NO310258B1

NO310258B1 - Specific binding assay, assay package and sensitizer conjugate

Info

Publication number: NO310258B1
Application number: NO19905302A
Authority: NO
Inventors: Frank Mccapra
Original assignee: London Diagnostics Inc
Priority date: 1988-06-08
Filing date: 1990-12-07
Publication date: 2001-06-11
Also published as: NO905302L; NO905302D0

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører spesifikk bindingsbestemmelse, analysepakke og sensibilisatorkonjngat. The present invention relates to specific binding determination, analysis package and sensitizer conjugate.

Noen forbindelser vil anta eksiterte triplett-tilstander etter eksitasjon ved bestråling, elektronoverføring, elektrolyse (dvs. elektroluminescens) eller energioverføring. Disse forbindelser eller "sensibilisatorer" kan vekselvirke med forskjellige andre forbindelser og overføre energi eller elektroner til disse andre forbindelser, hvorved sensibilisatoren vender tilbake til den ikke-eksiterte tilstand eller grunntilstand. Vekselvirkningen mellom den eksiterte sensibilisator og disse andre forbindelser kan under visse betingelser bevirke dannelse av et påvisbart signal, som kan overvåkes og/eller kvantifiseres. Some compounds will assume excited triplet states after excitation by irradiation, electron transfer, electrolysis (ie, electroluminescence) or energy transfer. These compounds or "sensitizers" can interact with various other compounds and transfer energy or electrons to these other compounds, whereby the sensitizer returns to the unexcited or ground state. The interaction between the excited sensitizer and these other compounds can, under certain conditions, cause the formation of a detectable signal, which can be monitored and/or quantified.

Det vil derfor være ønskelig å anvende sensibilisatorer som merke ved diagnostiske bestemmelser. It would therefore be desirable to use sensitizers as a marker for diagnostic determinations.

Ifølge foreliggende oppfinnelse beskrives spesifikke bindingsbestemmelser, hvorved det anvendes en sensibilisator som merke. Hvis sensibilisatoren bindes til et spesifikt bindende materiale, som anvendes i en spesifikk bindingsreaksjon ved en bestemmelse for tilstedeværelse av en analytt i en prøve, kan signalet dannet som resultat av vekselvirkningen mellom sensibilisatoren og en annen forbindelse, korreleres til tilstedeværelsen eller mengden av analytt i prøven. According to the present invention, specific binding determinations are described, whereby a sensitizer is used as a label. If the sensitizer binds to a specific binding material, which is used in a specific binding reaction in a determination of the presence of an analyte in a sample, the signal formed as a result of the interaction between the sensitizer and another compound can be correlated to the presence or amount of analyte in the sample .

Da sensibilisatoren kan bringes tilbake til den opprinnelige tilstand og således gjøres tilgjengelig for en annen eksitasjon, gir anvendelsen av en sensibilisator som merking også den ytterligere fordel at signalet fra sensibilisatoren forsterkes, hvilket øker bestemmelsens følsomhet sterkt. Since the sensitizer can be brought back to its original state and thus made available for another excitation, the use of a sensitizer as a label also provides the additional advantage that the signal from the sensitizer is amplified, which greatly increases the sensitivity of the determination.

I forbindelse med beskrivelsen av foreliggende oppfinnelse skal det ved uttrykket "sensibilisator" forstås enhver gruppe som ved eksitasjon ved bestråling med en eller flere bølgelengder eller ved annen kjemisk eller fysisk stimulans (f.eks. elektronoverføring, elektrolyse, elektro-luminescens eller energioverføring) vil oppnå en eksitert tilstand og som (a) ved etterfølgende reaksjon med molekylært oksygen vil danne molekylært singlett-oksygen eller (b) ved etterfølgende reaksjon med et leuko-farvestoff vil anta en redusert form, som deretter kan bringes tilbake til den opprinnelige tilstand ved reaksjon med molekylært oksygen, hvilket medfører dannelse av hydrogenperoksyd. In connection with the description of the present invention, the term "sensitiser" shall be understood as any group which, upon excitation by irradiation with one or more wavelengths or by other chemical or physical stimulation (e.g. electron transfer, electrolysis, electroluminescence or energy transfer) will attain an excited state and which (a) on subsequent reaction with molecular oxygen will form molecular singlet oxygen or (b) on subsequent reaction with a leuco-dye will assume a reduced form, which can then be returned to the original state by reaction with molecular oxygen, which leads to the formation of hydrogen peroxide.

Hver av reaksjonene av den eksiterte sensibilisator vil, ved tilsetning av andre reagenser, i noen tilfeller, men ikke i andre, gi et påvisbart signal. For det første kan det molekylære singlett-oksygen reagere med et olefin (a) for å danne et dioksetan som brytes ned ved oppvarmning og sender ut et påvisbart foton, eller (b) for å danne et peroksyd, som enten kan (i) brytes ned ved oppvarmning og utsende et påvisbart foton eller (ii) oksydere et kromogen for å danne en påvisbar farveendring eller fluorescens. For det annet vil det oksyderte leuko-farvestoff gi en påvisbar farveendring eller fluorescens. Hydrogenperoksydet som dannes ved resirkulering av den reduserte sensibilisator ved hjelp av molekylært oksygen, kan påvises som resultat av oksydasjonen av et kromogen, hvilket medfører en påvisbar farveendring eller fluorescens eller oksydasjon av en kjemiluminescerende gruppe som produserer et påvisbart foton. Each of the reactions of the excited sensitizer will, upon addition of other reagents, in some cases, but not in others, give a detectable signal. First, the molecular singlet oxygen can react with an olefin (a) to form a dioxetane which decomposes on heating and emits a detectable photon, or (b) to form a peroxide, which can either (i) decompose down upon heating and emit a detectable photon or (ii) oxidize a chromogen to produce a detectable color change or fluorescence. Secondly, the oxidized leuco-dye will give a detectable color change or fluorescence. The hydrogen peroxide formed by recycling the reduced sensitizer with molecular oxygen can be detected as a result of the oxidation of a chromogen, which causes a detectable color change or fluorescence or oxidation of a chemiluminescent group that produces a detectable photon.

Ifølge foreliggende oppfinnelse beskrives også analysepakke som inneholder sensibilisatorkonjugater, olefiner og leuko-farvestoffer. Fig. 1 på tegningen viser anvendelsen av en sensibilisator med et olefin for å danne et dioksetan som vil utsende lys ved oppvarmning. Fig. 2 viser resultatene av en probebestemmelse for varierende mengder av mål-DNA. According to the present invention, an analysis package is also described which contains sensitizer conjugates, olefins and leuco dyes. Fig. 1 of the drawing shows the use of a sensitizer with an olefin to form a dioxetane which will emit light when heated. Fig. 2 shows the results of a probe determination for varying amounts of target DNA.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig spesifikk bindingsbestemmelse av tilstedeværelse av en analytt i en prøve, kjennetegnet ved The present invention therefore relates to specific binding determination of the presence of an analyte in a sample, characterized by

dannelse av én eller flere spesifikke bindingsreaksjonsprodukter som inneholder et sensibilisatorkonjugat hvor en sensibilisator er bundet til et formation of one or more specific binding reaction products containing a sensitizer conjugate where a sensitizer is bound to a

spesifikt bindende materiale; specific binding material;

tilveiebringelse av sensibilisatorkonjugatet i en prøve som inneholder en analytt i nevnte prøve ved eksitasjon av sensibilisatoren som inneholdes i det nevnte ene eller de nevnte flere spesifikke bindingsreaksjonsprodukter inneholdende sensibilisatorkonjugatet eller eksitasjon av sensibilisatoren som inneholdes i sensibilisatorkonjugatet som ikke inneholdes i det nevnte ene eller de nevnte flere spesifikke bindingsreaksjonsprodukter, og providing the sensitizer conjugate in a sample containing an analyte in said sample by excitation of the sensitizer contained in said one or more specific binding reaction products containing the sensitizer conjugate or excitation of the sensitizer contained in the sensitizer conjugate not contained in said one or more specific binding reaction products, and

omsetning av den eksiterte sensibilisator enten med molekylært oksygen eller reaction of the excited sensitizer either with molecular oxygen or

med et leuko-farvestoff for å danne et påvisbart signal, og with a leuco dye to form a detectable signal, and

måling av det påvisbare signal. measurement of the detectable signal.

