NO309000B1 - Isolated DNA sequence encoding a mammalian IL-4 receptor - Google Patents
Isolated DNA sequence encoding a mammalian IL-4 receptor Download PDFInfo
- Publication number
- NO309000B1 NO309000B1 NO911713A NO911713A NO309000B1 NO 309000 B1 NO309000 B1 NO 309000B1 NO 911713 A NO911713 A NO 911713A NO 911713 A NO911713 A NO 911713A NO 309000 B1 NO309000 B1 NO 309000B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- sequence
- amino acid
- receptor
- figures
- cells
- Prior art date
Links
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 title claims description 248
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 title claims description 248
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 52
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 80
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 80
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 49
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 48
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 42
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 40
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 37
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 36
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 35
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 33
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 32
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 28
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 22
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 3
- 101001033312 Homo sapiens Interleukin-4 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims 1
- 102000054663 human IL4R Human genes 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 184
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 93
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 66
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 65
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 61
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 51
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 51
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 44
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 42
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 35
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 19
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 13
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 10
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 9
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 9
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 7
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 6
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 5
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 5
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 5
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 5
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 4
- 101100069857 Caenorhabditis elegans hil-4 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 4
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical group O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940112382 cysteine / methionine Drugs 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 2
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 2
- 108040006852 interleukin-4 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- -1 sulfopropyl Chemical group 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- NVESBJGTHMKFSF-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(2,5-dioxopyrrolidine-3-carbonyl)phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical class C=1C=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=CC=1C(=O)C1CC(=O)NC1=O NVESBJGTHMKFSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHEJDHPRYHYLKS-UHFFFAOYSA-N 2-(3,6-dihydroxy-9h-xanthen-9-yl)benzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C21 DHEJDHPRYHYLKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 102000019260 B-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010012919 B-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 101001007681 Candida albicans (strain WO-1) Kexin Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108010066072 DNA modification methylase EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010016946 Food allergy Diseases 0.000 description 1
- ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N Glu-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101001043807 Homo sapiens Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001718 Immediate Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108700001097 Insect Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 125000000415 L-cysteinyl group Chemical group O=C([*])[C@@](N([H])[H])([H])C([H])([H])S[H] 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 101800001509 Large capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 108700005443 Microbial Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100438957 Mus musculus Cd8a gene Proteins 0.000 description 1
- 101001002703 Mus musculus Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- OWQXAJQZLWHPBH-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O OWQXAJQZLWHPBH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- WVXQQUWOKUZIEG-VEVYYDQMSA-N Pro-Thr-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WVXQQUWOKUZIEG-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 101710173693 Short transient receptor potential channel 1 Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010045240 Type I hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008043 acidic salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 1
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 208000010216 atopic IgE responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- NTNZTEQNFHNYBC-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-aminoacetate Chemical compound CCOC(=O)CN NTNZTEQNFHNYBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 1
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000052622 human IL7 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 238000011694 lewis rat Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000001589 lymphoproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- 238000009343 monoculture Methods 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004967 non-hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L phthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920000098 polyolefin Polymers 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010242 retro-orbital bleeding Methods 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013606 secretion vector Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 1
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 101150108727 trpl gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
OppfinnPlfiPns bakgrunn InfinninPlfiPn's background
Foreliggende oppfinnelse vedrører en isolert DNA-sekvens som koder for en pattedyr-IL-4-reseptor (IL-4R), rekombinant ekspresjonsvektor, fremgangsmåte for fremstilling av IL-4R-polypeptid, antistoffer som er immunologisk reaktive med et IL-4R-protein, og anvendelse av IL-4R til påvisning av IL-4R eller IL-4R-molekyler eller interaksjonen derav in vi tro. The present invention relates to an isolated DNA sequence that codes for a mammalian IL-4 receptor (IL-4R), recombinant expression vector, method for the production of IL-4R polypeptide, antibodies that are immunologically reactive with an IL-4R protein , and using IL-4R to detect IL-4R or IL-4R molecules or their interaction in vitro.
Interleukin-4 (IL-4, også kjent som B-celle-stimuler-ende faktor eller BSF-1) ble opprinnelig karakterisert ved sin evne til å stimulere proliferasjonen av B-celler som respons på lave konsentrasjoner av antistoffer rettet mot overflateimmunglobulin. Senere er IL-4 blitt påvist å ha et langt bredere spektrum av biologiske aktiviteter, inkludert vekst-co-stimulering av T-celler, mastceller, granulocytter, megakaryocytter og erythrocytter. I tillegg stimulerer IL-4 proliferasjonen av flere IL-2- og IL-3-avhengige cellelinjer, induserer ekspresjonen av klasse II hoved-histo-kompatibilitetskompleksmolekyler på hvilende B-celler og øker sekresjonen av IgE- og IgGl-isotyper ved hjelp av sti-mulerte B-celler. Både murint og humant IL-4 er blitt definitivt karakterisert ved hjelp av rekombinant DNA-teknikk og ved rensing av det naturlige, murine protein til homogenitet (Yokota et al., Proe. Nati. Acad. Sciv USA, 83, Interleukin-4 (IL-4, also known as B-cell-stimulating factor or BSF-1) was originally characterized by its ability to stimulate the proliferation of B-cells in response to low concentrations of antibodies directed against surface immunoglobulin. Later, IL-4 has been shown to have a much wider spectrum of biological activities, including growth co-stimulation of T cells, mast cells, granulocytes, megakaryocytes and erythrocytes. In addition, IL-4 stimulates the proliferation of several IL-2- and IL-3-dependent cell lines, induces the expression of class II major histocompatibility complex molecules on resting B cells, and increases the secretion of IgE and IgGl isotypes by pathway -mulated B cells. Both murine and human IL-4 have been definitively characterized by recombinant DNA technology and by purification of the natural murine protein to homogeneity (Yokota et al., Proe. Nati. Acad. Sciv USA, 83,
s. 5894, 1986, Norna et al., Nature, 319, s. 640, 1986 og Grabstein et al., J. Exp. Med., 163, s. 1405, 1986). p. 5894, 1986, Norna et al., Nature, 319, p. 640, 1986 and Grabstein et al., J. Exp. Med., 163, p. 1405, 1986).
De biologiske aktivitetene til IL-4 medieres av bestemte celleoverflatereseptorer for IL-4 som uttrykkes på primærceller og in vitro cellelinjer av pattedyropprinnelse. IL-4 bindes til reseptoren som så overfører et biologisk signal til forskjellige immuneffektorceller. Rensede preparater av IL-4-reseptor (IL-4R) vil derfor kunne anvendes i diagnostiske analyser med hensyn på IL-4 eller IL-4-reseptor, og for å frembringe antistoffer mot IL-4-reseptor for anvendelse i diagnose eller terapi. I tillegg kan preparater av renset IL-4-reseptor anvendes direkte i terapi for å The biological activities of IL-4 are mediated by specific cell surface receptors for IL-4 which are expressed on primary cells and in vitro cell lines of mammalian origin. IL-4 binds to the receptor which then transmits a biological signal to various immune effector cells. Purified preparations of IL-4 receptor (IL-4R) will therefore be able to be used in diagnostic analyzes with regard to IL-4 or IL-4 receptor, and to produce antibodies against IL-4 receptor for use in diagnosis or therapy . In addition, preparations of purified IL-4 receptor can be used directly in therapy to
binde eller rense ut IL-4, hvorved det tilveiebringes et middel for å regulere de biologiske aktivitetene av dette cytokin. bind or purify IL-4, thereby providing a means of regulating the biological activities of this cytokine.
Selv om IL-4 er blitt grundig karakterisert, er det gjort lite fremskritt når det gjelder å karakterisere dets reseptor. Et stort antall undersøkelser som dokumenterer eksistensen av en IL-4-reseptor på et bredt spekter av celle-typer, er blitt publisert; strukturkarakterisering har imidlertid vært begrenset til estimater av molekylvekten til proteinet bestemt ved hjelp av SDS-PAGE-analyse av koval-ente komplekser dannet ved hjelp av kjemisk kryssbinding mellom reseptoren og de radioaktivt merkede IL-4-molekyler. Ohara et al. (Nature, 325, s. 537, 1987) og Park et al. Although IL-4 has been thoroughly characterized, little progress has been made in characterizing its receptor. A large number of studies documenting the existence of an IL-4 receptor on a wide range of cell types have been published; however, structural characterization has been limited to estimates of the molecular weight of the protein determined by SDS-PAGE analysis of covalent complexes formed by chemical cross-linking between the receptor and the radiolabeled IL-4 molecules. Ohara et al. (Nature, 325, p. 537, 1987) and Park et al.
(Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 84, s. 1669, 1987) fastslo først tilstedeværelsen av en IL-4-reseptor ved å bruke radioaktivt jodert, rekombinant, murint IL-4 for å binde en høyaffinitetsreseptor uttrykt i små antall på B- og T-lymfocytter og et bredt spekter av celler fra hematopoese-linjen. Ved afflnitets-kryssbxnding av <1>25I-IL-4 til IL-4R identifiserte Ohara et al. og Park et al. reseptorproteiner med tilsynelatende molekylvekter på hhv. 60.000 og 75.000 dalton. Det er mulig at den lille reseptorstørrelse observert på de murine cellene, utgjør et proteolytisk spaltet fragment av den naturlig forekommende reseptor. Senere forsøk av Park et al. (J. Exp. Med., 166, s. 476, 1987) under anvendelse av rekombinant, humant IL-4 utvunnet (Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 84, p. 1669, 1987) first established the presence of an IL-4 receptor by using radioiodinated recombinant murine IL-4 to bind a high-affinity receptor expressed in small number of B and T lymphocytes and a wide range of cells from the haematopoietic lineage. By affinity cross-linking of <1>25I-IL-4 to IL-4R, Ohara et al. and Park et al. receptor proteins with apparent molecular weights of 60,000 and 75,000 daltons. It is possible that the small receptor size observed on the murine cells constitutes a proteolytically cleaved fragment of the naturally occurring receptor. Later attempts by Park et al. (J. Exp. Med., 166, p. 476, 1987) using recombinant human IL-4 extracted
125 125
fra gjær og radioaktivt merket med I, viste at human IL-4-reseptor er til stede ikke bare på cellelinjer av B-, from yeast and radioactively labeled with I, showed that human IL-4 receptor is present not only on cell lines of B-,
T- og hematopoesecellelinjer, men også finnes på humane fibroblaster og celler av epitel- og endotelopprinnelse. IL-4-reseptorer er siden blitt påvist å være til stede på andre cellelinjer, inkludert CBA/N milt-B-celler (Nakajima et al., J. Immunol., 139, s. 774, 1987), Burkitt lymfom Jijoye-celler (Cabrillat et al., Biochem. & Biophys. Res. Commun., 149, s. 995, 1987), mange forskjellige hematopoese-og ikke-hematopoeseceller (Lowenthal et al., J. Immunol., 140, s. 456, 1988) og murine Lyt-2~/L3T4~-thymocytter. Senere rapporterte Park et al. (UCLA Symposia, J. Cell Biol., T and hematopoietic cell lines, but also found on human fibroblasts and cells of epithelial and endothelial origin. IL-4 receptors have since been shown to be present on other cell lines, including CBA/N splenic B cells (Nakajima et al., J. Immunol., 139, p. 774, 1987), Burkitt lymphoma Jijoye- cells (Cabrillat et al., Biochem. & Biophys. Res. Commun., 149, p. 995, 1987), many different hematopoietic and non-hematopoietic cells (Lowenthal et al., J. Immunol., 140, p. 456 , 1988) and murine Lyt-2~/L3T4~ thymocytes. Later, Park et al reported. (UCLA Symposia, J. Cell Biol.,
125 125
Suppl. 12A, 1988) at I-IL-4-bindende plasmamembranresep-torer med 138-145 kDa i nærvær av tilstrekkelige proteaseinhibitorer kunne identifiseres på flere murine cellelinjer. Betydelig uenighet gjenstår således når det gjelder den virkelige størrelse og struktur til IL-4-reseptorer. Suppl. 12A, 1988) that I-IL-4-binding plasma membrane receptors of 138-145 kDa in the presence of sufficient protease inhibitors could be identified on several murine cell lines. Thus, considerable disagreement remains regarding the true size and structure of IL-4 receptors.
En videre undersøkelse av strukturen og de biologiske kjennetegn til IL-4-reseptorer og rollen som IL-4-reseptorene spiller i responsene til forskjellige cellepopulasjoner overfor IL-4 eller annen cytokinstimulering, eller av metodene for anvendelse av IL-4-reseptorer effektivt i terapi, diagnose eller analyse, har ikke vært mulig på grunn av vanskeligheten med å oppnå tilstrekkelige mengder av renset IL-4-reseptor. Ingen cellelinjer har tidligere vært kjent for å uttrykke høye nivåer av IL-4-reseptorer konstitutivt og kontinuerlig, og i cellelinjer som er kjent for å uttrykke påvisbare nivåer av IL-4-reseptor, er ekspresjons-nivået generelt begrenset til mindre enn ca. 2000 reseptorer pr. celle. Forsøk på å rense IL-4-reseptormolekylet for anvendelse i biokjemisk analyse eller for å klone og uttrykke pattedyrgener som koder for IL-4-reseptor, har således vært vanskeliggjort ved mangel på renset reseptor og en egnet kilde for reseptor-mRNA. Further investigation of the structure and biological characteristics of IL-4 receptors and the role that IL-4 receptors play in the responses of different cell populations to IL-4 or other cytokine stimulation, or of the methods of using IL-4 receptors effectively in therapy, diagnosis or analysis, has not been possible due to the difficulty in obtaining sufficient quantities of purified IL-4 receptor. No cell lines have previously been known to express high levels of IL-4 receptors constitutively and continuously, and in cell lines known to express detectable levels of IL-4 receptor, the level of expression is generally limited to less than about 2000 receptors per cell. Attempts to purify the IL-4 receptor molecule for use in biochemical analysis or to clone and express mammalian genes encoding IL-4 receptor have thus been hampered by a lack of purified receptor and a suitable source of receptor mRNA.
Oppsummering av oppfinnelsen Summary of the invention
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en isolert DNA-sekvens som koder for en pattedyr-IL-4-reseptor (IL-4R), kjennetegnet ved at DNA-sekvensen er valgt fra: (a) en DNA-sekvens som omfatter nukleotidene -75-2355 i Figurene 2A-2C, nukleotidene 1-2355 i Figurene 2A-2C, nukleotidene -75-2400 i Figurene 4A-4C eller nukleotidene 1-2400 i Figurene 4A-4C, (b) DNA-sekvenser som kan hybridisere til en DNA ifølge (a) under middels strenge betingelser, og som koder for et lL-4R-polypeptid som kan binde IL-4, og (c) DNA-sekvenser som er degenererte som et resultat av den genetiske kode, til en DNA definert i (a) eller (b), og som koder for et IL-4R-polypeptid som kan binde IL-4. The present invention provides an isolated DNA sequence encoding a mammalian IL-4 receptor (IL-4R), characterized in that the DNA sequence is selected from: (a) a DNA sequence comprising nucleotides -75-2355 in Figures 2A-2C, nucleotides 1-2355 in Figures 2A-2C, nucleotides -75-2400 in Figures 4A-4C or nucleotides 1-2400 in Figures 4A-4C, (b) DNA sequences that can hybridize to a DNA according to ( a) under medium stringency conditions, and encoding an IL-4R polypeptide capable of binding IL-4, and (c) DNA sequences degenerated as a result of the genetic code, into a DNA defined in (a) or (b), and which encodes an IL-4R polypeptide capable of binding IL-4.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en rekombinant ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter en DNA-sekvens ifølge kravene 1 -9, samt en fremgangsmåte for fremstilling av et pattedyr-IL-4-reseptorpolypeptid (IL-4R-polypeptid), kjennetegnet ved en egnet vertscelle som omfatter en vektor ifølge krav 11, dyrkes under betingelser som fremmer ekspresjon av IL-4R-polypeptidet, etterfulgt av rensing av IL-4R-polypeptidet. The present invention also provides a recombinant expression vector, characterized in that it comprises a DNA sequence according to claims 1-9, as well as a method for producing a mammalian IL-4 receptor polypeptide (IL-4R polypeptide), characterized by a suitable host cell comprising a vector according to claim 11, is cultured under conditions that promote expression of the IL-4R polypeptide, followed by purification of the IL-4R polypeptide.
Det humane IL-4R-molekyl antas å ha en molekylvekt på mellom ca. 110.000 og 150.000 M,. og har følgende N-ende-aminosyresekvens utledet fra cDNA-sekvensen og ved analogi til den biokjemisk bestemte N-ende-sekvens i det fullt ferdige, murine protein: MKVLQEPTCVSDYMSISTCEW. The human IL-4R molecule is believed to have a molecular weight of between approx. 110,000 and 150,000 M,. and has the following N-terminal amino acid sequence derived from the cDNA sequence and by analogy to the biochemically determined N-terminal sequence in the fully completed, murine protein: MKVLQEPTCVSDYMSISTCEW.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også antistoffer som er immunologisk reaktive med et pattedyr-IL-4-reseptorprotein (IL-4R-protein), kjennetegnet ved at IL-4R-proteinet omfatter en aminosyresekvens valgt fra restene 1-785 vist i Figurene 2A-2C eller restene 1-800 vist i Figurene 4A-4C, samt anvendelse av IL-4R for påvisning av IL-4- eller IL-4-reseptormolekyler (IL-4R-molekyler) eller interaksjonen derav in vitro, ved at rensede IL-4R-molekyler bindes til IL-4-molekyler og bundne eller ubundne IL-4- eller IL-4R-molekyler måles eller påvises, hvor nevnte IL-4R er valgt f ra; The present invention also provides antibodies that are immunologically reactive with a mammalian IL-4 receptor protein (IL-4R protein), characterized in that the IL-4R protein comprises an amino acid sequence selected from residues 1-785 shown in Figures 2A-2C or residues 1-800 shown in Figures 4A-4C, as well as the use of IL-4R for the detection of IL-4 or IL-4 receptor molecules (IL-4R molecules) or their interaction in vitro, by purifying IL-4R- molecules are bound to IL-4 molecules and bound or unbound IL-4 or IL-4R molecules are measured or detected, wherein said IL-4R is selected from;
a) en IL-4R som omfatter aminosyresekvensen til restene 1-785 vist i Figurene 2A-2C, b) en IL-4R som omfatter aminosyresekvensen til restene 1-800 vist i Figurene 4A-4C, c) et fragment av IL-4R ifølge (a) eller (b), hvor fragmentet kan binde IL-4, og d) en IL-4R som kan binde IL-4, og som omfatter en aminosyresekvens som er mer enn 80 % lik med sekvensen angitt a) an IL-4R comprising the amino acid sequence of residues 1-785 shown in Figures 2A-2C, b) an IL-4R comprising the amino acid sequence of residues 1-800 shown in Figures 4A-4C, c) a fragment of IL-4R according to (a) or (b), wherein the fragment can bind IL-4, and d) an IL-4R that can bind IL-4, and which comprises an amino acid sequence that is more than 80% similar to the sequence indicated
i (a) eller (b). in (a) or (b).
Kort beskrivelse av tegningene Brief description of the drawings
Figur 1 viser restriksjonskart over cDNA-kloner som inneholder de kodende områdene (antydet ved hjelp av en søyle) for de murine og humane IL-4R-cDNA-er. Restriksjons-setene EcoRI, PvuII, HincII og Sstl er angitt ved hjelp av hhv. bokstavene R, P, H og S. Figurene 2A-C viser cDNA-sekvensen og den avledede aminosyresekvens fra det kodende område for en murin IL-4-reseptor, utvunnet fra klon 7B9-2 i 7B9-biblioteket. N-ende-isoleucinet i det fullstendige protein er betegnet aminosyre nr. 1. Det kodende område for det membran-bundne full-lengdeprotein fra klon 7B9-2 defineres av aminosyrene 1-785. ATC-kodonet som spesifiserer isoleucinresten som utgjør den fullt ferdige N-ende, er understreket i stilling 1 i proteinsekvensen; det antatte transmembranområde i aminosyrene 209-232 er også understreket. Sekvensene i de kodende områder til klonene 7B9-4 og klonene CTLL-18 og CTLL-16 fra CTLL 19.4-biblioteket er identiske med de kodende områdene i 7B9-2, bortsett fra det følgende. Det kodende område i CTLL-16 koder for en membran-bundet IL-4-bindende reseptor definert av aminosyrene fra og med -25 til og med 233 (inkludert den antatte 25 aminosyrers signalpeptidsekvens), men etterfølges av et TAG-terminatorkodon (ikke vist) som avslutter den åpne avlesningsramme. Nukleinsyresekvensen indikerer tilstedeværelsen av et donorsete for sammenspleisning i denne stilling (angitt ved hjelp av en pil i figur 1) og et akseptorsete for sammenspleisning nær 3<1->enden (angitt ved hjelp av en andre pil) , noe som tyder på at CTLL-16 ble utledet fra et ikke-sammenspleiset mRNA-mellomprodukt. Klonene 7B9-4 og CTLL-18 koder for hhv. aminosyrene fra og med 23 til og med 199 og fra og med -25 til og med 199. Etter aminosyre 199 innfører et 114-basepar-innskudd (identisk i begge klonene og vist ved hjelp av en åpen ramme i figur 1) seks nye aminosyrer etterfulgt av et termineringskodon. Denne formen for reseptoren er oppløselig. Figur 3 er en skjematisk illustrasjon av høy-ekspresjons-pattedyrplasmidet pCAV/NOT som er beskrevet nærmere i eksempel 8. Figurene 4A-C viser den kodende sekvens i en human IL-4-reseptor-cDNA fra klon T22-8 som ble erholdt fra cDNA-biblioteket avledet fra T-cellelinjen T22. Det utledede N-ende-methionin i det fullt ferdige protein og transmembranområdet er understreket. Figurene 5A-B er en sammenligning mellom de utledede aminosyresekvenser i humane (øverst) og murine (nederst) IL-4-reseptor-cDNA-kloner. Figure 1 shows restriction maps of cDNA clones containing the coding regions (indicated by a bar) of the murine and human IL-4R cDNAs. The restriction sites EcoRI, PvuII, HincII and Sstl are indicated using respectively the letters R, P, H and S. Figures 2A-C show the cDNA sequence and the deduced amino acid sequence from the coding region of a murine IL-4 receptor, recovered from clone 7B9-2 in the 7B9 library. The N-terminal isoleucine in the complete protein is designated amino acid No. 1. The coding region for the membrane-bound full-length protein from clone 7B9-2 is defined by amino acids 1-785. The ATC codon specifying the isoleucine residue that constitutes the fully formed N-terminus is underlined in position 1 of the protein sequence; the putative transmembrane region in amino acids 209-232 is also underlined. The sequences in the coding regions of clones 7B9-4 and clones CTLL-18 and CTLL-16 from the CTLL 19.4 library are identical to the coding regions of 7B9-2, except for the following. The coding region of CTLL-16 encodes a membrane-bound IL-4 binding receptor defined by amino acids from -25 through 233 (including the putative 25 amino acid signal peptide sequence), but is followed by a TAG terminator codon (not shown ) which ends the open reading frame. The nucleic acid sequence indicates the presence of a splice donor site at this position (indicated by an arrow in Figure 1) and a splice acceptor site near the 3<1-> end (indicated by a second arrow), suggesting that CTLL -16 was derived from an unspliced mRNA intermediate. The clones 7B9-4 and CTLL-18 encode respectively amino acids 23 through 199 and -25 through 199. After amino acid 199, a 114-base pair insertion (identical in both clones and shown by an open box in Figure 1) introduces six new amino acids followed by a termination codon. This form of the receptor is soluble. Figure 3 is a schematic illustration of the high expression mammalian plasmid pCAV/NOT which is described in more detail in Example 8. Figures 4A-C show the coding sequence of a human IL-4 receptor cDNA from clone T22-8 which was obtained from the cDNA library derived from the T cell line T22. The deduced N-terminal methionine in the fully formed protein and the transmembrane region are underlined. Figures 5A-B are a comparison of the deduced amino acid sequences of human (top) and murine (bottom) IL-4 receptor cDNA clones.
Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen Detailed description of the invention
Definisjoner Definitions
Slik de her er brukt, henviser uttrykkene "IL-4-reseptor" og "IL-4R" til proteiner med aminosyresekvenser som er i det vesentlige like med de naturlig forekommende pattedyr-interleukin-4-reseptor-aminosyresekvensene som er beskrevet i figurene 2 og 4, og som er biologisk aktive som definert nedenunder, ved at de er i stand til å binde interleukin-4-molekyler (IL-4-molekyler) eller overføre et biologisk signal initiert ved hjelp av en IL-4-molekyl-binding til en celle, eller kryssreagere med anti-IL-4R-antistoffer frembrakt mot IL-4R fra naturlige (dvs. lkke-rekombinante) kilder. Det naturlig forekommende, murine IL-4-reseptormolekyl antas å ha en tilsynelatende molekylvekt ved SDS-PAGE på ca. 140 kilodalton (kDa). Uttrykkene "IL-4-reseptor" eller "IL-4R" omfatter, men er ikke begrenset til, analoger eller underenheter av naturlig forekommende proteiner med minst 20 aminosyrer og som utviser minst noe biologisk aktivitet som er felles med IL-4R. Slik det er brukt i beskrivelsen, betyr uttrykket "fullt ferdig" et protein uttrykt i en form som mangler en ledersekvens som kan være til stede i full-lengde-transkripter av et naturlig forekommende gen. Forskjellige bioekvivalentprotein- og aminosyreanaloger er beskrevet nærmere nedenunder. As used herein, the terms "IL-4 receptor" and "IL-4R" refer to proteins having amino acid sequences that are substantially similar to the naturally occurring mammalian interleukin-4 receptor amino acid sequences described in Figures 2 and 4, and which are biologically active as defined below, in that they are able to bind interleukin-4 molecules (IL-4 molecules) or transmit a biological signal initiated by means of an IL-4 molecule binding to a cell, or cross-react with anti-IL-4R antibodies raised against IL-4R from natural (ie, non-recombinant) sources. The naturally occurring murine IL-4 receptor molecule is believed to have an apparent molecular weight by SDS-PAGE of approx. 140 kilodaltons (kDa). The terms "IL-4 receptor" or "IL-4R" include, but are not limited to, analogs or subunits of naturally occurring proteins of at least 20 amino acids and exhibiting at least some biological activity common to IL-4R. As used in the specification, the term "full-length" means a protein expressed in a form lacking a leader sequence that may be present in full-length transcripts of a naturally occurring gene. Various bioequivalent protein and amino acid analogues are described in more detail below.
