NO310030B1

NO310030B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av huBMP-3

Info

Publication number: NO310030B1
Application number: NO963789A
Authority: NO
Inventors: Elizabeth A Wang; John M Wozney; Vicki A Rosen
Original assignee: Genetics Inst
Priority date: 1986-07-01
Filing date: 1996-09-10
Publication date: 2001-05-07
Also published as: NO309531B1; NO310029B1; NO963788D0; NO963789D0; NO880701L; NO963788L; NO2003006I2; NO880701D0; NO963789L

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et protein. Proteinet har mulighet for indusering av trusk- og bendannelse.

Ben er et høyt spesialisert vev kjennetegnet ved omfattende matriks-struktur som dannes av fibrøse bunter av proteinet kollagen, og proteoglykaner, ikke-kollagenholdige proteiner, lipider og sure proteiner. Fremgangsmåtene for bendannelse og fornyings/preparering av benvev, som skjer kontinuerlig gjennom livet, utføres av spesialiserte celler. Normal dannelse av langskaft-skjelettdelene hos fostere forutgår for dannelsen av en bruskmodell. Benvekst utføres antagelig av "osteoblaster" (ben-dannende celler), mens ommodellering av ben utføres antageligvis av ben-resorberende celler, som kalles "osteoklaster" og osteoblaster. Forskjellige knokkeldannende, brusk-induserende og ben-induserende faktorer er blitt beskrevet. Se f.eks. Europa patentsøknad 148,155 og 15 9,016 angående diskusjoner derav.

Denne oppfinnelsen tilveiebringer et nytt protein i renset form. Proteinet betegneshu-BMP-3, hvori BMP er ben-morfogent protein. Poteinet er kjennetegnet ved en peptidsekvens som er den samme som, eller i vesentlig grad homolog, til aminosyresekvensen illustrert i tabell IV nedenfor. Proteinet har mulighet for indusering av bendannelse ved et forutbestemt sted. Denne ben-induserende faktoren er videre kjennetegnet ved biokjemiske og biologiske egenskaper som innbefatter en aktivitet ved en konsentrasjon på 10 til lOOOng/gram ben i en in vivo rotte-bendannende analyse som er beskrevet nedenfor. Proteinet i denne oppfinnelsen kan bli kodet av DNA-sekvensene beskrevet i tabellene eller av sekvenser som har mulighet for å hybridisere dertil og som koder for polypeptider ved benvekstfaktor biologiske egenskaper eller andre modifiserte sekvenser som demonstrerer slike egenskaper.

Enda en annen ben-induserende faktor er BMP-3, og er representert ved det bovine homologe bBMP-3. bBMP-3 er kjennetegnet ved DNA-sekvensen og aminosyresekvensen i tabell IV A og B som står for den bovine genome sekvensen. Det blir kjennetegnet av minst en del av en peptidsekvens som er den samme eller vesentlig den samme som aminosyre #1 til og med aminosyre #175 i tabell IV A og B. BMP-3 er videre kjennetegnet ved muligheten til å indusere bendannelse. Den bovine faktoren kan bli benyttet som et verktøy for å oppnå det analoge humane BMP-3 proteinet ifølge oppfinnelsen eller andre pattedyr-ben-induserende proteiner. En riktig karakterisering av denne bovine ben-induserende faktoren tilveiebringer det essensielle "utgangspunktet" for fremgangsmåten som benytter denne sekvensen. Denne fremgangsmåten, som benytter teknikker som er kjent innenfor genetisk konstruering, innbefatter bruk av den bovine DNA-sekvensen som en probe for å screene et humant genomisk eller cDNA-bibliotek; og identifisering av DNA-sekvensene som hybridiserer til probene. En klon med en sekvens som hybridiserer blir renset ved plaque-dannelse og DNA'et isolert derifra, subklonet og utsatt for DNA-sekvensanalyse. Proteinet ifølge oppfinnelsen er et humant hBMP-3 protein, fremstilt ved bruk av denne fremgangsmåten.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for fremstilling av huBMP-3, kjennetegnet ved at den innbefatter dyrking av en mikroorganisme transformert med en vektor inneholdende en DNA-sekvens som koder for huBMP-3 i et egnet kulturmedium, hvor nevnte DNA-sekvens innbefatter nukleotidsekvensen som følger:

og isolering av huBMP-3 fra nevnte kulturmedium.

Oppfinnelsen omfatter også en cDNA-sekvens kjennetegnet ved at den koder for huBMP-3 som innbefatter nukleotidsekvensen som tidligere nevnt, eller en sekvens som hybridiseres dertil under stringente betingelser og som ved ekspresjon koder for et protein som utviser de samme egenskaper som huBMP-3.

Videre omfatter oppfinnelsen også en vektor kjennetegnet ved at den inneholder og kan uttrykke en DNA-sekvens som koder for et humant BMP-3 som tidligere nevnt.

Oppfinnelsen omfatter også en mikroorganisme som inneholder og kan uttrykke vektoren som tidligere nevnt, og at den velges fra gruppen bestående av en bakteriecelle, gjærcelle og en mammalsk celle.

Benvekst-faktoren som tilveiebringes heri innbefatter også faktorer som koder fra sekvensene som ligner sekvensene i

tabellen IV, men hvorpå modifikasjoner er naturlig innbefattet (f.eks. alleliske variasjoner i nukleotidsekvens som kan resultere i aminosyre-forandringer i polypeptidet) eller som er med vilje konstruert. For eksempel, syntetiske polypeptider kan helt eller delvis duplikere kontinuerlige sekvenser av aminosyreresidiene i tabell IV. Disse sekvensene kan i kraft å dele primære, sekundære eller tertiære strukturelle og konformasjons-karaktertrekk med benvekstfaktor polypeptider i tabellen IV kan derfor inneholde felles benvekstfaktor biologiske egenskaper. De kan derfor bli benyttet som biologisk aktive substuenter for naturlig forekommende benvekstfaktor-polypeptider i terapeutiske fremgangsmåter.

Andre spesifikke mutasjoner i sekvensen til benvekstfaktoren beskrevet heri innbefatter modifikasjoner av en eller begge av glykosyleringssetene. Ingen glykosylering eller bare delvis glykosylering resulterer fra aminosyresubstitusjon ved en eller begge asparagin-bundet glykosyleringsgjenkjennings-seter som er tilstede i sekvensen til benvekstfaktorene vist i tabellen IV. Asparagin-bundet glykosylerings-gjenkjennings-setene innbefatter tripeptid-sekvensene som blir spesifikt gjenkjent av hensiktsmessige cellulære glykosyleringsenzymer. Disse tripeptidsekvensene innbefatter enten asparagin-X-threonin eller asparagin-X-serin, hvor X vanligvis er en hvilken som helst aminosyre. Forskjellige aminosyresubstitu-sjoner eller delesjoner ved en eller begge av den første eller tredje aminosyreposisjonene til et glykosylerings-gjenkjenningssete (og/eller aminsyredelesjon ved den andre posisjonen) resulterer i ikke-glykosylering ved den modifiserte tripeptid-sekvensen.

Denne oppfinnelsen innbefatter også de nye DNA-sekvensene, som ikke har noen tilknytning til DNA-sekvenser som koder for andre proteinholdige materialer, og som koder ved ekspresjon for benvekstfaktorer. DNA-sekvensen innbefatter den som er fremstilt i tabellen IV i en 5' til 3' retning og de sekvensene som hybridiserer under stringente hybridiseringsbetingelser [se T. Maniatis et al, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), sidene 387 til 389] til DNA-sekvensene i tabellen IV. DNA-sekvenser som hybridiserer til sekvensen i tabell IV under andre hybridiseringsbetingelser og som kode ved ekspresjon for benvekstfaktorer som har benvekstfaktor-biologiske egenskaper også koder for benvekstfaktorer i denne oppfinnelsen. For eksempel, en DNA-sekvens som deler områder med signifikant homologi, f.eks. glykosyleringsseter eller disulfid-bindingsseter, med sekvensene i tabellene IV og som koder for en benvekstfaktor som har en eller flere benvekstfaktor-biologiske egenskaper koder helt klart for et medlem av denne nye vekstf aktorf aml lien, selv om ikke en slik DNA-sekvens ville hybridisere stringent til sekvensen i tabell -

IV.

DNA-sekvensen som koder for benvekstfaktor-polypeptidet som kodes av sekvensene i tabellene II - VIII, men som har forskjellig kodon-sekvens på grunn av degenerasjon av den genetiske koden eller alleliske variasjoner (naturlig forekommende baseforandringer i arts-populasjonen som kan eller behøver ikke å resultere i aminosyreforandring) koder også for de nye vekstfaktorene beskrevet heri. Variasjoner i DNA-sekvensen i tabellen IV som skyldes punktmutasjoner eller som skyldes induserte modifikasjoner for å øke aktiviteten, halveringstiden eller fremstilling av polypeptidene som kodes fra denne DNA-sekvensen er også innbefattet i denne oppfinnelsen.