Det er videre beskrevet analysepakke for bestemmelse av spesifikk binding, kjennetegnet ved An analysis package for determining specific binding, characterized by

en første beholder inneholdende et sensibilisatorkonjugat, hvor sensibilisatorkonjugatet omfatter en sensibilisator bundet til et spesifikt bindende a first container containing a sensitizer conjugate, where the sensitizer conjugate comprises a sensitizer bound to a specific binding

materiale, og material, and

en andre beholder inneholdende et olefin eller et leuko-farvestoff. a second container containing an olefin or a leuco dye.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også sensibilisatorkonjugat, kjennetegnet ved at det omfatter en sensibilisator bundet til et spesifikt bindende materiale, idet sensibilisatorkonjugatet vil oppnå en eksitert tilstand, reagere med enten molekylært oksygen eller leuko-farvestoff for å danne et påvisbart signal, for deretter å falle tilbake til grunntilstanden. The present invention also relates to sensitizer conjugate, characterized in that it comprises a sensitizer bound to a specific binding material, the sensitizer conjugate will attain an excited state, react with either molecular oxygen or leuco-dye to form a detectable signal, then fall back to the ground state.

BESKRIVELSE AV DEN FORETRUKNE UTFØRELSESFORM DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENT

Ved utøvelsen av den foreliggende oppfinnelse merkes spesifikt bindende materialer med en sensibilisator. Slike sensibilisatorer omfatter, uten at dette skal oppfattes som begrensende, de fleste farvestoffer, så som metylenblått, rhodamin, perylen, aromatiske hydrokarboner (f.eks. pyren), heterocykliske forbindelser, eosin, frie porfyriner, metallporfyriher, tetrafenylporphin, ftalocyanin og forskjellige flavinderivater. Eksempler på spesifikke sensibilisatorer er anført i "The Chemistry of Synthetic Dyes," bind I til IX, redigert av K. Venkataraman (Academic Press, New York 1978), og "Singlet Molecular Oxygen," redigert av A. Paul Schaap (Bowden, Hutchinson and Ross 1976), hvortil det henvises. In the practice of the present invention, specifically binding materials are labeled with a sensitizer. Such sensitizers include, but are not limited to, most dyes, such as methylene blue, rhodamine, perylene, aromatic hydrocarbons (e.g., pyrene), heterocyclic compounds, eosin, free porphyrins, metal porphyries, tetraphenylporphine, phthalocyanine, and various flavin derivatives . Examples of specific sensitizers are listed in "The Chemistry of Synthetic Dyes," Volumes I through IX, edited by K. Venkataraman (Academic Press, New York 1978), and "Singlet Molecular Oxygen," edited by A. Paul Schaap (Bowden, Hutchinson and Ross 1976), to which reference is made.

Særlig anvendelige sensibilisatorer omfatter: Particularly useful sensitizers include:

Sensibilisatorer kan bindes til spesifikt bindende materiale ved fremgangs-måter som er velkjente innenfor teknikken, f.eks. ved anvendelse av en N-hydroksy-suksinimidylesterbinder, ved anvendelse av en diaminbinder og ved inkorporering av sensibilisatoren i en byggesten (f.eks. et nukleotid eller en aminosyre) av et spesifikt bindende materiale. Metoden til å binde sensibilisatoren til det spesifikt bindende materiale vil avhenge av typen av spesifikt bindende materiale og typen av sensibilisator som anvendes. Sensitizers can be bound to specific binding material by methods well known in the art, e.g. by using an N-hydroxy-succinimidyl ester linker, by using a diamine linker and by incorporating the sensitizer into a building block (eg a nucleotide or an amino acid) of a specific binding material. The method of binding the sensitizer to the specific binding material will depend on the type of specific binding material and the type of sensitizer used.

Spesifikt bindende materiale med tilknyttet sensibilisator (i det følgende betegnet "sensibilisatorkonjugat") er anvendelig til et bredt utvalg av spesifikke bindingsbestemmelser av tilstedeværelsen av analytt i en prøve. Ved uttrykket "tilstedeværelse" skal det i den foreliggende beskrivelse forstås kvalitativ og/eller kvantitativ påvisning av en analytt. Slike bestemmelser kan være rettet mot enhver analytt som kan påvises ved anvendelse av sensibilisatorkonjugatet i forbindelse med spesifikke bindingsreaksjoner. Disse bestemmelser omfatter f.eks. immuno-bestemmelser, proteinbindingsbestemmelser og nukleinsyrehybridiserings-bestemmelser. Specific binding material with associated sensitizer (hereinafter referred to as "sensitizer conjugate") is useful for a wide variety of specific binding determinations of the presence of analyte in a sample. In the present description, the expression "presence" shall mean qualitative and/or quantitative detection of an analyte. Such assays may be directed against any analyte that can be detected using the sensitizer conjugate in conjunction with specific binding reactions. These provisions include e.g. immunoassays, protein binding assays and nucleic acid hybridization assays.

Ved en typisk immunobestemmelse er analytten immunoreaktiv, og dens tilstedeværelse i en prøve kan bestemmes på grunn av dens immunoreaksjon med en bestemmelsesreagens. Ved en typisk proteinbindingsbestemmelse bestemmes tilstedeværelsen av analytt i en prøve ved hjelp av den spesifikke bindingsreaktivitet av analytten med en bestemmelsesreagens, hvor reaktiviteten er en annen enn immunoreaktivitet. Eksempler på dette omfatter enzym-substratgjenkjennelse og bindingsaffiniteten av avidin til biotin. Ved en typisk nukleinsyrehybridiseringsbestemmelse bestemmes tilstedeværelsen av analytt i en prøve ved en hybridise-ringsreaksjon av analytten med en bestemmelsesreagens. Analyttnukleinsyre (vanligvis til stede som dobbeltstrenget DNA eller RNA) omdannes vanligvis først til en enkeltstrenget form og immobiliseres på en bærer (f.eks. nitrocellulosepapir). Analyttnukleinsyren kan alternativt underkastes elektroforese i en gelmatrix. Den immobiliserte analytt kan deretter hybridiseres (dvs. bindes spesifikt) av en komplementær nukleinsyresekvens. In a typical immunoassay, the analyte is immunoreactive and its presence in a sample can be determined due to its immunoreaction with an assay reagent. In a typical protein binding determination, the presence of analyte in a sample is determined by means of the specific binding reactivity of the analyte with a determination reagent, where the reactivity is different from immunoreactivity. Examples of this include enzyme-substrate recognition and the binding affinity of avidin to biotin. In a typical nucleic acid hybridization determination, the presence of analyte in a sample is determined by a hybridization reaction of the analyte with a determination reagent. Analyte nucleic acid (usually present as double-stranded DNA or RNA) is usually first converted to a single-stranded form and immobilized on a support (eg, nitrocellulose paper). The analyte nucleic acid can alternatively be subjected to electrophoresis in a gel matrix. The immobilized analyte can then be hybridized (ie bound specifically) by a complementary nucleic acid sequence.

De ovennevnte spesifikke bindingsbestemmelser kan gjennomføres ved hjelp av et stort utvalg av bestemmelsesmetoder. Ved disse bestemmelsesmetoder anvendes et sensibilisatorkonjugat, som omfatter sensibilisatoren bundet til et spesifikt bindende materiale. Med "spesifikt bindende materiale" menes i den foreliggende beskrivelse ethvert materiale som vil binde spesifikt ved en immunoreaksjon, proteinbindingsreaksjon, nukleinsyrehybridiseringsreaksjon og enhver annen reaksjon, hvor materialet reagerer spesifikt med en begrenset klasse av biologiske, biokjemiske eller kjemiske stoffer. I denne kategori av bestemmelser deltar sensibilisatorkonjugatet i en spesifikke bindingsreaksjon, og tilstedeværelsen av analytt i prøven er proporsjonal med dannelsen av et eller flere spesifikke bindingsreaksjonsprodukter inneholdende sensibilisatorkonjugatet. Bestemmelsen utføres ved å gjøre det mulig for de nødvendige spesifikke bindingsreaksjoner å forekomme under egnede reaksjonsbetingelser. Dannelsen av spesifikke bindingsreaksjonsprodukter inneholdende sensibilisatorkonjugatet bestemmes ved å måle signalet dannet som resultat av eksitasjonen av slike produkter inneholdende sensibilisatorkonjugatet eller ved å måle signalet dannet som resultat av eksitasjonen av ikke-reagert eller delvis reagert sensibilisatorkonjugat som slike produkter ikke inneholder. The above-mentioned specific binding determinations can be carried out using a large variety of determination methods. In these determination methods, a sensitizer conjugate is used, which comprises the sensitizer bound to a specific binding material. By "specific binding material" is meant in the present description any material that will bind specifically in an immunoreaction, protein binding reaction, nucleic acid hybridization reaction and any other reaction, where the material reacts specifically with a limited class of biological, biochemical or chemical substances. In this category of determinations, the sensitizer conjugate participates in a specific binding reaction, and the presence of analyte in the sample is proportional to the formation of one or more specific binding reaction products containing the sensitizer conjugate. The determination is carried out by enabling the necessary specific binding reactions to occur under suitable reaction conditions. The formation of specific binding reaction products containing the sensitizer conjugate is determined by measuring the signal formed as a result of the excitation of such products containing the sensitizer conjugate or by measuring the signal formed as a result of the excitation of unreacted or partially reacted sensitizer conjugate that such products do not contain.