Uttrykket "i det vesentlige lik" betyr, når det anvendes til å definere enten aminosyre- eller nukleinsyresekvenser, at en bestemt sekvens, f.eks. en mutant sekvens, varierer fra en referansesekvens med én eller flere substitusjoner, delesjoner eller addisjoner, idet nettoeffekten er at den biologiske aktivitet av IL-4R-proteinet bibeholdes. Alternativt er nukleinsyre-underenheter og -analoger "i det vesentlige like" med de bestemte DNA-sekvenser som her er beskrevet dersom: (a) DNA-sekvensen er avledet fra det kodende område i et naturlig forekommende pattedyr-IL-4R-gen; The term "substantially similar", when used to define either amino acid or nucleic acid sequences, means that a particular sequence, e.g. a mutant sequence, varies from a reference sequence by one or more substitutions, deletions or additions, the net effect being that the biological activity of the IL-4R protein is maintained. Alternatively, nucleic acid subunits and analogs are "substantially similar" to the particular DNA sequences described herein if: (a) the DNA sequence is derived from the coding region of a naturally occurring mammalian IL-4R gene;
(b) DNA-sekvensen er i stand til å hybridisere til DNA-sekvenser ifølge (a) under middels strenge betingelser og (b) the DNA sequence is able to hybridize to DNA sequences according to (a) under medium stringency conditions and
som koder for biologisk aktive IL-4R-molekyler, eller DNA- which encode biologically active IL-4R molecules, or DNA
sekvenser som er degenererte som et resultat av den genetiske kode til DNA-sekvensene definert i (a) eller (b), og som koder for biologisk aktive IL-4R-molekyler. I det vesentlige like analogproteiner vil være mer enn ca. 30% like med den tilsvarende sekvens i det naturlig forekommende IL-4R. Sekvenser med mindre grader av likhet, men sammen-lignbar biologisk aktivitet anses for å være ekvivalenter. Helst vil analogproteinene være mer enn ca. 80% like med den tilsvarende sekvens i det naturlig forekommende IL-4R, og i dette tilfelle defineres de som "i det vesentlige identiske". Når nukleinsyresekvenser defineres, anses alle nukleinsyresekvenser som er i stand til å kode for i det vesentlige like aminosyresekvenser, for å være i det vesentlige like med en referansenukleinsyresekvens. Prosent likhet kan be-stemmes f.eks. ved å sammenligne sekvensinformasjon under anvendelse av GAP datamaskinprogram, versjon 6.0, tilgjengelig fra University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). GAP-programmet benytter sammenstillingsmetoden til Needleman og Wunsch (J. Mol. Biol., 4j}, s. 443, 1970), som revidert av Smith og Waterman (Adv. Appl. Math., 2> s* 482, 1981). I korte trekk definerer GAP-programmet likhet som antallet av sammenstilte symboler (dvs. nukleotider eller aminosyrer) som er like, dividert med det totale antall symboler i den korteste av de to sekvensene. De foretrukne feilparametere for GAP-programmet omfatter: (1) en ensartet sammenligningsmatriks (som inneholder en verdi på 1 for identiteter og 0 for ikke-identiteter) for nukleotider, og den veide sammenligningsmatriks til Gribskov og Burgess, Nucl. Acids Res., 1£, s. 6745, 1986, som beskrevet av Schwartz og Dayhoff, red., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, sequences which are degenerate as a result of the genetic code of the DNA sequences defined in (a) or (b), and which encode biologically active IL-4R molecules. Substantially similar analogue proteins will be more than approx. 30% identical to the corresponding sequence in the naturally occurring IL-4R. Sequences with lesser degrees of similarity but comparable biological activity are considered to be equivalents. Preferably, the analogue proteins will be more than approx. 80% identical to the corresponding sequence in the naturally occurring IL-4R, in which case they are defined as "substantially identical". When defining nucleic acid sequences, all nucleic acid sequences capable of encoding substantially identical amino acid sequences are considered to be substantially identical to a reference nucleic acid sequence. Percentage similarity can be determined e.g. by comparing sequence information using the GAP computer program, version 6.0, available from the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). The GAP program uses the assembly method of Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol., 4j}, p. 443, 1970), as revised by Smith and Waterman (Adv. Appl. Math., 2> p* 482, 1981). Briefly, the GAP program defines similarity as the number of contiguous symbols (ie, nucleotides or amino acids) that are similar, divided by the total number of symbols in the shorter of the two sequences. The preferred error parameters for the GAP program include: (1) a uniform comparison matrix (containing a value of 1 for identities and 0 for non-identities) for nucleotides, and the weighted comparison matrix of Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res., 1£, p. 6745, 1986, as described by Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation,
s. 353-358, 1979, (2) et tillegg på 3,0 for hvert hull og et ytterligere 0,10 tillegg for hvert symbol i hvert hull, og (3) ingen tillegg for endehull. pp. 353-358, 1979, (2) an addition of 3.0 for each hole and an additional 0.10 addition for each symbol in each hole, and (3) no end hole addition.
"Rekombinant" betyr slik det her er brukt, at et protein er avledet fra rekombinante (f.eks. mikrobielle eller pattedyr-) ekspresjonssystemer. "Mikrobielle" henviser "Recombinant" as used herein means that a protein is derived from recombinant (eg, microbial or mammalian) expression systems. "Microbial" refers
til rekombinante proteiner laget i bakterielle eller sopp-(f.eks. gjær-) ekspresjonssystemer. Som et produkt definerer "rekombinante, mikrobielle" et protein fremstilt i et mikrobielt ekspresjonssystem som er i det vesentlige fritt for naturlig forekommende, endogene stoffer. Protein uttrykt i de fleste bakteriekulturer, f.eks. E. coli, vil være fritt for glycan. Protein uttrykt i gjær, kan ha et glyco-syleringsmønster som er forskjellig fra det som uttrykkes i pattedyrceller. to recombinant proteins made in bacterial or fungal (eg yeast) expression systems. As a product, "recombinant microbial" defines a protein produced in a microbial expression system that is substantially free of naturally occurring endogenous substances. Protein expressed in most bacterial cultures, e.g. E. coli, will be free of glycan. Protein expressed in yeast may have a glycosylation pattern different from that expressed in mammalian cells.
"Biologisk aktiv" betyr, slik det er brukt i beskrivelsen som en karakterisering av IL-4-reseptorer, at et bestemt molekyl har til felles tilstrekkelig aminosyresekvens-likhet med de utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse som her er beskrevet, til å være i stand til å binde påvisbare mengder av IL-4, overføre en IL-4-stimulus til en celle, f.eks. som en bestanddel i en hybridreseptorkonstruk-sjon, eller kryssreagere med anti-IL-4R-antistoffer frembrakt mot IL-4R fra naturlige (dvs. ikke-rekombinante) "Biologically active", as used in the specification as a characterization of IL-4 receptors, means that a particular molecule shares sufficient amino acid sequence similarity with the embodiments of the present invention described herein to be capable of to bind detectable amounts of IL-4, transfer an IL-4 stimulus to a cell, e.g. as a component of a hybrid receptor construct, or cross-react with anti-IL-4R antibodies raised against IL-4R from natural (ie non-recombinant)
kilder. Fortrinnsvis er biologisk aktive IL-4-reseptorer innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse, i stand til å binde mer enn 0,1 nmol IL-4 pr. nmol reseptor, og helst mer enn 0,5 nmol IL-4 pr. nmol reseptor i standard bindingsanalyser (se nedenunder) . sources. Preferably, biologically active IL-4 receptors within the scope of the present invention are capable of binding more than 0.1 nmol of IL-4 per nmol receptor, and preferably more than 0.5 nmol IL-4 per nmol receptor in standard binding assays (see below).
"DNA-sekvens" henviser til et DNA-molekyl i form av et separat fragment eller som en bestanddel i en større DNA-konstruksjon, som er blitt avledet fra DNA isolert minst én gang i hovedsakelig ren form, dvs. fri for forurensende, endogene materialer, og i en mengde eller konsentrasjon som muliggjør identifikasjon, manipulasjon og utvinning av sekvensen og dens bestanddelnukleotidsekvenser ved hjelp av standard biokjemiske metoder, f.eks. ved å bruke en kloningsvektor. Slike sekvenser tilveiebringes fortrinnsvis i form av en åpen leseramme som ikke er avbrutt av indre, ikke-translaterte sekvenser, eller introner, som vanligvis er til stede i eukaryote gener. Genom-DNA som inneholder de relevante sekvenser, kan også anvendes. Sekvenser av ikke-translatert DNA kan være til stede 5' eller 3' fra den åpne "DNA sequence" refers to a DNA molecule in the form of a separate fragment or as a component of a larger DNA construct, which has been derived from DNA isolated at least once in substantially pure form, i.e. free of contaminating, endogenous materials, and in an amount or concentration that enables the identification, manipulation and recovery of the sequence and its constituent nucleotide sequences by standard biochemical methods, e.g. using a cloning vector. Such sequences are preferably provided in the form of an open reading frame that is not interrupted by internal, untranslated sequences, or introns, which are usually present in eukaryotic genes. Genomic DNA containing the relevant sequences can also be used. Sequences of untranslated DNA may be present 5' or 3' from the open
leseramme hvor de samme ikke virker inn på manipulasjon eller ekspresjon av de kodende områder. reading frame where they do not affect the manipulation or expression of the coding areas.
"Nukleotidsekvens" henviser til en heteropolymer av deoxyribonukleotider. DNA-sekvenser som koder for proteinene tilveiebrakt ved hjelp av denne oppfinnelse, kan settes sammen fra cDNA-fragmenter og korte oligonukleotidlinkere, eller fra en serie av oligonukleotider, hvorved det tilveiebringes et syntetisk gen som er i stand til å bli uttrykt i en rekombinant transkripsjonsenhet. "Nucleotide sequence" refers to a heteropolymer of deoxyribonucleotides. DNA sequences encoding the proteins provided by this invention can be assembled from cDNA fragments and short oligonucleotide linkers, or from a series of oligonucleotides, thereby providing a synthetic gene capable of being expressed in a recombinant transcription unit .
"Rekombinant ekspresjonsvektor11 henviser til en replikerbar DNA-konstruksjon brukt enten til å amplifisere eller uttrykke DNA som koder for IL-4R, og som omfatter en transkripsjonsenhet omfattende en sammensetning av (1) et genetisk element eller elementer med en regulatorrolle i genekspresjon, f.eks. promoterer eller "enhancers", (2) en struktur- eller kodesekvens som transkriberes til mRNA og translateres til protein, og (3) passende transkripsjons- og translasjonsinitierings- og translasjonsterminerings-sekvenser. Strukturelementer ment for anvendelse i gjærekspresjonssystemer, omfatter fortrinnsvis en ledersekvens som muliggjør ekstracellulær sekresjon av translatert protein ved hjelp av en vertcelle. Alternativt kan det, når rekombinant protein uttrykkes uten en leder- eller transport-sekvens, være inkludert en N-ende-methioninrest. Denne resten kan eventuelt etterpå bli avspaltet fra det uttrykte, rekombinante protein, hvorved man får et sluttprodukt. "Recombinant expression vector11 refers to a replicable DNA construct used either to amplify or express DNA encoding IL-4R, and which comprises a transcription unit comprising a composition of (1) a genetic element or elements with a regulatory role in gene expression, e.g. eg promoters or "enhancers", (2) a structural or coding sequence that is transcribed into mRNA and translated into protein, and (3) appropriate transcription and translation initiation and translation termination sequences. Structural elements intended for use in yeast expression systems preferably comprise a leader sequence that enables extracellular secretion of translated protein by a host cell. Alternatively, when recombinant protein is expressed without a leader or transport sequence, an N-terminal methionine residue may be included. This residue may subsequently be cleaved from the expressed , recombinant protein, whereby a final product is obtained.
"Rekombinant, mikrobielt ekspresjonssystem" betyr en i det vesentlige homogen monokultur av egnede vertmikro-organismer, f.eks. bakterier slik som E. coli, eller gjær slik som S. cerevisiae, som stabilt har integrert en rekombinant transkripsjonsenhet i kromosom-DNA eller bærer den rekombinante transkripsjonsenhet som en bestanddel i et tilstedeværende plasmid. Generelt er celler som utgjør systemet, avkommet fra en enkel stamtransformant. Rekombinante ekspresjonssystemer vil, slik de her er referert, uttrykke heterologt protein etter induksjon av regulator-elementene bundet til DNA-sekvensen eller det syntetiske gen som skal uttrykkes. "Recombinant microbial expression system" means a substantially homogeneous monoculture of suitable host micro-organisms, e.g. bacteria such as E. coli, or yeast such as S. cerevisiae, which have stably integrated a recombinant transcription unit into chromosomal DNA or carry the recombinant transcription unit as a component of a present plasmid. In general, cells that make up the system are progeny from a single stock transformant. Recombinant expression systems will, as they are referred to here, express heterologous protein after induction of the regulator elements bound to the DNA sequence or the synthetic gene to be expressed.
Proteiner og analoger Proteins and analogues
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i det vesentlige homogene, rekombinante pattedyr-IL-4R-polypeptider hovedsakelig frie for forurensende, endogene materialer og eventuelt uten forbundet glycosylering etter naturlig forekommende mønster. De naturlig forekommende, murine og humane IL-4-reseptormolekyler utvinnes fra cellelysater som glycoproteiner med en tilsynelatende molekylvekt ved SDS-PAGE på ca. 130-145 kilodalton (kDa). Pattedyr-IL-4R ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter eksempelvis primat-, human-, murin-, hunde-, katte-, bovin-, ovin-, heste- og porcin-IL-4R. Derivater av IL-4R innenfor omfanget av oppfinnelsen omfatter også forskjellige strukturformer av primaerproteinet som bibeholder biologisk aktivitet. På grunn av tilstedeværelsen av ioniserbare amino- og carboxylgrupper kan et IL-4R-protein f.eks. være i form av sure eller basiske salter, eller i nøytral form. Individuelle aminosyrerester kan også modifiseres ved oxydasjon eller reduksjon. The present invention provides essentially homogeneous, recombinant mammalian IL-4R polypeptides mainly free of contaminating, endogenous materials and possibly without associated glycosylation according to a naturally occurring pattern. The naturally occurring, murine and human IL-4 receptor molecules are recovered from cell lysates as glycoproteins with an apparent molecular weight by SDS-PAGE of approx. 130-145 kilodaltons (kDa). Mammalian IL-4R according to the present invention includes, for example, primate, human, murine, canine, feline, bovine, ovine, equine and porcine IL-4R. Derivatives of IL-4R within the scope of the invention also include different structural forms of the primary protein which retain biological activity. Due to the presence of ionizable amino and carboxyl groups, an IL-4R protein can e.g. be in the form of acidic or basic salts, or in neutral form. Individual amino acid residues can also be modified by oxidation or reduction.
Primæraminosyrestrukturen kan modifiseres ved dannelse av covalente eller aggregatkonjugater med andre kjemiske rester, slik som glycosylgrupper, lipider, fosfat, acetyl-grupper og lignende, eller ved å skape aminosyresekvens-mutanter. Covalente derivater fremstilles ved å binde bestemte, funksjonelle grupper til IL-4R-aminosyresidekjeder eller i N- eller C-endene. Andre derivater av IL-4R innenfor omfanget av oppfinnelsen omfatter covalente eller aggregatkonjugater av IL-4R eller fragmenter derav med andre proteiner eller polypeptider, slik som ved syntese i rekombinant kultur som N-ende- eller C-ende-fusjoner. F.eks. kan det konjugerte peptid være en signal- (eller leder-) poly-peptidsekvens i N-ende-området til proteinet som co-translasjonelt eller post-translasjonelt styrer overføring av proteinet fra dets syntesested til dets funksjonssted innenfor eller utenfor cellemembranen eller -veggen (f.eks. oc-faktor-lederen i gjær). IL-4R-proteinfusjoner kan omfatte peptider addert for å lette rensing eller identifikasjon av IL-4R (f.eks. poly-His). Aminosyresekvensen til IL-4-reseptor kan også bindes til peptidet Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp et al. , Bio/Technology, S_, The primary amino acid structure can be modified by forming covalent or aggregate conjugates with other chemical residues, such as glycosyl groups, lipids, phosphate, acetyl groups and the like, or by creating amino acid sequence mutants. Covalent derivatives are produced by attaching specific functional groups to IL-4R amino acid side chains or to the N- or C-termini. Other derivatives of IL-4R within the scope of the invention include covalent or aggregate conjugates of IL-4R or fragments thereof with other proteins or polypeptides, such as by synthesis in recombinant culture as N-end or C-end fusions. E.g. the conjugated peptide may be a signal (or leader) polypeptide sequence in the N-terminal region of the protein which co-translationally or post-translationally directs transfer of the protein from its site of synthesis to its site of function within or outside the cell membrane or wall ( eg the oc-factor leader in yeast). IL-4R protein fusions may comprise peptides added to facilitate purification or identification of the IL-4R (eg, poly-His). The amino acid sequence of IL-4 receptor can also be bound to the peptide Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp et al., Bio/Technology, S_,
s. 1204, 1988). Den sistnevnte sekvens er svært antigen og gir en epitop reversibelt bundet av et bestemt, monoklonalt antistoff, som muliggjør hurtig analyse og lett rensing av uttrykt, rekombinant protein. Denne sekvensen avspaltes også spesifikt ved hjelp av bovin slimhinne-enterokinase i resten umiddelbart etter Asp-Lys-paret. Fusjonsproteiner påsatt dette peptidet, kan også være resistente mot intra-cellulær nedbrytning i E. coli. pp. 1204, 1988). The latter sequence is highly antigenic and provides an epitope reversibly bound by a specific monoclonal antibody, which enables rapid analysis and easy purification of expressed recombinant protein. This sequence is also specifically cleaved by bovine mucosal enterokinase in the residue immediately following the Asp-Lys pair. Fusion proteins attached to this peptide may also be resistant to intracellular degradation in E. coli.
IL-4R-derivater kan også anvendes som immunogener, reagenser i reseptor-baserte, immunologiske analyser, eller som bindingsmidler for affinitetsrensefremgangsmåter av IL-4 eller andre bindende Ugandere. IL-4R-derivater kan også IL-4R derivatives can also be used as immunogens, reagents in receptor-based immunological assays, or as binding agents for affinity purification procedures of IL-4 or other binding ligands. IL-4R derivatives can also
fås ved hjelp av kryssbindingsmidler, slik som M-maleimido-benzoylsuccinimidester og N-hydroxysuccinimid, i cystein- obtained by means of cross-linking agents, such as M-maleimido-benzoylsuccinimide esters and N-hydroxysuccinimide, in cysteine-
og lysinrester. IL-4R-proteiner kan også bindes covalent gjennom reaktive sidegrupper til forskjellige uoppløselige substrater, slik som cyanbromidaktiverte, bisoxiran-aktiverte, carbonyldiimidazolaktiverte eller tosylaktiverte agarosestrukturer, eller ved adsorpsjon til polyolefin-overflater (med eller uten glutaraldehyd-kryssbinding). Når den først er bundet til et substrat, kan IL-4R anvendes til å binde (for analyse- eller renseformål) anti-IL-4R-antistoffer eller IL-4 selektivt. and lysine residues. IL-4R proteins can also be covalently bound through reactive side groups to various insoluble substrates, such as cyanobromide-activated, bisoxirane-activated, carbonyldiimidazole-activated or tosyl-activated agarose structures, or by adsorption to polyolefin surfaces (with or without glutaraldehyde cross-linking). Once bound to a substrate, IL-4R can be used to bind (for assay or purification purposes) anti-IL-4R antibodies or IL-4 selectively.
Foreliggende oppfinnelse omfatter også IL-4R med eller uten tilknyttet glycosylering etter naturlig forekommende mønster. IL-4R uttrykt i gjær- eller pattedyr-ekspresjonssystemer, f.eks. C0S-7-celler, kan med hensyn til molekylvekt og glycosyleringsmønster være lik med eller signifikant forskjellig fra de naturlig forekommende molekyler, avhengig av ekspresjonssystemet. Ekspresjon av IL-4R-DNA-er i bakterier, slik som E. coli, gir ikke-glycos-ylerte molekyler. Funksjonelle mutantanaloger av pattedyr-IL-4R med inaktiverte N-glycosyleringsseter kan fremstilles ved hjelp av oligonukleotidsyntese og ligering eller ved sete-spesifikke mutageneseteknikker. Disse analogproteiner kan fremstilles i en homogen form med redusert carbohydrat i godt utbytte ved å bruke gjærekspresjonssystemer. N-glycosyleringsseter i eukaryote proteiner er kjennetegnet ved aminosyretripletten Asn-A^-Z hvor A^ er en aminosyre bortsett fra Pro, og Z er Ser eller Thr. I denne sekvensen gir asparagin en sidekjedeaminogruppe for covalent binding av carbohydrat. Et slikt sete kan elimineres ved å bytte ut Asn eller resten Z med en annen aminosyre, fjerne Asn eller The present invention also includes IL-4R with or without associated glycosylation according to a naturally occurring pattern. IL-4R expressed in yeast or mammalian expression systems, e.g. C0S-7 cells, with respect to molecular weight and glycosylation pattern, can be similar to or significantly different from the naturally occurring molecules, depending on the expression system. Expression of IL-4R DNAs in bacteria, such as E. coli, yields non-glycos-ylated molecules. Functional mutant analogs of mammalian IL-4R with inactivated N-glycosylation sites can be prepared by oligonucleotide synthesis and ligation or by site-specific mutagenesis techniques. These analog proteins can be produced in a homogeneous form with reduced carbohydrate in good yield by using yeast expression systems. N-glycosylation sites in eukaryotic proteins are characterized by the amino acid triplet Asn-A^-Z where A^ is an amino acid other than Pro, and Z is Ser or Thr. In this sequence, asparagine provides a side chain amino group for covalent attachment of carbohydrate. Such a site can be eliminated by replacing Asn or the residue Z with another amino acid, removing Asn or
Z, eller innføye en ikke-Z-aminosyre mellom A^ og Z, eller Z, or insert a non-Z amino acid between A^ and Z, or
en annen aminosyre enn Asn mellom Asn og A^. an amino acid other than Asn between Asn and A^.
IL-4R-derivater kan også fås ved mutasjoner av IL-4R eller dens underenheter. En IL-4R-mutant er, slik den er henvist til her, et polypeptid som er homologt med IL-4R, IL-4R derivatives can also be obtained by mutations of IL-4R or its subunits. An IL-4R mutant is, as referred to herein, a polypeptide homologous to IL-4R,
men som har en aminosyresekvens som er forskjellig fra naturlig forekommende IL-4R på grunn av en delesjon, inn-føyelse eller substitusjon. På samme måte som de fleste pattedyrgener antas pattedyr-IL-4-reseptorer å være kodet av multi-eksongener. Alternative mRNA-konstruksjoner som kan tilskrives forskjellige mRNA-sammenspleisningshendelser etter transkripsjon, og som har til felles store områder med identitet eller likhet med de her krevde cDNA-er, anses for å være innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. but which has an amino acid sequence that differs from naturally occurring IL-4R due to a deletion, insertion or substitution. Like most mammalian genes, mammalian IL-4 receptors are thought to be encoded by multi-exon genes. Alternative mRNA constructs attributable to different post-transcriptional mRNA splicing events, and which share large areas of identity or similarity with the herein claimed cDNAs, are considered to be within the scope of the present invention.
Bioekvivalentanaloger av IL-4R-proteiner kan konstrueres ved f.eks. å lage forskjellige substitusjoner av rester eller sekvenser eller fjerne terminale eller innvendige rester eller sekvenser som ikke trengs for biologisk aktivitet. F.eks. kan cysteinrester fjernes eller erstattes med andre aminosyrer for å forhindre dannelse av ukorrekte, intramolekylære disulfidbroer etter renaturering. Andre fremgangsmåter for mutagenese omfatter modifikasjon av nabo-stilte, tobasiske aminosyrerester for å fremme ekspresjon i gjærsystemer hvor KEX2-proteaseaktivitet er til stede. Generelt bør substitusjoner gjøres konservative, dvs. de Bioequivalent analogues of IL-4R proteins can be constructed by e.g. to make different substitutions of residues or sequences or to remove terminal or internal residues or sequences not needed for biological activity. E.g. cysteine residues can be removed or replaced with other amino acids to prevent the formation of incorrect, intramolecular disulfide bridges after renaturation. Other methods of mutagenesis include modification of neighboring dibasic amino acid residues to promote expression in yeast systems where KEX2 protease activity is present. In general, substitutions should be made conservative, i.e. they
mest foretrukne substituttaminosyrer er de som har fysikalsk-kjemiske karakteristika som ligner på karakteristikaene til resten som skal erstattes. Når en delesjons- eller innføy-elsesstrategi vedtas, bør likeledes den potensielle effekt av delesjonen eller innføyelsen på biologisk aktivitet vur- most preferred substitute amino acids are those which have physicochemical characteristics similar to those of the residue to be substituted. When a deletion or insertion strategy is adopted, the potential effect of the deletion or insertion on biological activity should also be considered.
deres. their.