Fremstilling av den nye benvekstinduserende faktoren innbefatter dyrking av egnede celler eller cellelinjer, som er blitt transformert med en DNA-sekvens som ved ekspresjon koder for et nytt benvekstfaktor-polypeptid i oppfinnelsen, under kontroll av kjente regulatoriske sekvenser. Egnede celler eller cellelinjer kan innbefatte pattedyrceller, såsom kinesisk hamster ovarie-celler (CHO). Seleksjon av egnede pattedyr-vertsceller og fremgangsmåter for transformasjon, oppdyrking, ampi ifikasjon, screening og produktfremstilling og rensing er kjent innenfor fagområdet. Se, f.eks., Gething og Sambrook, Nature, 293:620-625 (1981), eller alternativt, Kaufman et al, Mol. Cell. Biol., 5(7 ): 1750-1759 (1985 ) eller Howley et al, U.S. Patent 4,419,446. En annen egnet pattedyr-cellelinje, som er beskrevet i de vedlagte eksemplene er ape COS-1 cellelinje. En annen nyttig pattedyr-cellelinje er CV-1 cellelinje.

Bakterieceller er egnede verter. For eksempel, de forskjellige E. coli stammene (f.eks. HB101, MC1061) er velkjente vertsceller innenfor bioteknologi-området. Forskjellige B. subtilis, Pseudomonas-stammer, andre bakterier og lignende kan også bli benyttet i denne fremgangsmåten.

Mange gjærcellestammer som er kjent innenfor fagområdet er også tilgjengelige som vertsceller for ekspresjon av polypeptidene i denne oppfinnelsen. I tillegg, når det er ønskelig, kan insekts-celler bli benyttet som vertsceller i fremgangsmåtene i denne oppfinnelsen. Se f.eks. Miller et al, Genetic Engineering, 8:277-298 (Plenum Press 1986) og referanser som er beskrevet deri.

Vektorene ifølge oppfinnelsen inneholder fortrinnsvis hele den nye DNA-sekvensen som er beskrevet ovenfor som koder for nye faktorer i denne oppfinnelsen. Disse vektorene inneholder i tillegg hensiktsmessige ekspresjonskontroll-sekvenser som tillater ekspresjon av beninduserende proteinsekvenser. Vektorer som inneholder modifiserte sekvenser som beskrevet ovenfor er også innbefattet i denne oppfinnelsen og nyttige ved fremstilling av beninduserende proteiner. Vektorene kan bli benyttet i fremgangsmåten som transformerer cellelinjer og som inneholder selekterte regulatoriske sekvenser i operativ assosiasjon med DNA-kodingssekvensene til oppfinnelsen som kan lede replikasjonen og ekspresjonen derav i selekterte vertsceller. Egnede regulatoriske sekvenser for slike vektorer er kjent for de som kjenner fagområdet og kan bli selektert avhengig av de selekterte vertsceller. Slik seleksjon er rutine og danner ikke deler av denne oppfinnelsen.

Proteinet fremstilt ved denne oppfinnelsen, som induserer benvekst i de tilfeller hvor ben normalt ikke dannes, kan benyttes til leging av benbrudd. Et knokkeldannende preparat som innbefatter en eller flere av proteinene i denne oppfinnelsen kan ha profylaktisk bruk ved lukkede som åpen bruddreduksjon og også ved en forbedret fiksering av kunstige ledd. Ny bendannelse indusert av et knokkeldannende middel deltar i reparasjon av kongenital, skadeindusert eller onkologisk bortskjæring induserte kranie-ansikts defekter, og kan også benyttes i den kosmetiske plastiske kirurgien. En-knokkeldannende faktor i oppfinnelsen kan være verdifull i behandling av tannrotshinne-sykdommer, og i andre tann-reparasjons-fremgangsmåter. Slike midler kan tilveiebringe et miljø for å tiltrekke bendannende celler, stimulere vekst av bendannende celler eller indusere differensiering av stam-celler til bendannende celler. Proteinet fremstilt ifølge oppfinnelsen kan også brukes i annen terapi.

En terapeutiske fremgangsmåte kan innbefatte lokal administrering av preparatet som et implantat eller innretning. Når det blir administrert, er det terapeutiske preparatet som blir brukt i denne oppfinnelsen, selvfølgelig, i en pyrogen-fri, fysiologisk akseptabel form. Preparatet kan hvis ønskelig være forkapslet eller bli injisert i en viskøs form for å føre det til benskade-stedet. Benvekst-induserende faktorpreparatet innbefatter helst en matriks som kan levere den beninduserende faktoren til benskade-stedet, og tilveiebringer en struktur for ben og brusk som utvikles og som eventuelt blir resorbert i kroppen. Slike matrikser kan bli dannet fra andre materialer som nå er i bruk ved andre implanterte medisinske forhold.

Valg av materiale er basert på, for eksempel, biokompatibili-tet, biodegradabilitet, mekaniske egenskaper, kosmetisk fremstilling og interfase-egenskaper. Bruk av de benvekst-induserende faktorene vil definere den hensiktsmessige formuleringen. Potensielle matrikser for benvekstinduserende faktorer kan være bionedbrytbare og kjemisk definerte, såsom men ikke begrenset til, kalsiumsulfat, trikalsiumfosfat, hydroksyapatit, polyleddiksyre, polyanhydrider; bionedbrytbare og biologisk veldefinerte, såsom ben eller hud-kollagen, andre rene proteiner eller ekstracellulære matrikskomponen-ter; ikke-bionedbrytbare og kjemisk definerte, såsom sintret hydroksyapatitt, bioglass, aluminat, eller andre keramikk; eller kombinasjoner av hvilke som helst av de ovenfor nevnte materialtypene, såsom polyleddiksyre og hydroksyapatit eller kollagen og trikalsiumfosfat. Biokeramikken kan også bli* forandret i komposisjon, såsom i kalsium-aluminat-fosfat og fremstilling for å forandre for eksempel porestørrelse, partikkelstørrelse, partikkelform og biodegradabiliteten.

Doseregimet vil bli bestemt av behandlende lege som avhenger av forskjellige faktorer som modifiserer virkning av slike vekstfaktorer, f.eks. mengde benvekt som er ønskelig at det blir dannet, stedet for benskaden, tilstanden til det skadede benet, pasientens alder, kjønn og diett, alvorlighetsgraden til infeksjoner, tidspunkt for administrering og andre kliniske faktorer. Dosen kan variere med matrikstyper som blir brukt til rekonstruksjon og sammensetningen av BMP'ene. Tilsetting av andre kjente vekstfaktorer, såsom IGF 1 (insulin-lignende vekstfaktor 1), til det endelige preparatet, kan også påvirke dosen. Generelt så bør doseregimet være i området på omtrent 10 til 10^ nanogram protein per gram benvekt som er ønskelig. Fremskritt kan bli avlest ved periodisk bestemmelse av benvekst og/eller reparasjon, f.eks. ved røntgen. Slike terapeutiske preparater er også nå verdifulle for veterinær-medisinsk bruk på grunn av mangel på arts-spesifisitet i beninduserende faktorer. Spesielt husdyr og fullblods hester i tillegg til mennesker er ønskelige pasienter for slik behandling med beninduserende faktorer i denne oppfinnelsen.

Følgende eksempler illustrerer bruk av denne oppfinnelsen i utvinning og karakterisering av bovine proteiner og bruk av disse til å utvinne humane proteiner, oppnåelse av disse humane proteinene og uttrykking av disse proteinene via rekombinante teknikker.

Eksemplene som følger nedenfor omfatter også andre beninduserende faktorer enn den som er omfattet av oppfinnelsen.

Eksempel I

Isolering av bovin beninduserende faktor.

Malt bovin-benpulver (20-120 mesh, Helitrex) er fremstilt i henhold til fremgangsmåten til M.R. Urist et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA, 70:3511 (1973) med eliminering av noen av ekstraheringsstegene som identifisert nedenfor. Ti kg malt pulver blir demineralisert i påfølgende skiftinger av 0.6N HC1 ved 40 C over en 48-timers periode med vigorøs røring. Den resulterende suspensjonen blir ekstrahert i 16 timer ved 4°C med 50 liter 2M CaCl2 og lOmM etylendiamin-tetraeddiksyre (EDTA), og etterfulgt av ekstraksjon i 4 timer i 50 liter 0.5M EDTA. Resten blir vasket tre ganger med destillert vann før det blir resuspendert i 20 liter 4M guanidin-hydroklorid [GuCl] , 20 mM Tris (pH 7.4), lmM N-etylmaleimid, ImM jodo-acetamid, ImM fenylmetylsulfonyl-fluorin som beskrevet i Clin. Orthop. Rel. Res., 171: 213 (1982). Etter 16 til 20 timer blir supernatanten fjernet og erstattet med nye 10 liter GuCl-buffer. Resten ble ekstrahert i 24 timer til.