Som typiske bestemmelsesmetoder kan nevnes sandwich-bestemmelser, kompetitive bestemmelser, overflateantigenbestemmelser, sekvensvise metnings-bestemmelser, kompetitive fortrengningsbestemmelser og "quenching"-bestemmelser. As typical determination methods, sandwich determinations, competitive determinations, surface antigen determinations, sequential saturation determinations, competitive displacement determinations and "quenching" determinations can be mentioned.

Ved en typisk sandwich-metode er det spesifikt bindende materiale, In a typical sandwich method, there is specific binding material,

hvortil sensibilisatoren bindes, i stand til spesifikk binding med analytten. Ved bestemmelsen anvendes ytterligere en reaktant som er i stand til spesifikk binding med analytten for å danne et reaktantanalytt-sensibilisatorkonjugatkompleks. Reaktanten kan være bundet til en fast fase, f.eks. dyppepinner, perler, rør, papirark eller polymerark. I slike tilfeller vil tilstedeværelsen av analytt i en prøve være proporsjonal med signalet dannet som resultat av eksitasjonen av sensibilisator bundet til den faste fase etter at de spesifikke bindingsreaksjoner er fullført. Slike bestemmelsesmetoder er beskrevet nærmere i US patentskrifter nr. 4.652.533, 4.383.031, 4.380.580 og 4.226.993, hvortil det henvises. to which the sensitizer binds, capable of specific binding with the analyte. In the determination, a further reactant is used which is capable of specific binding with the analyte to form a reactant analyte-sensitiser conjugate complex. The reactant can be bound to a solid phase, e.g. dip sticks, beads, tubes, sheets of paper or sheets of polymer. In such cases, the presence of analyte in a sample will be proportional to the signal formed as a result of the excitation of sensitizer bound to the solid phase after the specific binding reactions have been completed. Such determination methods are described in more detail in US patent documents no. 4,652,533, 4,383,031, 4,380,580 and 4,226,993, to which reference is made.

Ved en typisk kompetitiv metode anvendes det ved bestemmelsen en reaktant som er i stand til spesifikk binding til analytten, for å danne et analyttreaktant-kompleks og til det spesifikt bindende materiale, hvortil sensibilisatoren er bundet, for å danne et sensibilisatorkonjugat-reaktantkompleks. Reaktanten kan være bundet til en fast fase, eller reaksjonsproduktene inneholdende reaktanten kan alternativt utfelles ved anvendelse av et annet antistoff eller ved andre kjente metoder. Ved denne kompetitive metode er tilstedeværelsen av analytt "proporsjonal", dvs. omvendt proporsjonal, med signalet dannet som resultat av eksitasjonen av sensibilisator bundet til den faste fase eller i utfellingen. En ytterligere diskusjon av denne bestemmelsesmetode kan finnes i de umiddelbart ovenfor nevnte US patentskrifter. In a typical competitive method, a reactant capable of specific binding to the analyte, to form an analyte-reactant complex, and to the specific binding material, to which the sensitizer is bound, is used in the determination, to form a sensitizer conjugate-reactant complex. The reactant can be bound to a solid phase, or the reaction products containing the reactant can alternatively be precipitated by using another antibody or by other known methods. In this competitive method, the presence of analyte is "proportional", i.e. inversely proportional, to the signal formed as a result of the excitation of sensitizer bound to the solid phase or in the precipitate. A further discussion of this determination method can be found in the immediately above-mentioned US patent documents.

Ved en annen bestemmelsesmetode kan analytten forekomme på eller være bundet til et større biologisk, biokjemisk eller kjemisk stoff. Denne type av metode illustreres av en overflateantigenbestemmelse. Ved denne metode er det spesifikt bindende materiale i stand til spesifikk binding til analytten, og tilstedeværelsen av analytt er proporsjonal med analyttsensibilisator-konjugatkomplekset dannet som reaksjonsprodukt. Dette illustreres av binding av sensibilisatoren til et antistoff som er spesifikt for et overflateantigen på en celle. Tilstedeværelsen av celleoverflate-antigenet vil vise seg ved signalet dannet som resultat av eksitasjonen av sensibilisator bundet til cellene etter at reaksjonen er fullført. Cellene i seg selv kan anvendes sammen med et filtreringssystem til fraskillelse av analyttsensibilisator-konjugatkomplekset som dannes på overflaten av cellene, fra ikke-reagert sensibilisatorkonjugat. Dette er diskutert nærmere i US patentskrift nr. 4.652.533. In another determination method, the analyte can occur on or be bound to a larger biological, biochemical or chemical substance. This type of method is illustrated by a surface antigen determination. In this method, the specific binding material is capable of specific binding to the analyte, and the presence of analyte is proportional to the analyte sensitizer-conjugate complex formed as a reaction product. This is illustrated by binding of the sensitizer to an antibody that is specific for a surface antigen on a cell. The presence of the cell surface antigen will be shown by the signal formed as a result of the excitation of sensitizer bound to the cells after the reaction is complete. The cells themselves can be used together with a filtration system to separate the analyte sensitizer conjugate complex formed on the surface of the cells from unreacted sensitizer conjugate. This is discussed in more detail in US Patent No. 4,652,533.

Sensibilisatoren kan anvendes ved ytterligere bestemmelsesmetoder som er kjente innenfor teknikken, f.eks. sekvensvis metning og kompetitiv fortrengning, hvor det i begge tilfelle anvendes et sensibilisatorkonjugat, hvor både (1) det spesifikt bindende materiale som sensibilisatoren er bundet til, og (2) analytten bindes spesifikt til en reaktant. Når det er tale om sekvensvis metning, omsettes analytten først med reaktanten, hvoretter sensibilisatorkonjugatet omsettes med gjenværende ikke-omsatt reaktant. Når det er tale om kompetitiv fortrengning, fortrenger sensibilisatorkonjugatet kompetitivt analytt som allerede er bundet til reaktanten. The sensitizer can be used by further determination methods known in the art, e.g. sequential saturation and competitive displacement, where in both cases a sensitizer conjugate is used, where both (1) the specific binding material to which the sensitizer is bound, and (2) the analyte is bound specifically to a reactant. In the case of sequential saturation, the analyte is first reacted with the reactant, after which the sensitizer conjugate is reacted with the remaining unreacted reactant. In the case of competitive displacement, the sensitizer conjugate competitively displaces analyte that is already bound to the reactant.

Ved en typisk "quenching"-metode anvendes det ved bestemmelsen en reaktant, som er i stand til spesifikk binding til analytten for å danne et analyttreaktant-kompleks og til det spesifikt bindende materiale som sensibilisatoren er bundet til, for å danne et sensibilisatorkonjugat-reaktantkompleks. En "undertrykkende" gruppe bindes til reaktanten. Når den "undertrykkende" gruppe bringes tett på sensibilisatoren, reduserer eller undertrykker den signalet dannet som resultat av eksitasjonen av bundet sensibilisator eller reduserer eller undertrykker overføringen av elektroner eller energi fra den eksiterte sensibilisator til et mellomprodukt (dvs. molekylært oksygen eller et leuko-farvestoff). Ved denne "quenching"-metode er tilstedeværelsen av analytt proporsjonal med luminescensen av de dioksetaner som brytes ned. En ytterligere diskusjon av denne metode kan finnes i US patentskrift nr. 4.220.450 og 4.277.437, hvortil det henvises. In a typical "quenching" method, a reactant is used in the determination, which is capable of specific binding to the analyte to form an analyte-reactant complex and to the specific binding material to which the sensitizer is bound, to form a sensitizer conjugate-reactant complex . A "repressing" group is attached to the reactant. When the "suppressing" group is brought close to the sensitizer, it reduces or suppresses the signal formed as a result of the excitation of bound sensitizer or reduces or suppresses the transfer of electrons or energy from the excited sensitizer to an intermediate (ie, molecular oxygen or a leuco dye ). In this "quenching" method, the presence of analyte is proportional to the luminescence of the dioxetanes that are degraded. A further discussion of this method can be found in US Patent Nos. 4,220,450 and 4,277,437, to which reference is made.