Underenheter av IL-4R kan konstrueres ved å fjerne terminale eller innvendige rester eller sekvenser. Særlig foretrukne underenheter omfatter de hvor transmembranområdet og det intracellulære område i IL-4R er fjernet eller byttet ut med hydrofile rester for å lette utskillese av reseptoren i celledyrkningsmediet. Det resulterende protein er et oppløselig IL-4R-molekyl som kan beholde sin evne til å binde IL-4. Bestemte eksempler på oppløselig IL-4R omfatter polypeptider med vesentlig identitet med sekvensen til aminosyrerestene 1-208 i figur 2A, og restene 1-207 i figur 4A. Subunits of IL-4R can be constructed by removing terminal or internal residues or sequences. Particularly preferred subunits include those in which the transmembrane region and the intracellular region of the IL-4R have been removed or replaced with hydrophilic residues to facilitate secretion of the receptor into the cell culture medium. The resulting protein is a soluble IL-4R molecule that can retain its ability to bind IL-4. Certain examples of soluble IL-4R include polypeptides with substantial identity to the sequence of amino acid residues 1-208 of Figure 2A, and residues 1-207 of Figure 4A.
Mutasjoner i nukleotidsekvenser konstruert for ekspresjon av analoge IL-4R-er, må selvsagt bevare leseramme-fasen til de kodende sekvensene og vil fortrinnsvis ikke skape komplementærområder som ville kunne hybridisere slik at det fremstilles sekundære mRNA-strukturer, slik som sløyfer eller hårnåler, som ville påvirke translasjon av reseptor-mRNA på skadelig måte. Selv om et mutasjonssete kan forutbestemmes, er det ikke nødvendig at mutasjonstypen per se forutbestemmes. For utvelgelse med hensyn på optimale karakteristika for mutanter i et bestemt sete kan f.eks. vilkårlig mutagenese utføres i målkodonet og de uttrykte IL-4R-mutanter kan screenes med hensyn på den ønskede aktivitet. Mutations in nucleotide sequences engineered for expression of analogous IL-4Rs must of course preserve the reading frame phase of the coding sequences and will preferably not create complementary regions that could hybridize to produce secondary mRNA structures, such as loops or hairpins, which would adversely affect translation of the receptor mRNA. Although a mutation site can be predetermined, it is not necessary that the type of mutation per se be predetermined. For selection with regard to optimal characteristics for mutants in a particular site, e.g. random mutagenesis is performed in the target codon and the expressed IL-4R mutants can be screened for the desired activity.
Ikke alle mutasjoner i nukleotidsekvensen som koder for IL-4R, vil bli uttrykt i sluttproduktet, f.eks. kan nukleotidsubstitusjoner gjøres for å øke ekspresjon, primært for å unngå sekundærstruktursløyfer i den transkriberte Not all mutations in the nucleotide sequence encoding IL-4R will be expressed in the final product, e.g. nucleotide substitutions can be made to increase expression, primarily to avoid secondary structure loops in the transcribed
mRNA (se EPA 75.444A), eller for å tilveiebringe kodoner som translateres lettere av den utvalgte vert, f.eks. de velkjente E. coli-preferansekodoner for E. coli-ekspresjon. mRNA (see EPA 75.444A), or to provide codons that are more readily translated by the selected host, e.g. the well-known E. coli preference codons for E. coli expression.
Mutasjoner kan innføres på bestemte steder ved å syntetisere oligonukleotider som inneholder en mutantsekvens flankert av restriksjonsseter som muliggjør ligering til fragmenter i den naturlig forekommende sekvens. Etter ligering koder den resulterende, rekonstruerte sekvens for en analog med den ønskede aminosyreinnføyelse, -substitusjon eller -delesjon. Mutations can be introduced at specific sites by synthesizing oligonucleotides containing a mutant sequence flanked by restriction sites that allow ligation to fragments of the naturally occurring sequence. After ligation, the resulting reconstructed sequence encodes an analog with the desired amino acid insertion, substitution, or deletion.
Alternativt kan det anvendes oligonukleotid-rettede, sete-spesifikke mutagenesefremgangsmåter for å tilveiebringe et endret gen med bestemte kodoner endret i henhold til den påkrevde substitusjon, delesjon eller innføy-else. Eksempelvise metoder for å lage endringene angitt ovenfor, er beskrevet av Walder et al. (Gene, 4_2, s. 133, 1986), Bauer et al. (Gene, 3_7, s- 73/ 1985), Craik (BioTechniques, januar 1985, s. 12-19), Smith et al. Alternatively, oligonucleotide-directed, site-specific mutagenesis methods can be used to provide an altered gene with specific codons altered according to the required substitution, deletion or insertion. Exemplary methods for making the changes indicated above are described by Walder et al. (Gene, 4_2, p. 133, 1986), Bauer et al. (Gene, 3_7, p-73/ 1985), Craik (BioTechniques, January 1985, pp. 12-19), Smith et al.
(Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981) og US patentskrifter nr. 4.518.584 og 4.737.462. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981) and US Patent Nos. 4,518,584 and 4,737,462.
Ekspresjon av rekombinant IL- 4R Expression of recombinant IL-4R
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer rekombinante ekspresjonsvektorer som omfatter syntetiske eller cDNA-avledede DNA-fragmenter som koder for pattedyr-IL-4R eller bioekvivalente analoger operativt bundet til egnede transkripsjons- eller translasjonsregulatorelementer avledet fra pattedyr-, mikrobe-, virus- eller insektgener. Slike regulatorelementer omfatter en transkripsjonspromoter, en eventuell operatorsekvens for å regulere transkripsjon, en sekvens som koder for egnede mRNA-ribosombindingsseter, og sekvenser som regulerer avslutningen av transkripsjon og translasjon, og som er beskrevet nærmere nedenunder. Evnen til å replikere i en vert, vanligvis overdratt av et replikasjonsopprinnelsessted, og et seleksjonsgen for å lette gjen-kjennelse av transformanter, kan i tillegg inkorporeres. DNA-områder er operativt bundet når de er funksjonelt rela-tert til hverandre. F.eks. er DNA for et signalpeptid (sekretorisk leder) operativt bundet til DNA for et polypeptid dersom det uttrykkes som en forløper som deltar i ut-skillelsen av polypeptidet; en promoter er operativt bundet til en kodesekvens dersom den regulerer transkripsjonen av sekvensen; eller et ribosombindingssete er operativt bundet til en kodesekvens dersom det er slik plassert at det mulig-gjør translasjon. Generelt betyr operativt bundet tilgrensende og, i tilfellet med sekretoriske ledere, tilgrensende og i leseramme. The present invention provides recombinant expression vectors comprising synthetic or cDNA-derived DNA fragments encoding mammalian IL-4R or bioequivalent analogs operably linked to suitable transcriptional or translational regulatory elements derived from mammalian, microbial, viral or insect genes. Such regulatory elements include a transcription promoter, an eventual operator sequence to regulate transcription, a sequence that codes for suitable mRNA-ribosome binding sites, and sequences that regulate the termination of transcription and translation, and which are described in more detail below. The ability to replicate in a host, usually conferred by an origin of replication, and a selection gene to facilitate recognition of transformants may additionally be incorporated. DNA regions are operatively linked when they are functionally related to each other. E.g. DNA for a signal peptide (secretory leader) is operably linked to DNA for a polypeptide if it is expressed as a precursor that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter is operably linked to a coding sequence if it regulates transcription of the sequence; or a ribosome binding site is operatively bound to a coding sequence if it is positioned in such a way that it enables translation. Generally, operationally bound means contiguous and, in the case of secretarial managers, contiguous and in reading frame.
DNA-sekvenser som koder for pattedyr-IL-4-reseptorer som skal uttrykkes i en mikroorganisme, vil fortrinnsvis ikke inneholde introner som for tidlig ville kunne avslutte transkripsjon av DNA til mRNA; for tidlig avslutning av transkripsjon kan imidlertid være ønskelig, f.eks. når det ville resultere i mutanter med fordelaktige C-ende-avkort-ninger, f.eks. delesjon av et transmembranområde slik at det fås en oppløselig reseptor som ikke er bundet til cellemembranen. På grunn av kodedegenerering kan det være betydelig variasjon i nukleotidsekvenser som koder for den samme aminosyresekvens; eksempelvise DNA-utførelsesformer er de som svarer til nukleotidsekvensene vist i figurene. DNA sequences encoding mammalian IL-4 receptors to be expressed in a microorganism will preferably not contain introns that would prematurely terminate transcription of DNA into mRNA; however, premature termination of transcription may be desirable, e.g. when it would result in mutants with advantageous C-terminal truncations, e.g. deletion of a transmembrane region so that a soluble receptor is obtained that is not bound to the cell membrane. Due to code degeneracy, there can be considerable variation in nucleotide sequences encoding the same amino acid sequence; exemplary DNA embodiments are those corresponding to the nucleotide sequences shown in the figures.
Andre utførelsesformer omfatter sekvenser som er i stand til Other embodiments include sequences capable of
å hybridisere til sekvensene ifølge figurene under middels strenge betingelser (50°C, 2 X SSC), og andre sekvenser som hybridiserer eller degenererer til de som er beskrevet ovenfor, som koder for biologisk aktive IL-4-reseptorpolypep-tider. to hybridize to the sequences of the figures under medium stringency conditions (50°C, 2 X SSC), and other sequences that hybridize or degenerate to those described above, which encode biologically active IL-4 receptor polypeptides.
Transformerte vertceller er celler som er blitt transformert eller transfisert med IL-4R-vektorer konstruert ved å bruke teknikker med rekombinant DNA. Transformerte vertceller uttrykker vanligvis IL-4R, men vertceller transformert for det formål å klone eller amplifisere IL-4R-DNA, trenger ikke å uttrykke IL-4R. Uttrykt IL-4R vil bli avsatt i cellemembranen eller utskilt i kultursupernatanten, avhengig av den utvalgte IL-4R-DNA. Egnede vertceller for ekspresjon av pattedyr-IL-4R omfatter prokaryoter, gjær eller høyere eukaryote celler under kontroll av korrekte promoterer. Prokaryoter omfatter gramnegative eller gram-positive organismer, f.eks. E. coli eller bacilli. Høyere eukaryote celler omfatter etablerte cellelinjer av pattedyropprinnelse som beskrevet nedenunder. Cellefrie translasjons-systemer kunne også anvendes for å produsere pattedyr-IL-4R under anvendelse av RNA-er avledet fra DNA-konstruksjonene ifølge foreliggende oppfinnelse. Passende klonings- og ekspresjonsvektorer for anvendelse med bakterie-, sopp-, gjær- og pattedyrcelleverter er beskrevet av Pouwels et al. Transformed host cells are cells that have been transformed or transfected with IL-4R vectors constructed using recombinant DNA techniques. Transformed host cells usually express IL-4R, but host cells transformed for the purpose of cloning or amplifying IL-4R DNA need not express IL-4R. Expressed IL-4R will be deposited in the cell membrane or secreted into the culture supernatant, depending on the selected IL-4R DNA. Suitable host cells for expression of mammalian IL-4R include prokaryotes, yeast or higher eukaryotic cells under the control of correct promoters. Prokaryotes include gram-negative or gram-positive organisms, e.g. E. coli or bacilli. Higher eukaryotic cells include established cell lineages of mammalian origin as described below. Cell-free translation systems could also be used to produce mammalian IL-4R using RNAs derived from the DNA constructs of the present invention. Suitable cloning and expression vectors for use with bacterial, fungal, yeast and mammalian cell hosts are described by Pouwels et al.
(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York,
1985) . 1985).
Prokaryote ekspresjonsverter kan anvendes for ekspresjon av IL-4R-er som ikke krever omfattende proteolytisk og disulfidbearbeiding. Prokaryote ekspresjonsvektorer omfatter generelt én eller flere fenotypeselekterbare markører, f.eks. et gen som koder for proteiner som gir antibiotika-resistens eller tilfører et autotropt behov, og et replikasjonsopprinnelsessted gjenkjent av verten for å sikre ampli-fikasjon i verten. Egnede prokaryote verter for transformasjon omfatter E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhy-murium, og forskjellige arter innenfor slektene Pseudomonas, Streptomyces og Staphylococcus, selv om andre også kan anvendes etter ønske. Prokaryotic expression hosts can be used for expression of IL-4Rs that do not require extensive proteolytic and disulfide processing. Prokaryotic expression vectors generally comprise one or more phenotype selectable markers, e.g. a gene that codes for proteins that confer antibiotic resistance or add an autotrophic need, and an origin of replication recognized by the host to ensure amplification in the host. Suitable prokaryotic hosts for transformation include E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhymurium, and various species within the genera Pseudomonas, Streptomyces, and Staphylococcus, although others may also be used as desired.
Anvendbare ekspresjonsvektorer for bakteriebruk kan omfatte en selekterbar markør og bakterielt replikasjonsopprinnelsessted avledet fra kommersielt tilgjengelige plas-mider som omfatter genetiske elementer av den velkjente kloningsvektor pBR322 (ATCC 37017). Slike kommersielle vektorer omfatter f.eks. pKK223-3 og pGEMl. Disse pBR322-"ryggrad"-avsnitt kombineres med en passende promoter og struktursekvensen som skal uttrykkes. E. coli transformeres vanligvis ved å bruke derivater av pBR322, et plasmid avledet fra en E. coli-art (Bolivar et al., Gene, 2, s. 95, 1977). pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetracyklin-resistens og gir således et enkelt middel for identifikasjon av transformerte celler. Useful expression vectors for bacterial use may comprise a selectable marker and bacterial origin of replication derived from commercially available plasmids comprising genetic elements of the well-known cloning vector pBR322 (ATCC 37017). Such commercial vectors include e.g. pKK223-3 and pGEM1. These pBR322 "backbone" sections are combined with an appropriate promoter and the structural sequence to be expressed. E. coli is usually transformed using derivatives of pBR322, a plasmid derived from an E. coli species (Bolivar et al., Gene, 2, p. 95, 1977). pBR322 contains genes for ampicillin and tetracycline resistance and thus provides a simple means of identification of transformed cells.
Promoterer som vanligvis anvendes i rekombinante, mikrobielle ekspresjonsvektorer, omfatter (3-lactamasen (penicillinase) og lactosepromotersystemet (Chang et al., Nature, 275, s. 615, 1978 og Goeddel et al., Nature, 281, Promoters commonly used in recombinant microbial expression vectors include the 3-lactamase (penicillinase) and the lactose promoter system (Chang et al., Nature, 275, p. 615, 1978 and Goeddel et al., Nature, 281,
s. 544, 1979) , tryptofan- (trp) promotersystemet (Goeddel et al., Nucl. Acids Res., 8, s. 4057, 1980 og EPA 36.776) og tac-promoter (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 412, 1982). Et særlig nyttig bakterielt ekspresjonssystem anvender fag A-PT-promoteren og den cl857ts termolabile repressor. Plasmid-vektorer tilgjengelige fra American Type Culture Collection p. 544, 1979), the tryptophan (trp) promoter system (Goeddel et al., Nucl. Acids Res., 8, p. 4057, 1980 and EPA 36,776) and the tac promoter (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). A particularly useful bacterial expression system uses the phage A-PT promoter and the cl857ts thermolabile repressor. Plasmid vectors available from the American Type Culture Collection
som inneholder derivater av A-P -promoteren, omfatter plasmid pHUB2 som finnes i E. coli stamme JMB9 (ATCC 37092), og pPLc28 som finnes i E. coli RR1 (ATCC 53082). which contain derivatives of the A-P promoter, include plasmid pHUB2 found in E. coli strain JMB9 (ATCC 37092), and pPLc28 found in E. coli RR1 (ATCC 53082).
Rekombinante IL-4R-proteiner kan også uttrykkes i gjærverter, fortrinnsvis fra Saccharomyces-slekten, slik som S. cerevisiae. Gjær fra denne slekten, slik som Pichia eller Kluyveromyces, kan også anvendes. Gjærvektorer vil generelt inneholde et replikasjonsopprinnelsessted fra 2u-gjær-plasmidet eller en autonomt replikerende sekvens (ARS), promoter, DNA som koder for IL-4R, sekvenser for polyadenyl-ering og transkripsjonsterminering, og et seleksjonsgen. Fortrinnsvis vil gjærvektorer omfatte et replikasjonsopprinnelsessted og en selekterbar markør som muliggjør transformasjon av både gjær og E. coli, f.eks. ampicillinresistensgenet til E. coli og S. cerevisiae-trpl-genet, som gir en seleksjonsmarkør for en mutantstamme av gjær som mangler evnen til å vokse i tryptofan, og en promoter avledet fra et høyuttrykt gjærgen, for å indusere transkripsjon av en struktursekvens nedstrøms. Tilstedeværelsen av trpl-lesjonen i gjærvertcellegenomet gir så et effektivt miljø for påvisning av transformasjon ved vekst i fravær av tryptofan. Recombinant IL-4R proteins can also be expressed in yeast hosts, preferably from the Saccharomyces genus, such as S. cerevisiae. Yeasts from this genus, such as Pichia or Kluyveromyces, can also be used. Yeast vectors will generally contain an origin of replication from the 2u yeast plasmid or an autonomously replicating sequence (ARS), promoter, DNA encoding IL-4R, sequences for polyadenylation and transcription termination, and a selection gene. Preferably, yeast vectors will comprise an origin of replication and a selectable marker enabling transformation of both yeast and E. coli, e.g. the ampicillin resistance gene of E. coli and the S. cerevisiae trpl gene, which provides a selection marker for a mutant strain of yeast lacking the ability to grow in tryptophan, and a promoter derived from a highly expressed yeast gene, to induce transcription of a downstream structural sequence. The presence of the trpl lesion in the yeast host cell genome then provides an efficient environment for detection of transformation by growth in the absence of tryptophan.
Egnede promotersekvenser i gjærvektorer omfatter promoterene for metallothionein, 3-fosfoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255, s. 2073, 1980) eller andre glycolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 1_, s. 149, 1968 og Holland et al., Biochem. 17, s. 4900, 1978), slik som enolase, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogen-ase, hexokinase, pyruvat-decarboxylase, fosfofruktokinase, glucose-6-fosfat-isomerase, 3-fosfoglycerat-mutase, pyruvat-kinase, triosefosfat-isomerase, fosfoglucose-isomerase og glucokinase. Egnede vektorer og promoterer for anvendelse i gjærekspresjon er videre beskrevet i Hitzeman, EPA 73.657. Suitable promoter sequences in yeast vectors include the promoters for metallothionein, 3-phosphoglycerate kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255, p. 2073, 1980) or other glycolytic enzymes (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. , 1_, p. 149, 1968 and Holland et al., Biochem. 17, p. 4900, 1978), such as enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6 -phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, triose phosphate isomerase, phosphoglucose isomerase and glucokinase. Suitable vectors and promoters for use in yeast expression are further described in Hitzeman, EPA 73,657.
Foretrukne gjærvektorer kan settes sammen ved å bruke DNA-sekvenser fra pBR322 for seleksjon og replikasjon i E. coli (Amp -gen og replikasjonsopprinnelsessted) og gjær-DNA-sekvenser som omfatter en glucose-undertrykkbar ADH2-promoter og a-faktor-sekresjonsleder. ADH2-promoteren er blitt beskrevet av Russell et al. (J. Biol. Chem. 258, Preferred yeast vectors can be assembled using DNA sequences from pBR322 for selection and replication in E. coli (Amp gene and origin of replication) and yeast DNA sequences comprising a glucose-repressible ADH2 promoter and α-factor secretion leader. The ADH2 promoter has been described by Russell et al. (J. Biol. Chem. 258,
s. 2674, 1982) og Beier et al. (Nature, 300, s. 724, 1982). Gjær-a-faktor-lederen som styrer sekresjon av heterologe proteiner, kan innføyes mellom promoteren og strukturgenet som skal uttrykkes. Se f.eks. Kurjan et al., Cell, 30, pp. 2674, 1982) and Beier et al. (Nature, 300, p. 724, 1982). The yeast α-factor leader that directs secretion of heterologous proteins can be inserted between the promoter and the structural gene to be expressed. See e.g. Kurjan et al., Cell, 30,
s. 933, 1982 og Bitter et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, p. 933, 1982 and Bitter et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA,
81, s. 5330, 1984. Ledersekvensen kan modifiseres slik at den nær sin 3'-ende inneholder ett eller flere anvendbare restriksjonsseter for å lette fusjon av ledersekvensen til fremmedgener. 81, p. 5330, 1984. The leader sequence can be modified so that near its 3' end it contains one or more useful restriction sites to facilitate fusion of the leader sequence to foreign genes.
Egnede gjærtransformasjonsfremgangsmåter er kjent for fagfolk innen teknikken; en eksempelvis teknikk er beskrevet av Hinnen et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 75, s. 1929, 1978, hvor det selekteres med hensyn på Trp<+->transformanter i et selektivt medium bestående av 0,67% gjærnitrogenbase, 0,5% casaminosyrer, 2% glucose, 10 ug/ml adenin og 20 ug/ml uracil. Suitable yeast transformation procedures are known to those skilled in the art; an exemplary technique is described by Hinnen et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 75, p. 1929, 1978, where selection is made with regard to Trp<+->transformants in a selective medium consisting of 0.67% yeast nitrogen base, 0.5% casamino acids, 2% glucose, 10 ug/ ml adenine and 20 ug/ml uracil.
Vertstammer transformert av vektorer omfattende ADH2-promoteren, kan dyrkes for ekspresjon i et rikt medium bestående av 1% gjærekstrakt, 2% pepton og 1% glucose supplert med 80 ug/ml adenin og 80 ug/ml uracil. Derepresjon av ADH2-promoteren oppstår etter uttømming av mediumglucose. Urene gjærsupernatanter innhøstes ved filtrering og holdes ved 4°C før videre rensing. Host strains transformed by vectors comprising the ADH2 promoter can be grown for expression in a rich medium consisting of 1% yeast extract, 2% peptone and 1% glucose supplemented with 80 µg/ml adenine and 80 µg/ml uracil. Derepression of the ADH2 promoter occurs after depletion of medium glucose. Impure yeast supernatants are harvested by filtration and kept at 4°C before further purification.
Forskjellige pattedyr- eller insektcellekultur-systerner kan anvendes for å uttrykke rekombinant protein. Baculovirussystemer for fremstilling av heterologe proteiner Various mammalian or insect cell culture systems can be used to express recombinant protein. Baculovirus systems for the production of heterologous proteins
i insektceller er omtalt av Luckow og Summers, Bio/Technology, j>, s. 47 (1988). Eksempler på egnede pattedyrvertcelle-linjer omfatter C0S-7-linjene av apenyreceller beskrevet av Gluzman (Cell, 2_3, s. 175, 1981), og andre cellelinjer som in insect cells is discussed by Luckow and Summers, Bio/Technology, j>, p. 47 (1988). Examples of suitable mammalian host cell lines include the C0S-7 line of monkey kidney cells described by Gluzman (Cell, 2_3, p. 175, 1981), and other cell lines such as
er i stand til å uttrykke en passende vektor, omfatter f.eks. L-celler, C127-, 3T3-, kinesisk hamsterovarie- (CHO), HeLa- og BHK-cellelinjer. Pattedyrekspresjonsvektorer kan omfatte ikke-transkriberte elementer, slik som et replika-sjonsopprinnelssted, en egnet promoter og "enhancer" bundet is able to express a suitable vector, includes e.g. L cells, C127, 3T3, Chinese hamster ovary (CHO), HeLa and BHK cell lines. Mammalian expression vectors may comprise non-transcribed elements, such as an origin of replication, a suitable promoter and enhancer linked
til genet som skal uttrykkes, og andre 5'- eller 3"-flanker-ende, ikke-transkriberte sekvenser, og 5'- eller 3'-ikke-translaterte sekvenser, slik som nødvendige ribosombindingsseter, et polyadenyleringssete, sammenspleisningsdonor- og -akseptorseter, og transkripsjonstermineringssekvenser. to the gene to be expressed, and other 5'- or 3'-flanking, non-transcribed sequences, and 5'- or 3'-non-translated sequences, such as required ribosome binding sites, a polyadenylation site, splice donor and acceptor sites , and transcription termination sequences.
Transkripsjons- og translasjonskontrollsekvensene i ekspresjonsvektorer som skal anvendes ved transformering av hvirveldyrceller, kan tilveiebringes ved hjelp av virus-kilder. F.eks. utledes vanlig brukte promoterer og "enhancers" fra polyoma, adenovirus 2, apevirus 40 (SV40) og humant cytomegalovirus. DNA-sekvenser avledet fra SV40-virusgenomet, f.eks. SV40-opprinnelse, tidlig og sen promoter, "enhancer", sammenspleisnings- og polyadenylerings-seter, kan anvendes for å tilveiebringe de øvrige genetiske elementene som er påkrevet for ekspresjon av en heterolog DNA-sekvens. De tidlige og sene promoterer er særlig anvendbare ettersom begge fås lett fra viruset som et fragment som også inneholder replikasjonsopprinnelsesstedet til SV40-virus (Fiers et al., Nature, 273, s. 113, 1978). Mindre eller større SV40-fragmenter kan også anvendes, forutsatt at den omtrent 250 bp store sekvens som strekker seg fra Hindlll-setet mot Bgll-setet lokalisert i det virale replikasjonsopprinnelsessted, er inkludert. Videre kan pattedyrgenom-IL-4R-promoter-, -kontroll- og/eller -signalsekvenser benyttes, forutsatt at slike kontrollsekvenser er forenlige med den valgte vertcelle. Ytterligere detaljer vedrørende anvendelsen av høyekspresjonsvektorer fra pattedyr for fremstilling av en rekombinant pattedyr-IL-4-reseptor, er gitt i eksempel 8 nedenunder. Eksempelvise vektorer kan konstrueres som beskrevet av Okayama og Berg (Mol. Cell. Biol, _3, The transcriptional and translational control sequences in expression vectors to be used in the transformation of vertebrate cells can be provided by means of viral sources. E.g. derived commonly used promoters and enhancers from polyoma, adenovirus 2, simian virus 40 (SV40) and human cytomegalovirus. DNA sequences derived from the SV40 virus genome, e.g. SV40 origin, early and late promoter, enhancer, splicing and polyadenylation sites can be used to provide the other genetic elements required for expression of a heterologous DNA sequence. The early and late promoters are particularly useful as both are readily obtained from the virus as a fragment which also contains the origin of replication of SV40 virus (Fiers et al., Nature, 273, p. 113, 1978). Smaller or larger SV40 fragments can also be used, provided that the approximately 250 bp sequence extending from the HindIII site toward the Bgll site located in the viral origin of replication is included. Furthermore, mammalian genome IL-4R promoter, control and/or signal sequences can be used, provided that such control sequences are compatible with the chosen host cell. Further details regarding the use of mammalian high expression vectors for the production of a recombinant mammalian IL-4 receptor are provided in Example 8 below. Exemplary vectors can be constructed as described by Okayama and Berg (Mol. Cell. Biol, _3,
s. 280, 1983). p. 280, 1983).