De rå GuCl ekstraktene blir slått sammen, konsentrert omtrent 20 ganger på et Pellicon-apparat med 10,000 molekylvekt av kuttings-membran, og deretter dialysert i 50mM Tris, 0. IM NaCl, 6M urea (pH7.2), som er utgangsbufferen for den første kolonnen. Etter lang dialyse blir proteinet applisert på en 4 liter DEAE cellulose-kolonne og de ubundede fraksjonene blir samlet.

De ubundne fraksjonene blir konsentrert og realisert mot 50mM NaAc, 50mM NaCl (pH 4.6) i 6M urea. De ubundne fraksjonene ble applisert på en karboksymetyl-cellulosekolonne. Protein som ikke bindes til kolonnen blir fjernet ved en omfattende vasking med utgangsbufferen, og materialet som inneholder beninduserende faktor blir desorbert fra kolonnen med 50mM NaAc, 0.25mM NaCl, 6M urea (pH 4.6). Proteinet fra dette steget blir konsentrert 20- til 40- ganger, deretter fortyn-net 5 ganger med 80mM KPO4, 6M urea (pH6.0). pH til denne oppløsningen blir justert til 6.0 med 500mM K2HPO4. Prøven blir applisert på en hydroksyapatitt-kolonne (LKB) ekvilibrert i 80mM KPO4, 6M urea (pH6.0) og alle ubundne proteinene blir fjernet ved å vaske kolonnen med den samme bufferen.-Beninduserende faktoraktivitet blir eluert med lOOmM KPO4 (pH7.4) og 6M urea.

Proteinet blir konsentrert omtrent 10 ganger, og fast NaCl blir tilsatt til en final konsentrasjon på 0.15M. Dette materialet blir applisert på en heaprin- Sepharose kolonne ekvilibrert i 50m KP04, 150mM NaCl, 6M urea (pH7.4). Etter omfattende vasking av kolonnen med utgangsbufferen, blir et protein med beninduserende faktoraktivitet eluert med 50mM KP04, 700mM NaCl, 6M urea (pH7.4). Denne fraksjonen blir konsentrert til et minimalt volum, og 0.4ml aliquoter blir applisert på Superose 6 og Superose 12 kolonner koblet i serier, ekvilibrert med 4M GuCl, 20mM Tris (pE7.2) og kolonnene dannet ved en elueringshasighet på 0.25ml/min. Proteinet som demonstrerer beninduserende faktoraktivitet har en relativ vandring som korresponderer til omtrent 30,000 dalton protein.

Fraksjonene ovenfor blir slått sammen, dialysert mot 50mM NaAc, 6M urea (pH4.6), og applisert på en Pharmacia MonoS HR kolonne. Kolonnen blir utviklet med en gradient på 1. OM NaCl, 50mM NaAc, 6M urea (pH4.6). De aktive fraksjonene blir slått sammen og bragt til pH3.0 med 10$ trifluoroeddiksyre (TFA). Materialet blir applisert på en 0.46 x 25 cm Vydac C4 kolonne i 0.1* TFA og kolonnen utviklet med en gradient på 90* acetonitril, 0.1* TFA (31.5* acetonitril, 0.1* TFA til 49.5* acetonitril, 0.1* TFA i 60 minutter ved lml per . minutt). Aktivt materiale blir eluert ved omtrent 40-44* acetonitril. Aliquoter av de hensiktsmessige fraksjonene blir jodinert ved hjelp av en av de følgende metodene: P.J. McConahey et al, Int. Arch. Allergy, 29:185-189 (1966); A.E. Bolton et al, Biochem J., 133_529 (1973); og D.F. Bowen-Pope, J. Biol. Chem., 237:5161 (1982). De jodinerte proteinene som er tilstede i disse fraksjonene blir analysert ved SDS gelelektroforese og urea Triton X 100 isoelektrisk fokusering. Ved dette stadiet blir den beninduserende faktoren beregnet til å være omtrent 10-50* rent.

Eksempel II

Karakterisering av bovin- beninduserende faktor.

A. Molekylvekt.

Omtrent 20jjg protein fra Eksempel I blir frysetørret og gjen-oppløst i IX SDS prøvebuffer. Etter 15 minutter oppvarming ved 37°C, blir prøven applisert til en 15* SDS polyakrylamid-gel og deretter elektroforert med kjøling. Molekylvekten blir bestemt relativt til fargede molekylvektstandarder (Bethesda Research Labs). Rett etter at den er ferdig, blir gel-filen som inneholder den beninduserende faktoren kuttet til 0.3cm deler. Hver dele blir moset og 1.4 ml 0.1* SDS tilsatt. Prøvene blir svakt rystet over natt ved romtemperatur for å eluere proteinet. Hver gel-bit blir avsaltet for å forhindre interferens i den biologiske analysen. Supernatanten fra hver prøve blir surgjort til pH 3.0 med 10* TFA, filtrert gjennom 0.45 mikron membran og applisert på en 0.46cm x 5cm C4 Vydac kolonne utviklet med en gradient på 0.1* TFA til 0.1* TFA, 90* CH3CN. De hensiktsmessige beninduserende-faktor-inneholdende fraksjonene blir slått sammen og rekonstituert med 20mg rotte-matriks. I dette gelsystemet har hoveddelen av beninduserende-faktorfraksjon-ene en mobilitet som et protein som har molekylvekt på omtrent 28,000 - 30,000 daltons.

B. Isoelektrisk fokusering.

Det isoelektriske punktet til beninduserende faktoraktivitet blir bestemt i en denaturerende isoelektrisk fokuseringssys-tem. Triton X100 urea gel-systemet (Hoeffer Scientific) blir modifisert som følger: 1) 40* av amfolyttene som blir brukt er Servalyte 3/10; 60* er Servalyte 7-9. 2) Katolytten som blir brukt er 40mM NaOH. Omtrent 20jjg av protein fra Eksempel I blir frysetørret, løst opp i prøvebuffer og applisert på isoelektrofokuserende gelen. Gelen blir kjørt ved 20 watt, 10° C i omtrent 3 timer. Ved fullførelse blir filen som inneholder beninduserende faktor kuttet i 0.5 cm biter. Hver bit blir knust i 1. Oml 6M urea, 5mM Tris (pH 7.8) og prøvene blir ristet ved romtemperatur. Prøvene blir surgjort, filtrert, avsaltet og analysert som beskrevet ovenfor. Hoveddelen av aktiviteten slik den blir bestemt i analysen beskrevet i eksempel III vandrer på en måte som tyder med en pl på 8.8 - 9.2.

C. Subenhet karakterisering.

Subenhet-komposisjon til beninduserende faktor blir også bestemt. Ren beninduserende faktor blir isolert fra en preparativ 15* SDS-gel som beskrevet ovenfor. En del av prøven blir deretter redusert med 5mM DTT i prøvebuffer og elektroforert på nytt på en 15* SDS-gel. Det omtrent 30kd proteinet gir to hovedbånd ved omtrent 20kd og 18kd, likeledes et mindre bånd ved 30kd. Bredden på de to båndene indikerer heterogenitet som skyldes sannsynligvis glykosylering, andre post-translasjonsmodifikasjoner, protelytisk degradering eller karbamylering.

Eksempel III

Biologisk aktivitet til den beninduserende faktoren.

En rotte-bendannelse analyse i henhold til de generelle fremgangsmåtene til Sampath og Eeddi, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 80:6591-6595 (1983) blir brukt til å bestemme den knokkeldannende aktiviteten til den bovine beninduserende faktoren i denne oppfinnelsen som ble oppnådd i eksempel I. Denne analysen kan også bli brukt til å bestemme beninduserende faktorer i andre arter. Etanolpresipitasjonssteget blir erstattet med dialysering av fraksjonen som skal bli analysert mot vann. Oppløsningen eller suspensjonen blir deretter gjenoppløst i et flyktig oppløsningsmiddel, f.eks. 0.1 - 0.2* TFA, og den resulterende oppløsningen blir deretter satt til 20mg rotte-matriks. Dette stoffet blir frosset og frysetørket og det resulterende pulveret blir lagt inn i #5 gelatinkapsler. Kapslene blir implantert subkutant i brystbuk-området i 21 - 49 dag gamle hankjønns lang Evans-* rotter. De implanterte stoffene blir fjernet etter 7-10 dager. Halvparten av hvert stoff som blir implantert blir brukt i alkalisk fosf ataseanalyser [se A.H. Reddi et al., Proe. Nati Acad Sei., 69:1601 (1972)] og halvparten blir fiksert og preparert for histologisk analyse. Lum glykolmet-acrylat-seksjoner blir vanligvis farget med Von Kossa og syrefuschin for å detektere nye benmineraler. Alkalisk fosfatase er et enzym som dannes av kondroblaster og osteo-blåster i løpet av matriksdannelse, blir også målt. Ny knokkel og bendannelse henger ofte sammen med alkalisk fosfatasenivåer. Tabell I nedenfor illustrerer doseresponsen i rotte-matriksprøver inkludert en kontroll som ikke er behandlet med induserende faktor.

<*>På dette stadiet er den beninduserende faktoren omtrent 10-15% ren.