Ved de ovenfor diskuterte bestemmelsesmetoder og ved metodene som diskuteres nedenfor, kan den rekkefølge i hvilken bestemmelsesreagensene tilsettes og omsettes, variere i vidt omfang, slik det er velkjent innenfor teknikken. F.eks. kan reaktanten bundet til en fast fase ved en sandwich-bestemmelse omsettes med en analytt som inneholdes i en prøve, og etter denne reaksjon kan den faste fase inneholdende kompleksbundet analytt skilles fra den resterende prøve. Etter dette adskillelsestrinn kan sensibilisatorkonjugatet omsettes med komplekset på den faste fase. Alternativt kan den faste fase, prøven og sensibilisatorkonjugatet tilsettes samtidig og omsettes før adskillelsen. Som et ytterligere, men mindre foretrukket alternativ kan analytten i prøven og sensibilisatorkonjugatet omsettes før tilsetningen av reaktanten på den faste fase. Lignende variasjoner med hensyn til blandings- og reaksjonstrinnene er mulige ved kompetitive bestemmelsesmetoder og ved andre metoder som er kjente innenfor teknikken. Å "muliggjøre vesentlig dannelse under egnede betingelser" av spesifikke bindingsreaksjonsprodukter skal i den foreliggende beskrivelse omfatte de mange forskjellige variasjoner med hensyn til rekkefølgen for tilsetning og omsetning av bestemmelsesreagenser. In the determination methods discussed above and in the methods discussed below, the order in which the determination reagents are added and reacted can vary widely, as is well known in the art. E.g. the reactant bound to a solid phase in a sandwich determination can be reacted with an analyte contained in a sample, and after this reaction the solid phase containing complexed analyte can be separated from the remaining sample. After this separation step, the sensitizer conjugate can be reacted with the complex on the solid phase. Alternatively, the solid phase, sample and sensitizer conjugate can be added simultaneously and reacted before separation. As a further, but less preferred alternative, the analyte in the sample and the sensitizer conjugate may be reacted prior to the addition of the reactant on the solid phase. Similar variations with regard to the mixing and reaction steps are possible with competitive determination methods and with other methods known in the art. To "enable substantial formation under suitable conditions" of specific binding reaction products shall in the present description include the many different variations with respect to the order of addition and conversion of determination reagents.

De ovenfor beskrevne bestemmelser kan være heterogene eller homogene. Ved heterogene bestemmelser skilles reaksjonsproduktene, hvis dannelse er proporsjonal med tilstedeværelsen av analytt i prøven, fra andre produkter av reaksjonen. Adskillelsen kan oppnås ved enhver metode, f.eks. fraskillelse av en væskefase fra en fast fase ved filtrering, mikrofiltrering, dobbelt antistoffelling, sentrifugering, størrelsesutelukkelseskromatografi, fjerning av en fast fase (f.eks. en dyppepinne) fra en prøveoppløsning, eller elektroforese. Ved f.eks. en sandwich-bestemmelse skilles reaktantanalytt-sensibilisatorkonjugatkomplekset fra ikke-omsatt sensibilisatorkonjugat. Ved en overflateantigenbestemmelse skilles analytt-sensibilisatorkonjugatkomplekset fra ikke-reagert sensibilisatorkonjugat. Ved en kompetitiv bestemmelse skilles reaktant-sensibilisatorkonjugatkomplekset fra ikke-reagert sensibilisatorkonjugat. Ved en sekvensvis metningsbestemmelse og ved en kompetitiv fortrengningsbestemmelse skilles reaktant-sensibilisatorkonjugatkomplekset fra ikke-reagert sensibilisatorkonjugat. Alternativt fraskilles reaksjonsproduktene ikke ved homogene bestemmelser. Etter at bestemmelsesreagensene har fått lov å reagere, kan signalet måles fra den samlede bestemmelsesblanding, enten denne blanding er i oppløsning, på en fast fase eller fordelt mellom forskjellige membranlag på en dyppepinne eller annen fast bærer. "Quenching"-bestemmelsen illustrerer en kompleks homogen bestemmelse, ved hvilken fraskillelse er unødvendig. Det forutses at hver kategori av bestemmelsesmetoder kan gi anledning til enten heterogene eller homogene metoder. The provisions described above can be heterogeneous or homogeneous. In heterogeneous determinations, the reaction products, whose formation is proportional to the presence of analyte in the sample, are separated from other products of the reaction. The separation can be achieved by any method, e.g. separation of a liquid phase from a solid phase by filtration, microfiltration, double antibody precipitation, centrifugation, size exclusion chromatography, removal of a solid phase (eg, a dipstick) from a sample solution, or electrophoresis. By e.g. in a sandwich assay, the reactant analyte-sensitizer conjugate complex is separated from unreacted sensitizer conjugate. In a surface antigen determination, the analyte-sensitizer conjugate complex is separated from unreacted sensitizer conjugate. In a competitive assay, the reactant-sensitizer conjugate complex is separated from unreacted sensitizer conjugate. In a sequential saturation determination and in a competitive displacement determination, the reactant-sensitizer conjugate complex is separated from unreacted sensitizer conjugate. Alternatively, the reaction products are not separated by homogeneous determinations. After the determination reagents have been allowed to react, the signal can be measured from the overall determination mixture, whether this mixture is in solution, on a solid phase or distributed between different membrane layers on a dipstick or other solid support. The "quenching" provision illustrates a complex homogeneous provision in which separation is unnecessary. It is anticipated that each category of determination methods can give rise to either heterogeneous or homogeneous methods.

Et annet eksempel på en homogen bestemmelse er illustrert i EP patent-søknad nr. 82303699.1, offentliggjort den 16. oktober 1985 (offentliggjørelses nr. 70.685), hvortil det henvises. I dette skrift beskrives en homogen hybridiserings-bestemmelse, hvor det anvendes to prober, hvor den ene er merket med en kjemiluminescerende gruppe, og den annen er merket med en absorber/emitter-gruppe. Bestemmelsen kan gjennomføres i oppløsning, uten at det er nødvendig å anvende noen immobiliseringsprosedyrer. Ved den foreliggende oppfinnelse velges fortrinnsvis to strenger av DNA som avleses fra motsatte ender. En streng er fortrinnsvis merket med en kjemiluminescerende gruppe, hvis eksiterte tilstand gir et høyt fluorescens-kvantumutbytte. Den andre streng er fortrinnsvis merket med en sensibilisator som eksiteres av den andre merking. Alternativt kan den kjemiluminescerende gruppe erstattes med en forbindelse som inneholder et tungt atom (J eller Br), som ved kryssing mellom systemene vil omdanne sensibilisatormerkingen på den andre streng fra en svak til en sterk sensibilisator, når en slik forbindelse inneholdende et tungt atom er tett på sensibilisatormerkingen. Another example of a homogeneous determination is illustrated in EP Patent Application No. 82303699.1, published on October 16, 1985 (Publication No. 70,685), to which reference is made. This document describes a homogeneous hybridization determination, where two probes are used, one of which is labeled with a chemiluminescent group, and the other is labeled with an absorber/emitter group. The determination can be carried out in dissolution, without it being necessary to apply any immobilization procedures. In the present invention, two strands of DNA are preferably selected which are read from opposite ends. A strand is preferably labeled with a chemiluminescent group, whose excited state gives a high fluorescence quantum yield. The second strand is preferably labeled with a sensitizer which is excited by the second label. Alternatively, the chemiluminescent group can be replaced by a compound containing a heavy atom (J or Br), which upon crossing between the systems will convert the sensitizer label on the other strand from a weak to a strong sensitizer, when such a compound containing a heavy atom is dense on the sensitizer label.