Et anvendbart system for stabil høynivåekspresjon av pattedyrreseptor-cDNA-er i C127 murine pattedyrepitelceller kan konstrueres i det vesentlige som beskrevet av Cosman et al. (Mol. Immunol., 2_3, s. 935, 1986). A useful system for stable high-level expression of mammalian receptor cDNAs in C127 murine mammary epithelial cells can be constructed essentially as described by Cosman et al. (Mol. Immunol., 2_3, p. 935, 1986).
En særlig foretrukket, eukaryot vektor for ekspresjon av IL-4R-DNA er beskrevet nedenunder i eksempel 2. Denne vektoren som det er henvist til som pCAV/NOT, ble avledet fra pattedyr-høyekspresjonsvektoren pDC201 og inneholder regulatorsekvenser fra SV40, adenovirus-2 og humant cytomegalovirus. pCAV/NOT som inneholder et humant IL-7-reseptorinnskudd, er blitt deponert ved American Type Culture Collection (ATCC) under deponeringsnr. 68014. A particularly preferred eukaryotic vector for expression of IL-4R DNA is described below in Example 2. This vector, referred to as pCAV/NOT, was derived from the mammalian high expression vector pDC201 and contains regulatory sequences from SV40, adenovirus-2 and human cytomegalovirus. pCAV/NOT containing a human IL-7 receptor insert has been deposited at the American Type Culture Collection (ATCC) under accession no. 68014.
Rensede pattedyr-IL-4-reseptorer eller analoger fremstilles ved å dyrke egnede vert- og vektorsystemer for å utrykke de rekombinante translasjonsproduktene av DNA-ene ifølge foreliggende oppfinnelse, som så renses fra dyrknings-mediene eller cellekstraktene. Purified mammalian IL-4 receptors or analogs are prepared by culturing suitable host and vector systems to express the recombinant translation products of the DNAs of the present invention, which are then purified from the culture media or cell extracts.
F.eks. kan supernatanter fra systemer som utskiller rekombinant protein i dyrkningsmedier, først konsentreres ved å bruke et kommersielt tilgjengelig proteinkonsentra-sjonsfilter, f.eks. en "Amicon" eller "Millipore Pellicon" ultrafiltreringsenhet. Etter oppkonsentreringstrinnet kan konsentratet påføres en egnet rensematriks. F.eks. kan en egnet affinitetsmatriks omfatte et IL-4- eller lectin- E.g. supernatants from systems that secrete recombinant protein into culture media can first be concentrated using a commercially available protein concentration filter, e.g. an "Amicon" or "Millipore Pellicon" ultrafiltration unit. After the concentration step, the concentrate can be applied to a suitable cleaning matrix. E.g. a suitable affinity matrix may comprise an IL-4 or lectin
eller antistoffmolekyl bundet til en egnet bærer. Alternativt kan det anvendes en anionbytterharpiks, f.eks. en matriks eller substrat med påhengte diethylaminoethylgrupper (DEAE)-grupper. Matriksene kan være acrylamid, agarose, dextran, cellulose eller andre typer vanlig anvendt innen protein-rensing. Alternativt kan det anvendes et kationbyttertrinn. Egnede kationbyttere omfatter forskjellige uoppløselige matrikser som omfatter sulfopropyl- eller carboxymethyl-grupper. Sulfopropylgrupper er foretrukket. or antibody molecule bound to a suitable carrier. Alternatively, an anion exchange resin can be used, e.g. a matrix or substrate with pendant diethylaminoethyl (DEAE) groups. The matrices can be acrylamide, agarose, dextran, cellulose or other types commonly used in protein purification. Alternatively, a cation exchange step can be used. Suitable cation exchangers include various insoluble matrices comprising sulfopropyl or carboxymethyl groups. Sulfopropyl groups are preferred.
Endelig kan det anvendes ett eller flere revers-fase-væskekromatografitrinn med høy yteevne (RP-HPLC) hvor det brukes hydrofobe RP-HPLC-medier, f.eks. silicagel med påhengte methylgrupper eller andre alifatiske grupper, for ytterligere å rense et IL-4R-preparat. Noen eller alle av de ovenfor nevnte rensetrinn kan i forskjellige kombinasjoner også anvendes for å tilveiebringe et homogent, rekombinant protein. Finally, one or more reverse-phase high-performance liquid chromatography steps (RP-HPLC) can be used where hydrophobic RP-HPLC media are used, e.g. silica gel with pendant methyl groups or other aliphatic groups, to further purify an IL-4R preparation. Some or all of the above-mentioned purification steps can also be used in different combinations to provide a homogeneous, recombinant protein.
Rekombinant protein fremstilt i bakteriekultur, isoleres vanligvis ved innledende ekstraksjon fra cellepellets, etterfulgt av ett eller flere konsentrasjons-, utsaltings-, vandig ionebytter- eller størrelsesutelukkelseskromatografi-trinn. Endelig kan det anvendes væskekromatografi med høy yteevne (HPLC) for sluttrensetrinnene. Mikrobeceller anvendt ved ekspresjon av rekombinant pattedyr-IL-4R, kan brytes opp ved enhver passende metode, inkludert vekselvis nedfrysing og opptining, ultralydbehandling, mekanisk opp-brytning eller anvendelse av cellelysemidler. Recombinant protein produced in bacterial culture is usually isolated by initial extraction from cell pellets, followed by one or more concentration, salting out, aqueous ion exchange or size exclusion chromatography steps. Finally, high-performance liquid chromatography (HPLC) can be used for the final purification steps. Microbe cells used in the expression of recombinant mammalian IL-4R can be disrupted by any suitable method, including alternate freezing and thawing, sonication, mechanical disruption, or the use of cell lysing agents.
Fermentasjon av gjær som uttrykker pattedyr-IL-4R som et utskilt protein, forenkler rensing mye. Utskilt, rekombinant protein som skriver seg fra en stor-skala-fermentering, kan renses ved metoder som er analoge med de som er beskrevet av Urdal et al. (J. Chromatog., 296, s. 171, 1984). Denne litteraturhenvisning beskriver to på hverandre følgende, revers-fase-HPLC-trinn for rensing av rekombinant, humant IL-2 på en preparativ HPLC-kolonne. Fermentation of yeast expressing mammalian IL-4R as a secreted protein greatly simplifies purification. Secreted recombinant protein resulting from a large-scale fermentation can be purified by methods analogous to those described by Urdal et al. (J. Chromatog., 296, p. 171, 1984). This reference describes two consecutive reverse-phase HPLC steps for the purification of recombinant human IL-2 on a preparative HPLC column.
Human IL-4R syntetisert i rekombinant kultur, er kjennetegnet ved tilstedeværelsen av ikke-humane cellekom-ponenter, inkludert proteiner, i mengder og av en karakter som avhenger av rensetrinnene som gjennomføres for å utvinne human IL-4R fra kulturen. Disse komponentene vil vanligvis være av gjær-, prokaryot eller ikke-human, høyere eukaryot opprinnelse og er fortrinnsvis til stede i forurensende mengder som er ufarlige, i størrelsesorden mindre enn ca. 1 vekt%. Videre muliggjør rekombinant cellekultur fremstillingen av IL-4R som er fri for proteiner som vanligvis kan være forbundet med IL-4R slik den finnes i naturen i sine opprinnelsesarter, f.eks. i celler, celleeksudater eller kroppsvæsker. IL-4R-preparater fremstilles for administrering ved å blande IL-4R med den ønskede renhetsgrad med fysiologisk akseptable bærere. Slike bærere vil være ikke-toksiske for mottagere ved de doseringer og konsentrasjoner som anvendes. Vanligvis medfører fremstillingen av slike preparater å blande IL-4R med buffere, antioxydanter slik som ascorbin-syre, polypeptider med lav molekylvekt (mindre enn ca. 10 rester), proteiner, aminosyrer, carbohydrater som omfatter glucose, sucrose eller dextriner, chelateringsmidler som EDTA, glutathion og andre stabiliseringsmidler og til-setningsstoffer. IL-4R-preparater kan anvendes til å regulere B-cellers funksjon. F.eks. hemmer oppløselig IL-4R (sIL-4R) proliferasjonen av B-cellekulturer indusert av IL-4 i nærvær av anti-Ig. sIL-4R hemmer også IL-4-indusert IgGl-sekresjon hos LPS-aktiverte B-celler, slik som bestemt ved hjelp av isotype-spesifikk ELISA, og hemmer IL-4-indusert Ia-ekspresjon på murine B-celler, slik som bestemt ved hjelp av EPICS-analyse. sIL-4R hemmer også IL-4-indusert IgE-syntese og kan følgelig anvendes til å behandle IgE-induserte reak-sjoner med øyeblikkelig hypersensitivitet, slik som allergisk rhinitt (vanlig høyfeber), bronkieastma, atopisk dermatitt og gastrointestinal matallergi. IL-4R-preparater kan også anvendes til å regulere T-cellers funksjon. F.eks. hemmer IL-4R IL-4-indusert proliferasjon av T-cellelinjer, slik som CTLL T-cellelinjen. sIL-4R hemmer også funksjonell aktivitet mediert av endogent produsert IL-4. F.eks. hemmer SIL-4R genereringen av allo-reaktive, cytolytiske T-lymfocytter (CTL) i sekundærblandet leukocyttkultur når de er til stede i kultur sammen med et monoklonalt antistoff mot IL-2, slik som S4B6. Nøytraliser-ingsmidler for både IL-2 og IL-4 anvendes for å hemme endogent IL-2 og IL-4 som begge regulerer CTL-generering og produseres i slike kulturer. Human IL-4R synthesized in recombinant culture is characterized by the presence of non-human cell components, including proteins, in amounts and of a nature that depends on the purification steps carried out to recover human IL-4R from the culture. These components will usually be of yeast, prokaryotic or non-human, higher eukaryotic origin and are preferably present in contaminating amounts that are harmless, on the order of less than about 1% by weight. Furthermore, recombinant cell culture enables the production of IL-4R that is free of proteins that may normally be associated with IL-4R as found in nature in its species of origin, e.g. in cells, cell exudates or body fluids. IL-4R preparations are prepared for administration by mixing IL-4R of the desired degree of purity with physiologically acceptable carriers. Such carriers will be non-toxic to recipients at the dosages and concentrations used. Usually, the production of such preparations involves mixing IL-4R with buffers, antioxidants such as ascorbic acid, low molecular weight polypeptides (less than about 10 residues), proteins, amino acids, carbohydrates including glucose, sucrose or dextrins, chelating agents such as EDTA , glutathione and other stabilizers and additives. IL-4R preparations can be used to regulate the function of B cells. E.g. soluble IL-4R (sIL-4R) inhibits the proliferation of B cell cultures induced by IL-4 in the presence of anti-Ig. sIL-4R also inhibits IL-4-induced IgG1 secretion by LPS-activated B cells, as determined by isotype-specific ELISA, and inhibits IL-4-induced Ia expression on murine B cells, as determined using EPICS analysis. sIL-4R also inhibits IL-4-induced IgE synthesis and can consequently be used to treat IgE-induced reactions with immediate hypersensitivity, such as allergic rhinitis (common high fever), bronchial asthma, atopic dermatitis and gastrointestinal food allergy. IL-4R preparations can also be used to regulate the function of T cells. E.g. IL-4R inhibits IL-4-induced proliferation of T cell lines, such as the CTLL T cell line. sIL-4R also inhibits functional activity mediated by endogenously produced IL-4. E.g. SIL-4R inhibits the generation of allo-reactive cytolytic T lymphocytes (CTL) in secondary mixed leukocyte culture when co-cultured with a monoclonal antibody against IL-2, such as S4B6. Neutralizing agents for both IL-2 and IL-4 are used to inhibit endogenous IL-2 and IL-4, which both regulate CTL generation and are produced in such cultures.
Ved terapeutiske anvendelser administreres en tera-peutisk effektiv mengde av et IL-4-reseptorpreparat til et pattedyr, fortrinnsvis et menneske, sammen med en farmasøyt-isk bærer eller fortynner. In therapeutic applications, a therapeutically effective amount of an IL-4 receptor preparation is administered to a mammal, preferably a human, together with a pharmaceutical carrier or diluent.
Eksempler Examples
Eksempel 1 Example 1
Bindingsanalyser for IL- 4- reseptor Binding assays for IL-4 receptor
A. Radioaktiv merking av IL-4. Rekombinant, murint og humant IL-4 ble uttrykt i gjær og renset til homogenitet som beskrevet av hhv. Park et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 84, s. 5267 (1987) og Park et al., J. Exp. Med., 166, A. Radioactive labeling of IL-4. Recombinant, murine and human IL-4 was expressed in yeast and purified to homogeneity as described by, respectively. Park et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 84, p. 5267 (1987) and Park et al., J. Exp. Med., 166,
s. 476 (1987). Det rensede protein ble radioaktivt merket ved å bruke et kommersielt tilgjengelig "enzymobead" radio-joderingsreagens. Ved denne fremgangsmåten blandes 2,5 ug rIL-4 i 50 ul 0,2 M natriumf osf at, pH 7,2, med 50 vil "enzymobead"-reagens, 2 MCi natriumjodid i 20 ul 0,05 M natrium-fosfat, pH 7,0, og 10 ul 2,5% b-D-glucose. Etter 10 minutter ved 25°C ble natriumazid (10 ul av 50 mM) og natriummeta-bisulfitt (10 ul av 5 mg/ml) tilsatt og inkubasjon fortsatt i 5 minutter ved 25°C. Reaksjonsblandingen ble oppdelt ved gelfiltrering på et 2 ml volum "Sephadex" G-25 ekvilibrert i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium inneholdende 2,5% (vekt/volum) bovint serumalbumin (BSA), 0,2% pp. 476 (1987). The purified protein was radiolabeled using a commercially available "enzymobead" radioiodination reagent. In this procedure, 2.5 µg of rIL-4 in 50 µl of 0.2 M sodium phosphate, pH 7.2, is mixed with 50 µl of Enzymobead reagent, 2 MCi of sodium iodide in 20 µl of 0.05 M sodium phosphate, pH 7.0, and 10 µl 2.5% b-D-glucose. After 10 minutes at 25°C, sodium azide (10 µl of 50 mM) and sodium metabisulfite (10 µl of 5 mg/ml) were added and incubation continued for 5 minutes at 25°C. The reaction mixture was fractionated by gel filtration on a 2 mL volume of "Sephadex" G-25 equilibrated in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium containing 2.5% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.2%
(vekt/volum) natriumazid og 20 mM Hepes pH 7,4 (bindingsmedium). Sluttmengden av <125>I-IL-4 ble fortynnet til en arbeidsoppløsning på 2 x 10 — 8 Mi bindingsmedium og lagret i opp til 1 måned ved 4°C uten påvisbart tap av reseptor-bindingsaktivitet. Den spesifikke aktivitet er rutinemessig i området 1-2 x 10 cpm/mmol IL-4. (w/v) sodium azide and 20 mM Hepes pH 7.4 (binding medium). The final amount of <125>I-IL-4 was diluted to a working solution of 2 x 10 - 8 Mi binding medium and stored for up to 1 month at 4°C without detectable loss of receptor binding activity. The specific activity is routinely in the range of 1-2 x 10 cpm/mmol IL-4.
B. Binding til adherente celler. Bindingsanalyser gjort med celler dyrket i suspensjonskultur (dvs. CTLL og CTLL-19.4) ble utført ved hjelp av en fthalatoljeseparasjons-metode (Dower et al., J. Immunol., 132, s. 751, 1984) hovedsakelig som beskrevet av Park et al., J. Biol. Chem., 261, B. Binding to adherent cells. Binding assays performed with cells grown in suspension culture (ie CTLL and CTLL-19.4) were performed using a phthalate oil separation method (Dower et al., J. Immunol., 132, p. 751, 1984) essentially as described by Park et al., J. Biol. Chem., 261,
s. 4177, 1986 og Park et al., supra. Bindingsanalyser ble også gjort på COS-celler transfisert med en pattedyreks-presjonsvektor inneholdende cDNA som koder for et IL-4-reseptormolekyl. For Scatchard-analyse av binding til adherente celler ble COS-celler transfisert med plasmid-DNA ved hjelp av metoden til Luthman et al., Nucl. Acids. Res., 11, s. 1295, 1983 og McCutchan et al., J. Nati. Cancer Inst., 41, s. 351, 1968. 8 timer etter transfeksjon ble celler trypsinisert og på nytt inokulert i 6-brønners plater ("Costar") ved en tetthet på 1 x 10<4> C0S-IL-4-reseptor-transfektanter/brønn blandet med 5 x 10 <5>COS-kontrolltrans- pp. 4177, 1986 and Park et al., supra. Binding assays were also performed on COS cells transfected with a mammalian expression vector containing cDNA encoding an IL-4 receptor molecule. For Scatchard assay of binding to adherent cells, COS cells were transfected with plasmid DNA using the method of Luthman et al., Nucl. Acids. Res., 11, p. 1295, 1983 and McCutchan et al., J. Nat. Cancer Inst., 41, p. 351, 1968. 8 hours after transfection, cells were trypsinized and re-inoculated into 6-well plates ("Costar") at a density of 1 x 10<4> COS-IL-4 receptor -transfectants/well mixed with 5 x 10 <5>COS control trans-
fiserte celler som bærere. To dager senere ble monolag analysert med hensyn på 5I-IL-4-binding ved 4°C, hovedsakelig ved hjelp av metoden beskrevet av Park et al., J. Exp. Med., 166, s. 476, 1987. Ikke-spesifikk binding av <125>I-IL-4 ble målt i nærvær av et 200-gangers eller større molart overskudd av umerket IL-4. Natriumazid (0,2%) ble inkludert i alle bindingsanalyser for å hemme internaliser-ing av <125>I-IL-4 av celler ved 37°C. fissured cells as carriers. Two days later, monolayers were assayed for 5I-IL-4 binding at 4°C essentially by the method described by Park et al., J. Exp. Med., 166, p. 476, 1987. Non- specific binding of <125>I-IL-4 was measured in the presence of a 200-fold or greater molar excess of unlabeled IL-4. Sodium azide (0.2%) was included in all binding assays to inhibit internalization of <125>I-IL-4 by cells at 37°C.
For analyse av bindingshemming av oppløselig IL-4R ble supernatanter fra COS-celler transfisert med rekombinant IL-4R-konstruksjoner innhøstet tre dager etter transfeksjon. 2-gangers seriefortynninger av kondisjonerte medier ble forinkubert med 3 x 10~<10> M 12<5>I-IL-4 (med en spesifikk aktivitet på ca. lx 10<16> cpm/mmol) i 1 time ved 3 7°C før tilsetningen av 2 x 10^ CTLL-celler. Inkubasjon ble fortsatt i 30 minutter ved 37°C før separasjon av fritt og celle-125 For analysis of binding inhibition of soluble IL-4R, supernatants from COS cells transfected with recombinant IL-4R constructs were harvested three days after transfection. 2-fold serial dilutions of conditioned media were preincubated with 3 x 10~<10> M 12<5>I-IL-4 (with a specific activity of about lx 10<16> cpm/mmol) for 1 hour at 3 7 °C before the addition of 2 x 10^ CTLL cells. Incubation was continued for 30 minutes at 37°C before separation of free and cell-125
bundet, murint I-IL-4. bound, murine I-IL-4.
C. Fas t-fase-bindingsanalyser. IL-4-reseptors evne til stabilt å bli adsorbert til nitrocellulose fra detergent-ekstrakter av CTLL 19.4-celler mens IL-4-bindingsaktivitet fortsatt ble bibeholdt, ga et middel for å overvåke rensing. C. Fast-phase binding assays. The ability of IL-4 receptor to be stably adsorbed to nitrocellulose from detergent extracts of CTLL 19.4 cells while still retaining IL-4 binding activity provided a means to monitor purification.
1 ml aliquoter av celleekstrakter (se eksempel 3), IL-4-affinitetskolonnefraksjoner (se eksempel 4) eller andre prøver plasseres på tørre BA85/21-nitrocellulosemembraner og får tørke. Membranene inkuberes i vevkulturskåler i 30 minutter i Tris (0,05 M) bufret saltoppløsning (0,15 M) 1 ml aliquots of cell extracts (see Example 3), IL-4 affinity column fractions (see Example 4) or other samples are placed on dry BA85/21 nitrocellulose membranes and allowed to dry. The membranes are incubated in tissue culture dishes for 30 min in Tris (0.05 M) buffered saline (0.15 M)
pH 7,5 som inneholder 3% vekt/volum BSA, for å blokkere ikke-spesif ikke bindingsseter. Membranen dekkes så med 4 x lO-^ M 125 pH 7.5 containing 3% w/v BSA, to block non-specific binding sites. The membrane is then covered with 4 x lO-^ M 125
I-IL-4 i PBS + 3% BSA med eller uten et 200-gangers molart overskudd av umerket IL-4 og inkuberes i 2 timer ved 4°C med rysting. Ved slutten av denne tiden vaskes membranene 3 ganger i PBS, tørkes og plasseres på "X-0mat"-AR-film i I-IL-4 in PBS + 3% BSA with or without a 200-fold molar excess of unlabeled IL-4 and incubated for 2 hours at 4°C with shaking. At the end of this time, the membranes are washed 3 times in PBS, dried and placed on "X-0mat"-AR film in
18 timer ved -70°C. 18 hours at -70°C.