Ben eller knokler som blir dannet er fysisk begrenset til området som okkuperes av matriksen. Prøver blir også analysert ved SDS gelelektroforese og isoelektrisk fokusering som beskrevet ovenfor, etterfulgt av autoradiografi. Analysene viser en korrelasjon mellom aktivitet og proteinbåndende ved 28 - 30kd og ved pl 9.0. En ekstinksjonskoeffisient på 1 OD/mg-cm blir brukt som et estimat for protein og for en omtrentelig bestemmelse av renheten til den beninduserende faktoren i en bestemt fraksjon. I de in vivo rotte-bendannelse analysene gjort på fortynninger som beskrevet ovenfor, er proteinet aktivt in vivo ved 10 til 200ng protein/gram ben til sannsynligvis høyere enn øre protein/gram ben.

Eksempel IV

Bovin beninduserende faktor protein- sammensetning.

Proteinsammensetningen i eksempel IIA med molekylvekt 28 - 30 kd blir redusert som beskrevet i eksempel IIC og kuttet med trypsin. Åtte tryptiske fragmenter blir isolert ved hjelp av standard fremgangsmåte som har følgende aminosyresekvenser:

Fragment 1: AAFLGD IALDEEDLG

Fragment 2:AFQVQQAADL

Fragment 3: NYQDMVVEG

Fragment 4: STPAQDVSR

Fragment 5: N Q E A L R

Fragment 6: LSEPDPSHTLEE

Fragment 7: F D A Y Y

Fragment 8: LKPSN7ATIQSIVE

Et mindre rent proteinpreparat fra bovinben blir fremstilt i henhold til et rensningsskjerna som ligner det som er beskrevet i eksempel I. Rensingen er noe forskjellig fra det som tidligere er beskrevet fordi den utelater DE-52 kolonnen, CM-cellulose kolonnen og mono S kolonnen, likeledes en reverser-ing i rekkefølgen av hydroksylapatitt og heparing sefarose-kolonner. Det konsentrerte rå 4 M ekstraktet bringes til 85* final konsentrasjon etanol ved 4 grader. Blandingen blir deretter sentrifugert, og presipitatet blir deretter igjen løst opp i 50 mM Tris, 0.15 M NaCl, 6.0 M urea. Dette materialet blir deretter fraksjonert på Heparin Sepharose som beskrevet. Det Heparinnbundne materialet blir fraksjonert på hydroksyapatitt som beskrevet. De aktive fraksjonene blir slått sammen, konsentrert og fraksjonert ved høy-resolusjon gel-filtrering (TSK 30000 i 6 M guanidin-klorid, 50 mM Tris, pH 7.2). De aktive fraksjonene blir slått sammen, dialysert mot 0.1* TFA, og deretter fraksjonert på en C4 Vydac revers-fase kolonne som beskrevet. Preparatet blir redusert og elektroforert på en akrylamidgel. Proteinet som korresponderer til 18K-båndet blir eluert og kuttet med trypsin. Tryptiske fragmenter blir isolert og har følgende aminosyresekvenser:

Fragment 9:SLKPSNHATIQS?V

Fragment 10: SFDAYYCS7A

Fragment 11: VYPNMTVESCA

Fragment 12: VDFADI ? W

De tryptiske fragmentene 7 og 8 er vesentlig lik fragmentene 10 og 9, respektivt.

A. bBMP- 1

Prober bestående av oligonukleotid-pools (eller unike oligonukleotider) er betegnet i henhold til fremgangsmåten til R. Lathe, J. Mol. Biol., 183 (1):1-12 (1985) og fremstilt på en automatisert DNA-syntesemaskin. En probe består av en relativ lang (32 nukleotider) "guessmer" [se J.J. Toole et al., Nature, 312:342-347 (1984)] med følgende nukleotidsekvens.

TCCTCATCCAGGGCAATGTCGCCCAGGAAGGC

På grunn av at den genetiske koden er degenerert (mer enn et kodon kan kode for samme aminosyre), blir antall nukleotider i en probe-pool redusert basert på frekvensen hvorpå kodonet blir brukt i eukaryoter, den relative stabiliteten til G:T baseparene, og den relative sjeldne hyppigheten av dinukleo-tidet CpG i eukaryote kodingssekvenser [se Toole et al., ovenfor]. Det andre probe-settet består av kortere oligonukleotider (lengder på 17 nukleotider) som inneholder alle mulige sekvenser som aminosyrene kan kodes fra. Det andre probesettet har følgende sekvens:

(a) A [A/G] [A/G] TC [T/C] TC [T/C] TC [A/G] TC [T/C] AA

(b) A [A/G] [A/G] TC [T/C] TC [T/C] TC [A/G] TCNAG

Nukleotidene som står i parentes står for alternativer. "N" betyr enten A, T, C eller G.

I begge tilfeller blir områdene til aminosyresekvenser som blir brukt for probedannelse valgt ved å unngå kodoner som er sterkt degenererte hvor dette er mulig. Oligonukleotder blir fremstilt på en automatisert DNA-syntesemaskin; probene blir deretter radioaktivt merket med polynukleotid-kinase og <32p_>

ATP.

Disse to probesettene blir brukt til å screene et bovint genomisk rekombinant bibliotek. Biblioteket blir fremstilt som følger: Bovint lever-DNA blir delvis kuttet med restrik-sjons-endonuklease enzym Sau 3A og sedimentert gjennom et sukrosegradient. Størrelse fraksjonert DNA i området på 15-30kb blir deretter ligert til bakteriofag Barn HI vektor EMBL3 [Frischauf et al, J. Mol. Biol., 170:827-842 (1983)]. Biblioteket blir deretter platet med 8000 rekombinanter per skål. Duplikate nitrocellulose-kopier av plaquene blir utført og amplifisert i henhold til en modifikasjon av fremgangsmåten til Woo et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75:3688-91 (1978).

32-mer proben blir kinasebehandlet med <32p_>gamma_£<rrp> og hybridisert til et filtersett 5X SSC, 0.1* SDS, 5X Denhardts, lOOjjg/ml laksesperm-DNA ved 45 grader C og vasket med 5X SSC, 0.1* SDS ved 45 grader C. 17-mer probene blir kinasebehandlet og hybridisert til det andre filtersettet i 3M tetra-metylammonium-klorid (TMAC), 0.1M natriumfosfat pH6.5, ImM EDTA, 5X Denhardts, 0.6* SDS, lOOpg/ml laksesperm-DNA ved 48 grader C, og vasket i 3M TMAC, 50mM Tris pH8.0 ved 50 grader C. Ved disse betingelsene minimaliseres deteksjon av galt parrede nukleotider til 17-mer probe-pool'en [se Wood et al, Proe. Nati. Acad. Sei, U.S.A., 82:1585-1588 (1985)]. 400,000 rekombinanter blir screenet ved hjelp av denne fremgangsmåten og et positivt duplikat blir plaque-renset. DNA blir isolert fra et skål-lysat fra denne rekombinante bakteriofagen betegnet lambda bP-50. bP-50 ble deponert Desember 16, 1986 til the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD, USA (heretter "ATCC") under aksesjonsnummer 40295. Dette og det andre som er deponert heri opprettholder Budapest Treaty når det gjelder "International Recognition of-the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and Regulations thereunder". Denne bp-50 klonen koder i hvert fall for en del av den bovine benvekstfaktoren betegnet bBMP-1.

Oligonukleotid-hybridiseringsområdet til denne bBMP-1 klonen er lokalisert til et omtrentelig 800bp Eco RI fragment som blir subklonet inn i M13 og sekvensert ved bruk av standard teknikker. Den partielle DNA-sekvensen og den avledete aminosyresekvensen til lambda bP-50 er vist nedenfor i tabell II. Aminosyresekvenser som korresponderer til de tryptiske fragmentene isolert fra bovin-ben 28 til 30kd materialet er understreket i tabell II. Den første understrekede delen av sekvensen korresponderer til tryptisk fragment 1 ovenfor som oligonukelotidprobene er konstruert fra. Den andre understrekede delen korresponderer til tryptisk fragment 2 ovenfor. De antatte aminosyresekvensene indikerer at tryptisk fragment 2 forutgåes av et basisk residium (R) som er ventet i henhold til spesifisiteten til trypsin. Nuklein-syre-sekvensen som forutgås av den koblede CT ved nukleotid-posisjoner #292-293 i tabell II er antatt å være et intron (ikke-kodende sekvens) basert på tilstedeværelse av en konsensus akseptor-sekvens (dvs. et pyrimidinrikt området, TCTCTCTCC, etterfulgt av AG) og mangel på det basiske residiet i den hensiktsmessige posisjonen til den avledete aminosyresekvensen. Denne bBMP-1 genome sekvensen fremgår i tabell II. Den presumptive bBMP-1 peptidsekvensen fra denne genome klonen har en lengde på 37 aminosyrer og kodes fra DNA-sekvensen fra nukleotid #294 til og med #404 i tabell II.

b. bBMP- 2

To prober bestående av oligonukleotid-pooler er konstruert på basis av aminosyresekvensen til fragment 3 og fremstilt på en automatisert DNA-syntesemaskin som beskrevet ovenfor.