Utover det som er angitt ovenfor, kan sensibilisatormerkinger anvendes til DNA-sekvensbestemmelse. Ved eksisterende sekvensbestemmelser av DNA anvendes fire forskjellige fluorescerende farvestoffer, ett til hver av reaksjonene med A, T, C og G. I foreliggende oppfinnelse kan det anvendes fire sensibilisatorer som hver har en forskjellig eksitasjonsbølgelengde, sammen med fire filtre til sekvensvis eksitering av den rette sensibilisator. In addition to what is indicated above, sensitizer labels can be used for DNA sequencing. In existing sequence determinations of DNA, four different fluorescent dyes are used, one for each of the reactions with A, T, C and G. In the present invention, four sensitizers can be used, each with a different excitation wavelength, together with four filters for sequential excitation of the right sensitizer.

Ved bestemmelser hvor det anvendes et sensibilisatorkonjugat, kan tilstedeværelsen av analytt påvises ved eksitasjon av sensibilisatoren med den rette bestråling eller annen stimulans (f.eks. elektronoverføring, elektrolyse, elektro-luminescens eller energioverføring). Den eksiterte sensibili-sator vil deretter reagere med et "mellomprodukt" (dvs. molekylært oksygen eller et leuko-farvestoff). De resulterende produkter og ytterligere reaksjoner avhenger av, hvilke mellom-produkter som anvendes. In assays where a sensitizer conjugate is used, the presence of analyte can be detected by excitation of the sensitizer with the appropriate irradiation or other stimulus (e.g. electron transfer, electrolysis, electroluminescence or energy transfer). The excited sensitizer will then react with an "intermediate" (ie, molecular oxygen or a leuco dye). The resulting products and further reactions depend on which intermediates are used.

Når molekylært oksygen er mellomproduktet, dannes det molekylært singlett-oksygen, og sensibilisatoren vender tilbake til den opprinnelige ikke-eksiterte tilstand. Det molekylære singlett-oksygen vil deretter reagere med et olefin for å danne enten et dioksetan eller et peroksyd. Et olefin er karakterisert ved den generelle formel: hvor RI, R2, R3 og R4 er enhver gruppe. RI, R2, R3 og/eller R4 kan i noen tilfeller være bundet til hverandre for å danne ringstrukturer eller ringlignende strukturer, som f.eks. i strukturene (1) og (4) nedenfor: When molecular oxygen is the intermediate, molecular singlet oxygen is formed and the sensitizer returns to its original unexcited state. The molecular singlet oxygen will then react with an olefin to form either a dioxetane or a peroxide. An olefin is characterized by the general formula: where RI, R2, R3 and R4 are any group. R1, R2, R3 and/or R4 can in some cases be bound to each other to form ring structures or ring-like structures, such as e.g. in structures (1) and (4) below:

Karakteren av karbonatomet i hver av RI, R2, R3 og R4, som er tettest på dobbelt-bindingen ("det tilstødende karbonatom") i et gitt olefin vil avgjøre om det dannes et dioksetan eller et peroksyd etter omsetning av olefinet med molekylært singlett-oksygen. Hvis alle de tilstøtende karbonatomer er (a) et brohode eller (b) ikke bærer noen hydrogenatomer, vil det bli dannet et dioksetan, f.eks. The character of the carbon atom in each of R1, R2, R3 and R4, which is closest to the double bond ("the adjacent carbon atom") in a given olefin will determine whether a dioxetane or a peroxide is formed after reaction of the olefin with molecular singlet- oxygen. If all the adjacent carbon atoms are (a) a bridgehead or (b) bear no hydrogen atoms, a dioxetane will be formed, e.g.

Ved oppvarmning nedbrytes dioksetanet under dannelse av et påvisbart foton, f.eks. When heated, the dioxetane breaks down with the formation of a detectable photon, e.g.

Substituerte olefiner som har elektrondonerende grupper blant deres substituenter, foretrekkes til utøvelse av foreliggende oppfinnelse, fordi de danner dioksetaner med øket kvantumutbytte ved nedbryting. Fortrinnsvis er RI og R2 og/eller R3 og R4 forbundet for å danne en ringgruppe som er fluorescerende. F.eks. danner RI og R2 i strukturen (1) ovenfor et N-metylacridan. Tilstedeværelsen av en fluorescerende gruppe "ved den ene ende" av olefinet vil føre til en ytterligere økelse av kvantumutbyttet fra det resulterende dioksetan. Substituted olefins having electron-donating groups among their substituents are preferred for the practice of the present invention, because they form dioxetanes with increased quantum yield upon decomposition. Preferably R1 and R2 and/or R3 and R4 are joined to form a ring group which is fluorescent. E.g. R1 and R2 in the structure (1) above form an N-methylacridan. The presence of a fluorescent group "at one end" of the olefin will lead to a further increase in the quantum yield of the resulting dioxetane.

Hvis ett eller flere av de tilstøtende karbonatomer (a) ikke er et brohode og (b) bærer minst ett hydrogenatom, vil det bli dannet et peroksyd. Ved oppvarmning vil dioksetanet også brytes ned under dannelse av en påvisbar (men svak) emisjon av fotoner. Alternativt kan peroksydet anvendes til å oksydere et kromogen for å danne en påvisbar farveendring eller fluorescens. If one or more of the adjacent carbon atoms (a) is not a bridgehead and (b) carries at least one hydrogen atom, a peroxide will be formed. When heated, the dioxetane will also break down with the formation of a detectable (but weak) emission of photons. Alternatively, the peroxide can be used to oxidize a chromogen to produce a detectable color change or fluorescence.

Når et leuko-farvestoff er mellomproduktet, reduseres den eksiterte sensibilisator av leuko-farvestoffet. Det oksyderte leuko-farvestoff blir synlig og kan påvises ved hjelp av den fremkomne farveendring eller fluorescens. Den reduserte sensibilisator kan også omsettes med molekylært oksygen for å danne hydrogenperoksyd og føre sensibilisatoren tilbake til den opprinnelige ikke-eksiterte tilstand. Hydrogenperoksydet kan anvendes til å oksydere et kromogen for å danne en påvisbar farveendring eller fluorescens eller til å oksydere en kjemiluminescerende gruppe for å danne et påvisbart foton. Leuko-farvestoffer er farvestoffer (f.eks. hydroksyantrakinoner og metylenblått) som er farveløse i deres reduserte former og blir farvede ved oksydasjon. Eksempler på leuko-farvestoffer er anført i "The Chemistry of Synthetic Dyes", bind I til IX, redigert av K. Venkataraman (Academic Press, New York 1978), og "Singlet Molecular Oksygen," redigert av A. Paul Schaap (Bowden, Hutchinson and Ross 1976), hvortil det henvises. When a leuco-dye is the intermediate, the excited sensitizer is reduced by the leuco-dye. The oxidized leuco-dye becomes visible and can be detected by means of the resulting color change or fluorescence. The reduced sensitizer can also react with molecular oxygen to form hydrogen peroxide and return the sensitizer to its original unexcited state. The hydrogen peroxide can be used to oxidize a chromogen to produce a detectable color change or fluorescence or to oxidize a chemiluminescent group to produce a detectable photon. Leuko dyes are dyes (eg, hydroxyanthraquinones and methylene blue) that are colorless in their reduced forms and become colored by oxidation. Examples of leuco dyes are listed in "The Chemistry of Synthetic Dyes," Volumes I to IX, edited by K. Venkataraman (Academic Press, New York 1978), and "Singlet Molecular Oxygen," edited by A. Paul Schaap (Bowden , Hutchinson and Ross 1976), to which reference is made.

Da mengden av sensibilisator som stimuleres kan korreleres til tilstedeværelsen av analytt, kan signalet (dvs. fotoner eller farveendring eller fluorescens) dannet ved de ovenfor diskuterte reaksjoner også korreleres til tilstedeværelsen eller mengden av analytt i prøven. Since the amount of sensitizer stimulated can be correlated to the presence of analyte, the signal (ie, photons or color change or fluorescence) produced by the reactions discussed above can also be correlated to the presence or amount of analyte in the sample.

"Kromogener", som gir en farveendring eller fluorescens ved oksydasjon med peroksyder, er velkjente innenfor teknikken. Egnede "kromogener" som gir en farveendring, omfatter f.eks. benzidin og derivater av benzidin. Egnede "kromogener" som gir fluorescens, omfatter f.eks. fluorescein (dvs. dihydrofluorescein) og derivater derav. "Chromogens", which produce a color change or fluorescence upon oxidation with peroxides, are well known in the art. Suitable "chromogens" which give a color change include e.g. benzidine and derivatives of benzidine. Suitable "chromogens" which provide fluorescence include e.g. fluorescein (ie dihydrofluorescein) and derivatives thereof.