Eksempel 2 Example 2
Utvelgelse av CTLL- celler med høy IL- 4- reseptorekspresjon ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering ( FACS) Selection of CTLL cells with high IL-4 receptor expression by fluorescence-activated cell sorting (FACS)
Den foretrukne cellelinje for oppnåelse av høy IL-4-reseptor/utvelgelse er CTLL, en murin IL-2-avhengig, cyto-toksisk T-cellelinje (ATCC TIB 214). For å oppnå høyere nivåer av IL-4-reseptorekspresjon ble CTLL-celler (opphavs-celler) utsortert ved å bruke fluorescensaktivert cellesortering og fluoresceinkonjugert, rekombinant, murint IL-4 (rmIL-4) hvor den omfattende festing av carbohydrat til rmIL-4 av gjærverten brukes til å dra fordel av å koble fluoresceinhydrazid til perjodatoxyderte sukkerrester. Det fluoresceinkonjugerte IL-4 ble fremstilt ved å kombinere aliquoter av hyperglycosylert rmIL-4 (300 ug i 300 ul 0,1 M citratfosfatbuffer, pH 5,5) med 30 ul 10 mM natrium-m-perjodat, nylig fremstilt i 0,1 M citratfosfat, pH 5,5, og blandingen ble inkubert ved 4°C i 30 minutter i mørket. Reaksjonen ble stanset med 30 ul 0,1 M glycerol og dialysert i 18 timer ved 4°C mot 0,1 M citratfosfat, pH 5,5. Etter dialyse ble et 1/10 volum av 100 mM 5-(((2-(carbohydrazino)-methyl)thio)acetyl)-aminofluorescein oppløst i DMS0, tilsatt til prøven, og det ble inkubert ved 25°C i 30 minutter. IL-4-fluorescein ble så grundig dialysert ved 4°C mot PBS, pH 7,4, og proteinkonsentrasjon bestemt ved hjelp av amino-syreanalyse. Sluttproduktet ble lagret ved 4°C etter tilsetning av 1% (vekt/volum) BSA og sterilfiltrering. For å sortere ble CTLL-celler (5 x 10<6>) inkubert i 30 minutter ved 37°C i 150 ul PBS + 1% BSA inneholdende 1 x 10 — 9 M IL-4-fluorescein under sterile betingelser. Blandingen ble så avkjølt til 4°C, vasket én gang i et stort volum PBS + 1% BSA, og det ble sortert ved å bruke et "EPICS" C-strømningscytometer. Cellene som ga det høyeste fluorescenssignalnivå (topp 1,0%), ble samlet opp i bulk og populasjonen tynnet ut i flytende cellekultur. For enkeltcellekloning ble alternativt celler som utviser et fluores-censsignal i toppen 1,0%, sortert i 96-brønners vevkultur-mikrotiterplater ved 1 celle pr. brønn. Forløpet ble overvåket ved å gjøre bindingsanalyser 12 5 med I-IL-4 etter hver runde med FACS-utvelgelse. Usorterte CTLL-celler (CTLL-opphav) oppviste vanligvis 1000-2000 IL-4-reseptorer pr. celle. CTLL-celler ble underkastet 19 runder med FACS-utvelgelse. De endelige CTLL-celler utvalgt (CTLL-19) oppviste 5 x IO<5> til 1 x IO<6> til IL-4-reseptorer pr. celle. På dette punktet ble CTLL-19-populasjonen underkastet "EPICS" C-assistert enkeltcellekloning, og individuelle klonepopulasjoner ble fortynnet og testet med hensyn på <125>I-IL-4-binding. En enkelt klon, betegnet CTLL-19.4, oppviste 1 x IO<6> IL-4-reseptorer pr. celle og ble valgt ut for rensing og kloningsundersøkelser. Selv om de beregnede, tilsynelatende K cl-verdier er like for de to linjene, uttrykker CTLL-19.4 omtrent 400 ganger flere reseptorer på sin overflate enn det CTLL-opphavet gjør. The preferred cell line for achieving high IL-4 receptor/selection is CTLL, a murine IL-2 dependent cytotoxic T cell line (ATCC TIB 214). To obtain higher levels of IL-4 receptor expression, CTLL cells (progenitor cells) were sorted using fluorescence-activated cell sorting and fluorescein-conjugated recombinant murine IL-4 (rmIL-4) where the extensive attachment of carbohydrate to rmIL-4 of the yeast host is used to take advantage of coupling fluorescein hydrazide to periodate oxidized sugar residues. The fluorescein-conjugated IL-4 was prepared by combining aliquots of hyperglycosylated rmIL-4 (300 µg in 300 µl of 0.1 M citrate phosphate buffer, pH 5.5) with 30 µl of 10 mM sodium m-periodate, freshly prepared in 0.1 M citrate phosphate, pH 5.5, and the mixture was incubated at 4°C for 30 minutes in the dark. The reaction was stopped with 30 µl of 0.1 M glycerol and dialyzed for 18 hours at 4°C against 0.1 M citrate phosphate, pH 5.5. After dialysis, a 1/10 volume of 100 mM 5-(((2-(carbohydrazino)-methyl)thio)acetyl)-aminofluorescein dissolved in DMS0 was added to the sample, and it was incubated at 25°C for 30 minutes. IL-4-fluorescein was then thoroughly dialyzed at 4°C against PBS, pH 7.4, and protein concentration determined by amino acid analysis. The final product was stored at 4°C after addition of 1% (w/v) BSA and sterile filtration. To sort, CTLL cells (5 x 10<6> ) were incubated for 30 min at 37°C in 150 µl PBS + 1% BSA containing 1 x 10 - 9 M IL-4-fluorescein under sterile conditions. The mixture was then cooled to 4°C, washed once in a large volume of PBS + 1% BSA, and sorted using an "EPICS" C flow cytometer. The cells giving the highest fluorescence signal level (top 1.0%) were collected in bulk and the population diluted in liquid cell culture. For single-cell cloning, alternatively, cells exhibiting a fluorescence signal in the top 1.0% were sorted in 96-well tissue culture microtiter plates at 1 cell per well. The course was monitored by doing binding analyzes 12 5 with I-IL-4 after each round of FACS selection. Unsorted CTLL cells (CTLL origin) usually exhibited 1000-2000 IL-4 receptors per cell. cell. CTLL cells were subjected to 19 rounds of FACS selection. The final CTLL cells selected (CTLL-19) exhibited 5 x IO<5> to 1 x IO<6> to IL-4 receptors per cell. At this point, the CTLL-19 population was subjected to "EPICS" C-assisted single cell cloning, and individual clone populations were diluted and tested for <125>I-IL-4 binding. A single clone, designated CTLL-19.4, exhibited 1 x 10<6> IL-4 receptors per cell and was selected for purification and cloning studies. Although the calculated apparent K cl values are similar for the two lines, CTLL-19.4 expresses approximately 400-fold more receptors on its surface than does the CTLL parent.
Eksempel 3 Example 3
Detergentekstraksjon av CTLL- celler Detergent extraction of CTLL cells
CTLL 19.4-celler ble opprettholdt i RPMI 1640 inneholdende 10% kalvefosterserum, 50 U/ml pencillin, 50 ug/ml streptomycin og 10 ng/ml rekombinant, humant IL-2. Celler ble dyrket til 5 x 10 5 celler/ml i rulleflasker, innhøstet ved sentrifugering, vasket to ganger i serum-fritt DMEM og sedimentert ved 2000 x g i 10 minutter for å danne en pakket pellet (ca. 2 x 10 o celler/ml). Til pelleten ble det tilsatt et likt volum PBS inneholdende 1% "Triton" X-100 og en blanding av proteaseinhibitorer (2 mM fenylmethylsulfonyl-fluorid, 10 uM pepstatin, 10 uM leupeptin, 2 mM o-fenanthro-lin og 2 mM EGTA). Cellene ble blandet med ekstraksjons-bufferen ved kraftig vortexing og blandingen inkubert på is i 20 minutter, hvoretter blandingen ble sentrifugert ved 12.000 x g i 20 minutter ved 8°C for å fjerne kjerner og andre rester. Supernatanten ble enten brukt øyeblikkelig eller lagret ved -70°C inntil bruk. CTLL 19.4 cells were maintained in RPMI 1640 containing 10% fetal calf serum, 50 U/ml penicillin, 50 µg/ml streptomycin and 10 ng/ml recombinant human IL-2. Cells were grown to 5 x 10 5 cells/ml in roller bottles, harvested by centrifugation, washed twice in serum-free DMEM and pelleted at 2000 x g for 10 min to form a packed pellet (approximately 2 x 10 o cells/ml) . To the pellet was added an equal volume of PBS containing 1% "Triton" X-100 and a mixture of protease inhibitors (2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 µM pepstatin, 10 µM leupeptin, 2 mM o-phenanthroline and 2 mM EGTA) . The cells were mixed with the extraction buffer by vigorous vortexing and the mixture incubated on ice for 20 minutes, after which the mixture was centrifuged at 12,000 x g for 20 minutes at 8°C to remove nuclei and other debris. The supernatant was either used immediately or stored at -70°C until use.
Eksempel 4 Example 4
IL- 4- reseptorrensing ved hjelp av IL- 4- affinitetskromatografi IL-4 receptor purification using IL-4 affinity chromatography
For å oppnå tilstrekkelige mengder murin IL-4R til å bestemme N-ende-sekvensen eller for ytterligere å karakterisere human IL-4R, ble protein erholdt fra detergent-ekstraks jonen av celler ytterligere renset ved affinitetskromatografi. Rekombinant, murint eller humant IL-4 ble koblet til "Affigel"-10 i henhold til produsentens forslag. Til en oppløsning av IL-4 (3,4 mg/ml i 0,4 ml 0,1 M Hepes, pH 7,4) ble det f.eks. tilsatt 1,0 ml vasket "Affigel"-10. Oppløsningen ble rystet over natten ved 4°C, og en aliquot av supernatanten ble testet for protein ved hjelp av en "BioRad" proteinanalyse ifølge produsentens instruksjoner under anvendelse av BSA som standard. Mer enn 95% av proteinet var blitt koblet til gelen, noe som tyder på at kolonnen hadde en sluttladning på 1,3 mg IL-4 pr. ml gel. Glycinethylester ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,05 M for å blokkere eventuelle ikke-omsatte seter på gelen. Gelen ble vasket grundig med PBS-1% "Triton" etterfulgt av 0,1 glycin-HCl, pH 3,0. En 0,8 x 4,0 cm kolonne ble fremstilt med IL-4-koblet "Affigel" fremstilt som beskrevet (4,0 ml pakningsvolum) og vasket med PBS inneholdende 1% "Triton" X-100 for rensing av murin IL-4R. Alternativt ble 50 ul aliquoter a<y> 20% suspensjon av IL-4-koblet "Affigel" inkubert med <35>S-cystein/methionin-merkede celleekstrakter for små-skala-affinitetsrensinger og gelelektro-forese. To obtain sufficient amounts of murine IL-4R to determine the N-terminal sequence or to further characterize human IL-4R, protein obtained from detergent extraction of cells was further purified by affinity chromatography. Recombinant, murine or human IL-4 was coupled to "Affigel"-10 according to the manufacturer's suggestion. To a solution of IL-4 (3.4 mg/ml in 0.4 ml 0.1 M Hepes, pH 7.4) was e.g. added 1.0 ml of washed "Affigel"-10. The solution was shaken overnight at 4°C, and an aliquot of the supernatant was tested for protein using a "BioRad" protein assay according to the manufacturer's instructions using BSA as a standard. More than 95% of the protein had been coupled to the gel, indicating that the column had a final charge of 1.3 mg of IL-4 per ml of gel. Glycine ethyl ester was added to a final concentration of 0.05 M to block any unreacted sites on the gel. The gel was washed thoroughly with PBS-1% "Triton" followed by 0.1 glycine-HCl, pH 3.0. A 0.8 x 4.0 cm column was prepared with IL-4-coupled "Affigel" prepared as described (4.0 ml pack volume) and washed with PBS containing 1% "Triton" X-100 for purification of murine IL- 4R. Alternatively, 50 µl aliquots of a 20% suspension of IL-4-linked "Affigel" were incubated with <35>S-cysteine/methionine-labeled cell extracts for small-scale affinity purifications and gel electrophoresis.
Aliquoter (25 ml) av detergentekstrahert IL-4-reseptor som bærer CTLL 19.4-celler, ble sakte tilført affi-nitetskolonnen med murint IL-4 ved 4°C (strømningshastighet ved 3,0 ml/time). Kolonnen ble så vasket i rekkefølge med PBS inneholdende 1% "Triton" X-100, RIPA-buffer (0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 1% NP-40, 1% deoxycholat og 0,1% SDS), PBS inneholdende 0,1% "Triton" X-100 og 10 mM ATP, og PBS med 1% "Triton" X-100 for å fjerne alt forurensende materiale bortsett fra mIL-4R. Kolonnen ble så eluert med pH 3,0 glycin-HCl-buffer inneholdende 0,1% "Triton" X-100 for å fjerne IL-4R, og deretter vasket med PBS inneholdende 0,1% Aliquots (25 ml) of detergent-extracted IL-4 receptor bearing CTLL 19.4 cells were slowly added to the murine IL-4 affinity column at 4°C (flow rate at 3.0 ml/hr). The column was then washed sequentially with PBS containing 1% "Triton" X-100, RIPA buffer (0.05 M Tris, 0.15 M NaCl, 1% NP-40, 1% deoxycholate and 0.1% SDS) , PBS containing 0.1% "Triton" X-100 and 10 mM ATP, and PBS with 1% "Triton" X-100 to remove all contaminating material except mIL-4R. The column was then eluted with pH 3.0 glycine-HCl buffer containing 0.1% "Triton" X-100 to remove IL-4R, and then washed with PBS containing 0.1%
"Triton" X-100. Fraksjoner å 1 ml ble samlet opp for eluer-ingen, og fraksjoner å 2 ml ble samlet opp under vaskingen. Umiddelbart etter eluering ble prøver nøytralisert med 80 ul 1 M Hepes, pH 7,4. Tilstedeværelsen av reseptor i frak-sjonene ble påvist ved hjelp av fast-fase-bindingsanalysen "Triton" X-100. Fractions of 1 ml were collected for elution, and fractions of 2 ml were collected during washing. Immediately after elution, samples were neutralized with 80 µl of 1 M Hepes, pH 7.4. The presence of receptor in the fractions was demonstrated using the solid-phase binding assay
125 125
som beskrevet ovenfor under anvendelse av I-merket IL-4. Aliquoter ble fjernet fra hver fraksjon for analyse ved hjelp av SDS-PAGE og det gjenværende nedfryst ved -70°C inntil bruk. For SDS-PAGE ble 40 ul av hver kolonnefraksjon tilsatt til 40 ul 2 X SDS prøvebuffer (0,125 M Tris HC1, pH 6,8, 4% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol). Prøvene ble plassert i et kokende vannbad i 3 minutter og 80 ul aliquoter tilført til prøvebrønner av en 10% polyacrylamidgel som var satt opp og kjørt i henhold til metoden til Laemmli (Nature, 227, s. 680, 1970). Etter elektoforese ble geler sølvfarget som tidligere beskrevet av Urdal et al. (Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 81, s. 6481, 1984). as described above using I-labeled IL-4. Aliquots were removed from each fraction for analysis by SDS-PAGE and the remainder frozen at -70°C until use. For SDS-PAGE, 40 µl of each column fraction was added to 40 µl of 2 X SDS sample buffer (0.125 M Tris HCl, pH 6.8, 4% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol). The samples were placed in a boiling water bath for 3 minutes and 80 µl aliquots added to sample wells of a 10% polyacrylamide gel set up and run according to the method of Laemmli (Nature, 227, p. 680, 1970). After electrophoresis, gels were silver stained as previously described by Urdal et al. (Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 81, p. 6481, 1984).
Rensing ved hjelp av fremgangsmåten ovenfor mulig-gjorde identifikasjon ved hjelp av sølvfarging av polyacrylamidgeler av to mIL-4R-proteinbånd med gjennomsnittlig 45-55 kDa og 30-40 kDa som var til stede i fraksjoner som utviste IL-4-bindingsaktivitet. Forsøk hvor celleoverflate-proteinene på CTLL-19.4-celler ble merket radioaktivt og 125 I-merket reseptor ble renset ved affinitetskromatografi, tydet på at disse to proteinene ble uttrykt på celleoverflaten. Forholdet mellom de lavere og høyere molekylvekt-bånd økte etter lagring av fraksjoner ved 4°C, noe som tyder på et forløperproduktslektskap, muligens på grunn av sakte, proteolytisk nedbrytning. mIL-4-reseptorproteinet renset ved hjelp av fremgangsmåten ovenfor, forblir i stand til å binde IL-4, både i oppløsning og når det var adsorbert til nitrocellulose. Purification by the above method enabled identification by silver staining of polyacrylamide gels of two mIL-4R protein bands averaging 45-55 kDa and 30-40 kDa which were present in fractions exhibiting IL-4 binding activity. Experiments in which the cell surface proteins on CTLL-19.4 cells were radioactively labeled and 125 I-labeled receptor was purified by affinity chromatography indicated that these two proteins were expressed on the cell surface. The ratio of the lower and higher molecular weight bands increased after storage of fractions at 4°C, suggesting a precursor product relationship, possibly due to slow proteolytic degradation. The mIL-4 receptor protein purified by the above method remains capable of binding IL-4, both in solution and when adsorbed to nitrocellulose.
Eksempel 5 Example 5
Sekvensering av IL- 4- reseptorprotein Sequencing of IL-4 receptor protein
CTLL 19.4 mIL-4-reseptor inneholdende fraksjoner fra mIL-4-affinitetskolonnerensingen, ble fremstilt for amino-ende-proteinsekvensanalyse ved fraksjonering på en SDS-PAGE-gel og så overført til en PVDF-membran. Før proteinfrak-sjonene ble sendt på polyacrylamidgeler, var det først nød-vendig å fjerne gjenværende detergent fra affinitetsrens-ningsprosessen. Fraksjoner inneholdende proteiner bundet til mIL-4-affinitetskolonnen fra tre preparater, ble tint og konsentrert hver for seg i en "speed vac" under vakuum til et sluttvolum på 1 ml. De konsentrerte fraksjoner ble så regulert til pH 2 ved tilsetning av 50% (volum/volum) TFA og injisert på en "Brownlees" RP-300 revers-fase-HPLC-kolonne (2,1 x 30 mm) ekvilibrert med 0,1% (volum/volum) TFA i 1^0 ved en strømningshastighet på 200 ul/min på en "Hewlett Packard" modell 1090M HPLC. Kolonnen ble vasket med 0,1% TFA i H20 i 20 minutter etter injeksjon. HPLC-kolonnen inneholdende det bundne protein, ble så fremkalt med en gradient som følger: CTLL 19.4 mIL-4 receptor containing fractions from the mIL-4 affinity column purification were prepared for amino-terminal protein sequence analysis by fractionation on an SDS-PAGE gel and then transferred to a PVDF membrane. Before the protein fractions were sent on polyacrylamide gels, it was first necessary to remove residual detergent from the affinity purification process. Fractions containing proteins bound to the mIL-4 affinity column from three preparations were thawed and concentrated separately in a speed vac under vacuum to a final volume of 1 ml. The concentrated fractions were then adjusted to pH 2 by the addition of 50% (v/v) TFA and injected onto a Brownlees RP-300 reverse-phase HPLC column (2.1 x 30 mm) equilibrated with 0.1 % (v/v) TFA in 1^0 at a flow rate of 200 µl/min on a "Hewlett Packard" model 1090M HPLC. The column was washed with 0.1% TFA in H 2 O for 20 minutes after injection. The HPLC column containing the bound protein was then developed with a gradient as follows:
Fraksjoner å 1 ml ble samlet opp hvert femte minutt og analysert med hensyn på tilstedeværelsen av protein ved hjelp av SDS-PAGE etterfulgt av sølvfarging. Fractions of 1 ml were collected every five minutes and analyzed for the presence of protein by SDS-PAGE followed by silver staining.
Hver fraksjon fra HPLC-gjennomkjøringen ble inndampet til tørrhet i en "speed vac" og så på nytt oppslemmet i Laemmli reduserende prøvebuffer, fremstilt som beskrevet av Laemmli, U.K. Nature, 227, s. 680, 1970. Prøver ble tilført en 5-20% gradient Laemmli SDS-gel og kjørt ved 45 niA inntil fargestoffronten nådde bunnen av gelen. Gelen ble så over-ført til PVDF-papir og farget som beskrevet av Matsudaira, Each fraction from the HPLC run was evaporated to dryness in a speed vac and then resuspended in Laemmli reducing sample buffer, prepared as described by Laemmli, U.K. Nature, 227, p. 680, 1970. Samples were loaded onto a 5-20% gradient Laemmli SDS gel and run at 45 niA until the dye front reached the bottom of the gel. The gel was then transferred to PVDF paper and stained as described by Matsudaira,
J. Biol. Chem., 262, s. 10035, 1987. Fargede bånd ble tydelig identifisert i fraksjoner fra hvert av de tre prepar-atene ved omtrent 30.000 til 40.000 Mr. J. Biol. Chem., 262, pp. 10035, 1987. Colored bands were clearly identified in fractions from each of the three preparations at about 30,000 to 40,000 Mr.
Båndene fra den tidligere PVDF-blotting ble skåret ut og underkastet automatisert Edman-nedbrytning på et "Applied Biosystems" modell 477A proteinsekvenseringsapparat hovedsakelig som beskrevet av Maren et al. (Nature, 315, s. 641, 1985), bortsett fra at PTH-aminosyrer ble injisert auto-matisk og analysert på en tilkoblet "Applied Biosystems" modell 120A HPLC under anvendelse av en gradient og påvis-ningssystem levert av produsenten. Den følgende aminoende-sekvens ble bestemt ut fra sekvenseringsresultatene: NH2-Ile-Lys-Val-Leu-Gly-Glu-Pro-Thr-Cys/Asn-Phe-Ser-Asp-Tyr-Ile. Båndene fra det andre preparat brukt for aminoende-sekvensering, ble behandlet med CNBr under anvendelse av den in situ teknikk som er beskrevet av March et al. (Nature, 315, s. 641, 1985) for å spalte proteinet etter innvendige methioninrester. Sekvensering av de resulterende spaltnings-produkter ga de følgende data, noe som indikerer at CNBr spaltet proteinet etter to innvendige methioninrester: The bands from the previous PVDF blot were excised and subjected to automated Edman digestion on an Applied Biosystems model 477A protein sequencer essentially as described by Maren et al. (Nature, 315, p. 641, 1985), except that PTH amino acids were injected automatically and analyzed on a coupled Applied Biosystems Model 120A HPLC using a gradient and detection system supplied by the manufacturer. The following amino-terminal sequence was determined from the sequencing results: NH 2 -Ile-Lys-Val-Leu-Gly-Glu-Pro-Thr-Cys/Asn-Phe-Ser-Asp-Tyr-Ile. The bands from the second preparation used for amino-end sequencing were treated with CNBr using the in situ technique described by March et al. (Nature, 315, p. 641, 1985) to cleave the protein for internal methionine residues. Sequencing of the resulting cleavage products yielded the following data, indicating that CNBr cleaved the protein after two internal methionine residues:
Sammenlignet med proteinsekvensene avledet fra klonene 16 og 18 (se figur 2), passet sekvensene sammen på følgende måte: Compared to the protein sequences derived from clones 16 and 18 (see Figure 2), the sequences matched as follows:
Identiske motstykker ble funnet for alle stillingene i sekvens 1, bortsett fra Asn(2) og sekvens 2, bortsett fra Arg i stillingene 8, 10 og 12, Ser i stilling 13 og Leu i stilling 16. Sekvensene ovenfor svarer til aminosyrerestene 137-154 og 169-187 i figur 2. Identical counterparts were found for all positions in sequence 1, except Asn(2) and sequence 2, except Arg in positions 8, 10 and 12, Ser in position 13 and Leu in position 16. The above sequences correspond to amino acid residues 137-154 and 169-187 in Figure 2.
I tillegg samsvarte aminoendesekvensen med en sekvens avledet fra klonen, idet stilling 9 ble definert som en Cys-rest. In addition, the amino-terminal sequence matched a sequence derived from the clone, with position 9 defined as a Cys residue.
Dataene ovenfor understøtter den konklusjon at klonene 16 og 18 er avledet fra budskapet for IL-4-reseptoren. The above data support the conclusion that clones 16 and 18 are derived from the message for the IL-4 receptor.
Eksempel 6 Example 6
Syntese av hybrid- subtrahert cDNA- probe Synthesis of hybrid subtracted cDNA probe
For å screene et bibliotek med hensyn på kloner som koder for en murin IL-4-reseptor, ble det erholdt en sterkt anriket IL-4-reseptor-cDNA-probe ved å bruke en subtraksjons-hybridiseringsstrategi. Polyadenylert (polyA<+>) mRNA ble isolert fra to like cellelinjer, opphavscellelinjen CTLL To screen a library for clones encoding a murine IL-4 receptor, a highly enriched IL-4 receptor cDNA probe was obtained using a subtraction hybridization strategy. Polyadenylated (polyA<+>) mRNA was isolated from two identical cell lines, the parent cell line CTLL
(som uttrykker omtrent 2.000 reseptorer pr. celle) og den utsorterte cellelinje CTLL 19.4 (som uttrykker 1 x IO<6> reseptorer pr. celle). mRNA-innholdet i disse to cellelinjene antas å være identiske bortsett fra det relative nivå av IL-4-reseptor-mRNA. Et radioaktivt merket, enkelttrådet cDNA-preparat ble så laget fra mRNA fra den utsorterte cellelinje CTLL 19.4 ved hjelp av revers transkripsjon av polyadenylert mRNA fra CTLL 19.4-celler ved hjelp av en lignende fremgangsmåte som den som er beskrevet av Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). I korte trekk ble polyA<+->mRNA renset som beskrevet av March et al. (Nature, 315, s. 641-647, 1985) og (expressing approximately 2,000 receptors per cell) and the sorted cell line CTLL 19.4 (expressing 1 x 10<6> receptors per cell). The mRNA content of these two cell lines is believed to be identical except for the relative level of IL-4 receptor mRNA. A radiolabeled, single-stranded cDNA preparation was then made from mRNA from the sorted cell line CTLL 19.4 by reverse transcription of polyadenylated mRNA from CTLL 19.4 cells using a method similar to that described by Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). Briefly, polyA<+->mRNA was purified as described by March et al. (Nature, 315, pp. 641-647, 1985) and
kopiert inn i cDNA ved hjelp av revers transkriptase under anvendelse av oligo-dT som en primer. For å oppnå et høyt nivå 32 32 copied into cDNA by reverse transcriptase using oligo-dT as a primer. To achieve a high level 32 32
av P-merkmg av cDNA, ble 100 uCi P-dCTP (s.a. = 3000 Ci/mmol) brukt i en 50 ul reaksjonsblanding med ikke-radioaktivt dCTP ved 10 uM. Etter revers transkripsjon ved 42°C i 2 timer ble EDTA tilsatt til 20 mM, og RNA ble hydrolysert ved å tilsette NaOH til 0,2 M og inkubere cDNA-blandingen ved 68°C i 20 minutter. Den enkelttrådede cDNA ble ekstra-hert med en 50/50 blanding av fenol og kloroform som på forhånd var ekvilibrert med 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. Vann-fasen ble flyttet over i et rent rør og gjort alkalisk på nytt ved tilsetning av NaOH til 0,5 M. cDNA ble så størr-elsefraksjonert ved kromatografi på en 6 ml "Sephadex" G50-kolonne i 30 mM NaOH og 1 mM EDTA for å fjerne forurens-ninger med liten molekylvekt. of P-labeling of cDNA, 100 µCi P-dCTP (s.a. = 3000 Ci/mmol) was used in a 50 µl reaction mixture with non-radioactive dCTP at 10 µM. After reverse transcription at 42°C for 2 h, EDTA was added to 20 mM, and the RNA was hydrolyzed by adding NaOH to 0.2 M and incubating the cDNA mixture at 68°C for 20 min. The single-stranded cDNA was extracted with a 50/50 mixture of phenol and chloroform previously equilibrated with 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. The water phase was transferred to a clean tube and made alkaline again by addition of NaOH to 0.5 M. The cDNA was then size fractionated by chromatography on a 6 ml "Sephadex" G50 column in 30 mM NaOH and 1 mM EDTA to remove impurities with low molecular weight.