Probe #1:ACNACCAT [A/G] T C [T/C] T G [A/G] A T Probe #2: C A [A/G] G A [T/C] ATGGTNGTNGA

Disse probene er radioaktivt merket og blir brukt til å screene det bovine genome biblioteket konstruert som beskrevet i del A med unntagelse av vektoren er lambda Jl Barn Hl armer [Mullins et al Nature 308: 856-858 (1984).] Den radioaktivt merkede 17-mer probe #1 blir hybridisert til filtersettene i henhold til fremgangsmåten for 17-mer proben beskrevet i del A.

400,000 rekombinanter blir screenet ved fremgangsmåten beskrevet ovenfor i del A. Et positivt duplikat blir plaque-renset og DNA'et blir isolert fra et skål-lysat av den rekombinante bakteriofagen betegnet lambda bP-21. Bakteriofag bP-21 ble deponert med ATCC under aksesjonsnummer ATCC 40310 6. mars, 1987. bP-21-klonet koder for bovin vekstfaktor betegnet bBMP-2.

Oligonukleotid-hybridiserende området til denne bBMP-2 klonen blir lokalisert til et omtrentelig 1.2 kb Sac I restriksjonsfragment som blir subklonet inn i M13 og sekvensert ved bruk av standard teknikker. Den partielle DNA-sekvensen og DNA-avledete aminosyresekvensen til dette Sac I fragmentet og det tilstøtende Hind III-Sac I restriksjonsfragmentet til bP-21 er vist nedenfor i tabell III. bBMP-2 peptidsekvensen fra denne klonen har en lengde på 129 aminosyrer og blir kodet fra DNA-sekvensen fra nukleotid #1 til og med nukleotid #387. Aminosyresekvensen som korresponderer til det tryptiske fragmentet isolert fra bovin-ben 28 til 30kd materialet er understreket i tabell III. Den understrekede delen av sekvensen korresponderer til tryptisk fragment 3 ovenfor som-oligonukleotidprobene for bBMP-2 er konstruert fra. Den antatte aminosyresekvensen indikerer at det tryptiske fragment 3 forutgått av et basisk residium (K) som er ventet på grunnlag av spesifisiteten til trypsin. Arginin-residiet som kodes av CGT-tripletten er antatt å være karboksy-termini til proteinet som er basert på tilstedeværelsen av et stoppkodon (TAG) som ligger ved siden av.

C. bBMP- 3

Prober bestående av oligonukleotid-pooler blir konstruert på basis av aminosyresekvensen til det tryptiske fragment 9 (probe #3), 10 (probe #2), og 11 (probe #1), og fremstilt på en automatisert DNA-syntesemaskin.

Probe #1: ACNGTCAT [A/G] T T N G G [A/G] T A

Probe #2: CA [A/G] T A [A/G] T A N G C [A/G] T C [A/G] A A

Probe #3: T G [A/G/T] ATNGTNGC [A/G] T G [A/G] T T

Et rekombinant bovint genomisk bibliotek konstruert i EMBL3 blir screenet ved bruk av TMAC hybridisasjonsfremgangsmåten beskrevet ovenfor i del A. 400,000 rekombinanter blir screenet i duplikat form med probe #1 som er blitt merket med <32>p. Alle rekombinanter som hybridiserer til denne proben blir platet om for å åpne sekundære. Triplikate nitrocellulose kopier blir laget av de sekundære skålene, og amplifisert som beskrevet. De tre filtersettene blir hybridisert til probe #1, #2 og #3, igjen under TMAC-betingelser. En klon, lambda bP-819, hybridiseres til alle tre probene og blir plaque-renset og DNA'et blir isolert fra et skål-lysat. Bakteriofag lambda bP-819 ble deponert med ATCC 16. juni, 1987 under aksesjonsnummer 40344. Denne bP-819-klonen koder for den bovine vekstfaktoren betegnet bBMP-3.

Regionen til bP-819 som hybridiseres til probe #2 blir lokalisert og sekvensert. Det partielle DNA'et og den avledete aminosyresekvensen til denne regionen er vist i-tabell IVA. Aminosyresekvensene som korresponderer til tryptisk fragment 10 og 12 er understreket. Den første understrekede sekvensen korresponderer til fragment 12 mens den andre korresponderer til fragment 10. Dette området av bP-819, som hybridiserer til probe #2 koder i hvert fall for 111 aminosyrer. Denne aminosyresekvensen blir kodet fra DNA-sekvensen fra nukleotid #414 til og med #746.

bP-819 området som hybridiserer til probe #1 og #3 blir lokalisert og sekvensert. Det partiellet DNA'et og den avledete aminosyresekvensen til dette området er vist i tabell IVB. Aminosyresekvensene som korresponderer til de tryptiske fragmentene 9 og 11 er understreket. Den første understrekede sekvensen korresponderer til fragment 9, mens<* >den andre understrekede sekvensen korresponderer til fragment 11. Den peptide sekvensen til dette området av bP-819 som hybridiserer til probe #1 og #3 har en lengde på 64 aminosyrer som kodes av nukleotid #305 til og med #493 i tabell IVB. Argininresidiet som blir kodet fra AGA-tripletten er antatt å være karboksy-termini til proteinet som er basert på tilstedeværelsen av et stopp-koden (TAA) som ligger ved siden av det. Nukleinsyresekvensen som forutgår den koblede TC

(posisjoner 305-306) er antatt å være et intron (ikke-kodende sekvens) som er basert på tilstedeværelse av en konsensus akseptor-sekvens (dvs. et pyrimidin-rikt område, TTCTCCCTTTTCGTTCCT, etterfulgt av AG) og tilstedeværelsen av en stopp i stedet for et basisk residium 1 den hensiktsmessige posisjonen av den avledete aminosyresekvensen.

bBMP-3 er derfor karakterisert ved DNA og aminosyresekvensen i tabell IV A og tabell IV B. Peptldsekvensen til denne klonen har en lengde på 175 aminosyrer og blir kodet fra DNA-sekvensen fra nukleotid #414 til og med nukleotid #746 i tabell IV A og nukleotid #305 til og med nukleotid #493 i tabell IV B.

Eksempel V

Humane beninduserende faktorer.

A. hBMP- 1

På grunn av at bovine og humane benvekstfaktorgener er antatt å være signifikant homologe, blir den bovine bBMP-1 DNA-sekvensen i tabell II (eller deler derav) brukt som en probe til å screene et humant genomisk bibliotek. 800bp EcoRI fragmentet til den bovine genome klonen blir merket med <32>P ved nick-translasjon. Et humanet genomisk bibliotek (Toole et al., supra) blir platet på 20 skåler med 40,000 rekombinanter per skål. Duplikate nitrocellulose filterkopier blir laget av hver skål og hybridisert til nick-translatert probe i 5 X SSC, 5 X Denhardt' s, lOOjjg/ml denaturert laksesperm DNA, 0.1* SDS (standard hybridisasjons-oppløsninger) ved 50 grader C i omtrent 14 timer. Filtrene blir deretter vasket i 1 X SSC, 0.1* SDS ved 50 grader og utsatt for autoradiografi. Fem positive duplikater blir isolert og plaque-renset. DNA tilveiebringes fra et skål-lysat til en av disse rekombinante bakteriofag, betegnet LP-Hl. LP-H1 ble deponert ved ATCC 6. mars, 1987 under aksesjonsnummer 40311. Denne klonen koder i hvert fall for en del av den humane genome benvekstf aktor betegnet hBMP-1. Hybridiseringsområdet til LP-H1 er lokalisert til et 2.5 kb Xbal/Hindlll restriksjonsfragment.

Den partielle DNA-sekvensen og avledete aminosyresekvensen til lambda LP-E1 er vist nedenfor i tabell V. Peptidsekvensen fra denne klonen har en lengde på 37 aminosyrer og blir kodet fra DNA-sekvensen fra nukleotid #3440 til og med nukleotid #3550. Den kodende sekvensen i tabell V er flankert av omtrent 28 nukleotider (en antatt 5' ikke-kodende sekvens) og omtrent 19 nukleotider (en antatt 3' ikke-kodende sekvens). En sammenligning av bBMP-1 sekvensen i tabell II med hBMP-1 genomisk sekvens i tabell V indikerer den signifi-kante homologien mellom de to.

På grunnlag av størrelsen av de kodende områdende og posisjo-nene til ikke-kodende områdene generelt er konservert i-homologe gener fra forskjellige arter, så kan beliggenhetene til de kodende og ikke-kodende områdene til beninduserende faktorgenene bli identifisert. Homologiområder mellom genene til de to artene, flankert av RNA-prosesserings-signaler ved homologe seter, indikerer et kodende område.