"Å muliggjøre under egnede betingelser" skal uten begrensninger omfatte, hvor det er relevant, fraskillelsen av de spesifikke bindingsreaksjonsprodukter (hvis dannelse er proporsjonal med tilstedeværelsen av analytt i prøven) fra andre reaksjonsprodukter, eksitering av sensibilisatorkonjugatet som i ethvert spesifikt bindingsreaksjonsprodukt inneholder tilsetning av andre reagenser (dvs. olefin, leuko-farvestoff, kromogen eller kjemiluminescerende gruppe) og/eller oppvarming av dioksetanet eller peroksydet til fremkalling av nedbryting, måling av en farveendring eller fluorescens ved enhver metode (f.eks. visuelt, ved absorpsjon, ved refleksjon eller ved fluorescens). "Enable under suitable conditions" shall include, without limitation, where relevant, the separation of the specific binding reaction products (the formation of which is proportional to the presence of analyte in the sample) from other reaction products, the excitation of the sensitizer conjugate which in any specific binding reaction product contains the addition of other reagents (ie olefin, leuco-dye, chromogenic or chemiluminescent group) and/or heating the dioxetane or peroxide to induce decomposition, measurement of a color change or fluorescence by any method (eg visually, by absorption, by reflection or by fluorescence).

EKSEMPEL I EXAMPLE I

For å danne et sensibilisatorkonjugat bindes pyrensmørsyre til det 5'-terminale fosfat av et kinasebehandlet syntetisk oligonukleotid (20 baser, sekvens: 5'-TTCAATCATGCGAAACGATC-3') via en heksandiaminbinder som vist nedenfor: To form a sensitizer conjugate, pyrenebutyric acid is attached to the 5'-terminal phosphate of a kinase-treated synthetic oligonucleotide (20 bases, sequence: 5'-TTCAATCATGCGAAACGATC-3') via a hexanediamine linker as shown below:

Oligonukleotidet ble syntetisert på et automatisert synteseapparat (tilgjengelig i handelen fra Applied Biosystems, Foster City, CA 94404, Modell 380B). The oligonucleotide was synthesized on an automated synthesizer (commercially available from Applied Biosystems, Foster City, CA 94404, Model 380B).

Oligonukleotidet (2,5 ug) ble omdannet til 5-fosforimidazolidet ved behandling med 0,1 M l-etyl-3,3-dimetylaminopropyl-karbodiimid (CDI) i 0,1 M 1-metylimidazolbuffer ved en pH-verdi på 7,8 i 1 time ved romtemperatur under kraftig omrystning. Produktet ble omdannet til 5'-heksandiamin-addisjonsproduktet ved behandling med 0,25 M heksandiamin ved en pH-verdi på 7,8 i 1 time ved 50°C. The oligonucleotide (2.5 µg) was converted to the 5-phosphoimidazolide by treatment with 0.1 M 1-ethyl-3,3-dimethylaminopropylcarbodiimide (CDI) in 0.1 M 1-methylimidazole buffer at a pH of 7, 8 for 1 hour at room temperature with vigorous shaking. The product was converted to the 5'-hexanediamine adduct by treatment with 0.25 M hexanediamine at a pH of 7.8 for 1 hour at 50°C.

Det pyrenmerkede (sensibilisatormerkede) oligonukleotid ble dannet ved å omsette 5'-heksandiamin-addisjonsproduktet med 0,25 M pyrensmørsyre som syrens N-hydroksysuksinimidylester i 1-metylimidazolbuffer ved en pH-verdi på 7,8 ved romtemperatur. The pyrene-labeled (sensitizer-labeled) oligonucleotide was formed by reacting the 5'-hexanediamine adduct with 0.25 M pyrenebutyric acid as the acid's N-hydroxysuccinimidyl ester in 1-methylimidazole buffer at a pH of 7.8 at room temperature.

Olefinet 9-(adamantyliden)-N-metylacridan (struktur (1) ovenfor) ble syntetisert på følgende måte. N-metylacridan (15,2 g, 0,074 mol) og fosforpentasulfid (10,3 g, 0,046 mol) ble blandet i tørr pyridin (470 ml) og kokt ved tilbakeløp i 1 time. Røde krystaller ble utvunnet etter avkjøling av oppløsningen. Omkrystalli-sasjon fra xylen ga 12,5 g N-metylacridonetion. The olefin 9-(adamantylidene)-N-methylacridan (structure (1) above) was synthesized as follows. N-methyl acridane (15.2 g, 0.074 mol) and phosphorus pentasulfide (10.3 g, 0.046 mol) were mixed in dry pyridine (470 mL) and refluxed for 1 hour. Red crystals were recovered after cooling the solution. Recrystallization from xylene gave 12.5 g of N-methylacridonethione.

Adamantanon-p-tolylhydrazon og trifenylfosfin i dimetylacetamid (DMA) ble tilsatt til tørt natriumhydrid, og blandingen ble oppvarmet til 120°C i 20 minutter. N-metylacridonetion ble tilsatt til reaksjonsblandingen, og denne blanding ble kokt ved tilbakeløp i 2 timer. Oppløsningen ble avkjølt, og det oppsamlede faste stoff ble omkrystallisert fra xylen. Det fremkomne produkt ble kromatografert på silikagel, idet det ble eluert med toluen. Den første fraksjon (Rf 0,8) ble oppsamlet. Toluenet ble avdampet, og det fremkomne 9-(ada-mantylidin)-N-metylacridan ble omkrystal-lisert fra aceton. Adamantanone-p-tolylhydrazone and triphenylphosphine in dimethylacetamide (DMA) were added to dry sodium hydride and the mixture was heated to 120°C for 20 minutes. N-methylacridonethione was added to the reaction mixture, and this mixture was refluxed for 2 hours. The solution was cooled and the collected solid was recrystallized from xylene. The resulting product was chromatographed on silica gel, eluting with toluene. The first fraction (Rf 0.8) was collected. The toluene was evaporated, and the resulting 9-(ada-mantylidin)-N-methylacridan was recrystallized from acetone.

Ved gjennomføringen av en nukleinsyrehybridiseringsbestemmelse ble DNA immobilisert på polyamidfiltre (tilgjengelige i handelen som "Hybond" fra Amersham, U.K.) ved metoder som er kjente innenfor teknikken. Et komplementært oligonukleotid ("Sorneo") og et ikke-komplementært oligonukleotid (dvs. kontroll-nukleotid) ("pAT 153") ble anvendt som mål ved en standard Southem-blot-prosedyre under anvendelse av det sensibilisatormerkede oligonukleotid som probe. Mål-oligonukleotidene ble bestemt ved konsentrasjoner på 0,2 ug, 0,02 ug og 0,002 ug. Prøven ble konsentrert i en flekk på 2 x 2 cm. Hybridiseringen ble gjennomført med 200 ug/ml sensibilisatormerket oligonukleotid ved 37°C i 2 timer i hybridiseringsbuffer (6x SSC, 0,5% SDS, 100x Denhardts), og vaskingen ble gjennomført på vanlig måte. In performing a nucleic acid hybridization assay, DNA was immobilized on polyamide filters (commercially available as "Hybond" from Amersham, U.K.) by methods known in the art. A complementary oligonucleotide ("Sorneo") and a non-complementary oligonucleotide (ie, control nucleotide) ("pAT 153") were used as targets by a standard Southern blot procedure using the sensitizer-labeled oligonucleotide as a probe. The target oligonucleotides were determined at concentrations of 0.2 µg, 0.02 µg and 0.002 µg. The sample was concentrated in a spot of 2 x 2 cm. The hybridization was carried out with 200 ug/ml sensitizer-labeled oligonucleotide at 37°C for 2 hours in hybridization buffer (6x SSC, 0.5% SDS, 100x Denhardt's), and the washing was carried out in the usual way.

Etter fullstendig hybridisering og vasking ble 50 lx IO"6 M 9-(adaman-tyliden)- N-metylacridan i diklortoluen tilsatt til hver hybridiseringsflekk. Hver flekk ble bestrålt med en ultrafiolett strålingskilde (150 W xenon-buelampe) i 10 minutter i nærvær av omgivende molekylært oksygen. Halvdelen av flekkene ble også oppvarmet til 100°C umiddelbart etter bestrålingen for å fremkalle nedbryting av dioksetanet som ble dannet ved bestrålingen. After complete hybridization and washing, 50 lx 10"6 M 9-(adamantylidene)-N-methylacridane in dichlorotoluene was added to each hybridization spot. Each spot was irradiated with an ultraviolet radiation source (150 W xenon arc lamp) for 10 minutes in the presence of ambient molecular oxygen.Half of the spots were also heated to 100°C immediately after irradiation to induce decomposition of the dioxetane formed by irradiation.

Luminescensen av de dioksetaner som nedbrytes ble målt ved anvendelse av et fotoforsterkerrør (tilgjengelig i handelen fra Thorn EMI, type 9813 QB), som ble holdt ved 0°C i et termoelektrisk avkjølt standardhus. Prøvene som skulle måles, ble anbrakt i et lystett kammer på en oppvarmingsblokk. Et termoelement montert i varmeplaten muliggjorde temperaturkontroll (± 0,1 °C i området 30-300°C) av varmeelementene direkte under varmeplaten. Prøvecellen ble også lukket hermetisk for å muliggjøre måling under den ønskede atmosfære. The luminescence of the degraded dioxetanes was measured using a photoamplifier tube (commercially available from Thorn EMI, type 9813 QB), which was maintained at 0°C in a thermoelectrically cooled standard housing. The samples to be measured were placed in a light-tight chamber on a heating block. A thermocouple mounted in the hotplate enabled temperature control (± 0.1 °C in the range 30-300°C) of the heating elements directly under the hotplate. The sample cell was also hermetically sealed to enable measurement under the desired atmosphere.

De oppnådde luminescensmålinger er sammenfattet i tabellene 1 og 2. The obtained luminescence measurements are summarized in tables 1 and 2.

Selv om resultatene er oppnådd ved en rå og uforfinet bestemmelsesprosedyre, ga oppvarmningen i alle tilfeller et sterkere signal, og det komplementære mål ga flere tellinger enn kontrollmålet. Metoder til forfining av denne bestemmelsesprosedyre (f.eks. bedre bortvaskning av hver type av reagens, tilsetning av inhibitorer for å nedsette auto-oksydasjon av olefinet, anvendelse av mer effektive sensibilisatorer, anvendelse av de rette filtre for den primære bølgelengde som absorberes av sensibilisatoren, avkjøling av flekken mens den bestråles, regulering og/eller optimering av oppvarmningshastigheten, anvendelse av mer reaktive olefiner, anvendelse av olefiner som danner dioksetaner som gir høyere lysutbytte, og anvendelse av løsemidler for å fremme vandring av singlett-oksygen) vil være nærliggende for en fagmann. Although the results were obtained by a crude and unrefined determination procedure, in all cases the heating gave a stronger signal and the complementary measure gave more counts than the control measure. Methods for refining this determination procedure (e.g. better washing away of each type of reagent, addition of inhibitors to reduce autoxidation of the olefin, use of more effective sensitizers, use of the right filters for the primary wavelength absorbed by the sensitizer , cooling the spot while it is irradiated, regulation and/or optimization of the heating rate, use of more reactive olefins, use of olefins that form dioxetanes that give a higher light yield, and use of solvents to promote the migration of singlet oxygen) will be close to a professional.

EKSEMPEL II EXAMPLE II

Probebestemmelsen ifølge det foregående eksempel kan anvendes med porfyrin-merkede oligonukleotider. Det porfyrinmerkede (sensibilisatormerkede) oligo-nukleotid kan dannes ved anvendelse av N<6->(6-aminoheksyl)-dATP (i det følgende betegnet "AHdATP"), som er vist nedenfor: The probe determination according to the previous example can be used with porphyrin-labeled oligonucleotides. The porphyrin-labeled (sensitizer-labeled) oligonucleotide can be formed using N<6->(6-aminohexyl)-dATP (hereinafter referred to as "AHdATP"), which is shown below:

DNA underkastes en nick-translasjon på kjent måte i nærvær av AHdATP for å danne strenger av DNA, som har frie funksjonelle Ntb-grupper. Dette produkt omsettes med NHS-esterporfyrinkonjugat i nærvær av DMF/H2O på kjent måte for å danne strenger av DNA, hvortil det er bundet: DNA is subjected to nick translation in a known manner in the presence of AHdATP to form strands of DNA having free Ntb functional groups. This product is reacted with NHS ester porphyrin conjugate in the presence of DMF/H2O in a known manner to form strands of DNA, to which it is bound:

EKSEMPEL III EXAMPLE III

Probebestemmelsen ifølge de foregående eksempler ble gjentatt under anvendelse av protoporfyrindinatriumsalt som merke. 5 ul av dCTP, dGTP og dTTP (20 uM) ble tilsatt til 1 ul prøve-DNA (pUG), 3 ul 0,4 raM AHdATP og 10 ul H20. Etter kort blanding ble det tilsatt 5 ul DNA-polymerase I. Blandingen ble deretter inkubert ved 15°C i 60 minutter. Inkorporeringen ble overvåket på kjent måte. DNA som er merket med aminoheksalgruppen, ble deretter skilt fra ikke-inkorporerte nukleotider ved utelukkelseskromatografi på en "Sephadex G-50"-kolonne, idet det ble eluert med 1 x 5SC inneholdende 0,1% SDS. Fraksjoner ble oppsamlet, fulgt av utfelling med etanol. Etter omsetning ifølge eksempel II med NHS-esterproto-porfyrin ble probebestemmelsen gjennomført ifølge eksempel I. DNA ble immobilisert på polyamidfiltre. Komplementært oligonukleotid ble anvendt som mål ved en standard Southern blot-prosedyre under anvendelse av det sensibilisatormerkede oligonukleotid som probe ifølge eksempel I. De resulterende flekker ble oppvarmet til 100°C umiddelbart etter bestråling for å fremkalle nedbryting av dioksetanet dannet ved bestrålingen. The probe determination according to the previous examples was repeated using protoporphyrin disodium salt as label. 5 µl of dCTP, dGTP and dTTP (20 µM) were added to 1 µl sample DNA (pUG), 3 µl 0.4 rM AHdATP and 10 µl H 2 O. After brief mixing, 5 µl DNA polymerase I was added. The mixture was then incubated at 15°C for 60 minutes. The incorporation was monitored in a known manner. DNA labeled with the aminohexal group was then separated from unincorporated nucleotides by size exclusion chromatography on a Sephadex G-50 column, eluting with 1 x 5SC containing 0.1% SDS. Fractions were collected, followed by precipitation with ethanol. After reaction according to example II with NHS ester protoporphyrin, the probe determination was carried out according to example I. DNA was immobilized on polyamide filters. Complementary oligonucleotide was used as a target by a standard Southern blot procedure using the sensitizer-labeled oligonucleotide as a probe according to Example I. The resulting spots were heated to 100°C immediately after irradiation to induce degradation of the dioxetane formed by the irradiation.

EKSEMPEL IV EXAMPLE IV

Eksempel III ble gjentatt under anvendelse av protoporfyrindinatriumsalt og <32>P som samtidige merkestoffer for å sammenligne følsomheten av bestemmelsen ved anvendelse av disse to merkestoffer. 1 ul <32>P-dCTP ble tilsatt blandingen fra eksempel III før tilsetningen av 5 ul DNA-polymerase I. Bestemmelsen ble gjennomført mot følgende konsentrasjoner av mål-DNA: 100 ug Example III was repeated using protoporphyrin disodium salt and <32>P as simultaneous labels to compare the sensitivity of the determination using these two labels. 1 µl <32>P-dCTP was added to the mixture from Example III before the addition of 5 µl DNA polymerase I. The determination was carried out against the following concentrations of target DNA: 100 µg

10 ug 10 ug

1 Hg 1 Hg

0,1 ug 0.1 ug

0,01 ug 0.01 µg

0,005 ug 0.005 ug

blindprøve blind test

Resultatene vist i fig. 2 for oppvarmning av flekkene til 100°C i 1 minutt viser en påvisningsgrense på 0,005 ug mål-DNA ved den ovenfor beskrevne bestemmelse. Alternativt, når det er tale om <32>P-merking, oppviser en 24 timers eksponeringstid i et standard filmdeteksjonssystem en sammenlignbar påvisningsgrense. The results shown in fig. 2 for heating the spots to 100°C for 1 minute shows a detection limit of 0.005 µg target DNA in the above described determination. Alternatively, in the case of <32>P labeling, a 24 hour exposure time in a standard film detection system exhibits a comparable detection limit.