Den resulterende, størrelsefraksjonerte cDNA frembrakt fra de utsorterte CTLL 19.4-celler, ble så hybridisert med et overskudd av mRNA fra de ikke-sorterte opphavs-CTLL-celler ved ethanolutfelling av cDNA fra CTLL 19.4-celler med 30 ug polyA+ mRNA isolert fra usorterte CTLL-celler, ny oppslemming i 16 ul 0,25 M NaP04, pH 6,8, 0,2% SDS, 2 mM The resulting size-fractionated cDNA generated from the sorted CTLL 19.4 cells was then hybridized with an excess of mRNA from the unsorted parent CTLL cells by ethanol precipitation of cDNA from CTLL 19.4 cells with 30 µg of polyA+ mRNA isolated from unsorted CTLL -cells, resuspended in 16 µl 0.25 M NaPO 4 , pH 6.8, 0.2% SDS, 2 mM
EDTA og inkubasjon i 20 timer ved 68°C. cDNA-ene fra de utsorterte CTLL 19.4-celler som er komplementære med mRNA-er fra de usorterte CTLL-celler, danner dobbelttrådede cDNA/mRNA-hybrider som så kan skilles fra den enkelttrådede cDNA EDTA and incubation for 20 hours at 68°C. The cDNAs from the sorted CTLL 19.4 cells that are complementary to mRNAs from the unsorted CTLL cells form double-stranded cDNA/mRNA hybrids that can then be separated from the single-stranded cDNA
basert på deres forskjellige bindingsaffiniteter på hydroxyapatitt. Blandingen ble fortynnet med 30 volumer 0,02 M NaPO^, pH 6,8, bundet til hydroxyapatitt ved værelsetempera-tur, og enkelttrådet cDNA ble så eluert fra harpiksen med 0,12 M NaPO^, pH 6,8, ved 60°C, som beskrevet av Sims et al., Nature, 312, s. 541, 1984. Fosfatbuffer ble så fjernet ved sentrifugering over 2 ml "Sephadex" G50-spinnkolonner i vann. Denne hybridsubtraksjonsfremgangsmåte fjerner hoved-delen av felles sekvenser hos CTLL 19.4 og usorterte CTLL-celler og etterlater en enkelttrådet cDNA-pool anriket med hensyn på radioaktivt merket IL-4-reseptor-cDNA som kan anvendes for å undersøke et cDNA-bibliotek (som beskrevet neden- based on their different binding affinities on hydroxyapatite. The mixture was diluted with 30 volumes of 0.02 M NaPO 3 , pH 6.8, bound to hydroxyapatite at room temperature, and single-stranded cDNA was then eluted from the resin with 0.12 M NaPO 3 , pH 6.8, at 60° C, as described by Sims et al., Nature, 312, p. 541, 1984. Phosphate buffer was then removed by centrifugation over 2 ml "Sephadex" G50 spin columns in water. This hybrid subtraction procedure removes the bulk of common sequences in CTLL 19.4 and unsorted CTLL cells and leaves a single-stranded cDNA pool enriched for radiolabeled IL-4 receptor cDNA that can be used to screen a cDNA library (as described down-
under). under).
Eksempel 7 Example 7
Syntese av cDNA- bibliotek og plakkscreening cDNA library synthesis and plaque screening
Et cDNA-bibliotek ble konstruert fra polyadenylert mRNA isolert fra CTLL 19.4-celler under anvendelse av standardteknikker (Gubler et al., Gene, 25_, s. 263, 1983; Ausubel et al., red., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 1987). Etter reverstranskripsjon under anvendelse av oligo-dT som primer, ble den enkelttrådede cDNA gjort dobbelttrådet med DNA-polymerase I, gjort butt-endet med T4-DNA-polymerase, methylert med EcoRI-methylase for å be-skytte EcoRI-spaltingsseter innenfor cDNA, og ligert til EcoRI-linkere. De resulterende konstruksjoner ble oppløst med EcoRI for å fjerne alle bortsett fra én kopi av linkerne i hver ende av cDNA, og ligert til en ekvimolar konsentrasjon av EcoRI-kutt og defosforylerte "AZAP"-armer, og den resulterende ligeringsblanding ble innpakket in vitro ("Gigapack") i henhold til produsentens instruksjoner. Andre egnede metoder og reagenser for frembringelse av cDNA-bibliotéker i A-fagvektorer er beskrevet av Huynh et al., DNA Cloning Techniques: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1984), Meissner et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, j34_, s. 4171 A cDNA library was constructed from polyadenylated mRNA isolated from CTLL 19.4 cells using standard techniques (Gubler et al., Gene, 25_, p. 263, 1983; Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 1987). After reverse transcription using oligo-dT as a primer, the single-stranded cDNA was made double-stranded with DNA polymerase I, blunt-ended with T4 DNA polymerase, methylated with EcoRI methylase to protect EcoRI cleavage sites within the cDNA, and ligated to EcoRI linkers. The resulting constructs were digested with EcoRI to remove all but one copy of the linkers at each end of the cDNA, ligated to an equimolar concentration of EcoRI cut and dephosphorylated "AZAP" arms, and the resulting ligation mixture packaged in vitro ( "Gigapack") according to the manufacturer's instructions. Other suitable methods and reagents for generating cDNA libraries in A phage vectors are described by Huynh et al., DNA Cloning Techniques: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1984), Meissner et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, j34_, p. 4171
(1987) og Ausubel et al., supra. "AZAP" er en fag-A-kloningsvektor som er lik med Agtll (US patentskrift 4.788.135) inneholdende plasmidsekvenser fra pUC19 (Norrander et al., Gene, 26, 101, 1987), et polylinkersete lokalisert i et lacZ-gen-fragment og et fl fag-opprinnelsessted for replikasjon som muliggjør utvinning av ssDNA når vertbakterier super-infiseres med fl hjelperfag. DNA skjæres ut i form av et plasmid som omfatter de ovennevnte elementer, betegnet "Bluescript". "Gigapack" er en ultralydbehandlet E. coli-ekstrakt brukt til innpakning av A-fag-DNA. (1987) and Ausubel et al., supra. "AZAP" is a phage A cloning vector similar to Agt11 (US Patent 4,788,135) containing plasmid sequences from pUC19 (Norrander et al., Gene, 26, 101, 1987), a polylinker site located in a lacZ gene- fragment and a fl phage origin of replication that enables recovery of ssDNA when host bacteria are super-infected with fl helper phage. The DNA is excised in the form of a plasmid comprising the above-mentioned elements, termed "Bluescript". "Gigapack" is an ultrasonically treated E. coli extract used for packaging A-phage DNA.
Den radioaktivt merkede, hybridsubtraherte cDNA fra eksempel 6 ble så brukt som en probe for å screene cDNA-biblioteket. Det amplifiserte bibliotek ble platet ut på BB4-celler ved en tetthet på 25.000 plakker på hver av 20 150 mm plater og inkubert over natten ved 37°C. Alle mani-pulasjoner av "AZAP" og utskjæring av "Bluescripf-plasmidet var som beskrevet av Short et al., (Nucl. Acids Res., 16, s. 7583, 1988) og Stratagene-produktlitteratur. Plakk-oppsugningsfiltere in duplo ble inkubert med hybridsubtraherte cDNA-prober fra eksempel 6 i hybridiseringsbuffer inneholdende 50% formamid, 5 X SSC, 5 X Denhardts reagens og 10% dextransulfat ved 42°C i 48 timer som beskrevet av Wahl et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 76, s. 3683, 1979. Filtere ble så vasket ved 68°C i 0,2 X SSC. 16 positive plakker ble renset for videre analyse. "Bluescript"-plasmider inneholdende cDNA-innskuddene, ble skåret ut fra fagen som beskrevet av produsenten og transformert inn i E. coli. Plasmid-DNA ble isolert fra enkeltstående kolonier, oppløst med EcoRI for å frigjøre cDNA-innskuddene og elektroforesebehandlet på standard 1% agarosegeler. Fire duplikatgeler ble blottet på nylon-filtere for å fremstille identiske Southern-blots for analyse med forskjellige prober som var (1) radioaktivt merket cDNA fra usorterte CTLL-celler, (2) radioaktivt merket cDNA fra CTLL 19.4 sorterte celler, (3) hybridsubtrahert cDNA fra CTLL 19.4 sorterte celler og (4) hybridsubtrahert cDNA fra CTLL 19.4 sorterte celler etter en andre runde med hybridisering til polyA<+->mRNA fra en IL-4-reseptor-negativ muse-cellelinje (LBRM 33 1A5B6). Disse probene ble i økende grad anriket på cDNA-kopier av mRNA som er spesifikk for den utsorterte cellelinje CTLL 19.4. Av de 16 positive plakker isolert fra biblioteket, oppviste fire kloner (11A, 14, 16 og 18) en parallell økning i signalstyrke med anrikning av proben. The radiolabeled hybrid subtracted cDNA from Example 6 was then used as a probe to screen the cDNA library. The amplified library was plated onto BB4 cells at a density of 25,000 plaques in each of 20 150 mm plates and incubated overnight at 37°C. All manipulations of "AZAP" and excision of the "Bluescripf" plasmid were as described by Short et al., (Nucl. Acids Res., 16, pp. 7583, 1988) and Stratagene product literature. Plaque blotting filters in duplicate were incubated with hybrid subtracted cDNA probes from Example 6 in hybridization buffer containing 50% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt's reagent and 10% dextran sulfate at 42°C for 48 hours as described by Wahl et al., Proe . Nati. Acad. Sci., USA, 76, p. 3683, 1979. Filters were then washed at 68°C in 0.2 X SSC. 16 positive plaques were purified for further analysis. "Bluescript" plasmids containing the cDNA inserts were excised from the phage as described by the manufacturer and transformed into E. coli. Plasmid DNA was isolated from single colonies, resolved with EcoRI to release the cDNA inserts and electrophoresed on standard 1% agarose gels. Four duplicate gels were blotted onto nylon filters to prepare identical Southern blots for analysis with different probes that were (1) radiolabeled cDNA from unsorted CTLL cells, (2) radiolabeled cDNA from CTLL 19.4 sorted cells, (3) hybrid subtracted cDNA from CTLL 19.4 sorted cells and (4) hybrid subtracted cDNA from CTLL 19.4 sorted cells after a second round of hybridization to polyA<+->mRNA from an IL-4 receptor-negative mouse cell line (LBRM 33 1A5B6). These probes were increasingly enriched for cDNA copies of mRNA specific for the sorted cell line CTLL 19.4. Of the 16 positive plaques isolated from the library, four clones (11A, 14, 16 and 18) showed a parallel increase in signal strength with enrichment of the probe.
Restriksjonskartlegging (vist i figur 1) og DNA-sekvensering av de isolerte CTLL-kloner indikerte eksistensen av minst to distinkte mRNA-populasjoner. Begge mRNA-typene har homologe, åpne leserammer over mesteparten av det kodende område, men adskiller seg fra hverandre i 3'-enden og koder således for homologe proteiner med forskjellige C00H-ende-sekvenser. DNA-sekvens fra innenfor de åpne leserammer hos begge klonene koder for proteinsekvens som er identisk med proteinsekvens avledet fra sekvensering av den rensede IL-4-reseptor beskrevet nærmere i eksempel 5. Klon 16 og klon 18 ble brukt som prototypene på disse to distinkte budskapstyper. Klon 16 inneholder en åpen leseramme som koder for et 25 8-aminosyrers polypeptid som omfatter aminosyrene -25 til 233 i figur 2A. Klon 18 koder for et 230-aminosyrers polypeptid hvorav de N-terminale 224 aminosyrene er identiske med N-enden i klon 16, men adskiller seg i 3'-enden med nukleotider CCAAGTAATGAAAATCTG som koder for de C-terminale 6 aminosyrer, Pro-Ser-Asn-Glu-Asn-Leu, etterfulgt av et termineringskodon TGA. Begge klonene ble uttrykt i et pattedyrekspresjonssystem som beskrevet i eksempel 8. Restriction mapping (shown in Figure 1) and DNA sequencing of the isolated CTLL clones indicated the existence of at least two distinct mRNA populations. Both mRNA types have homologous open reading frames over most of the coding region, but differ from each other at the 3' end and thus encode homologous proteins with different C00H end sequences. DNA sequence from within the open reading frames of both clones encodes protein sequence identical to protein sequence derived from sequencing of the purified IL-4 receptor described in more detail in Example 5. Clone 16 and clone 18 were used as the prototypes of these two distinct message types . Clone 16 contains an open reading frame encoding a 25 8-amino acid polypeptide comprising amino acids -25 to 233 of Figure 2A. Clone 18 codes for a 230-amino acid polypeptide of which the N-terminal 224 amino acids are identical to the N-end in clone 16, but differ at the 3' end with nucleotides CCAAGTAATGAAAATCTG which codes for the C-terminal 6 amino acids, Pro-Ser -Asn-Glu-Asn-Leu, followed by a termination codon TGA. Both clones were expressed in a mammalian expression system as described in Example 8.
Eksempel 8 Example 8
Ekspresjon av IL- 4R i pattedyrceller Expression of IL-4R in mammalian cells
A. Ekspresjon i C0S-7-celler. En eukaryot ekspresjonsvektor pCAV/NOT, vist i figur 3, ble avledet fra høy-ekspresjons-pattedyrvektoren pDC201 beskrevet av Sims et al., Science, 241, s. 585, 1988). pDC201 er et derivat av pMLSV tidligere beskrevet av Cosman et al., Nature, 312, s. 768, 1984. pCAV/NOT er utformet for å uttrykke cDNA-sekvenser innføyet i dens multiple kloningssete (MCS) når den er transfisert inn i pattedyrceller, og omfatter de følgende kom-ponenter: SV40 (skravert boks) inneholder SV40-sekvenser fra coordinatene 5171-270 inkludert replikasjonsopprinnelsesstedet, "enhancer"-sekvensene og de tidlige og sene promoterer. Fragmentet er orientert slik at transkripsjons-retningen fra den tidlige promoter er vist ved hjelp av pilen. CMV inneholder promoteren og "enhancer"-områdene fra humant cytomegalovirus (nukleotidene -671 til +7 fra sekvensen publisert av Boshart et al., Cell, 4_1, s. 521-530, 1985). Tripartittlederen (stiplet boks) inneholder det første exon og en del av intronet mellom det første og andre exonet i adenovirus-2-tripartittlederen, det andre exon og en del av det tredje exon i tripartittlederen og et mul-tippelt kloningssete (MCS) inneholdende setene for Xhol, Kpnl, Smal, Noti og Bglll. pA (skravert boks) inneholder SV40-sekvensene fra 4127-4100 og 2770-2533 som omfatter polyadenylerings- og -termineringssignalene for tidlig transkripsjon. Medurs fra pA er adenovirus-2-sekvensene 10532-11156 inneholdende VAI- og VAII-genene (angitt ved hjelp av svart søyle), etterfulgt av pBR322-sekvensene (heltrukket linje) fra 4363-2486 og 1094-375 inneholdende ampicillinresistensgenet og replikasjonsopprinnelsesstedet. Den resulterende ekspresjonsvektor ble betegnet pCAV/NOT. A. Expression in COS-7 cells. A eukaryotic expression vector pCAV/NOT, shown in Figure 3, was derived from the high-expression mammalian vector pDC201 described by Sims et al., Science, 241, p. 585, 1988). pDC201 is a derivative of pMLSV previously described by Cosman et al., Nature, 312, p. 768, 1984. pCAV/NOT is designed to express cDNA sequences inserted into its multiple cloning site (MCS) when transfected into mammalian cells , and comprises the following components: SV40 (shaded box) contains SV40 sequences from coordinates 5171-270 including the origin of replication, the "enhancer" sequences and the early and late promoters. The fragment is oriented so that the direction of transcription from the early promoter is shown by the arrow. CMV contains the promoter and enhancer regions of human cytomegalovirus (nucleotides -671 to +7 of the sequence published by Boshart et al., Cell, 4_1, pp. 521-530, 1985). The tripartite leader (dashed box) contains the first exon and part of the intron between the first and second exons of the adenovirus-2 tripartite leader, the second exon and part of the third exon of the tripartite leader and a multiple cloning site (MCS) containing the sites for Xhol, Kpnl, Smal, Noti and Bglll. pA (shaded box) contains the SV40 sequences from 4127-4100 and 2770-2533 that comprise the polyadenylation and termination signals for early transcription. Clockwise from pA are the adenovirus-2 sequences 10532-11156 containing the VAI and VAII genes (indicated by black bars), followed by the pBR322 sequences (solid line) from 4363-2486 and 1094-375 containing the ampicillin resistance gene and the origin of replication. The resulting expression vector was designated pCAV/NOT.
Innskuddene i klon 16 og klon 18 ble begge frigjort fra "Bluescript"-plasmid ved oppløsning med Asp718 og Noti. Det 3,5 kb store innskudd fra klon 16 ble så ligert direkte inn i ekspresjonsvektoren pCAV/NOT, også kuttet i Asp718- The inserts in clone 16 and clone 18 were both released from "Bluescript" plasmid by digestion with Asp718 and Noti. The 3.5 kb insert from clone 16 was then ligated directly into the expression vector pCAV/NOT, also cut in Asp718-
og Notl-setene i polylinkerområdet. Innskuddet fra klon 18 ble gjort butt-endet med T4-polymerase etterfulgt av ligering inn i vektoren pCAV/NOT, kuttet med Smal og defosfor-ylert. and the Notl seats in the polylinker region. The insert from clone 18 was blunt-ended with T4 polymerase followed by ligation into the vector pCAV/NOT, cut with SmaI and dephosphorylated.
Plasmid-DNA fra begge IL-4-reseptorekspresjons-plasmidene ble brukt til å transfisere et subsammenflytende lag av ape-C0S-7-celler under anvendelse av DEAE-dextran etterfulgt av klorkin-behandling, som beskrevet av Luthman et al. (Nucl. Acids Res., 11, s. 1295, 1983) og McCutchan et al. (J. Nati. Cancer Inst., 4_1, s. 351, 1968). Cellene ble så dyrket i kultur i tre dager for å muliggjøre forbi-gående ekspresjon av de innføyde sekvenser. Etter tre dager ble cellekultursupernatanter og cellemonolag analysert (som beskrevet i eksempel 1), og IL-4-binding ble bekreftet. Plasmid DNA from both IL-4 receptor expression plasmids was used to transfect a subconfluent layer of monkey COS-7 cells using DEAE-dextran followed by chlorquine treatment, as described by Luthman et al. (Nucl. Acids Res., 11, p. 1295, 1983) and McCutchan et al. (J. Nat. Cancer Inst., 4_1, p. 351, 1968). The cells were then grown in culture for three days to allow transient expression of the inserted sequences. After three days, cell culture supernatants and cell monolayers were analyzed (as described in Example 1), and IL-4 binding was confirmed.
B. Ekspresjon i CHO-celler. IL-4R ble også uttrykt B. Expression in CHO cells. IL-4R was also expressed
i pattedyr-CHO-cellelinjen ved først å ligere et Asp718/NotI-restriksjonsfragment fra klon 18 inn i pCAV/NOT-vektoren som beskrevet i eksempel 8. pCAV/NOT-vektoren inneholdende innskuddet fra klon 18, ble så co-transfisert under anvendelse av en standard kalsiumfosfatmetode i CHO-celler med den dihydrofolatreduktase (DHFR) cDNA-selekterbare markør under kontroll av SV40-tidlig-promoteren. DHFR-sekvensen mulig-gjør methotrexatutvelgelse for pattedyrceller som inneholder plasmidet. DHFR-sekvensamplifikasjonshendelser i slike celler ble valgt ut under anvendelse av forhøyede methotrexatkonsentrasjoner. På denne måte amplifiseres også in the mammalian CHO cell line by first ligating an Asp718/NotI restriction fragment from clone 18 into the pCAV/NOT vector as described in Example 8. The pCAV/NOT vector containing the insert from clone 18 was then co-transfected using by a standard calcium phosphate method in CHO cells with the dihydrofolate reductase (DHFR) cDNA selectable marker under the control of the SV40 early promoter. The DHFR sequence enables methotrexate selection for mammalian cells containing the plasmid. DHFR sequence amplification events in such cells were selected using elevated methotrexate concentrations. In this way is also amplified
de tilstøtende DNA-sekvenser, og det oppnås således for-sterket ekspresjon. Massecellekulturer av transfektantene utskilte aktivt, oppløselig IL-4R ved omtrent 100 ng/ml. the adjacent DNA sequences, and enhanced expression is thus achieved. Bulk cell cultures of the transfectants actively secreted soluble IL-4R at approximately 100 ng/ml.
C. Ekspresjon i HeLa-celler. IL-4R ble uttrykt i den humane HeLa-EBNA-cellelinje 653-6 som uttrykker EBV-kjerneantigen-1 konstitutivt drevet fra den CMV "immediate-early enhancer/promoter". Den anvendte ekspresjonsvektor var pHAV-EO-NEO beskrevet av Dower et al., J. Immunol., 142, s. 4314, 1989), et derivat av pDC201 som inneholder EBV-replikasjonsopprinnelsesstedet, og som muliggjør høynivå-ekspresjon i 653-6-cellelinjen. pHAV-EO-NEO avledes fra pDC201 ved å erstatte den viktigste senproraoteren i adenovirus med syntetiske sekvenser fra HIV-1 som strekker seg fra -148 til +78 i forhold til kappesetet i virus-mRNA, og som omfatter HIV-l-tat-genet under kontroll av SV40-tidlig-promoteren. Det inneholder også et BglII-SmaI-fragment som inneholder neomycinresistensgenet i pSV2NE0 (Southern & Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1, s. 332, 1982) innføyet i Bglli- og Hpal-setene og underkloning nedstrøms fra Sall-kloningssetet. Den resulterende vektor muliggjør utvelgelse av transfiserte celler for neomycinresistens. C. Expression in HeLa cells. IL-4R was expressed in the human HeLa-EBNA cell line 653-6 which expresses EBV core antigen-1 constitutively driven from the CMV immediate-early enhancer/promoter. The expression vector used was pHAV-EO-NEO described by Dower et al., J. Immunol., 142, p. 4314, 1989), a derivative of pDC201 which contains the EBV origin of replication and which enables high-level expression in 653-6 - the cell line. pHAV-EO-NEO is derived from pDC201 by replacing the major adenovirus late promoter with synthetic sequences from HIV-1 extending from -148 to +78 relative to the cap site of viral mRNA, and comprising the HIV-1-tat- the gene under the control of the SV40 early promoter. It also contains a BglII-SmaI fragment containing the neomycin resistance gene in pSV2NE0 (Southern & Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1, p. 332, 1982) inserted into the BglII and HpaI sites and subcloning downstream from the SalI the cloning site. The resulting vector enables selection of transfected cells for neomycin resistance.
Et 760 bp IL-4R-fragment ble frigjort fra "Bluescript"-plasmidet ved å oppløse med EcoNI- og SStl-restrik-sjonsenzymer. Dette fragmentet av klon 18 svarer til nukleotidene 1-672 i figur 2A med tillegg av en 5<*->ende-nukleotidsekvens GTGCAGGCACCTTTTGTGTCCCCA, et TGA-stoppkodon som etterfølger nukleotid 672 i figur 2A, og en 3'-ende-nukleotidsekvens CTGAGTGACCTTGGGGGCTGCGGTGGTGAGGAGAGCT. Dette fragmentet ble så gjort butt-endet ved bruk av T4-polymerase og subklonet i Sall-setet til pHAV-EO-NEO. Det resulterende plasmid ble så transfisert inn i 653-6-cellelinjen ved hjelp av en modifisert polybrentransfeksjons-metode som beskrevet av Dower et al. (J. Immunol., 142, A 760 bp IL-4R fragment was released from the "Bluescript" plasmid by digestion with EcoNI and SSt1 restriction enzymes. This fragment of clone 18 corresponds to nucleotides 1-672 in Figure 2A with the addition of a 5<*-> end nucleotide sequence GTGCAGGCACCTTTTGTGTCCCCA, a TGA stop codon following nucleotide 672 in Figure 2A, and a 3' end nucleotide sequence CTGAGTGACCTTGGGGGCTGCGGTGGTGAGGAGAGCT. This fragment was then blunt-ended using T4 polymerase and subcloned into the SalI site of pHAV-EO-NEO. The resulting plasmid was then transfected into the 653-6 cell line using a modified polybrene transfection method as described by Dower et al. (J. Immunol., 142,
s. 4314, 1989), med det unntak at cellene ble trypsinert 2 dager etter transfeksjon og splittet ved et forhold på 1:8 i medium inneholdende G418 ved en konsentrasjon på 1 mg/ml. Dyrkningsmedier ble endret to ganger ukentlig inntil neo- pp. 4314, 1989), except that the cells were trypsinized 2 days after transfection and split at a ratio of 1:8 in medium containing G418 at a concentration of 1 mg/ml. Culture media were changed twice weekly until neo-
mycinresistente kolonier var etablert. Kolonier ble så mycin-resistant colonies had been established. Colonies were so
enten plukket ut enkeltvis ved å bruke kloningsringer, eller slått sammen for å frembringe flere forskjellige cellelinjer. Disse cellelinjene ble holdt under legemiddelseleksjon ved either picked out individually using cloning rings, or pooled together to produce several different cell lines. These cell lines were maintained under drug selection at
en G418-konsentrasjon på 250 ug/ml. Etter at cellene nådde sammenflytning, ble supernatanter tatt og testet i inhiberingsanalysen ifølge eksempel IB. Cellelinjene prod-userte fra 100 ng/ml til 600 ng/ml oppløselig IL-4R-protein. a G418 concentration of 250 ug/ml. After the cells reached confluency, supernatants were collected and tested in the inhibition assay according to Example IB. The cell lines produced from 100 ng/ml to 600 ng/ml soluble IL-4R protein.