En probe som er spesifikk for den humane kodende sekvensen gitt i tabell V blir brukt til å identifisere en human cellelinje eller vev som fremstiller beninduserende faktor. Proben lages i henhold til følgende fremgangsmåte. To oligonukleotlder som har følgende sekvenser:

( a) GGGAATTCTGCCTTTCTTGGGGACATTGCCCTGGACGAAGAGGACCTGAG

(b) CGGGATCCGTCTGAGATCCACAGCCTGCTGTACCTGGAAGGCCCTCAGG

fremstilt på en automatisert syntesemaskin, sammensmeltet, utvidet ved bruk av Klenow-f ragmentet til E. coli DNA-polymerase I, kuttet med restriksjonsenzymer Eco RI og Bam HI, og satt inn i en M13 vektor. En enkelt-trådet <32>P-merket probe blir deretter fra templatfremstilling av denne subklonet ved bruk av standard teknikker. Polyadenylerte RNA'er fra forskjellige celle- og vevskilder blir deretter elektroforert på formaldehyd-agarosegeler og overført til nitrocellulose ved bruk av fremgangsmåten til Toole et al., ovenfor. Proben blir deretter hybridisert til nitrocellulose blottet i 50* formamid, 5 X SSC, 0.1* SDS, 40 mM natriumfosfat pH 6.5, 100 pg/ml denaturert laksesperm DNA, og 5 mM* vanadyl ribonukleosider ved 42<*>C over natt og vasket ved 65<*>C i 0.2 X SSC, 0.1* SDS. Etter autoradiografi, inneholder filen som inneholder RNA fra den humane osteosarkoma cellelinjen U-2 OS hybridiserende bånd som korresponderer RNA-arter på omtrentelig 4.3 og 3.0 kb.

cDNA blir fremstilt fra U-2 OS polyadenylert RNA og klonet inn i lambda gtlO ved bruk av etablerte teknikker (Toole et

al., ovenfor). 20,000 rekombinanter fra dette biblioteket blir platet på hver av 50 skåler. Duplikate nitrocellulose kopier blir laget av skålene. De ovenfor beskrevne oligo-nukleotidene blir kinasebehandlet med <32>P-gamma-ATP og hybridisert til de to replika-settene ved 55° C i standard hybridisasjonsoppløsning over natt. Filtrene ble deretter vasket i 1 X SSC, 0.1* SDS ved 55°C og utsatt for autoradiografi. Et positivt duplikat, betegnet lambda U20S-1, blir plaque-renset. Lambda U20S-1 ble deponert med ATCC 16. juni, 1987 under aksesjonsnummer 40343.

Hele nukleotidsekvensen og avledete aminosyresekvensen av innskuddet til lambda U20S-1 er gitt i tabell VI. Denne cDNA klonen koder for en Met etterfulgt av en hydrofob ledersekvens som er karakteristisk for et protein som utskilles, og inneholder et stoppkodon ved nukleotidposisjonene 2226-2228. Denne klonen inneholder en åpen leseramme på 2190bp, som koder for et protein på 730 aminosyrer med en molekylvekt på 83kd som er basert på denne aminosyresekvensen. Klonen inneholder en sekvens som er identisk til det kodende området gitt i tabell V. Dette proteinet antas å representere et primært translasjonsprodukt som blir kuttet ved utskillelse og danner dermed hBMP-1 protein. Denne klonen er derfor et cDNA for hBMP-1 som korresponderer til det humane genfragmen-tet i den genome hBMP-1 sekvensen lambda LP-H1. Aminosyrene #550 til #590 til BMP-1 er homolog til overhuds-vekstfaktor og "vekstfaktor" domenene til protein C, faktor X og faktor

IX.

B. hBMP- 2: Klasse I og II

Hindlll-SacI bovine genome bBMP-2 fragmentet beskrevet i eksempel IV B. blir subklonet inn i M13 vektoren. En <32>P-merket enkelt-trådet DNA-probe blir laget fra et templat preparat av denne subklonen. Denne proben blir brukt til å'* screene polyadenylert RNA'er fra forskjellige celle og vevskilder som beskrevet ovenfor i del A. Et hybridisert bånd som korresponderer til en mRNA-form på omtrentelig 3.8 kb blir detektert i filen som inneholder RNA fra den humane cellelinjen U-2 OS. Hindlll-SacI fragmentet blir merket med <32>P ved nick-translasjon og brukt til å screene nitrocellulose-filterkopiene til ovenfor-beskrevne U-2 OS cDNA biblioteket ved hybridisasjon i standard hybridisasjonsbuffer ved 65" over natt etterfulgt av vasking i 1 X SSC, 0.1* SDS ved 65° C. Tolv positive duplikate kloner blir plukket og platet på ny for å oppnå sekundærer. Duplikate nitrocellulose-kopier er laget av de sekundære skålene og begge settene hybridisert til den bovine genome proben slik som den primære screeningenble utført. Et filtersett ble deretter vasket i 1 X SSC, 0.1* SDS; og den andre 0.1 X SSC, 0.1* SDS ved 65°C.

To klasser av hBMP-2 cDNA kloner er tydelige basert på sterke (4 rekombinanter) eller svake (7 rekombinanter) hybridisa-sjonssignaler under de mere stringente vaskebetingelsene (0.1 X SSC, 0.1* SDS). Alle 11 rekombinante bakteriofag blir plaque-renset, DNA-preparering i liten skala fra skål-lysatene av hver, og innskuddene subklonet inn i pSP65 og inn i M13 for sekvensanalyse. Sekvensanalyser av de sterkt hybridiserende klonene betegnet hBMP-2 klasse I (også kjent som BMP-2) indikerer at de har omfattende sekvenshomologi med sekvensen gitt i tabell III. Disse klonene er derfor cDNA'er som koder for den humane ekvivalenten til proteinet so kodes av bBMP-2 genet hvor dens partielle sekvens er gitt i tabell III. Sekvensanalyser av de svakt hybridiserende rekombinantene betegnet hBMP-2 klasse II (også kjent som BMP-4) indikerer at de også er ganske homologe til sekvensen gitt i tabell III ved 3'enden av deres kodende områder, men mindre i de mere 5' områdene. De koder dermed for et humant protein med lignende, men ikke identisk, struktur til det ovenfor.

hBMP-2 klasse I cDNA-kloner med full lengde oppnås på følgende måte. 1.5 kb innskuddet til en av klasse II - subkloner (II-10-1) blir isolert og radioaktivt merket ved nick-translasjon. Et sett av nitrocellulose-kopiene til U-2 OS cDNA-biblioteket screenet ovenfor (50 filtere, korrespond-erende til 1,000,000 rekombinante bakteriofag) blir rehybrid-isert med denne proben under stringente betingelser (hybridi-sering ved 65° i standard hybridsasjonsbuffer; vask ved 65° i 0.2 X SSC, 0.1* SDS). Alle rekombinantene som hybridiserer til den bovine genome proben som ikke hybridiserer til klasse

II proben blir plukket og plaque-renset (10 rekombinanter). Det blir laget stokker fra skålene og det blir laget bakteriofag DNÅ-preparater i liten skala. Etter subkloning inn i M13, indikerer sekvensenanalysen at 4 av disse representerer kloner som overlapper den opprinnelige klasse I klonen. En av disse, lambda U20S-39, inneholder et innskudd på omtrent 1.5 kb og ble deponert ved ATCC 16. juni, 1987 under aksesjonsnummer 40345. Den partielle DNA-sekvensen (utarbei-det fra lambda U20S-39 og flere andre hBMP-2 klasse I cDNA rekombinanter) og avledet aminosyresekvens er vist nedenfor i tabell VII. Lambda U20S-39 er ventet å inneholde hele nukleotidsekvensen som er nødvendig for å kode hele det humane motstykket til protein BMP-2 klasse II som blir kodet fra det bovine gen-segmentet hvor dets partielle sekvens er presentert i tabell III. Denne humane cDNA hBMP-2 klasse II inneholder en åpen leseramme på 1188 bp, som koder for et protein på 396 aminosyrer. Dette proteinet på 396 aminosyrer har en molekylvekt på 45kd som er basert på denne aminosyresekvensen. Det antas at denne sekvensen representerer det primære translasjonsproduktet. Proteinet forutgås av et 5' ikke-translatert område på 342 bp med stopp-kodoner i alle rammer. Det 13 bp området som forutgår dette 5' ikke-translaterte området står for en linker som blir brukt i cDNA-klonings fremgangsmåtene. Full-lengde hBMP-2 klasse II human cDNA kloner tilveiebringes på følgende måte. Det 200 bp EcoRI-SacI fragmentet fra 5<* >enden til klasse II rekombinant II-10-1 blir isolert fra dets plasmid-subklon, merket ved nick-translasjon og hybridisert til ét sett av duplikate nitrocellulosekopier av U-2 OS cDNA-bibliotek (251 filtere/sett; representerer 500,000 rekombinanter). Hybridisasjon og vasking utføres under stringente betingelser som beskrevet ovenfor. 16 positive duplikater blir plukket og omplatet for å oppnå sekundaerer. Nitrocellulose-filterkopiene til de sekundære skålene blir laget og hybridisert til et oligonukleotid som ble fremstilt for å korrespondere til sekvensen til II-10-1 og har følgende sekvens:

Hybridisasjon gjøres i standard hybridisasjonsbuffer ved 50°C med vasking ved 50° i 1 X SSC, 0.1* SDS. 14 rekombinante bakteriofag som hybridiserer til denne oligonukleotiden blir plaque-renset. Stokker fra skålene blir laget og bakteriofag DNA-preparater laget i liten skala. Etter subkloning av 3 av disse inn i M13, indikerer sekvensanalysen på at de står for kloner som overlapper den opprinnelige klasse II klonen. En av disse, lambda U20S-3, ble deponert med ATCC under aksesjonsnummer 40342, 16. Juni, 1987. U20S-3 inneholder et innskudd på omtrent 1.8 kb. Den partielle DNA-sekvensen og avledet aminosyresekvens til U20S-3 er vist nedenfor i tabell VIII. Denne klonen er ventet å inneholde hele den nukleotidsekvensen som er nødvendig for at den koder for hele humane BMP-2 klasse II protein. Denne cDNA inneholder en åpen leseramme på 1224 bp, som koder for et protein på 408 aminosyrer, som forutgås av et 5' ikke-translatert område på 394 bp med stoppkodoner i alle rammer, og inneholder en 3' ikke-translatert område på 308 bp etter stoppkodonet i riktig leseramme. Det 8 bp-området som forutgår det 5' ikke-translaterte området står for en linker som brukes ved cDNA kloningsfremgangsmåten. Dette proteinet på 408 aminosyrer har molekylvekt på 47kd og antas å stå for det primære translasj onsproduktet.

Sekvensene til BMP-2 klasse I og II, og BMP-3 som vist i

tabellene III, IV, VII og VIII har signifikant homologi til beta (B) og beta (A) subenhetene til inhibinene. Inhibinene er en familie hormoner som nå investigeres for bruk ved, prevensjon. Se A.J. Mason et al., Nature, 318:659-663

(1985). De er også 1 mindre grad homologe til Mullerian inhiberende substans (MIS), som er et testikulært glykopro-tein som hører til regresjon av Mullerian-kanalen i løpet av utvikling av hankjønns-embryo og transformerende vekstfaktor-beta (TGF-b) som kan inhibere eller stimulere vekst av celler eller få dem til å differensiere. Sekvensen 1 tabell VII som koder for hBMP-2 klasse II har signifikant homologi til Drosophila dekapentaplegic (DPP-C) locus transcript. Se J. Massague, Cell, 49:437-438 (1987); R.W. Padgett et al, Nature, 325:81-84 (1987); R.L. Cate et al, Cell 45: 685-698

(1986). Det er derfor mulig at BMP-2 klasse II er den humane protein-homologen laget fra dette transkriptet fra dette utviklingsmutant-locuset.

C. BMP- 3

Fordi bovine og humane benvekstfaktor-gener er antatt å være signifikant homologe, blir oligonukleotide prober som har vist seg å hybridisere til bovine DNA-sekvenser fra tabell IV.A og IV.B brukt til å screene et humant genomisk bibliotek. Et humant genomisk bibliotek (Toole et al., ovenfor) blir screenet ved bruk av disse probene, og presumptive positiver blir isolert og DNA-sekvensen tilveiebragt som beskrevet ovenfor. Tegn på at denne rekombinanten koder for en del av det humane beninduserende faktormolekylet ligger på bovin/human proteinet og genstruktur-homologier.

Når en rekombinant bakteriofag som inneholder DNA som koder for en del av det humane BMP-3 molekylet blir oppnådd i den humane kodende sekvensen blir brukt som en probe som beskrevet i eksempel V (A) for å identifisere en human cellelinje eller vev som fremstiller BMP-3. mRNA blir selektert ved oligo (dT) cellulose-kromatografi og cDNA blir fremstilt og klonet i lambda gtlO ved bruk av etablerte teknikker (Toole et al., ovenfor).

Alternativt så kan hele genet som koder for denne humane beninduserende faktoren bli identifisert og tilveiebragt i flere rekombinante kloner hvis nødvendig. Flere rekombinanter som inneholder flere 3' eller 5' regioner av dette humane beninduserende faktorgenet kan tilveiebringes ved identifisering av unike DNA-sekvenser ved enden(e) til den opprinnelige klonen og deretter bruke disse probene til på ny å screene det humane genome biblioteket. Genet kan deretter bli på nytt samlet i et enkelt plasmid ved bruk av standard moleky-lær-biologiske teknikker og amplifisert i bakterier. Hele det humane BMP-3 faktorgenet kan deretter bli overført til en hensiktsmessig ekspresjonsvektor. Ekspresjonsvektoren som inneholder genet blir deretter transfektert inn i en patte-dyrcelle, f.eks. ape COS celler, hvor det humane genet blir transkribert og RNA'et spleiset på en riktig måte. Media fra de transfekterte cellene blir analysert for beninduserende faktoraktivitet som beskrevet heri som en indikasjon på at genene er fullstendige. mRNA oppnås fra disse cellene og cDNA blir fremstilt fra denne mRNA kilden og klonet. Fremgangsmåten beskrevet ovenfor kan på lignende måte blir benyttet for å isolere andre arters beninduserende faktor som er av interesse ved bruk av den bovine beninduserende faktoren og/eller den humane beninduserende faktoren som en probekilde. Slik annen arts beninduserende faktor viser seg å kunne bli benyttet ved, blant annet, reparasjon av brudd.

Eksempel VI

Ekspresjon av beninduserende faktor

For å fremstille bovine, humane eller andre pattedyr-ben-induserende faktorer, blir DNA som koder for det overført til en hensiktsmessig ekspresjonsvektor og introdusert inn i pattedyrceller ved bruk av konvensjonelle genetiske konstruk-sjonsteknikker .

En som er kjent innenfor fagområdet kan konstruere pattedyr-ekspresjonsvektorer ved bruk av sekvensen i tabellene II-VIII eller andre modifiserte sekvenser og kjente vektorer, såsom pCD (Okayama et al., Mol. Cell Biol., 2:161-170 (1982)] og pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4:645-653 (1985 )]. Transformering av disse vektorene inn i hensiktsmessige vertsceller kan resultere i ekspresjon av benvekstinduserende faktorer. En som er kjent innenfor fagområdet kan manipulere sekvensene i tabellene II - VIII ved eliminering eller erstatning av pattedyr-regulatoriske sekvenser som flankerer den kodende sekvensen med bakterielle sekvenser for dannelse av bakterielle vektorer for intracellulær eller ekstracellu-lær ekspresjon ved bakterielle celler. For eksempel, så kan de kodende sekvensene videre bli manipulert (f.eks. ligert til andre kjente linkere eller modifisert ved deletering av ikke-kodende sekvenser derfra eller forandring av nukleotider deri ved bruk av andre kjente teknikker). Den kodende sekvensen til den modifiserte beninduserende faktoren kunne deretter bli satt inn i en kjent bakteriell vektor ved bruk av fremgangsmåter slik som er beskrevet i T. Taniguchi et al., Proe. Nati Acad. Sei. USA, 77:7230-5233 (1980). Denne bakterielle vektoren kunne deretter bli transformert inn i bakterielle vertsceller og dermed så kunne beninduserende faktor bli uttrykt. En strategi for fremstilling av ekstra-cellulær av beninduserende faktor i bakterie-celler, se f.eks. Europa patentsøknad EPA 177,343.

Lignende manipulasjoner kan bli utført ved konstruksjon av en insektvektor [se f.eks. fremgangsmåter beskrevet i publisert Europa-patentsøknad 155,476] for ekspresjon i insektceller. En gjærvektor kan også bli konstruert ved bruk av gjær-regulatoriske sekvenser for intracellulær eller ekstracellu-lær ekspresjon av faktorene i denne oppfinnelsen ved gjærceller. [Se f.eks. fremgangsmåter beskrevet i publisert PCG søknad W086/00639 og Europa patentsøknad EPA 123,289].

En fremgangsmåte for fremstilling av store mengder av en benvekststimulerende faktor i oppfinnelsen fra pattedyrceller innbefatter konstruksjon av celler som inneholder flere kopier av det heterologe beninduserende faktorgenet. Det heterologe genet kan bli knyttet til en amplifiserbar markør,-f.eks. dihydrofolat reduktase (DHFR) genet hvorpå celler som inneholder økende genkopier kan bli selektert for propagering i økende konsentrasjoner av metotreksat (MTX) i henhold til fremgangsmåten til Kaufman og Sharp, J. Mol. Biol., 159:601-629 (1982). Denne fremgangsmåten kan bli benyttet for et stort antall forskjellige celletyper.

For eksempel, så kan et plasmid som inneholder en DNA-sekvens for en beninduserende faktor i oppfinnelsen som er i operativ assosiasjon med andre plasmidsekvenser som muliggjør ekspresjon derav og DHFR ekspresjonsplasmid pAdA26SV(A)3 [Kaufman og Sharp, Mol. Cell. Biol., 2:1304 (1982)] kan bli ko-introdusert inn i DEFR-defekte CHO-celler, DUKX-BII, ved kalsiumfosfat ko-presipitasjon og transfeksjon. Transforman-ter som uttrykker DEFR blir selektert for vekst i alfa-medium med dialysert føtalt kalveserum, og deretter selektert for amplifikasjon ved vekst i økende konsentrasjoner av MTX (påfølgende steg i 0.02, 0.2, 1.0 og 5uM MTX) som beskrevet i Kaufman et al., Mol Cell Biol., 5:1750 (1983). Transforman-ter blir klonet, og biologisk aktiv beninduserende faktorekspresjon blir bestemt ved rotte bendannelse-analyse. Beninduserende faktorekspresjon bør øke med økende nivåer av MTX motstand. Lignende fremgangsmåter kan følges for å fremstille andre beninduserende faktorer.

Alternativt, så kommer det humane genet direkte til uttrykk, som beskrevet ovenfor. Aktivt beninduserende faktor kan bli fremstilt i bakterier og gjærceller. Det ekspresjonssystemet som for tiden er å foretrekke for biologisk aktivt rekombinant human beninduserende faktor er stabilt transformerte CEO-celler.

Som et spesifikt eksempel, for å fremstille den humane beninduserende faktoren (hBMP-1) i eksempel V, blir innskuddet til U20S-1 frigjort fra vektorarmene ved kutting med Sal I og subklonet inn i pattedyr-ekspresjonsvektor pMT2CX kuttet-med Xho I. Plasmid dNA fra denne subklonen blir transfektert inn i COS-celler ved DEAE-dekstran-fremgangsmåten [Sompayrac og Danna PNAS 78:7575-7578 (1981); Luthman og Magnusson, Nucl.Acids Res. 11: 1295-1308 (1983)]. Serum-fritt 24 t kondisjonert medium blir samlet fra cellene 40-70 t etter transfeksj onen.

Pattedyr-ekspresjonsvektor pMT2 Cla-Xho (pMT2 CX) er et derivat av p91023 (b) (Wong et al., Science 228:810-815, 1985 ) som er forskjellig fra den sistnevnte ved at den inneholder ampicillin resistens-genet istedenfor tetracyklin-resistensgenet og at den videre inneholder et Xhol sete for innsetting av cDNA-kloner. De funksjonelle elementene til pMT2 Cla-Xho er blitt beskrevet (Kaufman, R.J., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:689-693) og innbefatter adenovirus VA-gener, SV40 replikasjonsorigo som innbefatter den 72 bp forsterkeren, adenovirus hoved-senpromoter innbefattet et 5' spleise-sete og hovedparten av adenovirusets tredelte ledersekvens som er tilsted epå adenovirus sen mRNA'er, et 3' spleise-akseptorsete, et DHFR innskudd, SV40 tidlig polyade-nyleringssete (SV40), og pBR322 sekvenser som er nødvendig for propagering i E. coli.

Plasmid pMT2 Cla-Xho oppnås ved EcoRI kutting av pMT2-VWF, som er blitt deponert ved the American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD (USA) under aksesjonsnummer ATCC 67122. EcoRI kutting kutter cDNA-innskuddet som er tilstede i pMT2-VWF ut, som gir pMT2 i lineær form som kan bli ligert og brukt til å transformere E. coli HB 101 eller DH-5 til ampicillin resistens. Plasmid pMT2 DNA kan bli fremstilt ved bruk av konvensjonelle fremgangsmåter. pMT2CX blir deretter konstruert ved kutting av pMT2 med Eco RV og Xbal, behandling av det kuttede DNA'et med Klenow-fragment av DNA-polymerase I, og ligering av Cla-linkere (NEBiolabs, CATCGATG). Dette fjerner basene 2266 til 2421 med utgangspunkt fra Hind III setet nær SV40 replikasjonsorigo og forsterkersekvensen til pMT2. Plasmid DNA blir deretter kuttet med EcoRI, gjort butt som ovenfor, og ligert til en EcoRI adapter,

5' PO4-AATTCCTCGAGAGCT 3'

3' GGAGCTCTCGA 5'

kuttet med Xhol, og ligert, som gir pMT2 Cla-Xho, som deretter kan bli brukt til å transformere E. coli til ampicillin-resistens. Plasmid pMT2 Cla-Xho DNA kan bli fremstilt ved konvensjonelle fremgangsmåter.

Eksempel VII

Biologisk aktivitet til uttrykt beninduserende faktor A. BMP-1

For måling av den biologiske aktiviteten til uttrykt beninduserende faktor (hBMP-1) tilveiebragt i eksempel VI ovenfor, blir faktoren delvis renset på en Heparin Sepharose kolonne. 4 ml av transfeksjons-supernatanten fra en 100 mm skål blir konsentrert omtrent 10 ganger ved ultrafiltrering på en YM 10 membran og deretter dialysert mot 20mM Tris, 0.15 M NaCl, pH 7.4 (utgangsbuffer). Dette materialet blir deretter applisert på en 1.1 ml Heparin Sepharose kolonne i utgangsbuffer. Ubundede proteiner blir fjernet ved bruk av en 8 ml vask med utgangsbuffer, og bundne proteiner, innbefattet BMP-1, blir desorbert ved en 3-4 ml vask med 20 mM Tris, 2.0 M NaCl, pH 7.4.

Proteinene som bindes av Heparin-kolonnen blir konsentrert omtrent ti-ganger på en Centricon 10 og saltet reduseres ved diafiltrering med 0.1* trifluoreddiksyre. Den hensiktsmessige mengden av denne oppløsningen blir blandet med 20 mg rottematriks og deretter analyser for in vivo ben- eller brusk-dannelse som nylig beskrevet i eksempel III. En falsk transfeksjons-supernatant fraksjonering blir brukt som en kontroll.

Stoffene som er implantert som inneholder rotte-matriks til hvilket det er tilsatt spesifikke mengder av human BMP-1 blir fjernet fra rottene etter syv dager og prosessert for-histologisk evaluering. Represenative seksjoner fra hvert implantat blir farget for tilstedeværelse av nye benmineraler med von Kossa og syre-fuschin, og for tilstedeværelse av brusk-spesifikk matriksdannelse ved bruk av toluidin blå. Typer av celler som er tilstede innenfor seksjonen, blir evaluert likeledes i hvilken grad disse cellene utviser fenotype.

Tilsetting av human BMP-1 til matriksmaterialet resulterte i dannelse av brusk-lignende klumper 7 dager etter implanta-sjon. Bruskdannende-type celler er det mulig å gjenkjenne ved form og ekspresjon av metakromatisk matriks. Aktivitetsmeng-den observert for human BMP-1 var avhengig av mengden av human BMP-1 protein som var satt til matriksen. Tabell IX illustrerer dose-respons-sammenhengen mellom human BMP-1 protein og mengde ben-induksjon som observeres.

Brusk (c) aktivitet ble angitt på en skala på O(-) til 5.

Lignende aktivitetsnivåer blir sett i Heparin Sepharose fraksjonerte COS-celle-ekstrakter. Partiell opprensning oppnås på en lignende måte som beskrevet ovenfor med unntagelse av at 6 M urea er innbefattet i alle buffere. I en rotte-bendannelse-analyse som beskrevet ovenfor, har BMP-2 på* lignende måte demonstrert bruskdannende aktivitet.

Fremgangsmåtene beskrevet ovenfor kan bli benyttet for å isolere andre beninduserende faktorer som er av interesse ved bruk av de bovine beninduserende faktorene og/eller humane beninduserende faktorer som probe-kilde. Slike andre beninduserende faktorer kan være nyttige ved, blant annet, reparasjon av brudd.

De foregående beskrivelsene beskriver de foretrukne fremstil-lingene av denne oppfinnelsen. Mangfoldige modifikasjoner og variasjoner i utførelse derav er ventet å oppstå til en som er kjent innenfor fagområdet ved betraktning av disse beskrivelsene. Disse modifikasjonene og variasjonene er ment å være innbefattet innenfor de vedlagte kravene.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av huBMP-3, karakterisert ved at den innbefatter dyrking av en mikroorganisme transformert med en vektor inneholdende en DNA-sekvens som koder for huBMP-3 i et egnet kulturmedium, hvor nevnte DNA-sekvens innbefatter nukleotidsekvensen som følger: og isolering av huBMP-3 fra nevnte kulturmedium.

2. cDNA-sekvens, karakterisert ved at den koder for huBMP-3 som innbefatter nukleotidsekvensen ifølge krav 1 eller en sekvens som hybridiseres dertil under stringente betingelser og som ved ekspresjon koder for et protein som utviser de samme egenskaper som huBMP-3.

3. Vektor, karakterisert ved at den innehol- • der og kan uttrykke en DNA-sekvens som koder for et humant BMP-3 ifølge krav 2.

4. Mikroorganisme, karakterisert ved at den inneholder og kan uttrykke vektoren ifølge krav 3, og at den velges fra gruppen bestående av en bakteriecelle, gjærcelle og en mammalsk celle.