I dette eksempel IV ble det ikke gjort noe forsøk på å nedsette bakgrunnen, når det er tale om sensibilisatormerking. Sensibilisatorer kan utvelges til følsomhet for visse bølgelengder som er forskjellige fra eksitasjonsbølgelengden for bakgrunns-materialene, herunder dannelse av generelle peroksyder. F.eks. kan metylenblått eller pyren anvendes som sensibilisator, og det kan inkorporeres et eksitasjonsfilter, således at kun bølgelengder som eksiterer disse sensibilisatorer, vil medføre dannelse av singlett-oksygen. Oppvarmning av membranen kan gi bakgrunnslys fra oppvarmning av generelle peroksyder. Fremkallelse av nedbryting av dioksetaner ved lavere spaltingstemperaturer vil hjelpe til med å nedsette bakgrunns-avlesningene, særlig når slike temperaturer er meget lavere enn en temperatur som bevirker bakgrunnslys. Endelig bør olefinet velges slik at det dannes et dioksetan som emitterer ved en annen bølgelengde enn bakgrunnen. Et emisjonsfilter kan da utvelges til å redusere bakgrunnen. Det forutses at disse og andre forbedringer vil øke følsomheten av bestemmelsene med anvendelse av sensibilisatormerking vesentlig. In this example IV, no attempt was made to reduce the background when it comes to sensitizer labeling. Sensitizers can be selected for sensitivity to certain wavelengths that are different from the excitation wavelength for the background materials, including the formation of general peroxides. E.g. methylene blue or pyrene can be used as a sensitizer, and an excitation filter can be incorporated, so that only wavelengths that excite these sensitizers will lead to the formation of singlet oxygen. Heating of the membrane can produce background light from heating of general peroxides. Inducing decomposition of dioxetanes at lower cleavage temperatures will help to reduce the background readings, especially when such temperatures are much lower than a temperature that causes background light. Finally, the olefin should be chosen so that a dioxetane is formed which emits at a different wavelength than the background. An emission filter can then be selected to reduce the background. It is anticipated that these and other improvements will significantly increase the sensitivity of the determinations using sensitizer labeling.

Claims

1. Specific binding determination of the presence of an analyte in a sample, characterized by formation of one or more specific binding reaction products as in holding a sensitizer conjugate wherein a sensitizer is bound to a specific binding material; providing the sensitizer conjugate in a sample containing an analyte in said sample by excitation of the sensitizer contained in said one or more specific binding reaction products containing the sensitizer conjugate or excitation of the sensitizer contained in the sensitizer conjugate not contained in said one or more specific binding reaction products, and reaction of the excited sensitizer either with molecular oxygen or with a leuco dye to form a detectable signal, and measuring the detectable signal.

2. Specific binding determination according to claim 1, characterized in that the specific binding material is capable of specific binding with the analyte, and where said one or more specific binding reaction products is an analyte-sensitizer conjugate complex.

3. Specific binding determination according to claim 1, characterized in that the determination further uses a reactant capable of specific binding (i) with the analyte to form an analyte-reactant complex and (ii) with the specific binding material to form a sensitizer conjugate-reactant complex, the said one or more specific binding reaction products being the sensitizer conjugate-reactant complex.

4. Specific binding determination according to claim 1, characterized in that the specific binding material is capable of specific binding to the analyte, and the determination further uses a reactant that is capable of specific binding to the analyte to form a reactant analyte-sensitizer conjugate complex, said one or more specific binding reaction products being the reactant analyte-sensitizer conjugate complex.

5. Specific binding determination according to claim 1, characterized in that the sensitizer is selected from the group consisting of a dye, a porphyrin, a metal porphyrin, an aromatic hydrocarbon, a heterocyclic compound and a flavin derivative.

6. Specific binding determination according to claim 5, characterized in that the sensitizer is pyrene or methylene blue.

7. Specific binding determination according to claim 5, characterized in that the porphyrin is protoporphyrin dimethyl ester, protoporphyrin disodium salt, methylpyrroporphin ethyl ester, methylpyrroporphin, tetraphenylporphin, co-porphyrin or hematoporphyrin.

8. Specific binding determination according to claim 5, characterized in that the sensitizer is phthalocyanine, hemin or rhodamine.

9. Specific bond determination according to claim 1, characterized in that the molecular singlet oxygen reacts with an olefin to form a group selected from the group consisting of a dioxetane and a peroxide.

10. Specific binding determination according to claim 9, characterized in that the said group is broken down by heating and forms the detectable signal as a photon.

11. Specific binding determination according to claim 9, characterized in that the peroxide oxidizes a chromogen to form the detectable signal as a color change or fluorescence of the chromogen.

12. Specific bond determination according to claim 9, characterized in that the olefin is a substituted olefin.

13. Specific bond determination according to claim 12, characterized in that the substituted olefin has at least one substituent which is an electron-donating group.

14. Specific bond determination according to claim 12, characterized in that at least two of the substituents on the substituted olefin are connected to form a ring group which is fluorescent.

15. Specific bond determination according to claim 14, characterized in that the substituted olefin has the formula and that the ring group is an N-methyl-acridan group.

16. Specific binding determination according to claim 1, characterized in that the leuco-dye is oxidized to form the detectable signal as a color change or fluorescence of the leuco-dye.

17. Specific binding determination according to claim 1, characterized in that the excited sensitizer is reduced by the leuco-dye and then oxidized by reaction with molecular oxygen to form hydrogen peroxide.

18. Specific binding determination according to claim 17, characterized in that the hydrogen peroxide oxidizes a chromogen to form the detectable signal as a color change or fluorescence of the chromogen.

19. Specific binding determination according to claim 17, characterized in that the hydrogen peroxide oxidizes a chemiluminescent group to form the detectable signal as a photon.

20. Analysis package for determining specific binding, characterized in that it comprises a first container containing a sensitizer conjugate, wherein sensitizer the conjugate comprises a sensitizer bound to a specific binding material, and a second container containing an olefin or a leuco dye.

21. Analysis package according to claim 20, characterized in that the sensitizer is selected from the group consisting of a dye, a porphyrin, a metal porphyrin, an aromatic carbon hydride and a flavin derivative.

22. Analysis package according to claim 20, characterized in that the second container contains an olefin.

23. Analysis package according to claim 22, characterized in that the olefin is a substituted olefin.

24. Analysis package according to claim 23, characterized in that the substituted olefin has at least one substituent which is an electron-donating group.

25. Analysis package according to claim 23, characterized in that at least two of the substituents on the substituted olefin are connected to form a ring group which is fluorescent.

26. Analysis package according to claim 25, characterized in that the substituted olefin has the formula

27. Analysis package according to claim 20, characterized in that the second container contains a leuco dye.

28. Sensitizer conjugate, characterized in that it comprises a sensitizer bound to a specific binding material, the sensitizer conjugate will attain an excited state, react with either molecular oxygen or leuco dye to form a detectable signal, then fall back to the ground state.

29. Sensitizer conjugate according to claim 28, characterized in that the sensitizer that is bound to a specific binding material is selected from the group consisting of a dye, a porphyrin, a metalloporphyrin, an aromatic hydrocarbon, a heterocyclic compound and a flavin derivative.

30. Sensitizer conjugate according to 29, wherein the sensitizer is pyrene or methylene blue.

31. Sensitizer conjugate according to claim 29, characterized in that the sensitizer is protoporphyrin dimethyl ester, protoporphyrin disodium salt, methylpyrroporphinethyl ester, methylpyrroporphin, tetraphenylporphyrin, co-porphyrin or hematoporphyrin.

32. Sensitizer conjugate according to claim 29, characterized in that the sensitizer is phthalocyanine, hemin or rhodamine.

33. Sensitizer conjugate according to claim 28, characterized in that the specific binding material binds specifically to either A, T, C or G.

34. Sensitizer conjugate according to claim 28, characterized in that the specific binding material binds specifically to a polynucleotide segment.

35. Sensitizer conjugate according to claim 28, characterized in that the specific binding material binds specifically to protein or a protein conjugate.

36. Sensitizer conjugate according to claim 36, characterized in that the specific material is an antibody or comprises an antibody fragment.

37. Specific binding determination according to claim 1, characterized in that the sensitizer conjugate comprises a sensitizer bound to a first single-stranded polynucleotide segment, and the determination further uses a conjugate with a chemiluminescent group comprising a chemiluminescent group bound to a second single-stranded polynucleotide segment, the first polynucleotide segment and the second polynucleotide segment is complementary to mutually exclusive parts of a single-stranded target polynucleotide, so that the chemiluminescent group and the sensitizer after hybridization with a single-stranded target polynucleotide are sufficiently close to each other to enable energy transfer from the chemiluminescent group to excitation of the sensitizer.