Eksempel 9 Example 9
Ekspresjon av IL- 4R i gjærceller Expression of IL-4R in yeast cells
For ekspresjon av mIL-4R ble en gjærekspresjonsvektor avledet fra pIXY120, konstruert som følger. pIXY120 er identisk med pYaHuGm (ATCC 53157), bortsett fra at det ikke inneholder noe cDNA-innskudd og omfatter et polylinker/mul-tippelkloningssete med et Ncol-sete. Denne vektoren omfatter DNA-sekvenser fra de følgende kilder: (1) et stort SphI- (nukleotid 562) til EcoRI- (nukleotid 4361) fragment skåret ut fra plasmid pBR3 22 (ATCC 3 7017) som omfatter replikasjonsopprinnelsen og ampicillinresistensmarkøren for seleksjon i E. coli; (2) S. cerevisiae-DNA som omfatter TRP-l-markøren, 2 u replikasjonsopprinnelse, ADH2-promoter; og (3) DNA som koder for et signalpeptid med 85 aminosyrer avledet fra genet som koder for den utskilte peptid-a- For expression of mIL-4R, a yeast expression vector derived from pIXY120 was constructed as follows. pIXY120 is identical to pYaHuGm (ATCC 53157), except that it contains no cDNA insert and comprises a polylinker/multiple cloning site with an NcoI site. This vector comprises DNA sequences from the following sources: (1) a large SphI (nucleotide 562) to EcoRI (nucleotide 4361) fragment excised from plasmid pBR3 22 (ATCC 3 7017) comprising the origin of replication and the ampicillin resistance marker for selection in E .coli; (2) S. cerevisiae DNA comprising the TRP-1 marker, 2 u origin of replication, ADH2 promoter; and (3) DNA encoding a signal peptide of 85 amino acids derived from the gene encoding the secreted peptide-a-
faktor (se US patentskrift nr. 4.546.082). Et Asp718-restriksjonssete ble innført i stilling 237 i a-faktor-signalpeptidet for å lette fusjon til heterologe gener. factor (see US Patent No. 4,546,082). An Asp718 restriction site was introduced at position 237 in the α-factor signal peptide to facilitate fusion to heterologous genes.
Dette ble oppnådd ved å endre thymidinresten i nukleotid 241 til en cytosinrest ved hjelp av oligonukleotid-rettet in vitro mutagenese som beskrevet av Craik, BioTechniques, januar 1985, s. 12-19. Et syntetisk oligonukleotid inneholdende multiple kloningsseter og med den følgende sekvens, ble innføyet fra Asp718-setet i aminosyre 79 nær 3'-enden i oc-faktor-signalpeptidet til et Spel-sete i 2 u-sekvensen: This was accomplished by changing the thymidine residue in nucleotide 241 to a cytosine residue by oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis as described by Craik, BioTechniques, January 1985, pp. 12-19. A synthetic oligonucleotide containing multiple cloning sites and with the following sequence was inserted from the Asp718 site in amino acid 79 near the 3' end of the oc factor signal peptide to a SpeI site in the 2 u sequence:
PBC120 varierer også fra pYaHuGM ved tilstedeværelsen av et 514 bp DNA-fragment avledet fra enkelttrådet fag fl inneholdende replikasjonsopprinnelsen og intergenområdet, som er blitt innføyet i Nrul-setet i pBR322-sekvensen. Tilstedeværelsen av en fl replikasjonsopprinnelse muliggjør frembringelse av enkelttrådede DNA-kopier av vektoren når den er transformert i passende stammer av E. coli og super-infisert med bakteriofag fl, noe som letter DNA-sekvensering av vektoren og gir et grunnlag for in vitro mutagenese. For å innføye en cDNA, oppløses pIXY120 med Asp718 som spalter nær 3<1->enden til a-faktor-lederpeptidet (nukleotid 237), og f.eks. BamHI som spalter i polylinkeren. Det store vektorfragment renses så og ligeres til et DNA-fragment som koder for proteinet som skal uttrykkes. For å skape en sekresjonsvektor for uttrykking av mIL-4R ble et cDNA-fragment som koder for mIL-4R, skåret ut fra "Bluescripf-plasmidet ifølge eksempel 8 ved oppløsning med Ppuml og Bglll for å frigjøre et 831 bp stort fragment fra Ppuml-setet (se figur) til et Bglll-sete lokalisert 3' i forhold til den åpne leseramme som inneholder mIL-4R-sekvensen minus de første to 5'-kodoner som koder for Ile og Lys. pIXY120 ble oppløst med Asp718 nær 3<1->enden av a-faktorlederen og BamHI. Vektorfragmentet ble ligert til Ppuml/Bglll hIL-4R-cDNA-fragmentet og det følgende fragment skapt ved "annealing" av et par av syntetiske oligonukleotider for å gjenskape de siste 6 aminosyrene i a-faktor-lederen og de to første aminosyrene i fullt ferdig mIL-4R. PBC120 also differs from pYaHuGM by the presence of a 514 bp DNA fragment derived from single-stranded phage fl containing the origin of replication and the intergenic region, which has been inserted into the Nrul site of the pBR322 sequence. The presence of an fl origin of replication enables the generation of single-stranded DNA copies of the vector when transformed into appropriate strains of E. coli and super-infected with bacteriophage fl, facilitating DNA sequencing of the vector and providing a basis for in vitro mutagenesis. To insert a cDNA, pIXY120 is digested with Asp718 cleaving near the 3<1> end of the α-factor leader peptide (nucleotide 237), and e.g. BamHI which cleaves the polylinker. The large vector fragment is then purified and ligated to a DNA fragment that codes for the protein to be expressed. To create a secretion vector for expression of mIL-4R, a cDNA fragment encoding mIL-4R was excised from the "Bluescripf plasmid of Example 8 by digestion with Ppuml and Bglll to release an 831 bp fragment from Ppuml- site (see figure) to a Bglll site located 3' to the open reading frame containing the mIL-4R sequence minus the first two 5' codons encoding Ile and Lys. pIXY120 was resolved with Asp718 near 3<1 ->end of the α-factor leader and BamHI The vector fragment was ligated to the Ppuml/Bglll hIL-4R cDNA fragment and the following fragment created by "annealing" a pair of synthetic oligonucleotides to recreate the last 6 amino acids of α-factor -the leader and the first two amino acids in fully finished mIL-4R.
Oligonukleotidet omfatter også en endring fra nukleotidsekvensen TGG ATA til CTA GAT som innfører et Xbal-restrik-sjonssete uten å endre aminosyresekvensen som det kodes for. The oligonucleotide also comprises a change from the nucleotide sequence TGG ATA to CTA GAT which introduces an XbaI restriction site without changing the amino acid sequence for which it is encoded.
Ekspresjonsvektoren ovenfor ble så renset og anvendt til å transformere en diploidgjærstamme av S. cerevisiae (XV2181) ved hjelp av standardteknikker, slik som de som er beskrevet i EPA 165.654, som selekterer for tryptofan-prototrofer. De resulterende transformanter ble dyrket for ekspresjon av et utskilt mIL-4R-protein. Kulturer som skulle analyseres med hensyn på biologisk aktivitet, ble dyrket i 20-50 ml YPD-medium (1% gjærekstrakt, 2% pepton, The above expression vector was then purified and used to transform a diploid yeast strain of S. cerevisiae (XV2181) using standard techniques, such as those described in EPA 165,654, which select for tryptophan prototrophs. The resulting transformants were cultured for expression of a secreted mIL-4R protein. Cultures to be analyzed for biological activity were grown in 20-50 ml of YPD medium (1% yeast extract, 2% peptone,
1% glucose) ved 37 o C inntil en celletetthet på 1-5 x 10<8 >celler/ml. For å skille celler fra medium ble celler fjernet ved sentrifugering, og mediet ble filtrert gjennom et 0,45 um celluloseacetatfilter før analyse. Supernatanter fremstilt ved hjelp av den transformerte gjærstamme, eller urensede ekstrakter fremstilt fra oppbrutte gjærceller transformert med plasmidet, ble analysert for å bekrefte ekspresjon av et biologisk aktivt protein. 1% glucose) at 37 o C until a cell density of 1-5 x 10<8 >cells/ml. To separate cells from medium, cells were removed by centrifugation, and the medium was filtered through a 0.45 µm cellulose acetate filter before analysis. Supernatants prepared using the transformed yeast strain, or crude extracts prepared from disrupted yeast cells transformed with the plasmid, were analyzed to confirm expression of a biologically active protein.
Eksempel 10 Example 10
Isolering av full- lengde- og avkortede former av murine IL- 4- reseptor- cDNA- er fra usorterte 7B9- celler Isolation of full-length and truncated forms of murine IL-4 receptor cDNAs from unsorted 7B9 cells
Polyadenylert RNA ble isolert fra 7B9-celler, en antigenavhengig hjelper-T-celle-klon avledet fra C57Bl/6-mus, og brukt til å konstruere et cDNA-bibliotek i AZAP, som beskrevet i eksempel 7. AZAP-biblioteket ble amplifisert én gang, og i alt 300.000 plakker ble screenet som beskrevet i eksempel 7, med det unntak at proben var et vilkårlig primet <32>P-merket 700 bp stort EcoRI-fragment isolert fra CTLL 19.4 klon 16. 13 kloner ble isolert og karakterisert ved restriksjonsanalyse. Polyadenylated RNA was isolated from 7B9 cells, an antigen-dependent helper T cell clone derived from C57Bl/6 mice, and used to construct a cDNA library in AZAP, as described in Example 7. The AZAP library was amplified one times, and a total of 300,000 plaques were screened as described in Example 7, with the exception that the probe was an arbitrarily primed <32>P-labeled 700 bp EcoRI fragment isolated from CTLL 19.4 clone 16. 13 clones were isolated and characterized by restriction analysis.
Nukleinsyresekvensanalyse av klon 7B9-2 avslørte at den inneholder en polyadenylert hale, et putativt polyaden-yleringssignal og en åpen leseramme med 810 aminosyrer (vist i figur 2), hvorav de første 258 er identiske med de som kodes av CTLL 19.4 klon 16, inkludert den putative signalpeptidsekvens med 25 aminosyrer. 7B9-2-cDNA ble subklonet i den eukaryote ekspresjonsvektor pCAV/NOT, og det resulterende plasmid ble transfisert i C0S-7-celler som beskrevet i eksempel 8. COS-7-transfektanter ble analysert som angitt i eksempel 12. Nucleic acid sequence analysis of clone 7B9-2 revealed that it contains a polyadenylated tail, a putative polyadenylation signal and an open reading frame of 810 amino acids (shown in Figure 2), the first 258 of which are identical to those encoded by CTLL 19.4 clone 16, including the putative signal peptide sequence of 25 amino acids. 7B9-2 cDNA was subcloned into the eukaryotic expression vector pCAV/NOT, and the resulting plasmid was transfected into COS-7 cells as described in Example 8. COS-7 transfectants were analyzed as indicated in Example 12.
En andre cDNA-form som er lik med klon 18 i CTLL 19.4-biblioteket, ble isolert fra 7B9-biblioteket og underkastet sekvensanalyse. Denne cDNA, klon 7B9-4, er 376 bp kortere enn klon 7B9-2 i 5'-enden og mangler de første 47 aminosyrene som kodes av 7B9-2, men koder for de gjenværende N-ende-aminosyrene 23-199 (figur 2). I stilling 200 har klon 7B9-4 (på samme måte som klon 18 fra CTLL 19.4) et 114 bp stort innskudd som endrer aminosyresekvensen til Pro Ser Asn Glu Asn Leu, etterfulgt av et termineringskodon. De 114 bp store innskuddene som finnes både i klon 7B9-4 og CTLL 19.4 klon 18, har identisk nukleinsyresekvens. Det faktum at denne cDNA-form som produserer en utskilt form av IL-4-reseptoren når den uttrykkes i C0S-7-celler, ble isolert fra disse to forskjellige cellelinjene, indikerer at den er hverken et klonet kunstprodukt eller en mutantform som er særegen for de utsorterte CTLL-celler. A second cDNA form similar to clone 18 in the CTLL 19.4 library was isolated from the 7B9 library and subjected to sequence analysis. This cDNA, clone 7B9-4, is 376 bp shorter than clone 7B9-2 at the 5' end and lacks the first 47 amino acids encoded by 7B9-2, but encodes the remaining N-terminal amino acids 23-199 (Figure 2). At position 200, clone 7B9-4 (like clone 18 from CTLL 19.4) has a 114 bp insertion that changes the amino acid sequence to Pro Ser Asn Glu Asn Leu, followed by a termination codon. The 114 bp inserts found in both clone 7B9-4 and CTLL 19.4 clone 18 have an identical nucleic acid sequence. The fact that this cDNA form, which produces a secreted form of the IL-4 receptor when expressed in COS-7 cells, was isolated from these two different cell lines indicates that it is neither a cloned artifact nor a mutant form that is distinctive for the sorted CTLL cells.
Eksempel 11 Example 11
Isolering av human- IL- 4- reseptor- cDNA- er fra PBL- og T22-biblioteker ved artskryssende hybridisering Isolation of human IL-4 receptor cDNAs from PBL and T22 libraries by cross-species hybridization
Polyadenylert RNA ble isolert fra sammenslåtte, humane, perifere blodlymfocytter (PBL) som var erholdt ved hjelp av standard Ficoll-rensing, ble dyrket i IL-2 i 6 dager etterfulgt av stimulering med PMA og Con-A i 8 timer. Et oligo-dT-primet cDNA-bibliotek ble konstruert i AgtlO under anvendelse av teknikker beskrevet i eksempel 7. Det ble fremstilt en probe ved å syntetisere et umerket RNA-transkript av 7B9-4-cDNA-innskuddet under anvendelse av T7-RNA-polymerase, etterfulgt av 3 2 P-merket cDNA-syntese med revers transkriptase under anvendelse av vilkårlige primere. Denne murine, enkelttrådede cDNA-probe ble brukt til å screene 50.000 plakker fra human-cDNA-biblioteket i 50% formamid/0,4 M NaCl ved 42°C, etterfulgt av vasking i 2 X SSC ved 55°C. Tre positive plakker ble renset, og EcoRI-innskuddene ble subklonet inn i "Bluescripf-plasmidvektoren. Nukleinsyre-sekvensering av en del av klon PBL-1, en 3,4 kb stor cDNA, indikerte at klonen var omtrent 67% homolog med den tilsvarende sekvens i den murine IL-4-reseptor. Et innskudd med 68 bp som inneholdt et termineringskodon og ikke bar noen homologi til mus-IL-4-reseptorklonene, ble imidlertid funnet 45 aminosyrer nedstrøms fra den forutsagte N-ende i det fullt ferdige protein, noe som tyder på at klon PBL-1 koder for en ikke-funksjonell, avkortet form av reseptoren. Ni ytterligere humane PBL-kloner ble erholdt ved å screene det Polyadenylated RNA was isolated from pooled human peripheral blood lymphocytes (PBL) obtained by standard Ficoll purification, cultured in IL-2 for 6 days followed by stimulation with PMA and Con-A for 8 hours. An oligo-dT-primed cDNA library was constructed in AgtlO using techniques described in Example 7. A probe was prepared by synthesizing an unlabeled RNA transcript of the 7B9-4 cDNA insert using T7 RNA- polymerase, followed by 3 2 P-labeled cDNA synthesis with reverse transcriptase using arbitrary primers. This murine single-stranded cDNA probe was used to screen 50,000 plaques from the human cDNA library in 50% formamide/0.4 M NaCl at 42°C, followed by washing in 2 X SSC at 55°C. Three positive plaques were purified and the EcoRI inserts were subcloned into the Bluescripf plasmid vector. Nucleic acid sequencing of a portion of clone PBL-1, a 3.4 kb cDNA, indicated that the clone was approximately 67% homologous to the corresponding sequence in the murine IL-4 receptor However, a 68 bp insert containing a termination codon and bearing no homology to the mouse IL-4 receptor clones was found 45 amino acids downstream of the predicted N-terminus in the full-length protein , suggesting that clone PBL-1 encodes a nonfunctional, truncated form of the receptor.Nine additional human PBL clones were obtained by screening the
32 32
samme bibliotek (under strenge betingelser) med en P-merket, vilkårlig primet probe laget fra klonen PBL-1 (det 3,4 kb store EcoRI-cDNA-innskudd). To av disse klonene, PBL-11 og PBL-5, omfattet 5'-området som inneholder det same library (under stringent conditions) with a P-labeled, arbitrarily primed probe made from clone PBL-1 (the 3.4 kb EcoRI cDNA insert). Two of these clones, PBL-11 and PBL-5, encompassed the 5' region containing it
68 bp store innskudd i PBL-1, men manglet det 68 bp store innskudd og strekker seg ikke fullstendig ut i 3 *, noe som fremgår av størrelsen og følgelig utelukker funksjonell analyse ved hjelp av pattedyrekspresjon. For å oppnå en konstruksjon som lar seg uttrykke i COS-7-celler, ble 5' Notl-HincII-fragmentet av klonene PBL-11 og PBL-5 ligert separat til 3' HincII-BamHI-enden i klon PBL-1 og subklonet inn i pCAV/NOT-ekspresjonsvektoren kuttet med Noti og Bglll beskrevet i eksempel 8. Disse kimære, humane IL-4R-cDNA-er som inneholder PBL-ll/PBL-1- og PBL-5/PBL-l-DNA-sekvenser, er blitt kalt hhv. klon A5 og klon B4 som ytterligere beskrevet i eksempel 12. Disse konstruksjonene ble transfisert inn i C0S-7-celler og analysert med hensyn på IL-4-binding i en platebindingsanalyse hovedsakelig som beskrevet i Sims et al. (Science, 241, s. 585, 1988). Begge sammensatte konstruksjoner kodet for protein som oppviste IL-4-bindingsaktivitet. Nukleotidsekvensen og den forutsagte aminosyresekvens i den sammensatte A5-konstruksjon svarer til sekvensinformasjonen angitt i figurene 4A-4C, med det unntak at et GTC-kodon koder for aminosyren Val i stilling 50 68 bp insert in PBL-1, but lacked the 68 bp insert and does not fully extend into 3*, as evidenced by its size and thus precludes functional analysis using mammalian expression. To obtain a construct expressible in COS-7 cells, the 5' NotI-HincII fragment of clones PBL-11 and PBL-5 was separately ligated to the 3' HincII-BamHI end of clone PBL-1 and subcloned into the pCAV/NOT expression vector cut with Noti and Bglll described in Example 8. These chimeric human IL-4R cDNAs containing PBL-11/PBL-1 and PBL-5/PBL-1 DNA sequences , have been called respectively clone A5 and clone B4 as further described in Example 12. These constructs were transfected into COS-7 cells and analyzed for IL-4 binding in a plate binding assay essentially as described in Sims et al. (Science, 241, p. 585, 1988). Both composite constructs encoded protein that exhibited IL-4 binding activity. The nucleotide sequence and the predicted amino acid sequence of the assembled A5 construct correspond to the sequence information set forth in Figures 4A-4C, with the exception that a GTC codon encodes the amino acid Val at position 50
i stedet for Ile. Ingen andre kloner som ble sekvensert inneholdt denne endring. Konsensuskodonet fra klonene PBL-1, instead of Ile. No other clones that were sequenced contained this change. The consensus codon from clones PBL-1,
50 50
PBL-5 og T22-8 er imidlertid ATC og koder for Ile , slik som angitt i figur 4A. Nukleotidet og forutsagt aminosyresekvens i den sammensatte B4-konstruksjon viser også at ledersekvensen med 25 aminosyrer i PBL-11 er erstattet med sekvensen Met-Gln-Lys-Asp-Ala-Arg-Arg-Glu-Gly-Asn. However, PBL-5 and T22-8 are ATC and encode Ile, as indicated in Figure 4A. The nucleotide and predicted amino acid sequence in the composite B4 construct also shows that the 25 amino acid leader sequence in PBL-11 is replaced by the sequence Met-Gln-Lys-Asp-Ala-Arg-Arg-Glu-Gly-Asn.
Konstruksjoner som uttrykker en oppløselig form av den humane IL-4-reseptoren, ble laget ved å skjære ut et 5'-terminalt 0,8 kb SmaI-DraIII-fragment fra PBL-5 og det tilsvarende 0,8 kb Asp718-DraIII-fragment fra PBL-11, hvorav Dralll-overhengene ble gjort butt-endede med T4-polymerase. PBL-5- og PBL-ll-fragmentene ble separat subklonet inn i CAV/NOT kuttet med hhv. Smal eller Asp718 pluss Smal; disse kalles hhv. oppløselig hIL-4R-5 og oppløselig hIL-4R-ll. Constructs expressing a soluble form of the human IL-4 receptor were made by excising a 5'-terminal 0.8 kb SmaI-DraIII fragment from PBL-5 and the corresponding 0.8 kb Asp718-DraIII- fragment from PBL-11, of which the DralII overhangs were blunt-ended with T4 polymerase. The PBL-5 and PBL-ll fragments were separately subcloned into CAV/NOT cut with resp. Smal or Asp718 plus Smal; these are called respectively soluble hIL-4R-5 and soluble hIL-4R-11.
Et andre bibliotek laget av en CD4+/CD8- human T-celle-klon, T22, (Acres et al., J. Immunol., 138, s. 2132, 1987) ble screenet (ved å bruke filtere in duplo) med to forskjellige prober syntetisert som beskrevet ovenfor. Den første probe ble erholdt fra et 220 bp PvuII-fragment fra 5'-enden i klon PBL-1, og den andre probe ble erholdt fra et 300 bp stort PvuII-EcoRI-fragment fra 3'-enden i klon PBL-1. Fem ytterligere cDNA-kloner ble identifisert ved å bruke disse to probene. To av disse klonene spente over 5'-området som inneholder det 6 8 bp store innskudd, men ingen av dem inneholder innskuddet. Den tredje av disse klonene, T22-8, var omtrent 3,6 kb i størrelse og inneholdt en åpen leseramme med 825 aminosyrer, inkludert en ledersekvens med 25 aminosyrer, et fullt ferdig utvendig område med 207 aminosyrer, et transmembranområde med 24 aminosyrer og et cyto-plasmaområde med 569 aminosyrer. Sekvensen til klon T22-8 er angitt i figurene 4A-4C. Figurene 5A-5B sammenligner den forutsagte, humane IL-4R-aminosyresekvens med den forutsagte, murine IL-4R-sekvens og viser omtrent 53% sekvens-identitet mellom de to proteinene. A second library made from a CD4+/CD8- human T-cell clone, T22, (Acres et al., J. Immunol., 138, p. 2132, 1987) was screened (using filters in duplicate) with two different probes synthesized as described above. The first probe was obtained from a 220 bp PvuII fragment from the 5' end in clone PBL-1, and the second probe was obtained from a 300 bp PvuII-EcoRI fragment from the 3' end in clone PBL-1. Five additional cDNA clones were identified using these two probes. Two of these clones spanned the 5' region containing the 6 8 bp insert, but neither contained the insert. The third of these clones, T22-8, was approximately 3.6 kb in size and contained an open reading frame of 825 amino acids, including a leader sequence of 25 amino acids, a complete external region of 207 amino acids, a transmembrane region of 24 amino acids, and a cytoplasmic region of 569 amino acids. The sequence of clone T22-8 is shown in Figures 4A-4C. Figures 5A-5B compare the predicted human IL-4R amino acid sequence with the predicted murine IL-4R sequence and show approximately 53% sequence identity between the two proteins.
Eksempel 12 Example 12
Analyse og rensing av IL- 4- reseptor i COS- transfektanter Analysis and purification of IL-4 receptor in COS transfectants
Likevektsbindingsundersøkelser ble utført for COS-celler transfisert med murine IL-4-reseptorkloner 16 og 18 fra CTLL 19.4-biblioteket. I alle tilfeller ga analyse av dataene i Scatchard-koordinatsysternet (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sei., 5_1, s. 660-672, 1949) en rett linje, noe som indikerer en enkel klasse av høyaffinitetsreseptorer for murin IL-4. For COS pCAV-16-celler var den beregnede, til-9 -1 5 Equilibrium binding studies were performed for COS cells transfected with murine IL-4 receptor clones 16 and 18 from the CTLL 19.4 library. In all cases, analysis of the data in the Scatchard coordinate system (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sei., 5_1, pp. 660-672, 1949) gave a straight line, indicating a single class of high affinity receptors for murine IL-4. For COS pCAV-16 cells, the calculated, to-9 -1 was 5
synelatende K& 3,6 x 10 M med 5,9 x 10 spesifikke bindingsseter pr. celle. En lignende tilsynelatende K ble visible K& 3.6 x 10 M with 5.9 x 10 specific binding seats per cell. A similar apparent K became
9-1 a beregnet for COS pCAV-18-celler ved 1,5 x 10 M , men reseptorantall uttrykt på celleoverflaten var 4,2 x IO<4>. Likevektsbindingsundersøkelser utført på COS-celler transfisert med IL-4R-DNA-kloner isolert fra 7B9-cellebiblioteket, viste også høyaffinitetsbinding av reseptoren til IL-4. Nærmere bestemt viste undersøkelser ved bruk av COS-celler transfisert med pCAV-7B9-2, at den murine IL-4-reseptor med full lengde bandt <125>I-IL-4 med en tilsynelatende K& på ca. 1,4 x 10"^ M ^ med 4,5 x IO<4> spesifikke bindingsseter pr. celle. Den tilsynelatende K for CAV-7B9-4 IL-4R ble beregnet til å være ca. 1,7 x 10 9 M -1. Selv om absolutte verdier for K clog bindingsseter pr. celle var forskjellige for transfeksjonene, var bindingsaffinitetene generelt like (1 x 10^ - 1 x 10"*"° M "*") og passet godt til tidligere pub-liserte affinitetskonstanter for IL-4-binding. 9-1 a calculated for COS pCAV-18 cells at 1.5 x 10 M , but receptor number expressed on the cell surface was 4.2 x 10<4>. Equilibrium binding studies performed on COS cells transfected with IL-4R DNA clones isolated from the 7B9 cell library also showed high affinity binding of the receptor to IL-4. Specifically, studies using COS cells transfected with pCAV-7B9-2 showed that the full-length murine IL-4 receptor bound <125>I-IL-4 with an apparent K& of approx. 1.4 x 10"^ M ^ with 4.5 x 10<4> specific binding sites per cell. The apparent K for CAV-7B9-4 IL-4R was calculated to be approximately 1.7 x 10 9 M - 1. Although absolute values of K clog binding sites per cell were different for the transfections, the binding affinities were generally similar (1 x 10^ - 1 x 10"*"° M "*") and fit well with previously published affinity constants for IL-4 binding.
