates in a large number of products before, during and after a process step in a manufacturing process. This is shown in summary in table 1. Similarly for other NMR systems, the height of the signal amplitudes must be converted to the quantity of the compounds using calibration curves.

Som angitt i tabell 1, kan både "spin-echo" og "double quantum" teknikk benyttes for å måle mengden fett i prøver med lite vann. Imidlertid er instrument typer som kan utføre "double quantum" teknikk mer komplekse i oppbygging og dyrere i innkjøp, og det vil derfor være en fordel å bare benytte "solid-echo" i stedet for "double quantum". Det kan være en fordel å benytte en kombinasjon av "spin-echo", "solid-echo" og "double quantum" teknikker for alle prøvene for å sikre best mulig resultat, men det vil i praksis medføre unødvendige kostnader. Videre kan både "spin-echo" og "solid-echo" teknikker benyttes for å måle summen av fett og vann i prøver med mye vann. Ettersom "solid-echo" puls-sekvensen er nødvendig for å oppnå et mål på protein-mengden, kan "spin-echo" puls-sekvensen utelates. For å sikre best resultat er det imidlertid en fordel at den utføres. As indicated in Table 1, both "spin-echo" and "double quantum" techniques can be used to measure the amount of fat in samples with little water. However, instrument types that can perform "double quantum" technique are more complex in construction and more expensive to purchase, and it would therefore be an advantage to only use "solid-echo" instead of "double quantum". It may be advantageous to use a combination of "spin-echo", "solid-echo" and "double quantum" techniques for all samples to ensure the best possible result, but in practice this will entail unnecessary costs. Furthermore, both "spin-echo" and "solid-echo" techniques can be used to measure the sum of fat and water in samples with a lot of water. As the "solid-echo" pulse sequence is necessary to obtain a measure of the protein amount, the "spin-echo" pulse sequence can be omitted. However, to ensure the best result, it is an advantage that it is carried out.

I prøver med lite vann, kan altså "spin-echo" teknikk benyttes for å måle fett, mens "solid-echo" kan benyttes for å måle protein samt summen av fett og vann. Mengden vann kan dermed beregnes ved å subtrahere amplitude-høyden av signalet fra "spin-echo" puls-sekvensen, fra høyden 3 (se figur 1) av signalet fra "solid-echo" puls-sekvensen (som er proporsjonalt med mengden flytende forbindelser, dvs fett og vann), og deretter regne om differansen til vannmengde ved hjelp av en kalibreringskurve. Mengden fett beregnes fra amplitude-høyden av signalet fra "spin-echo" puls-sekvensen og en fett-kalibreringskurve, mens mengden protein beregnes fra høyden 2 (se figur 1) av signalet fra "solid-echo" puls-sekvensen (som er proporsjonal med alle faste forbindelser) og en protein-kalibreringskurve. In samples with little water, the "spin-echo" technique can therefore be used to measure fat, while "solid-echo" can be used to measure protein as well as the sum of fat and water. The amount of water can thus be calculated by subtracting the amplitude height of the signal from the "spin-echo" pulse sequence, from the height 3 (see Figure 1) of the signal from the "solid-echo" pulse sequence (which is proportional to the amount of liquid compounds , i.e. fat and water), and then calculate the difference to the amount of water using a calibration curve. The amount of fat is calculated from the amplitude height of the signal from the "spin-echo" pulse sequence and a fat calibration curve, while the amount of protein is calculated from the height 2 (see Figure 1) of the signal from the "solid-echo" pulse sequence (which is proportional to all solid compounds) and a protein calibration curve.

I prøver med mye vann, kan "double quantum" teknikk benyttes for å måle fett, mens mengden protein og summen av fett og vann måles med "solid-echo" teknikk. Mengden vann kan i disse prøvene beregnes ved å subtrahere amplitude-høyden 4 (se figur 2) av signalet fra "double quantum" puls-sekvensen, fra høyden 3 (se figur 1) av signalet fra "solid-echo" puls-sekvensen (som er proporsjonal med mengden flytende forbindelser), og regne om differansen til vannmengde ved hjelp av en kalibreringskurve. Mengden fett beregnes fra amplitude-høyden 4 (se figur 2) av signalet fra "double quantum" puls-sekvensen ved hjelp av en fett-kalibreringskurve, og protein-mengden beregnes som for prøver med lite vann. In samples with a lot of water, the "double quantum" technique can be used to measure fat, while the amount of protein and the sum of fat and water are measured with the "solid-echo" technique. The amount of water in these samples can be calculated by subtracting the amplitude height 4 (see figure 2) of the signal from the "double quantum" pulse sequence, from the height 3 (see figure 1) of the signal from the "solid-echo" pulse sequence ( which is proportional to the amount of liquid compounds), and calculate the difference to the amount of water using a calibration curve. The amount of fat is calculated from the amplitude height 4 (see figure 2) of the signal from the "double quantum" pulse sequence using a fat calibration curve, and the amount of protein is calculated as for samples with little water.

En fagperson vil i de aller fleste tilfeller vite hvorvidt en prøve inneholder mye vann eller ikke. Dersom dette ikke er sikkert, eller det er et tvilstilfelle, kan framgangsmåten for måling av prøver med mye vann, det vil si en kombinasjon av "double quantum" og solid-echo, benyttes, fordi denne vil gi riktig svar uansett hvor mye vann prøven inneholder. In the vast majority of cases, a professional will know whether a sample contains a lot of water or not. If this is not certain, or there is a case of doubt, the procedure for measuring samples with a lot of water, i.e. a combination of "double quantum" and solid-echo, can be used, because this will give the correct answer regardless of how much water the sample contains.

Framgangsmåten kan drives "at line" og har vist seg å være svært robust og enkel i bruk, når disse applikasjonene er en del av instrumentene. Ved betjening av instrumentene, må bare start-knappen trykkes inn, og en datamaskin som er koblet til systemet vil holde orden på prosess-parameterene. Prosessen kan dermed optimaliseres med hensyn på kostnader, effektivitet og nøyaktighet/reproduserbarhet. The procedure can be operated "at line" and has proven to be very robust and easy to use, when these applications are part of the instruments. When operating the instruments, just press the start button, and a computer connected to the system will keep track of the process parameters. The process can thus be optimized with regard to costs, efficiency and accuracy/reproducibility.

Framgangsmåten i samsvar med foreliggende oppfinnelse er anvendelig på ethvert komplekst system, og fordi signal fra vann i prøven effektivt kan undertrykkes med "double quantum" teknikk, kan fettinnholdet måles nøyaktig. Den ukjente mengden fett i prøven beregnes ved kalibrering av 'HNMR-signalet mot et sett referanseprøver, hvor fettinnholdet er kjent. En rekke slike kalibrerings-prosedyrer, utført ved SINTEF Unimed MR senteret (Trondheim, Norge) har vist veldig god reproduserbarhet av resultatene. Figur 3 viser en kalibreringskurve basert på 5 referanse-prøver, 2 paralleller av hver. Tilpasning av de eksperimentelle punktene gir en korrelasjons-faktor på 0.9998, hvilket viser utmerket samsvar mellom resultatet fra framgangsmåten i samsvar med foreliggende oppfinnelse, og kjent innhold. Ved bruk av kalibreringskurven kan fettinnholdet i en ukjent prøve bestemmes under ett minutt. Separate kalibreringskurver for materialer av svært ulike opphav kan bli nødvendig. The method according to the present invention is applicable to any complex system, and because the signal from water in the sample can be effectively suppressed with the "double quantum" technique, the fat content can be measured accurately. The unknown amount of fat in the sample is calculated by calibrating the HNMR signal against a set of reference samples, where the fat content is known. A number of such calibration procedures, carried out at the SINTEF Unimed MR center (Trondheim, Norway) have shown very good reproducibility of the results. Figure 3 shows a calibration curve based on 5 reference samples, 2 parallels of each. Adaptation of the experimental points gives a correlation factor of 0.9998, which shows excellent agreement between the result from the method in accordance with the present invention and known content. By using the calibration curve, the fat content of an unknown sample can be determined in under one minute. Separate calibration curves for materials of very different origins may be necessary.

Oppfinnelsen vil i det følgende beskrives med en sammenligningsanalyse, hvor resultat fra kjente målemetoder blir sammenlignet med resultater fra framgangsmåten i samsvar med foreliggende oppfinnelse. In the following, the invention will be described with a comparative analysis, where results from known measurement methods are compared with results from the method in accordance with the present invention.

Sammenligningsanalyse. Comparative analysis.

Fett-, vann- og proteininnhold i 26 prøver ble bestemt av Felleskjøpet AS (Trondheim, Norge) og Norsk Matanalyse AS (Oslo, Norge) ved hjelp av kjente kjemiske framgangsmåter: Biichi-Caviezel for bestemmelse av fett og AOAC 981.10 (1983), for bestemmelse av proteiner. Biichi-Caviezel ble utført på BUCHI B-815/B-820, i samsvar med BUCHI Instructions, Fat determination B-820, Version C, 96571 (1996) og BUCHI Fat Determination system B-815/B-820. Method, Version B, 95668 (1995). Bestemmelse av proteiner var utført på et Kjeltec 2400 (Kjeltab S tabletter) instrument, med kjøttbasert sertifisert referansemateriale (SMRI 94-1, kjøttbasert). Resultatene er vist i tabell 3 og figur 4, 5 og 6. Vann-innholdet ble bestemt ved våtkjemisk standard metode NMKL 23. Fat, water and protein content in 26 samples was determined by Felleskjøpet AS (Trondheim, Norway) and Norsk Matanalyse AS (Oslo, Norway) using known chemical methods: Biichi-Caviezel for determination of fat and AOAC 981.10 (1983), for the determination of proteins. Biichi-Caviezel was performed on BUCHI B-815/B-820, in accordance with BUCHI Instructions, Fat determination B-820, Version C, 96571 (1996) and BUCHI Fat Determination system B-815/B-820. Method, Version B, 95668 (1995). Determination of proteins was carried out on a Kjeltec 2400 (Kjeltab S tablets) instrument, with meat-based certified reference material (SMRI 94-1, meat-based). The results are shown in table 3 and figures 4, 5 and 6. The water content was determined by wet chemical standard method NMKL 23.

'HNMR-signalet for mengden fett og vann, samt protein ('HNMR Signal / Prøvevekt) i disse prøvene (med nøyaktig kjent fett- og proteininnhold) ble deretter målt i samsvar med foreliggende oppfinnelse, på et Bruker minispec mq20 'HNMR instrument, bistillingene på instrumentet er vist i tabell 2. 'The HNMR signal for the amount of fat and water, as well as protein ('HNMR Signal / Sample weight) in these samples (with precisely known fat and protein content) was then measured in accordance with the present invention, on a Bruker minispec mq20 'HNMR instrument, the bipositions on the instrument is shown in table 2.

"Spin-echo" puls-sekvensen slik den var implementert og testet ut, omfattet en enkel jt/2 RF-puls ved 0°-fase, og en % puls ved 0°-fase, og "solid-echo" puls-sekvensen omfattet to (7t/2) RP-pulser ved henholdsvis 0°- og 90°-fase, oppholdstiden mellom pulsene var lengre enn eller lik dødtiden i 'HNMR-apparatet. "Double quantum" puls-sekvensen, slik den var implementert og testet ut, omfattet to (7t/2) RF pulser med mellomrom på d0=l/(4J) (J er koplingskonstant i fettmolekyler i Hz) med følgende (rc), (7t/2) og (rc) RF pulser som alle hadde lik tidsavstand dl fra hverandre (alle pulser ved 0° fase). Mellom tredje og fjerde puls i puls-sekvensen ble en magnetisk gradient Gl slått på og av. Samme magnetiske gradient ble slått på og av mellom siste (femte) RF puls og observerte signal. Etter en tidsforsinkelse d, ble det observert et signal som et mål for fett/ olje mengden i prøven. "Spin-echo", "solid-echo" og "double quantum" puls-sekvensene kan omfatte andre pulser og framgangsmåter i samsvar med kjent teknikk, og vil være kjent for en fagperson. The "spin-echo" pulse sequence as implemented and tested comprised a single jt/2 RF pulse at 0° phase, and a % pulse at 0° phase, and the "solid-echo" pulse sequence comprised two (7h/2) RP pulses at 0° and 90° phase respectively, the residence time between the pulses was longer than or equal to the dead time in the 'HNMR apparatus. The "double quantum" pulse sequence, as it was implemented and tested, comprised two (7t/2) RF pulses spaced at d0=l/(4J) (J is the coupling constant in fat molecules in Hz) with the following (rc), (7t/2) and (rc) RF pulses that all had the same time distance dl from each other (all pulses at 0° phase). Between the third and fourth pulses in the pulse sequence, a magnetic gradient Gl was switched on and off. The same magnetic gradient was switched on and off between the last (fifth) RF pulse and the observed signal. After a time delay d, a signal was observed as a measure of the amount of fat/oil in the sample. The "spin-echo", "solid-echo" and "double quantum" pulse sequences may include other pulses and procedures in accordance with the known art, and will be known to a person skilled in the art.

Resultatene både fra de kjemiske og NMR-målingene vist i tabell 3 samt figur 4, 5 og 6. The results from both the chemical and NMR measurements shown in table 3 and figures 4, 5 and 6.

Figurene viser målte [Signal/Vekt] verdier for henholdsvis protein, fett og vann fremstilt som funksjon av kjemisk bestemte mengder i tilsvarende prøver. Alle kurvene er tilpasset en lineær funksjon. The figures show measured [Signal/Weight] values for protein, fat and water respectively produced as a function of chemically determined amounts in corresponding samples. All curves are fitted to a linear function.

Korrelasjonsfaktoren for fett-kurven var ca. 0,9986, for protein var den ca 0,9677, og for vann var den ca 0,8209 hvilket antyder samsvar mellom framgangsmåtene for måling av fett- protein og vann-innhold i prøvene. The correlation factor for the fat curve was approx. 0.9986, for protein it was about 0.9677, and for water it was about 0.8209, which suggests agreement between the procedures for measuring fat, protein and water content in the samples.

Etter en slik kalibrering mot et sett prøver med kjent protein-, (fett+vann)- og fett-innhold kan framgangsmåten i samsvar med foreliggende oppfinnelse anvendes for å bestemme protein-, fett- og vanninnhold i ukjente prøver samtidig, på under 1 minutt. After such a calibration against a set of samples with known protein, (fat+water) and fat content, the method in accordance with the present invention can be used to determine protein, fat and water content in unknown samples at the same time, in less than 1 minute .

Ovenfor er det beskrevet bruk av tre 'HNMR puls-sekvenser for å måle mengde fett, vann og protein i heterogene biologiske forbindelser. Det vil være opplagt for en fagmann at med svært enkle modifiseringer kan framgangsmåten benyttes for å måle andre bestanddeler. Above is described the use of three HNMR pulse sequences to measure the amount of fat, water and protein in heterogeneous biological compounds. It will be obvious to a person skilled in the art that, with very simple modifications, the procedure can be used to measure other components.

Claims

1. Procedure for measuring various components in organic and biological material, using NMR and calibration curves, as pre-treatment of the sample is unnecessary, characterized in that the procedure includes -analysis in an NMR instrument where for samples with little water a "spin-echo" pulse sequence and a "solid-echo" pulse sequence is performed, and for samples with a lot of water a "solid -echo" pulse sequence and a "double quantum" pulse sequence, after which the obtained NMR signals are recorded, and - processing of the obtained signals in a computer.

2. Procedure in accordance with claim 1, characterized in that the procedure comprises a "spin-echo" pulse sequence, a "solid-echo" pulse sequence, and a "double quantum" pulse sequence, for all samples.

3. Procedure in accordance with claim 1 or 2, characterized in that the "spin-echo" pulse sequence comprises a single n/l RF pulse at 0° phase, and a 7i pulse at 0° phase.

4. Procedure in accordance with claim 1 or 2, characterized in that the "solid-echo" pulse sequence comprises two (n/2) RF pulses at 0° and 90° phase respectively, and the residence time between the pulses is longer than or equal to the dead time in the NMR instrument.

5. Procedure in accordance with claim 1 or 2, characterized by the fact that the "double quantum" pulse sequence uses cycling of phases on RF pulses with 16 different combinations.

6. Procedure in accordance with claim 1 or 2, characterized in that the "double quantum" pulse sequence uses external magnetic gradients.

7. Procedure in accordance with one of the preceding requirements, characterized in that the processing in the computer includes - for samples with little water - subtraction of the amplitude height of the signal from the "spin-echo" pulse sequence, from the height (3) of the signal from liquid compounds in the "solid-echo" pulse sequence , and conversion of the difference to water quantity using a water calibration curve, - conversion of the amplitude height of the signal from the "spin-echo" pulse sequence to fat quantity using a fat calibration curve, and - conversion of the height ( 2) of the signal from solid compounds in the "solid-echo" pulse sequence, to the amount of protein using a protein calibration curve, - for samples with a lot of water - subtraction of the amplitude height (4) of the signal from the "double quantum" pulse - the sequence, from the height (3) of the signal from liquid compounds in the "solid-echo" pulse sequence, and conversion of the difference to water quantity by means of a water calibration curve, - conversion of the amplitude height (4) of the signal from " double quantum" the pulse sequence to fat amount ve d using a fat calibration curve, and - conversion of the height of the signal (2) from solid compounds in the "solid-echo" pulse sequence, to protein amount using a protein calibration curve.