125 125
Inhibering av I-mIL-4-bmding til CTLL-celler ved hjelp av kondisjonerte medier fra COS-celler transfisert med plasmid pCAV, pCAV-18 eller pCAV-7B9-4, ble brukt til å bestemme om disse cDNA-er kodet for funksjonelle, oppløselige reseptormolekyler. Omtrent 1,5 ul COS pCAV-18-kondisjonert medium i et endelig analysevolum på 150 ul gir omtrent 50% inhibering av <125>I-IL-4-binding til IL-4-reseptoren på CTLL-celler. <125> I-IL-4-reseptor-konkurrerende aktivitet påvises ikke i kontroll-pCAV-transfiserte COS-supernatanter. Fra kvantitativ analyse av fortynningen av pCAV-18-supernatant påkrevet for å hemme <1>25I-IL-4-binding med 50%, beregnes det at omtrent 60-100 ng/ml oppløselig IL-4-reseptor er blitt utskilt av COS-celler høstet tre dager etter transfeksjon. Lignende resultater ble oppnådd ved å benytte supernatanter fra COS-celler transfisert med pCAV-7B9-4. Inhibition of I-mIL-4 binding to CTLL cells by conditioned media from COS cells transfected with plasmid pCAV, pCAV-18, or pCAV-7B9-4 was used to determine whether these cDNAs encoded functional , soluble receptor molecules. Approximately 1.5 µl of COS pCAV-18 conditioned medium in a final assay volume of 150 µl provides approximately 50% inhibition of <125>I-IL-4 binding to the IL-4 receptor on CTLL cells. <125> I-IL-4 receptor-competitive activity is not detected in control pCAV-transfected COS supernatants. From quantitative analysis of the dilution of pCAV-18 supernatant required to inhibit <1>25I-IL-4 binding by 50%, it is estimated that approximately 60-100 ng/ml of soluble IL-4 receptor has been secreted by COS -cells harvested three days after transfection. Similar results were obtained using supernatants from COS cells transfected with pCAV-7B9-4.
Kondisjonert medium fra COS-celler transfisert med pCAV-18 eller pCAV-7B9-4 (se eksempel 8) og dyrket i DMEM inneholdende 3% FBS, ble innhøstet tre dager etter transfeksjon. Supernatanter ble sentrifugert ved 3.000 cpm i 10 minutter og nedfryst inntil de trengtes. 200 ml kondisjonert medium ble fylt på en kolonne inneholdende 4 ml muIL-4-"Affigel" fremstilt som beskrevet ovenfor. Kolonnen ble vasket grundig med PBS og IL-4-reseptor eluert med 0,1 M glycin, og 0,15 M NaCl, pH 3,0. Øyeblikkelig etter eluering ble prøver nøytralisert med 80 ul 1 M Hepes, pH 7,4. Prøver ble testet med hensyn på deres evne til å hemme Conditioned medium from COS cells transfected with pCAV-18 or pCAV-7B9-4 (see Example 8) and grown in DMEM containing 3% FBS was harvested three days after transfection. Supernatants were centrifuged at 3,000 cpm for 10 minutes and frozen until needed. 200 ml of conditioned medium was loaded onto a column containing 4 ml of muIL-4 "Affigel" prepared as described above. The column was washed thoroughly with PBS and IL-4 receptor eluted with 0.1 M glycine, and 0.15 M NaCl, pH 3.0. Immediately after elution, samples were neutralized with 80 µl of 1 M Hepes, pH 7.4. Samples were tested for their ability to inhibit
125 125
binding av I-muIL-4 til CTLL-celler som angitt i eksempel IB. Tilleggsprøver ble testet med hensyn på renhet ved analyse på SDS-PAGE og sølvfarging som tidligere beskrevet. Alternative metoder for testing av aktivitet av funksjonell, oppløselig reseptor eller hemming av IL-4-binding omfatter fast-fase-bindingsanalyser som beskrevet i eksempel 1C, eller andre lignende cellefrie analyser hvor det kan benyttes enten radioaktivt jodert eller kolorimetrisk fremkalt IL-4-binding, slik som RIA eller ELISA. Proteinet analysert ved hjelp av SDS-PAGE under reduserende betingelser, har en molekylvekt på omtrent 37.500 og synes å være omtrent 90% ren ved sølvfargeanalyse av geler. binding of I-muIL-4 to CTLL cells as indicated in Example IB. Additional samples were tested for purity by analysis on SDS-PAGE and silver staining as previously described. Alternative methods for testing activity of functional, soluble receptor or inhibition of IL-4 binding include solid-phase binding assays as described in example 1C, or other similar cell-free assays where either radioactive iodinated or colorimetrically developed IL-4 can be used binding, such as RIA or ELISA. The protein analyzed by SDS-PAGE under reducing conditions has a molecular weight of about 37,500 and appears to be about 90% pure by silver staining of gels.
Renset, rekombinant, oppløselig, murint IL-4-reseptorprotein kan også testes med hensyn på evne til å hemme IL-4-indusert <3>H-thymidin-inkorporering i CTLL-celler. Ifølge slike metoder er oppløselig IL-4-reseptor blitt funnet å blokkere IL-4-stimulert proliferasjon, men påvirker ikke IL-2-drevet mitogenrespons. Purified recombinant soluble murine IL-4 receptor protein can also be tested for ability to inhibit IL-4-induced <3>H-thymidine incorporation in CTLL cells. According to such methods, soluble IL-4 receptor has been found to block IL-4-stimulated proliferation but does not affect IL-2-driven mitogen response.
Molekylvektestimater ble utført på mIL-4-reseptor-kloner transfisert inn i COS-celler. Ved å benytte M2 monoklonalt antistoff fremstilt mot murine CTLL 19.4-celler (se eksempel 13), utfelles IL-4-reseptor immunologisk fra COS-celler transfisert med CAV-16, CAV-7B9-2 og CAB-7B9-4 og Molecular weight estimates were performed on mIL-4 receptor clones transfected into COS cells. Using M2 monoclonal antibody raised against murine CTLL 19.4 cells (see Example 13), IL-4 receptor is immunoprecipitated from COS cells transfected with CAV-16, CAV-7B9-2 and CAB-7B9-4 and
35 35 merket med S-cystein og S-methionin. Celleassosiert reseptor fra CAV-7B9-4 viser molekylvektheterogenitet som varierer fra 32-39 kDa. Utskilt CAV-7B9-4-reseptor har molekylvekt mellom 36 og 41 kDa. Celleassosiert reseptor fra CAV-16-transfiserte COS-celler er ca. 40-41 kDa. Dette er betydelig mindre enn molekylvektberegninger fra kryss-bindingsundersøkelser beskrevet av Park et al., J. Exp. Med., 166, s. 476, 1987, J. Cell. Biol., Suppl., 12A, 1988. Immunologisk utfelling av COS-CAV-7B9-2-celleassosiert reseptor viste en molekylvekt på 130-140 kDa lik med esti-matene til Park et al., J. Cell. Biol., Suppl. 12A, 1988, beregnet til å være full-lengde IL-4-reseptoren. Lignende molekylvektestimater av celleassosiert CAV-16 og CAV-7B9-2-IL-4-reseptor er også blitt gjort basert på kryssbinding av 125 IL-4 til COS-celler transfisert med disse cDNA-ene. Heterogenitet av molekylvekt hos de individuelle klonene kan delvis tilskrives glycosylering. Disse data sammen med DNA-sekvensanalyse, tyder på at 7B9-2-cDNA-en koder for full-lengde-celleoverflate-IL-4-reseptoren, mens både 7B9-4 og klon 18 utgjør oppløselige former av murin IL-4-reseptor. 35 35 labeled with S-cysteine and S-methionine. Cell-associated receptor from CAV-7B9-4 shows molecular weight heterogeneity ranging from 32-39 kDa. Secreted CAV-7B9-4 receptor has a molecular weight between 36 and 41 kDa. Cell-associated receptor from CAV-16-transfected COS cells is approx. 40-41 kDa. This is significantly less than molecular weight calculations from cross-linking studies described by Park et al., J. Exp. Med., 166, p. 476, 1987, J. Cell. Biol., Suppl., 12A, 1988. Immunoprecipitation of COS-CAV-7B9-2 cell-associated receptor showed a molecular weight of 130-140 kDa similar to the estimates of Park et al., J. Cell. Biol., Suppl. 12A, 1988, calculated to be the full-length IL-4 receptor. Similar molecular weight estimates of cell-associated CAV-16 and CAV-7B9-2 IL-4 receptor have also been made based on cross-linking of 125 IL-4 to COS cells transfected with these cDNAs. Heterogeneity of molecular weight in the individual clones can be partially attributed to glycosylation. These data, together with DNA sequence analysis, suggest that the 7B9-2 cDNA encodes the full-length cell surface IL-4 receptor, whereas both 7B9-4 and clone 18 constitute soluble forms of the murine IL-4 receptor .
Karakteriseringsundersøkelser av reseptor ble også gjort på COS-celler transfisert med hIL-4R inneholdende ekspresjonsplasmider. De to kimære human-IL-4R-molekylene A5 og B4 (definert i eksempel 11) ble transfisert inn i COS-celler og likevektsundersøkelser foretatt. Selve COS-ape-cellen har reseptorer som er i stand til å binde hIL-4; de bindingsberegninger som utføres på COS-celler transfisert med og som overuttrykker hIL-4R-cDNA-er, utgjør derfor bak-grunnsbinding fra endogene ape-IL-4R-molekyler subtrahert fra den totale binding. COS-celler transfisert med hIL-4R-A5, hadde 5,3 x 10 hIL-4-bindingsseter med en beregnet K på Receptor characterization studies were also done on COS cells transfected with hIL-4R containing expression plasmids. The two chimeric human IL-4R molecules A5 and B4 (defined in Example 11) were transfected into COS cells and equilibrium studies performed. The COS monkey cell itself has receptors capable of binding hIL-4; therefore, the binding calculations performed on COS cells transfected with and overexpressing hIL-4R cDNAs represent background binding from endogenous monkey IL-4R molecules subtracted from total binding. COS cells transfected with hIL-4R-A5 had 5.3 x 10 hIL-4 binding sites with a calculated K of
9-1 9-1
3,4 8 x 10 M . Likeledes bandt hIL-4R-B4 uttrykt i COS-celler, bundet <125>I-hIL-4 med en affinitet på 3,94 x IO9 M*"1 3.4 8 x 10 M . Similarly, hIL-4R-B4 expressed in COS cells bound <125>I-hIL-4 with an affinity of 3.94 x 109 M*"1
4 4
og oppviste 3,2 x 10 reseptorer pr. celle. and showed 3.2 x 10 receptors per cell.
Molekylvektestimater av human IL-4R uttrykt i COS-celler, ble også utført. COS-celler transfisert med klonene A5 eller B4 i pCAV/NOT, ble merket med <35>S-cystein/methionin og lysert. Human IL-4R ble affinitetsrenset fra de resulterende lysater med hIL-4-koblet "Affigel" (som beskrevet i eksempel 4). hIL-4R-A5 og -B4 eluert fra denne affinitets-bærer, migrerte ved ca. 140.000 dalton på SDS-PAGE, noe som stemmer godt overens med tidligere estimater for hIL-4R-molekylvekt ved kryssbinding (Park et al., J. Exp. Med. 166, s. 476, 1987), samt med estimater av full-lengde-mIL-4R som her er angitt. Molecular weight estimates of human IL-4R expressed in COS cells were also performed. COS cells transfected with clones A5 or B4 in pCAV/NOT were labeled with <35>S-cysteine/methionine and lysed. Human IL-4R was affinity purified from the resulting lysates with hIL-4-linked "Affigel" (as described in Example 4). hIL-4R-A5 and -B4 eluted from this affinity carrier migrated at ca. 140,000 daltons on SDS-PAGE, which is in good agreement with previous estimates of hIL-4R molecular weight upon cross-linking (Park et al., J. Exp. Med. 166, p. 476, 1987), as well as with estimates of full- full-length mIL-4R as indicated herein.
Ettersom ikke noe oppløselig human IL-4R-CDNA hittil er blitt funnet å oppstå naturlig slik tilfellet var med den murine reseptor (klonene 18 og 7B9-4), ble en avkortet form konstruert som beskrevet i eksempel 11. Etter ekspresjon i COS-celler ble supernatanter innhøstet tre dager etter transfeksjon med oppløselig hIL-4R-ll og oppløselig hIL-4R-5 og testet for hemming av 12<5>I-hIL-4-binding til den humane B-cellelinje Raji. Supernatanter fra to av de oppløselige hIL-4R-ll og en av de oppløselige hIL-4R-5-transfiserte plater inneholdt 29-149 ng/ml IL-4R-konkurrer-ende aktivitet i mediet. I tillegg kunne det avkortede protein påvises i <35>S-methionin/cystein-merket COS-celle-transfektanter ved affinitetsrensing på hIL-4-koblet "Affigel" som omtrent et 44 kDa protein ved SDS-PAGE. As no soluble human IL-4R cDNA has so far been found to occur naturally as was the case with the murine receptor (clones 18 and 7B9-4), a truncated form was constructed as described in Example 11. After expression in COS cells supernatants were harvested three days after transfection with soluble hIL-4R-11 and soluble hIL-4R-5 and tested for inhibition of 12<5>I-hIL-4 binding to the human B cell line Raji. Supernatants from two of the soluble hIL-4R-11 and one of the soluble hIL-4R-5 transfected plates contained 29-149 ng/ml IL-4R competitive activity in the medium. In addition, the truncated protein could be detected in <35>S-methionine/cysteine-labeled COS cell transfectants by affinity purification on hIL-4-coupled "Affigel" as an approximately 44 kDa protein by SDS-PAGE.
Eksempel 13 Example 13
Fremstilling av monoklonale antistoffer mot IL- 4R Production of monoclonal antibodies against IL-4R
Preparater av renset, rekombinant IL-4-reseptor, f.eks. human eller murin IL-4-reseptor, transfiserte COS-celler som uttrykker høye nivåer av IL-4-reseptor eller CTLL 19.4-celler, anvendes til å frembringe monoklonale antistoffer mot IL-4-reseptor under anvendelse av vanlige teknikker, slik som de som er beskrevet i US patentskrift nr. 4.411.993. Slike antistoffer vil sannsynligvis være anvendbare for å innvirke på IL-4-binding til IL-4-reseptorer, f.eks. for å bedre toksiske eller andre uønskede effekter av IL-4. Preparations of purified, recombinant IL-4 receptor, e.g. human or murine IL-4 receptor, transfected COS cells expressing high levels of IL-4 receptor or CTLL 19.4 cells are used to generate monoclonal antibodies against IL-4 receptor using standard techniques, such as those which is described in US Patent No. 4,411,993. Such antibodies are likely to be useful for interfering with IL-4 binding to IL-4 receptors, e.g. to ameliorate toxic or other undesirable effects of IL-4.
For å immunisere rotter ble IL-4-reseptor-bærende CTLL 19.4-celler brukt som immunogen emulgert i komplett Freunds adjuvans og injisert i mengder som varierte fra To immunize rats, IL-4 receptor-bearing CTLL 19.4 cells were used as immunogen emulsified in complete Freund's adjuvant and injected in amounts ranging from
10 - 100 pl, subkutant i Lewis-rotter. Tre uker senere fikk de immuniserte dyrene injisert ytterligere immunogen emulgert i ufullstendig Freunds adjuvans, og de fikk injeksjoner hver tredje uke deretter. Serumprøver ble tatt med jevne mellomrom ved retro-orbital blødning eller haletipp-utskjæring for testing med "dot-blot"-analyse, ELISA (enzym-bundet immunosorbentanalyse) eller hemming av binding av 125 10 - 100 µl, subcutaneously in Lewis rats. Three weeks later, the immunized animals were injected with additional immunogen emulsified in incomplete Freund's adjuvant, and they received injections every three weeks thereafter. Serum samples were obtained periodically by retro-orbital bleeding or tail-tip excision for testing by dot-blot assay, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), or inhibition of binding of 125
I-IL-4 til ekstrakter av CTLL-celler (som beskrevet i eksempel 1). Andre analysefremgangsmåter er også egnet. Etter påvisning av en passende antistofftiter ble positive dyr gitt en intravenøs sluttinjeksjon av antigen i saltoppløs-ning. Tre til fire dager senere ble dyrene avlivet, spleno-cytter ble innhøstet og fusjonert til den murine myelom-cellelinje AG8653. Hybridomcellelinjer frembrakt ved hjelp av denne fremgangsmåte, ble platet ut i multiple mikrotiter-plater i et HAT selektivt medium (hypoxanthin, aminopterin og thymidin) for å hemme proliferasjon av ikke-fusjonerte celler, myelomhybrider og miltcellehybrider. I-IL-4 to extracts of CTLL cells (as described in Example 1). Other analytical methods are also suitable. After detection of an appropriate antibody titer, positive animals were given a final intravenous injection of antigen in saline. Three to four days later, the animals were sacrificed, splenocytes were harvested and fused to the murine myeloma cell line AG8653. Hybridoma cell lines generated by this method were plated in multiple microtiter plates in a HAT selective medium (hypoxanthine, aminopterin and thymidine) to inhibit proliferation of non-fused cells, myeloma hybrids and spleen cell hybrids.
Således frembrakte hybridomkloner ble screenet med hensyn på reaktivitet med IL-4-reseptor. Ved innledende screening av hybridomsupernatanter ble det benyttet en anti-125 stoffoppfangning og binding av delvis renset I-mIL-4-reseptor. To av over 400 hybridomer som ble screenet, var positive ved denne metode. Disse to monoklonale antistoffene, Ml og M2, ble testet ved hjelp av en modifisert antistoff-oppfangning for å påvise blokkerende antistoff. Bare Ml var Hybridoma clones thus produced were screened for reactivity with IL-4 receptor. In the initial screening of hybridoma supernatants, an anti-125 substance capture and binding of partially purified I-mIL-4 receptor was used. Two out of over 400 hybridomas that were screened were positive by this method. These two monoclonal antibodies, M1 and M2, were tested using a modified antibody capture to detect blocking antibody. Only Ml was
125 125
i stand til å hemme I-rmIL-4-bindmg til intakte CTLL-celler. Begge antistoffene er i stand til å immunoutfelle naturlig forekommende mIL-4R-protein fra CTLL-celler eller able to inhibit I-rmIL-4 binding to intact CTLL cells. Both antibodies are able to immunoprecipitate naturally occurring mIL-4R protein from CTLL cells or
35 C0S-7-celler transfisert med IL-4R-kloner merket med S-cystein/methionin. Ml og M2 ble så injisert i peritoneal-hulrommene hos nakne mus for å fremstille ascites inneholdende høye konsentrasjoner (>1 mg/ml) av anti-IL-4R monoklonalt antistoff. Det resulterende monoklonale antistoff ble renset ved ammoniumsulfatutfelling etterfulgt av geleksklu-sjonskromatografi og/eller affinitetskromatografi basert på binding av antistoff til protein G. 35 COS-7 cells transfected with IL-4R clones labeled with S-cysteine/methionine. M1 and M2 were then injected into the peritoneal cavities of nude mice to produce ascites containing high concentrations (>1 mg/ml) of anti-IL-4R monoclonal antibody. The resulting monoclonal antibody was purified by ammonium sulfate precipitation followed by gel exclusion chromatography and/or affinity chromatography based on binding of antibody to protein G.
Eksempel 14 Example 14
Anvendelse av oppløselig IL- 4R for å undertrykke immunrespons in vivo Use of soluble IL-4R to suppress immune responses in vivo
Forsøk ble utført for å bestemme effekten av oppløse-lig IL-4R på allogen "host versus graft" (HVG) respons in vivo under anvendelse av en knehaselymfeknuteanalyse. Ved denne modellen injiseres mus i fotputen med bestrålte, allogene miltceller. Bestrålte, syngene celler injiseres så Experiments were performed to determine the effect of soluble IL-4R on the allogeneic host versus graft (HVG) response in vivo using a popliteal lymph node assay. In this model, mice are injected into the footpad with irradiated, allogeneic spleen cells. Irradiated, healthy cells are then injected
i den kontralaterale pute. Det oppstår en alloreaktiv respons i puten som får de allogene cellene hvis utstrek-ning kan måles ved hjelp av den relative økning i størrelse og vekt av knehaselymfeknuten som drenerer stedet for antigen-avsetning. in the contralateral pad. An alloreactive response occurs in the pad which receives the allogeneic cells, the extent of which can be measured by means of the relative increase in size and weight of the popliteal lymph node that drains the site of antigen deposition.
På dag 0 ble tre BALB/C-mus injisert i fotputen med bestrålte, allogene miltceller fra c57BL/6-mus og i den kontralaterale fotpute med bestrålte, syngene miltceller. On day 0, three BALB/C mice were injected in the footpad with irradiated allogeneic spleen cells from c57BL/6 mice and in the contralateral footpad with irradiated syngeneic spleen cells.
På dagene -1, 0 og +1 ble tre mus injisert (intravenøst på dagene -1 og 0, og subkutant på dag +1) med 100 ng renset, oppløselig IL-4R (sIL-4R) i fosfatbufret saltoppløsning, On days -1, 0 and +1, three mice were injected (intravenously on days -1 and 0, and subcutaneously on day +1) with 100 ng of purified, soluble IL-4R (sIL-4R) in phosphate-buffered saline,
tre mus ble injisert intravenøst med 1 ug sIL-4R, tre mus ble injisert med 2 ug SIL-4R, og tre mus ble injisert med MSA (kontroll). Den gjennomsnittlige forskjell i vekt av lymfe-knutene fra stedene for allogene og syngene miltceller var omtrent 2,5 mg for musene behandlet med MSA, 1 mg for musene behandlet med 100 ng sIL-4R og 0,5 mg for musene behandlet med 1 ug sIL-4R. Ingen påvisbar forskjell i vekt av lymfeknuter lot seg med sikkerhet påvise for musene behandlet med 2 ug sIL-4R. IL-4R undertrykte således signifikant three mice were injected intravenously with 1 µg sIL-4R, three mice were injected with 2 µg SIL-4R, and three mice were injected with MSA (control). The mean difference in weight of the lymph nodes from the sites of allogeneic and syngeneic spleen cells was approximately 2.5 mg for the mice treated with MSA, 1 mg for the mice treated with 100 ng sIL-4R, and 0.5 mg for the mice treated with 1 ug sIL-4R. No detectable difference in lymph node weight could be reliably demonstrated for the mice treated with 2 µg sIL-4R. Thus, IL-4R suppressed significantly
(p < 0,5 i alle grupper ved bruk av den todelte T-test) den in vivo lymfoproliferative respons på en doseavhengig måte i forhold til kontrollmus. (p < 0.5 in all groups using the two-tailed T-test) the in vivo lymphoproliferative response in a dose-dependent manner compared to control mice.
Claims (23)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NO911713A NO309000B1 (en) | 1988-10-31 | 1991-04-30 | Isolated DNA sequence encoding a mammalian IL-4 receptor |
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US26504788A | 1988-10-31 | 1988-10-31 | |
US31943889A | 1989-03-02 | 1989-03-02 | |
US32615689A | 1989-03-20 | 1989-03-20 | |
US37092489A | 1989-06-23 | 1989-06-23 | |
PCT/US1989/004076 WO1990005183A1 (en) | 1988-10-31 | 1989-09-18 | Interleukin-4 receptors |
NO911713A NO309000B1 (en) | 1988-10-31 | 1991-04-30 | Isolated DNA sequence encoding a mammalian IL-4 receptor |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO911713L NO911713L (en) | 1991-04-30 |
NO911713D0 NO911713D0 (en) | 1991-04-30 |
NO309000B1 true NO309000B1 (en) | 2000-11-27 |
Family
ID=27532601
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO911713A NO309000B1 (en) | 1988-10-31 | 1991-04-30 | Isolated DNA sequence encoding a mammalian IL-4 receptor |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
NO (1) | NO309000B1 (en) |
-
1991
- 1991-04-30 NO NO911713A patent/NO309000B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO911713L (en) | 1991-04-30 |
NO911713D0 (en) | 1991-04-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU643427B2 (en) | Interleukin-4 receptors | |
JP2753287B2 (en) | Interleukin-1 receptor | |
US7211259B1 (en) | 4-1BB polypeptides and DNA encoding 4-1BB polypeptides | |
US5674704A (en) | Cytokine designated 4-IBB ligand | |
US5319071A (en) | Soluble interleukin-1 receptors | |
JP3559281B2 (en) | CD27 ligand | |
US7138500B1 (en) | Antibodies to human 4-1BB | |
JPH07504083A (en) | Novel cytokine | |
NO323197B1 (en) | Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor, DNA encoding it, process for its preparation, and pharmaceutical preparation. | |
JPH03133382A (en) | Tumor necrosis factor-alpha and-beta receptor | |
AU8656991A (en) | Isolated viral protein cytokine antagonists | |
JPH11503309A (en) | IL-17 receptor | |
US5422248A (en) | DNA sequences encoding granulocyte-colony stimulating factor receptors | |
JPH09508009A (en) | Ligands that bind Fas antigen | |
EP0403114B1 (en) | Interleukin-7 receptors | |
JPH05268971A (en) | Interleukin-7 | |
JPH05500614A (en) | Granulocyte colony-stimulating factor receptor | |
NO309000B1 (en) | Isolated DNA sequence encoding a mammalian IL-4 receptor | |
CA1340761C (en) | Interleukin-4-receptors | |
NO312769B1 (en) | Isolated DNA Sequence, Method of Preparation of a Purified Mammalian TNF-R Protein | |
IE911108A1 (en) | Isolated Viral Protein Cytokine Antagonists |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |