NO20100446A1

NO20100446A1 - Feed composition

Info

Publication number: NO20100446A1
Application number: NO20100446A
Authority: NO
Inventors: Adel El-Mowafi; Jose Miguel Troncoso Kirsten; Nestor Javier Gonzalez Foretic; Jorge Eduardo Pino Marambio; Kari Ruohonen; Jose Luis Gonzalez Vecino
Original assignee: Ewos Innovation As
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2010-03-26
Publication date: 2011-09-27
Also published as: WO2011119048A1

Abstract

Sammendrag Det beskrives et fôr for et dyr hvor nevnte fôr omfatter et alkadienal. Nevnte alkadienal eller et fôr omfattende nevnte forbindelse kan anvendes i behandling og profylakse av en parasittinfeksjon og/eller -angrep i et dyr.Summary An animal feed is disclosed in which said feed comprises an alkadienal. Said alkadienal or a feed comprising said compound may be used in the treatment and prophylaxis of a parasite infection and / or attack in an animal.

Description

OMRÅDE FOR OPPFINNELSEN FIELD OF THE INVENTION

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et for til et dyr, en alkadienal i samsvar med innledningen i krav 11, for anvendelse i foret og anvendelse av nevnte alkadienal og en fremgangsmåte for fremstilling av foret. Foreliggende oppfinnelse vedrører videre en fremgangsmåte for å hindre infeksjon og/eller angrep av marin lus i fisk. The present invention relates to a lining for an animal, an alkadienal in accordance with the introduction in claim 11, for use in the lining and use of said alkadienal and a method for producing the lining. The present invention further relates to a method for preventing infection and/or attack by marine lice in fish.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN. BACKGROUND OF THE INVENTION.

Angrep av lus (( Caligus rogercresseyr) er for tiden en av de viktigste helse-utfordringer for lakseproduksjonsindustrien. Denne eksterne parasitt svekker produksjonseffektivitet, forårsaker stress og skade på fisken og er som en sekundær infeksjon en mulig vektor for andre patogener så som infeksiøs lakseanemi virus (ISAv) og Piscirickettsia salmonis. I Chile, som i mange andre land som produserer Salmonider, har angrepsrater økt signifikant og påvirker i hovedsak arter som Atlantisk laks (( Salmo salar), Regnbueørret ( Onchorhynkuss mykiss) og sølvlaks ( Oncorhynchus kisutch). I Norge vurderes angrep av lus som et av de mest alvorlige helseproblemer i oppdrettsindustrien av laks. Denne høye angrepsrate er sann-synligvis en konsekvens av en kombinasjon av faktorer inkluderende utvikling av utstrakt resistens av lusen til de fleste anvendte kjemiske antiparasittmidler som anvendes i behandling i dag. Forskjellige planteekstrakter, terrestriale og marine planter, har blitt undersøkt for antibakterielle, antifungicidale, antivirale og anti-oksidantaktiviteter for mennesker og dyr. Visse polyumettede aldehyder, produsert av terrestriale planter og diatomer har nylig blitt beskrevet til å inhibere eller ha toksiske effekter i noen andre arter. Infestation by lice (( Caligus rogercresseyr) is currently one of the most important health challenges for the salmon production industry. This external parasite impairs production efficiency, causes stress and damage to the fish and, as a secondary infection, is a possible vector for other pathogens such as infectious salmon anemia virus (ISAv) and Piscirickettsia salmonis. In Chile, as in many other Salmonid-producing countries, attack rates have increased significantly and mainly affect species such as Atlantic salmon (( Salmo salar), Rainbow trout ( Onchorhynkuss mykiss) and silver salmon ( Oncorhynchus kisutch). I In Norway, lice infestation is considered one of the most serious health problems in the salmon farming industry. This high infestation rate is probably a consequence of a combination of factors including the development of extensive resistance of the lice to most of the chemical antiparasitic agents used in treatment today .Various plant extracts, terrestrial and marine plants, have been investigated for antibacterial, antifungal, antiviral and anti-oxidant activities for humans and animals. Certain polyunsaturated aldehydes, produced by terrestrial plants and diatoms, have recently been described to inhibit or have toxic effects in some other species.

Det er en viktig oppgave å finne nye forbindelser og måter å behandle og hindre ektoparasittangrep i fisk, spesielt av lus. Antiparasittiske midler anvendt for lus-behandling eller profylakse må være effektive, men må samtidig ikke være toksiske eller skadelige for fisken, andre organismer eller miljøet generelt. It is an important task to find new compounds and ways to treat and prevent ectoparasite infestation in fish, especially by lice. Antiparasitic agents used for lice treatment or prophylaxis must be effective, but at the same time must not be toxic or harmful to the fish, other organisms or the environment in general.

Basert på problemet beskrevet over er det objektive formål med foreliggende oppfinnelse således å tilveiebringe nye effektive midler og fremgangsmåter for å inhibere angrep av lus og andre kopepodparasitter i fisk, som ikke er skadelige for fisken eller for miljøet. Based on the problem described above, the objective purpose of the present invention is thus to provide new effective means and methods for inhibiting attacks by lice and other copepod parasites in fish, which are not harmful to the fish or to the environment.

SAMMENDRAG AV AOPPFINNELSEN SUMMARY OF THE INVENTION

I samsvar med et første aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse et for for et dyr hvor nevnte for omfatter en alkadienal. In accordance with a first aspect, the present invention relates to a feed for an animal where said feed comprises an alkadienal.

Fortrinnsvis, en alkadienenhet av nevnte alkadienal inneholder 6 til 16 karboner, mer fortrinnsvis 7 til 12 karboner, enda mer fortrinnsvis er nevnte alkadienal et dekadienal, og mer foretrukket at nevnte dekadienal er 2-4-dekadienal. Mer fortrinnsvis er dette trans-trans-2-4-dekadienal. Preferably, an alkadiene unit of said alkadienal contains 6 to 16 carbons, more preferably 7 to 12 carbons, even more preferably said alkadienal is a decadienal, and more preferably said decadienal is 2-4-decadienal. More preferably this is trans-trans-2-4-decadienal.

Fortrinnsvis er nevnte alkadienal ekstrahert fra peanøttolje, potetjuice, diatomer, alger, marine sopp, en flyktig fraksjon fra plante eller en organisk fraksjon. Preferably, said alkadienal is extracted from peanut oil, potato juice, diatoms, algae, marine fungi, a volatile fraction from a plant or an organic fraction.

Det er også foretrukket at foret ytterligere omfatter vanlig anvendte foringredienser så som proteiner, lipider, vitaminer, karbohydrater og mineraler. It is also preferred that the feed further comprises commonly used pre-ingredients such as proteins, lipids, vitamins, carbohydrates and minerals.

Det er ytterligere foretrukket at nevnte trans-trans-2-4-dekadienal er i en konsentrasjon av minst 0,009 vekt % av foret, basert på våtvekt. It is further preferred that said trans-trans-2-4-decadienal is in a concentration of at least 0.009% by weight of the feed, based on wet weight.

Fortrinnsvis, dyret er et vandig dyr, fortrinnsvis en fisk, mer fortrinnsvis en art valgt blant familien Salmonidae. Preferably, the animal is an aquatic animal, preferably a fish, more preferably a species selected from the family Salmonidae.

Mer fortrinnsvis er nevnte Salmonidae valgt blant Atlantisk laks { Salmo salar), Regnbueørret { Onchorhynkuss mykiss), sølvlaks { Oncorhynchus kisutch), og Artisk ørret ( Salvelinus alpinus). More preferably, said Salmonidae are selected from Atlantic salmon {Salmo salar), Rainbow trout {Onchorhynkuss mykiss), Silver salmon {Oncorhynchus kisutch), and Artichoke trout (Salvelinus alpinus).

Fortrinnsvis er foret for en fisk, og administreres til fisk under fiskeoppdrett. Preferably, the feed is for one fish, and is administered to fish during fish farming.

Et andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et for i samsvar med et av de ovennevnte avsnitt for anvendelse i behandling og/eller profylakse av parasittiske infeksjoner og/eller angrep i et dyr. A second aspect of the present invention relates to a preparation in accordance with one of the above sections for use in the treatment and/or prophylaxis of parasitic infections and/or attacks in an animal.

Fortrinnsvis, foret anvendes i behandling og/eller for profylakse av lusangrep i Salmonidae. Preferably, the feed is used in the treatment and/or for the prophylaxis of lice infestation in Salmonidae.

Et tredje aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører et alkadienal, som fortrinnsvis er et alkadienal hvor en enhet av nevnte alkadienal inneholder 6 til 16 karboner, mer fortrinnsvis 7 til 17 karboner, mer fortrinnsvis at nevnte alkadienal er et dekadienal, enda mer foretrukket et 2-4-dekadienal, og mest foretrukket en trans-trans-2-4-dekadienal for anvendelse i profylakse av en parasittinfeksjon og/eller -angrep i et dyr. A third aspect of the present invention relates to an alkadienal, which is preferably an alkadienal where a unit of said alkadienal contains 6 to 16 carbons, more preferably 7 to 17 carbons, more preferably that said alkadienal is a decadienal, even more preferably a 2-4 -decadienal, and most preferably a trans-trans-2-4-decadienal for use in the prophylaxis of a parasitic infection and/or attack in an animal.

Fortrinnsvis, nevnte alkadienal er for anvendelse i behandling og/eller profylakse av en parasittinfeksjon og/eller angrep i samsvar med ovennevnte avsnitt, hvor dyret er et vandig dyr, fortrinnsvis en fisk og hvor parasitten fortrinnsvis er en ektoparasitt. Preferably, said alkadienal is for use in the treatment and/or prophylaxis of a parasitic infection and/or attack in accordance with the above paragraph, where the animal is an aquatic animal, preferably a fish and where the parasite is preferably an ectoparasite.

Det er foretrukket at nevnte alkadienal er for anvendelse i behandling og/eller profylakse av en lusinfeksjon og/eller -angrep, hvor lusen er fortrinnsvis en kopepodart tilhørende familien Caligidae fortrinnsvis valgt blant Caligus rogercresseyi, Caligus elongateus og Lepeophtheirus salmonis, og fisken er en art valgt blant familien av Salmonidae, fortrinnsvis valgt blant Atlantisk laks ( Salmo salar), Regnbueørret ( Onchorhynkuss mykiss), sølvlaks ( Oncorhynchus kisutch) og Arktisk ørret ( Salvelinus alpinus). It is preferred that said alkadienal is for use in the treatment and/or prophylaxis of a louse infection and/or attack, where the louse is preferably a copepod species belonging to the Caligidae family, preferably selected from among Caligus rogercresseyi, Caligus elongateus and Lepeophtheirus salmonis, and the fish is a species selected from the family of Salmonidae, preferably selected from Atlantic salmon (Salmo salar), Rainbow trout (Onchorhynkuss mykiss), Silver salmon (Oncorhynchus kisutch) and Arctic trout (Salvelinus alpinus).

Fortrinnsvis, nevnte alkadienalforbindelse injiseres intraperitonealt, mer fortrinnsvis i en mengde korresponderende til 0,1 ml av 0,5 mg/liter til 60 mg/liter av nevnte alkadienal per dag, fortrinnsvis i en konsentrasjon av mindre enn 28 mg/l/dag. Preferably, said alkadienal compound is injected intraperitoneally, more preferably in an amount corresponding to 0.1 ml of 0.5 mg/liter to 60 mg/liter of said alkadienal per day, preferably in a concentration of less than 28 mg/l/day.

Det er videre foretrukket at nevnte alkadienalforbindelse administreres oralt. It is further preferred that said alkadienal compound is administered orally.

Et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et for i samsvar med ovennevnte for oppdrett av fisk. A further aspect of the present invention relates to the use of a line in accordance with the above for farming fish.

Et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et alkadienal, som fortrinnsvis er et alkadien hvor en enhet av nevnte akladianal inneholder 6 til 16 karboner, mer fortrinnsvis 7 til 12 karboner, mer fortrinnsvis et alkadienal som er et dekadienal, enda mer foretrukket et 2-4-dekadienal, og mest foretrukket en trans-trans-2-4-dekadienal for produksjon av et bioaktivt for og/eller et medikament for profylakse og/eller behandling av en sykdom forårsaket av en ektoparasitt i et dyr. A further aspect of the present invention relates to the use of an alkadienal, which is preferably an alkadiene where a unit of said akladienal contains 6 to 16 carbons, more preferably 7 to 12 carbons, more preferably an alkadienal which is a decadienal, even more preferably a 2 -4-decadienal, and most preferably a trans-trans-2-4-decadienal for the production of a bioactive agent and/or a drug for the prophylaxis and/or treatment of a disease caused by an ectoparasite in an animal.

Et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et for i samsvar med et av ovennevnte avsnitt, hvor nevnte alkadienal er oppløst i et oppløsningsmiddel og deretter belegges på og/eller tilsettes til foret. A further aspect of the present invention relates to a method for producing a lining in accordance with one of the above-mentioned paragraphs, where said alkadienal is dissolved in a solvent and then coated on and/or added to the lining.

Et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å hindre en infeksjon og/eller av lus i fisk, kjennetegnet ved at nevnte fisk fores med et for omfattende et alkadienal, som fortrinnsvis er et alkadien hvor en enhet av nevnte alkadienal inneholder 6 til 16 karboner, mer fortrinnsvis 7 til 12 karboner, mer fortrinnsvis er dette alkadienal et dekadienal, enda mer fortrinnsvis en 2-4 dekadienal, og mest fortrinnsvis en trans-trans-2-4-dekadienal og/eller at nevnte fisk infiseres med en sammensetning omfattende nevnte alkadienal. A further aspect of the present invention relates to a method for preventing an infection and/or of lice in fish, characterized in that said fish is fed with a too comprising an alkadienal, which is preferably an alkadiene where a unit of said alkadienal contains 6 to 16 carbons, more preferably 7 to 12 carbons, more preferably this alkadienal is a decadienal, even more preferably a 2-4 decadienal, and most preferably a trans-trans-2-4-decadienal and/or that said fish is infected with a composition comprising said alkadienal.

Fortrinnsvis, konsentrasjonen av nevnte trans-trans-2-4-dekadienal i foret er minst 0,009 vekt % av foret, basert på våtvekt. Preferably, the concentration of said trans-trans-2-4-decadienal in the feed is at least 0.009% by weight of the feed, based on wet weight.

Det er også foretrukket at mengden av inntatt trans-trans-2-4-dekadienal er minst 0,052 mg/fisk, fortrinnsvis fra 0,052 mg til 0,311 mg/fisk. It is also preferred that the amount of ingested trans-trans-2-4-decadienal is at least 0.052 mg/fish, preferably from 0.052 mg to 0.311 mg/fish.

Fortrinnsvis, fisken fores med nevnte for i minst 4 dager, mer fortrinnsvis i en periode mellom 4 og 12 dager. Preferably, the fish is fed with said feed for at least 4 days, more preferably for a period between 4 and 12 days.

Oppfinnelsen vedrører også en anvendelse av et alkadienal, som fortrinnsvis er et alkadien hvor enheten av nevnte alkadien inneholder 6 til 16 karboner, mer fortrinnsvis 7 til 12 karboner, mer fortrinnsvis er nevnte alkadienal et dekadienal, enda mer foretrukket en 2-4-dekadienal, og mest foretrukket en trans-trans-2-4-dekadienal, eller et fiskefor omfattende nevnte alkadienal for å inhibere uttrengning (morfogenese) av det frontale filament i lus-kopepodider og/eller for å redusere modning eller reproduksjonsevne i lusen og/eller forekomst av luslarver. The invention also relates to the use of an alkadienal, which is preferably an alkadiene where the unit of said alkadiene contains 6 to 16 carbons, more preferably 7 to 12 carbons, more preferably said alkadienal is a decadienal, even more preferably a 2-4-decadienal, and most preferably a trans-trans-2-4-decadienal, or a fish too comprehensively mentioned alkadienal to inhibit extrusion (morphogenesis) of the frontal filament in louse copepodids and/or to reduce maturation or reproductive ability in the louse and/or incidence of louse larvae.

Oppfinnelsen vedrører videre en anvendelse av nevnte alkadienal eller av et fiskefor omfattende nevnte alkadienal for å redusere antallet lus i nauplius II utviklingstrinn, idet det fores til en fisk i minst 12 dager. The invention further relates to an application of said alkadienal or of a fish feed comprising said alkadienal to reduce the number of lice in the nauplius II development stage, as it is fed to a fish for at least 12 days.

Foretrukket utførelse er også definert i de uselvstendige krav. Preferred design is also defined in the non-independent requirements.

Alkadienalforbindelsene i samsvar med foreliggende oppfinnelse omfatter følgende formel (I): The alkadienal compounds in accordance with the present invention comprise the following formula (I):

(CAS Nr. [25152-84-5]). (CAS No. [25152-84-5]).

Gruppen vist i formel (I) er antatt å representere den biologisk effektive del i samsvar med foreliggende oppfinnelse. The group shown in formula (I) is believed to represent the biologically effective part in accordance with the present invention.

Overraskende, oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse gjorde det mulig å tilveiebringe et nytt middel som er nyttig i behandling og profylakse av ektoparasittangrep, spesielt forårsaket av lus i Salmonidae. Surprisingly, the inventors of the present invention made it possible to provide a new agent useful in the treatment and prophylaxis of ectoparasite infestations, particularly caused by lice in Salmonidae.

Idet en direkte behandling av fisk i et vannbad omfattende nevnte alkadienalforbindelse, spesifikt trans-trans-2-4-dekanienal, ikke, eller kun i mindre grad påvirket angrep av lus, var det overraskende mulig å påvirke lusangrep og kvantitativ mengde indirekte med å fore fisken med en diett omfattende nevnte aktive alkadienalforbindelse. As a direct treatment of fish in a water bath comprising said alkadienal compound, specifically trans-trans-2-4-decanienal, did not, or only to a lesser extent, affect lice infestation, it was surprisingly possible to influence lice infestation and quantitative quantity indirectly by the fish with a diet comprising said active alkadienal compound.

Fra et praktisk ståsted er det en fordel at fisken ikke trenger å isoleres eller fjernes fra dyrkningsenheten slik som en sjømerd for å behandles, siden fisken enkelt kan mates en diett omfattende den aktive forbindelse. Ved anvendelse av for eksempel et vannbad for ytre behandling må fisk ofte holdes isolert eller overføres til en isolert/lukket enhet. Dette betyr mer behandling og er således mer arbeidskrevende og videre mer stressende for fisken. Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således mulig å behandle fisken i dyrkningsenheter uten å isolere fisken. From a practical point of view, it is advantageous that the fish do not need to be isolated or removed from the culture unit such as a sea cage to be treated, since the fish can easily be fed a diet comprising the active compound. When using, for example, a water bath for external treatment, fish must often be kept isolated or transferred to an isolated/closed unit. This means more processing and is thus more labor-intensive and furthermore more stressful for the fish. According to the present invention, it is thus possible to process the fish in culture units without isolating the fish.

Med foreliggende oppfinnelse ble det mulig å identifisere et nytt middel egnet for profylakse og behandling av ektoparasittinfeksjoner i fisk, som kan administreres direkte endogent til fisken så som med injeksjon av fisken eller ved oral administrering. With the present invention, it was possible to identify a new agent suitable for the prophylaxis and treatment of ectoparasite infections in fish, which can be administered directly endogenously to the fish such as by injection into the fish or by oral administration.

Det skal anerkjennes at trekk ifølge oppfinnelsen beskrevet ovenfor kan kombineres It should be recognized that features according to the invention described above can be combined

i enhver kombinasjon uten å avvike fra rammen av oppfinnelsen. in any combination without departing from the scope of the invention.

BESKRIVELSE AV OPPFINNSELSEN DESCRIPTION OF THE INVENTION

Utførelser av foreliggende oppfinnelse vil nå bli beskrevet, ved hjelp av eksempler med referanse til de følgende tegninger, hvor: Figur 1 viser trans-trans-2-4-dekanienal persistens i sjøvann i en periode av 15 dager for tre temperaturer (10 °C, 12 °C og 14 °C). Figur 2 viser spesifikk foringsrate (SFR %) i S. salar opptatt daglig for hver behandling med trans-trans-2-4-dekadienal, og for kontrollgruppen. Figur 3 viser estimater av parametere som beskriver effektene av trans-trans-2-4-dekadienal dosering i for matet til laks, og eksponeringstid for forskjellige lus (C. rogercresseyi) faser (figurer 3 A-F). "DxT" angir gjennomsnittlig estimat, tykke linjer angir 50 % konfidensintervall og tynne linjer angir 95 % konfidens intervall. Figur 4 viser inhibering av frontal filament av kopepodider av C. rogercresseyi. Kopepodidene ble samlet fra hunnkjønn lus fra kontrollfor behandling eller fra behandling med for som omfatter den høyere dosering av trans-trans-2-4-dekadienal (0,0018 vekt % av foret, våtvekt). Små bokstaver indikerer statistisk signifikante forskjeller. Embodiments of the present invention will now be described, using examples with reference to the following drawings, where: Figure 1 shows trans-trans-2-4-decanienal persistence in seawater over a period of 15 days for three temperatures (10 °C , 12 °C and 14 °C). Figure 2 shows specific feeding rate (SFR%) in S. salar occupied daily for each treatment with trans-trans-2-4-decadienal, and for the control group. Figure 3 shows estimates of parameters describing the effects of trans-trans-2-4-decadienal dosage in the feed to salmon, and exposure time for different louse (C. rogercresseyi) phases (Figures 3 A-F). "DxT" indicates mean estimate, thick lines indicate 50% confidence interval and thin lines indicate 95% confidence interval. Figure 4 shows inhibition of the frontal filament by copepodids of C. rogercresseyi. The copepods were collected from female lice from control pretreatment or from treatment with pretreatment containing the higher dosage of trans-trans-2-4-decadienal (0.0018 wt% of pretreatment, wet weight). Lowercase letters indicate statistically significant differences.

EKSPERIMENTELL SEKSJON EXPERIMENTAL SECTION

Eksperiment 1: Experiment 1:

Undersøkelse av trans- trans- 2- 4- dekanienal resistens i sjøvann Investigation of trans- trans- 2- 4- decanienal resistance in seawater

Persistensen av trans-trans-2-4-dekadienal i sjøvann ble testet ved tre forskjellige temperaturer ((10 °C, 12 °C og 14 °C). 0,5 g/l trans-trans-2-4-dekadenal ble fortynnet i sjøvann og inkubert i triplikat for hver temperaturbehandling i 250 ml kar med lufting ved anvendelse av en inkubator i en periode på 15 dager. Prøver (6 ml/prøve/kar) ble tatt ved starten av testen og etter 1, 3, 6,10 og 15 dager. The persistence of trans-trans-2-4-decadienal in seawater was tested at three different temperatures ((10 °C, 12 °C and 14 °C). 0.5 g/l trans-trans-2-4-decadenal was diluted in seawater and incubated in triplicate for each temperature treatment in 250 ml vessels with aeration using an incubator for a period of 15 days.Samples (6 ml/sample/vessel) were taken at the start of the test and after 1, 3, 6 , 10 and 15 days.

Hver av prøvene ble prosessert som følger: Each of the samples was processed as follows:

Faststoffekstrahering: Solids extraction:

Faststoffekstrahering ble anvendt for å isolere trans-trans-2-4-dekadienalforbind-elsen fortynnet i vann i samsvar med metoden beskrevet i Pino-Marambio et al. Solid-state extraction was used to isolate the trans-trans-2-4-decadienal compound diluted in water according to the method described in Pino-Marambio et al.

(2007). Trans-trans-2-4-dekadienal ble ekstrahert i en EFS (Biotage, Uppsala - Sweden) kolonne med en glassinnsats på 6 ml (sjikt C2 (500 mg) over ENV+ (200 mg)), ved anvendelse av en innsats per replika. Innsatsen ble forhåndsfremstilt med 2 ml metanol HPLC kvalitet, og metanolen ble fjernet med vann HPLC kvalitet (2 ml). Etter ekstrahering av trans-trans-2-4-dekadienal ble urenheter fjernet med mer vann HPLC kvalitet (2 ml). De kjemiske forbindelser absorberte i begge faser, C2 og ENV+, og ble eluert med 2 ml etanol HPLC kvalitet. (2007). Trans-trans-2-4-decadienal was extracted in an EFS (Biotage, Uppsala - Sweden) column with a 6 ml glass insert (layer C2 (500 mg) over ENV+ (200 mg)), using one insert per replicate . The insert was pre-prepared with 2 ml HPLC grade methanol, and the methanol was removed with HPLC grade water (2 ml). After extraction of trans-trans-2-4-decadienal, impurities were removed with more HPLC grade water (2 ml). The chemical compounds absorbed in both phases, C2 and ENV+, and were eluted with 2 ml of ethanol HPLC grade.

Destillering med vakuum: Distillation with vacuum:

Flyktige og ikke-flyktige fraksjoner ble opptatt gjennom en vakuumdestillasjon. Destillering ble utført i løpet av 24 timer med et trykk på 0,04 torr og en omgivelses-temperatur (gjennomsnittlig 20 °C). Volatile and non-volatile fractions were collected through a vacuum distillation. Distillation was carried out during 24 hours with a pressure of 0.04 torr and an ambient temperature (average 20 °C).

Væske-til-væske-ekstrahering: Liquid-to-liquid extraction:

Flyktige og organiske fraksjoner av det destillerte ble opptatt gjennom en væske-til væske-ekstrahering, ved anvendelse av dietyleter (20 ml) og destillert eter (3 x 20 ml). Organiske faser ble blandet og tørket med CaS04. Ekstraktet som ble oppnådd ble konsentrert inntil 100 ul og lagret i rør (-18 °C) inntil ytterligere analyse. Trans-trans-2-4-dekadienal ble bestemt ved anvendelse av GC-MS-analyser (Pino-Marambio et al., 2007). Volatile and organic fractions of the distillate were collected through a liquid-to-liquid extraction, using diethyl ether (20 mL) and distilled ether (3 x 20 mL). Organic phases were mixed and dried with CaSO 4 . The extract obtained was concentrated to 100 µl and stored in tubes (-18 °C) until further analysis. Trans-trans-2-4-decadienal was determined using GC-MS analyzes (Pino-Marambio et al., 2007).

Resultater: Results:

Etter 10 dager av sjøvanneksponering av trans-trans-2-4-dekadienal-løsninger ble det observert at ved alle temperaturer som ble testet hadde trans-trans-2-4-dekadienal forsvunnet fullstendig i løsningene (figur 1). I tilfellet med trans-trans-2-4-dekadienal-løsning inkubert ved 10 °C ble en høyere persistens fra den tredje dag inntil den sjette dag observert, sammenlignet med trans-trans-2-4-dekadienal løsninger inkubert ved 12 °C eller ved 14 °C (figur 1). After 10 days of seawater exposure of trans-trans-2-4-decadienal solutions, it was observed that at all temperatures tested, trans-trans-2-4-decadienal had completely disappeared from the solutions (Figure 1). In the case of trans-trans-2-4-decadienal solution incubated at 10 °C, a higher persistence from the third day until the sixth day was observed, compared to trans-trans-2-4-decadienal solutions incubated at 12 °C or at 14 °C (Figure 1).

Eksperiment 2: Undersøkelse av trans-trans-2-4-dekadienal i for for laks mot lusangrep av C. rogercresseyi og reproduksjon. Effekten av trans-trans-2-4-dekadienal ble testet for av laks S. salar med C. rogercresseyi og på reproduksjon av C. rogercresseyi. Experiment 2: Investigation of trans-trans-2-4-decadienal in salmon against lice attack by C. rogercresseyi and reproduction. The effect of trans-trans-2-4-decadienal was tested for salmon S. salar with C. rogercresseyi and on reproduction of C. rogercresseyi.

Løsninger av trans-trans-2-4-dekadienal (SIGMA Aldrich (85 % renhet)) ble fremstilt med metanol og deretter tilsatt til belagt for for laks (tabell 1). Solutions of trans-trans-2-4-decadienal (SIGMA Aldrich (85% purity)) were prepared with methanol and then added to coated salmon (Table 1).

Eksperimentoppsett av foringsforsøket vist i tabell 2. Experimental setup of the lining trial shown in Table 2.

Tre hundre Atlantiske laks { Salmo salar), med en gjennomsnittlig vekt på 150 g, ble angrepet med kopepodider av C. rogercresseyi (80 lus/fisk) i en 1,5 m<2>tank med et åpent sjøvannstrømningssystem og en gjennomsnittstemperatur på ca 13 °C. Three hundred Atlantic salmon { Salmo salar), with an average weight of 150 g, were infested with copepodids of C. rogercresseyi (80 lice/fish) in a 1.5 m<2> tank with an open seawater flow system and an average temperature of approx. 13 °C.

Idet 80 % av lusen nådde voksenfasen, ble 250 fisk selektert for eksperiment-perioden, som ble allokert i 25 tanker av 350 I (10 fisk/tank), i et åpent sjøvann-strømningssystem med en gjennomsnittlig temperatur på 13 °C. As 80% of the lice reached the adult phase, 250 fish were selected for the experimental period, which were allocated in 25 tanks of 350 I (10 fish/tank), in an open seawater flow system with an average temperature of 13 °C.

Atlantisk laks ble foret i en periode av 12 dager med en gjennomsnittlig SFR (spesifikk foringsrate) på 0,9 % av de forskjellige testdietter inneholdende trans-trans-2-4-dekadienal i konsentrasjonene som vist i tabell 1 og 2. For hver behandling var det 5 replikattanker. Atlantic salmon were fed for a period of 12 days with an average SFR (specific feeding rate) of 0.9% of the different test diets containing trans-trans-2-4-decadienal at the concentrations shown in Tables 1 and 2. For each treatment there were 5 replicate tanks.

For å unngå tap av luslarver under forsøket ble et gitter (80 um) installert i utgangen av hver tank. Gitteret ble renset daglig, og oppsamlete luslarver ble fiksert med To avoid the loss of louse larvae during the experiment, a grid (80 µm) was installed at the outlet of each tank. The grid was cleaned daily, and collected louse larvae were fixed with it

formaldehyd (5 %) og deretter talt. Larvene i vannet ble bestemt hver dag for hver av behandlingene (dag 4, 8 og 12, respektivt). I tillegg, ble de forskjellige livstrinn av lus som var festet til Atlantisk laks (25 fisk/tank) telt, i samsvar med dagene angitt i tabell 2 for hver behandling. formaldehyde (5%) and then counted. The larvae in the water were determined every day for each of the treatments (days 4, 8 and 12, respectively). In addition, the different life stages of lice attached to Atlantic salmon (25 fish/tank) were counted, according to the days indicated in Table 2 for each treatment.

Variablene av analysene var som følger: The variables of the analyzes were as follows:

a) antall modne hunnkjønnlus ved dager 4, 8 og 12. a) number of mature female lice at days 4, 8 and 12.

b) antall hunnkjønnlus med eggstrenger ved dager 4, 8 og 12. b) the number of female bedbugs with egg strings at days 4, 8 and 12.

c) antallet totale embryoer per streng av lus ved dager 4, 8 og 12. (c) the number of total embryos per strand of lice at days 4, 8 and 12.

d) antall totale larver av lus ved dag 4, 8 og 12. d) number of total lice larvae at days 4, 8 and 12.

e) antallet ikke-levedyktige larver av lus ved dag 4, 8 og 12. e) the number of non-viable larvae of lice at days 4, 8 and 12.

f) antallet neuplius II av lus ved dag 4, 8 og 12. f) the number of neuplius II of lice at days 4, 8 and 12.

For å undersøke larvelevedyktigheten av lus, ble det anvendt et in vitro frontal To investigate the larval viability of lice, an in vitro frontal was used

filament inhiberingsmetode for kopepodidangrep som beskrevet i detalj nedenfor. Ti hunnkjønnlus med eggstrimler ble samlet fra hver tank og deretter inkubert (ved 14 °C) i 2 dager i filtrert (1 um sjøvann). Kopepodidene ble samlet og inkubert for aangrep i Petriskåler med agar og laksemukus. filament inhibition method for copepod attack as detailed below. Ten female bedbugs with egg strips were collected from each tank and then incubated (at 14 °C) for 2 days in filtered (1 µm seawater). The copepods were collected and incubated for infestation in Petri dishes with agar and salmon mucus.

Frontal filament inkuberingsmetoder for undersøkelse av kopepodidangrep { in vitro) : Mukus ble opptatt direkte fra Salmo salar. Fisk ble anestetisert med AQUi-S (BAYER, Tyskland) i et bad i ca 5 minutter. Mukus ble samlet ved skraping av kroppen til fisken, for dermed å unngå noe kontaminering. Den opptatte mukus ble frosset i væskeformig nitrogen og lagret ved - 80 °C inntil videre bruk. Mukusprøvene ble tint ved romtemperatur og filtrert ved 100 um for retensjon av skjellene og restvev av fisken, dersom nødvendig. 1 I agar omfattende mukusattraktant ble oppløst ved 30 g agar i 1 I destillert vann med oppvarming og konstant omrøring. 100 ul av det tinte Salmo Salar mukus ble tilsatt til den oppnådde løsning ved mindre enn 35 °C etterfulgt av blanding. Ca 60 ml av den oppnådde blanding ble tilsatt i Petri skåler (10 cm i diameter og 2 cm dybde), og beholdt inntil en gel ble oppnådd. 2 Petri skåler med agar blandet med Salmo salar mukus (9:1) ble plassert på bun-nen av et 2 I plastbeholder som ble fylt med 2 I filtrert (0,1 um) og UV-sterilisert sjøvann og luftet konstant. Testene ble utført ved anvendelse av tre replikater for hver konsentrasjon, hvor hvert replikat plasseres i en 2 I plastbeholder. Et minimum av femti innsamlete kopepodider for hver behandling ble deponert per beholder og satt med lufting i 48 t. Etter 48 t ble alle kopepodider av hver beholder og Petriskålene ekstrahert. Lus ble overført i Petriskålene inneholdende en blanding av alkohol, destillert vann og glyserol (45 %, 45 % og 10 %, respektivt) for fiksering, og tørket i en ovn ved en konstant temperatur på 35 °C i 4 timer. Hver av de fikserte prøvene ble undersøkt individuelt under et mikroskop (12 subprøver per behandling). Nærvær av det frontale filament i hver kopepodid fiksert på en mikroskopglassplate ble telt ved å studere nivået av utvikling av det frontale filament. Frontal filament incubation methods for the study of copepodid infestation {in vitro): Mucus was collected directly from Salmo salar. Fish were anesthetized with AQUi-S (BAYER, Germany) in a bath for about 5 minutes. Mucus was collected by scraping the body of the fish, in order to avoid any contamination. The collected mucus was frozen in liquid nitrogen and stored at - 80 °C until further use. The mucus samples were thawed at room temperature and filtered at 100 µm for retention of the scales and residual tissue of the fish, if necessary. 1 L of agar containing mucus attractant was dissolved in 30 g of agar in 1 L of distilled water with heating and constant stirring. 100 µl of the thawed Salmo Salar mucus was added to the obtained solution at less than 35 °C followed by mixing. About 60 ml of the mixture obtained was added to Petri dishes (10 cm in diameter and 2 cm deep), and kept until a gel was obtained. 2 Petri dishes with agar mixed with Salmo salar mucus (9:1) were placed on the bottom of a 2 L plastic container which was filled with 2 L filtered (0.1 µm) and UV sterilized seawater and aerated constantly. The tests were carried out using three replicates for each concentration, each replicate being placed in a 2 L plastic container. A minimum of fifty collected copepodids for each treatment were deposited per container and left with aeration for 48 h. After 48 h, all copepodids of each container and the Petri dishes were extracted. Lice were transferred into Petri dishes containing a mixture of alcohol, distilled water and glycerol (45%, 45% and 10%, respectively) for fixation, and dried in an oven at a constant temperature of 35 °C for 4 h. Each of the fixed samples was examined individually under a microscope (12 subsamples per treatment). Presence of the frontal filament in each copepodid fixed on a microscope slide was counted by studying the level of development of the frontal filament.

Resultater: Results:

Vanntemperaturen i forsøket varierte mellom 12 °C til 13 °C og oksygenmetningen varierte fra 80 % til 110 %, med et gjennomsnitt på 92 %. The water temperature in the experiment varied between 12 °C to 13 °C and the oxygen saturation varied from 80% to 110%, with an average of 92%.

Den spesifikke foringsrate (SFR %) oppnådd for hver behandling var tilsvarende i forsøksperioden. (Figur 2). Det høyeste gjennomsnittlige SFR (1,3 %) ble registrert ved den syvende dag for alle behandlinger, mens den første dag viste lavest SFR (0,57 %) for doseringer på 0,0009 % trans-trans-2-4-dekadienal i for og 0,0018 % trans- trans-2-4-dekadienal i for, sammenlignet med kontroll (SFR 0,7 %). Mengden av trans-trans-2-4-dekadienal konsumert per fisk er vist i tabell 3. The specific feeding rate (SFR%) obtained for each treatment was similar during the experimental period. (Figure 2). The highest mean SFR (1.3%) was recorded on the seventh day for all treatments, while the first day showed the lowest SFR (0.57%) for dosages of 0.0009% trans-trans-2-4-decadienal in for and 0.0018% trans-trans-2-4-decadienal in for, compared to control (SFR 0.7%). The amount of trans-trans-2-4-decadienal consumed per fish is shown in Table 3.

De skadelige effekter av trans-trans-2-4-dekadienal i hunnkjønn, embryo og larve-trinn av Caligus rogercresseyi er vist i figurer 3 A-F. generelt, alle data analysert var overdispergert. The deleterious effects of trans-trans-2-4-decadienal in female, embryo and larval stages of Caligus rogercresseyi are shown in Figures 3 A-F. in general, all data analyzed were overdispersed.

Totale egg. Total eggs.

Det ble ikke funnet en relevant interaksjonseffekt mellom trans-trans-2-4-dekadienal dosering og eksponeringstid (= antallet dager idet fisken ble foret med de forskjellige dietter), men det ble observert klare effekter på både trans-trans-2-4-dekadienal dosering og eksponeringstid (figur 3A). For høyere trans-trans-2-4-dekadienal doseringer i for ble det oppnådd lavere mengder av egg per hunnkjønn. Mens for lengre behandlinger (eksponeringstid), ble det oppnådd høyere mengder egg, som er relatert med tiden nødvendig for inkubering av eggstrengene til hunnkjønnene. No relevant interaction effect was found between trans-trans-2-4-decadienal dosage and exposure time (= number of days when the fish were fed the different diets), but clear effects were observed on both trans-trans-2-4- decadienal dosage and exposure time (Figure 3A). For higher trans-trans-2-4-decadienal dosages in for, lower amounts of eggs per female were obtained. While for longer treatments (exposure time), higher amounts of eggs were obtained, which is related to the time required for the incubation of the egg strings of the females.

Gravide hunner. Pregnant females.

Det var ingen klare effekter på hverken trans-trans-2-4-dekadienal dosering eller eksponeringstid på gravide hunner (Figur 3B). Der er en indikasjon på at antall gravide hunner ble redusert med økende eksponeringstid. Dette kan forklares med det faktum at med økende tid så blir flere egg modne og larver forlater eggstrengene, som dermed reduserer antall gravide hunner. There were no clear effects on either trans-trans-2-4-decadienal dosage or exposure time on pregnant females (Figure 3B). There is an indication that the number of pregnant females was reduced with increasing exposure time. This can be explained by the fact that with increasing time more eggs mature and larvae leave the egg strings, which thus reduces the number of pregnant females.

Modne hunner. Mature females.

Trans-trans-2-4-dekadienal dosering og eksponeringstid viste klare negative effekter på antallet modne hunner, men det syntes ikke å være noen interaksjon mellom disse parametere (figur 3C). Dette indikerer at effektene er additive. Både en øket dosering og en øket eksponeringstid reduserer tallene for modne hunner, hvor øket eksponeringstid er omtrent dobbelt så effektiv. Basert på modellen (Montgomery, 1997; Myers & Montgomery, 1995) vil en økning i dosering fra null til 0,0018 % redusere antallet modne hunner fra ca 99 hunner til 85 hunner (15 % fall). Tilsvarende, øking av eksponeringstiden fra 4 til 12 timer med dosering 0,0018 % reduserte antallet fra ca 98 hunner til 73 hunner (25 % fall). Trans-trans-2-4-decadienal dosage and exposure time showed clear negative effects on the number of mature females, but there appeared to be no interaction between these parameters (Figure 3C). This indicates that the effects are additive. Both an increased dosage and an increased exposure time reduce the numbers for mature females, where increased exposure time is approximately twice as effective. Based on the model (Montgomery, 1997; Myers & Montgomery, 1995), an increase in dosage from zero to 0.0018% will reduce the number of mature females from approximately 99 females to 85 females (15% drop). Similarly, increasing the exposure time from 4 to 12 hours with a dosage of 0.0018% reduced the number from approximately 98 females to 73 females (25% drop).

Totalt antall larver. Total number of larvae.

Trans-trans-2-4-dekadienaldoseringen viste ingen effekt på totalt larvetall, mens eksponeringstid påvirket det totale larvetall (figur 3D). Det siste kan forklares med konstant frigjørelse av larver fra eggstrengene og deres akkumulering i de forskjellige larvelivsfaser (naupilus I, naupilus II og kopepodider). The trans-trans-2-4-decadienal dosage showed no effect on total larval numbers, while exposure time affected total larval numbers (Figure 3D). The latter can be explained by the constant release of larvae from the egg strings and their accumulation in the different larval life stages (naupilus I, naupilus II and copepodids).

Ikke-levedyktige larver. Non-viable larvae.

En tilsvarende effekt som for det totale larvetall ble også observert for antallet ikke-levedyktige larver. Trans-trans-2-4-dekadienaldoseringen viste ikke en effekt på antallet av levedyktige larver, mens eksponeringstiden klart øker antallet ikke-levedyktige larver (figur 3E), som forklares på samme måte som for det totale antall larver, og er en akkumulering av ikke-levedyktige larver med tiden. A similar effect as for the total number of larvae was also observed for the number of non-viable larvae. The trans-trans-2-4-decadienal dosage did not show an effect on the number of viable larvae, while the exposure time clearly increases the number of non-viable larvae (Figure 3E), which is explained in the same way as for the total number of larvae, and is an accumulation of non-viable larvae over time.

Nauplius II. Nauplius II.

Tolkning av effektene på nauplius II fasen er tilsvarende som for det totale antall larver og for ikke-levedyktige larver. Der var ingen effekt av trans-trans-2-4-deka-dienaldosering og eksponeringstid, på grunn av en akkumulering over tid av larver i nauplius II fasen (figur 3F). I dette tilfellet var der en svak indikasjon på en negativ interaksjon mellom dosering og eksponeringstid som kan indikere at økende eksponeringstid med trans-trans-2-4-dekadienal har en effekt på nauplius II fasen. Interpretation of the effects on the nauplius II phase is similar to that for the total number of larvae and for non-viable larvae. There was no effect of trans-trans-2-4-deca-dienaldose and exposure time, due to an accumulation over time of larvae in the nauplius II stage (Figure 3F). In this case there was a weak indication of a negative interaction between dosage and exposure time which may indicate that increasing exposure time with trans-trans-2-4-decadienal has an effect on the nauplius II phase.

Frontal filament inhibering (respons). Frontal filament inhibition (response).

En sammenligning mellom kontrollgruppen (ikke eksponert til trans-trans-2-4-dekadienal), og gruppen eksponert til den høyere dosering av 0,0018 % trans-trans-2-4-dekadienal ble utført, ved anvendelse av inhibering av metoden for frontalt filament i kopepodider av C. rogercresseyi. En signifikant forskjell ble observert mellom kontrollresponsen og doseresponsen av trans-trans-2-4-dekadienal (0,0018 %). Således, der er en sterk inhibering av frontal filament (58 %) i kopepodider som eksponeres til trans-trans-2-4-dekadienal (figur 4). A comparison between the control group (not exposed to trans-trans-2-4-decadienal) and the group exposed to the higher dosage of 0.0018% trans-trans-2-4-decadienal was performed, using the inhibition of the method of frontal filament in copepodids of C. rogercresseyi. A significant difference was observed between the control response and the dose response of trans-trans-2-4-decadienal (0.0018%). Thus, there is a strong inhibition of the frontal filament (58%) in copepodids exposed to trans-trans-2-4-decadienal (Figure 4).

Eksperiment 3. Experiment 3.

Undersøkelse av skadelige effekter, letale eller sub-letale, av trans-trans-2-4-dekadienal injisert i Atlantisk laks og dets vev. Investigation of harmful effects, lethal or sub-lethal, of trans-trans-2-4-decadienal injected into Atlantic salmon and its tissues.

Et LD50 (letal dose, 50 %) forsøk ble utført for å evaluere den letale dosering av trans-trans-2-4-dekadienal for Atlantisk laks (Salmo salar). 138 fisk ble pit-merket og allokert i seks tanker (23 fisk/tank; biomasse per tank: 15 kg/m<3>), hver med en total kapasitet på 350 I, med en gjennomsnittlig vekt på 75 g/fisk. Etter 7 dager ble fisken injisert en gang intraperitonealt med 0,1 ml av følgende konsentrasjoner av trans-trans-2-4-dekadienal i en saltserum: 0,57 mg trans-trans-2-4-dekadienal/l/dag, 1,13 mg trans-trans-2-4-dekadienal/l/dag, 5,65 mg trans-trans-2-4-dekadienal/l/dag, 28,24 mg trans-trans-2-4-dekadienal/l/dag eller 56,47 mg trans-trans-2-4-dekadienal/l/dag. An LD50 (lethal dose, 50%) experiment was conducted to evaluate the lethal dose of trans-trans-2-4-decadienal for Atlantic salmon (Salmo salar). 138 fish were pit-tagged and allocated in six tanks (23 fish/tank; biomass per tank: 15 kg/m<3>), each with a total capacity of 350 I, with an average weight of 75 g/fish. After 7 days, the fish were injected once intraperitoneally with 0.1 ml of the following concentrations of trans-trans-2-4-decadienal in a saline serum: 0.57 mg trans-trans-2-4-decadienal/l/day, 1 .13 mg trans-trans-2-4-decadienal/l/day, 5.65 mg trans-trans-2-4-decadienal/l/day, 28.24 mg trans-trans-2-4-decadienal/l /day or 56.47 mg trans-trans-2-4-decadienal/l/day.

Ikke-injisert fisk ble anvendt som en kontroll. Miljømessige variabler ble registrert daglig, så som sjøvanntemperatur (grader celsius) og oksygenmetning i sjøvann (%). Fisk ble ikke matet under eksponeringsforsøket (7 dager). Non-injected fish were used as a control. Environmental variables were recorded daily, such as seawater temperature (degrees Celsius) and oxygen saturation in seawater (%). Fish were not fed during the exposure trial (7 days).

Vevsprøver av hjerne, tarm, skinn, lever og muskel fra laks ble tatt per hver dosering injisert 7 dager etter første injeksjon. Triplikatprøve per vev ble tatt per dosering, samlet og deretter splittet i subprøver for histologiske analyser og for GC-MS analyser av transtrans24dekadienal. Tissue samples of brain, intestine, skin, liver and muscle from salmon were taken per each dose injected 7 days after the first injection. Triplicate samples per tissue were taken per dosage, pooled and then split into subsamples for histological analyzes and for GC-MS analyzes of transtrans24decadienal.

GC-MS- analyser: GC-MS analyses:

For prøvefremstilling ble 0,1 g avfiskevev (lever, muskel, hjerne, nyre eller tarm) homogenisert og plassert i et Falcon-rør (NALGENE, Centrifuge Tube Oak Ridge™ For sample preparation, 0.1 g of fish tissue (liver, muscle, brain, kidney or intestine) was homogenized and placed in a Falcon tube (NALGENE, Centrifuge Tube Oak Ridge™

Sealing Cap P 10 ml_). 1 ml NaCI (1 mg/ml) og 1 ml heksan (HPLC kvalitet) ble tilsatt til prøven og omrørt for homogenisering. Deretter ble prøvene sentrifugert ved 10000 rpm i 20 min og plassert i en fryser (-18 °C) i 1 time. Supernatanten ble trukket av og filtrert (DURAPORE membrane GV (PVDF), 0,22 um, 13mm diameter, Hydrophilic, 100/CX). Den filtrerte løsning ble konsentrert til 100 ul under en strøm av nitrogen. 1 ul av denne løsning ble injisert for GC-MS-analyser ved anvendelse av en kalibrert gasskromatograf (Focus GC) koplet til et massespektrometer (Thermo) og utstyrt med en BP-1 kappelærkolonne (30 m, 0.22 mm, 0,25 um; SGE, Australia). Ovn-temperaturen ble holdt ved 40 °C i 2 min, og deretter programmert med en gradient med 10 °C min -1 til 250 °C. Bærergassen var helium. Injeksjonstemperaturen og overføringslinje til massedetektor ble holdt ved 250 °C. Elektron impakt ionisering ble benyttet med energier på 70 eV ved 250 °C. Sealing Cap P 10 ml_). 1 ml of NaCl (1 mg/ml) and 1 ml of hexane (HPLC grade) were added to the sample and stirred for homogenization. The samples were then centrifuged at 10,000 rpm for 20 min and placed in a freezer (-18 °C) for 1 hour. The supernatant was drawn off and filtered (DURAPORE membrane GV (PVDF), 0.22 µm, 13 mm diameter, Hydrophilic, 100/CX). The filtered solution was concentrated to 100 µl under a stream of nitrogen. 1 µl of this solution was injected for GC-MS analyzes using a calibrated gas chromatograph (Focus GC) coupled to a mass spectrometer (Thermo) and equipped with a BP-1 capillary column (30 m, 0.22 mm, 0.25 µm; SGE, Australia). The oven temperature was held at 40 °C for 2 min, and then programmed with a gradient of 10 °C min -1 to 250 °C. The carrier gas was helium. The injection temperature and transfer line to the mass detector were maintained at 250 °C. Electron impact ionization was used with energies of 70 eV at 250 °C.

Resultater: Results:

Under perioden av forsøket (7 dager) ble ingen mortalitet registrert i Atlantisk laks (S.Salar), som var injisert med forskjellige trans-trans-2-4-dekadienal doseringer eller i kontroll. Derfor, en LD50-undersøkelse var ikke relevant for dette forsøk. During the period of the experiment (7 days) no mortality was recorded in Atlantic salmon (S. Salar), which were injected with different trans-trans-2-4-decadienal dosages or in control. Therefore, an LD50 study was not relevant for this experiment.

Registrering av miljøbetingelser for forsøket, temperatur på sjøvann var i gjennomsnitt 12 °C med variabilitet mindre enn 1 %, mens oksygenmetning varierte fra 90 % til 100%. Recording of environmental conditions for the experiment, seawater temperature averaged 12 °C with variability less than 1%, while oxygen saturation varied from 90% to 100%.

Ingen viktige forandringer i cellestruktur i vevsprøvene ble observert (tabell 4 og 5) mellom fisk behandlet med trans-trans-2-4-dekadienal doseringer og kontroll. Skade av type 2 ble observert med mer frekvens i lever og i tarm. Ingen skader ble observert i skinn og muskel. No important changes in cell structure in the tissue samples were observed (tables 4 and 5) between fish treated with trans-trans-2-4-decadienal dosages and control. Damage of type 2 was observed with more frequency in the liver and in the intestine. No damage was observed in the skin and muscle.

En høyere skade (type 3 ble observert i lever, for trans-trans-2-4-dekadienal A higher damage (type 3) was observed in liver, for trans-trans-2-4-decadienal

dosering av 28,24 mg/l (tabell 4 og 5), med et nekrotisk område kun i en prøve. En høyere frekvens av vevsskade ble observert i lever og tarm, som prinsipielt var type 2 (tabell 4). Kun et tilfelle av skadenivå 1, ble observert i hjerne og dette var en mild meningitt (tabell 4 og 5). dosage of 28.24 mg/l (Tables 4 and 5), with a necrotic area only in one sample. A higher frequency of tissue damage was observed in the liver and intestine, which was mainly type 2 (table 4). Only one case of damage level 1 was observed in the brain and this was a mild meningitis (tables 4 and 5).

Konsentrasjonene av trans-trans-2-4-dekadienal detektert i hvert analyserte vev er vist i tabell 6. Trans-trans-2-4-dekadienal ble funnet i alle vevene analysert (lever, hjerne, tarm, skinn og muskel). Høyere konsentrasjoner ble registrert for tarmvevet. Ingen konsentrasjoner av trans-trans-2-4-dekadienal ble detektert i kontrollvevet. The concentrations of trans-trans-2-4-decadienal detected in each analyzed tissue are shown in Table 6. Trans-trans-2-4-decadienal was found in all the tissues analyzed (liver, brain, intestine, skin and muscle). Higher concentrations were recorded for the intestinal tissue. No concentrations of trans-trans-2-4-decadienal were detected in the control tissue.

Diskusjoner og konklusjoner. Discussions and conclusions.

Med hensyn til forskjellige tider av persistens av trans-trans2-4-dekadienal, oppløst i sjøvann, ved 10 °C sammenlignet med 12 °C og 14 °C, syntes trans-trans-2-4-dekadienal å vedvare i lengre tid ved en lavere vanntemperatur. Trnas-trans-2-4-dekadienal oppløst i sjøvann, vedvarer for maksimum 10 dager ved temperaturer mellom 10 °C og 14 °C. Resultatene i denne testen ifølge foreliggende oppfinnelse viser at det umettede aldehyd ikke er en persistent forbindelse i sjøvann. Dette vurderes som en stor fordel og forhåndsbetingelser for egnethet av dette middel ved anvendelse i behandling av fisk i et vandig miljø, spesielt idet det anvendes i et åpent system. Regarding different persistence times of trans-trans2-4-decadienal, dissolved in seawater, at 10 °C compared to 12 °C and 14 °C, trans-trans-2-4-decadienal appeared to persist for a longer time at a lower water temperature. Trnas-trans-2-4-decadienal dissolved in seawater persists for a maximum of 10 days at temperatures between 10 °C and 14 °C. The results of this test according to the present invention show that the unsaturated aldehyde is not a persistent compound in seawater. This is considered a major advantage and preconditions for the suitability of this agent when used in the treatment of fish in an aqueous environment, especially when it is used in an open system.

En direkte administrering av trans-trans-2-4-dekadienal til sjøvann gav liten eller ingen effekt på lus angrep i Atlantisk laks (resultater ikke vist). Overraskende, det ble funnet ifølge foreliggende oppfinnelse at det er mulig å negativt påvirke luspopula-sjonen, idet trans-trans-2-4-dekadienal ble tilsatt til foret og matet til fisk angrepet med nevnte lus. A direct administration of trans-trans-2-4-decadienal to seawater produced little or no effect on lice infestation in Atlantic salmon (results not shown). Surprisingly, it was found according to the present invention that it is possible to negatively affect the lice population, as trans-trans-2-4-decadienal was added to the feed and fed to fish infested with said lice.

Dette er en fordel ut fra et praktisk ståsted siden fisken ikke må isoleres eller fjernes fra dyrkningsenheten så som sjømerden for å kunne behandles, siden fisken enkelt kan fores dietten som omfatter den aktive forbindelse. This is an advantage from a practical point of view since the fish does not have to be isolated or removed from the culture unit such as the sea cage in order to be treated, since the fish can easily be fed the diet that includes the active compound.

En vannmerdbehandling krever mer behandling og er således mer arbeidskrevende og vil videre være stressende for fisken. Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således mulig å behandle fisken i dyrkningsenhetene uten å isolere fisken. A water cage treatment requires more treatment and is thus more labor-intensive and will also be stressful for the fish. According to the present invention, it is thus possible to process the fish in the cultivation units without isolating the fish.

LD50- analysen viste at ingen mortalitet ble observert i laks injisert med trans-trans-2-4-dekadienal. Det ble observert noen milde skader i lever og tarmkanal etter behandling med økete doseringer av de umettete aldehyder. Skadene vurderes som reversible. The LD50 analysis showed that no mortality was observed in salmon injected with trans-trans-2-4-decadienal. Some mild damage was observed in the liver and intestinal tract after treatment with increased dosages of the unsaturated aldehydes. The damage is considered reversible.

Med hensyn til resultater av effektivitetsforsøkene ble et lavere antall modne hunner og egg av Caligus rogercresseyi oppnådd idet laksen ble foret høyere doseringer av trans-trans-2-4-dekadienal i lakseforet. With regard to the results of the effectiveness trials, a lower number of mature females and eggs of Caligus rogercresseyi was obtained when the salmon were fed higher dosages of trans-trans-2-4-decadienal in the salmon feed.

Samtidig, med en økende eksponeringstid til trans-trans-2-4-dekadienal i foret, ble et redusert antall gravide og modne hunner oppnådd. En reduksjon på 25 % i antallet modne hunner av C. rogercresseyi ble oppnådd. Det ble også vist at trans-trans-2-4-dekadienal har en skadelig effekt i gonadikal modning av hunner av C. rogercresseyi, idet Atlantisk laks (S. salar) behandles med umettet aldehyd tilsatt til foret. Dette indikerer at trans-trans-2-4-dekadienal effektivt reduserer modningen og reproduktiv evne til lus. Det ble vist at trans-trans-2-4-dekadienal også har en skadelig effekt i tilgjengelighet av egg i eggstrengene av C. rogercresseyi, idet Atlantisk laks (S. salar) behandles med umettet aldehyd tilsatt i foret. De påviste effekter av de forskjellige lusfaser vil føre til en kvantitativ reduksjon av tilgjengelighet av luslarver i sjøburene anvendt i fiskeoppdrett og, gjennom dette, en reduksjon av sannsynlighet for angrep av kopepodider til fisken. At the same time, with an increasing exposure time to trans-trans-2-4-decadienal in the feed, a reduced number of pregnant and mature females was obtained. A 25% reduction in the number of mature females of C. rogercresseyi was achieved. It was also shown that trans-trans-2-4-decadienal has a detrimental effect on gonadal maturation of females of C. rogercresseyi, as Atlantic salmon (S. salar) are treated with unsaturated aldehyde added to the feed. This indicates that trans-trans-2-4-decadienal effectively reduces the maturation and reproductive ability of lice. It was shown that trans-trans-2-4-decadienal also has a detrimental effect on the availability of eggs in the egg strings of C. rogercresseyi, as Atlantic salmon (S. salar) are treated with unsaturated aldehyde added to the feed. The proven effects of the different lice phases will lead to a quantitative reduction in the availability of lice larvae in the sea cages used in fish farming and, through this, a reduction in the likelihood of copepodids attacking the fish.

Den viste inhibitoriske effekt av eversjon av frontalt filament (morfogenese) i kopepodider oppnådd fra hunner av fisk behandlet med 0,0018 % dosering i for indikerer at trans-trans-2-4-dekadienal negativt påvirker levedyktigheten av kopepodider av C. rogercresseyi under prosessen. trans-trans-2-4-dekadienal i samsvar med foreliggende oppfinnelse vurderes således som å være en bioaktiv forbindelse som effektivt hindrer en og tilfestingen av ektoparasitten til fiskens skinn. The shown inhibitory effect of frontal filament eversion (morphogenesis) in copepodids obtained from female fish treated with 0.0018% dosage in for indicates that trans-trans-2-4-decadienal negatively affects the viability of copepodids of C. rogercresseyi during the process . trans-trans-2-4-decadienal in accordance with the present invention is thus considered to be a bioactive compound which effectively prevents the attachment of the ectoparasite to the skin of the fish.

Injiserte doseringer av trans-trans-2-4-dekadienal, 0,1 mg/l, 0,5 mg/l og 1,5 mg/l i Atlantisk laks ( Salmo salar) produserer ikke mortalitet. Derfor, det umettede aldehyd kan vurderes som å være sikkert idet det anvendes som et laksefor. Injected dosages of trans-trans-2-4-decadienal, 0.1 mg/l, 0.5 mg/l and 1.5 mg/l in Atlantic salmon (Salmo salar) do not produce mortality. Therefore, the unsaturated aldehyde can be considered to be safe when used as a salmon feed.

Tarmen var det organ i Atlantisk laks { Salmo salar) som akkumulerte det meste av trans-trans-2-4-dekadienal og en høyere frekvens av milde skader foreligger i dette organ. The intestine was the organ in Atlantic salmon {Salmo salar) that accumulated the most trans-trans-2-4-decadienal and a higher frequency of mild damage is present in this organ.

Det skal anerkjennes at egenskapene med foreliggende oppfinnelse beskrevet i det overnevnte kan modifiseres uten å avvike fra oppfinnelsens ramme. It must be recognized that the characteristics of the present invention described in the above can be modified without deviating from the scope of the invention.

Referanser: References:

Montgomery, D. 1997. Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons, New York, 684 pp. Montgomery, D. 1997. Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons, New York, 684 pp.

Myers, R. & D. Montgomery. 1995. Response Surface Methodology. John Wiley Myers, R. & D. Montgomery. 1995. Response Surface Methodology. John Wiley

& Sons, New York, 700 pp. & Sons, New York, 700 pp.

Pino-Marambio, J.E., Mordue (Luntz), A.J., Birkett, M.A., Carvajal, J., Asencio, G., Mellado, A., Quiroz, A.E., (2007). Behavioural Studies of Host, Non-Host and Mate Location by the Sea Louse, Caligus rogercresseyi. Boxshall & Bravo, 2000 (Copepoda: Caligidae). Aquac 271, 70-76. Pino-Marambio, J.E., Mordue (Luntz), A.J., Birkett, M.A., Carvajal, J., Asencio, G., Mellado, A., Quiroz, A.E., (2007). Behavioral Studies of Host, Non-Host and Mate Location by the Sea Louse, Caligus rogercresseyi. Boxshall & Bravo, 2000 (Copepoda: Caligidae). Aquac 271, 70-76.

Claims

1. For an animal, characterized in that said for comprises an alkadienal.

2. For in accordance with claim 1, characterized in that an alkadienal unit of said alkadienal contains 6 to 16 carbons, more preferably 7 to 12 carbons.

3. For in accordance with one of the preceding claims, characterized in that said alkadienal is a decadienal.

4. For in accordance with claim 3, characterized in that said decadienal is 2-4-decadienal, more preferably trans-trans-2-4-decadienal.

5. For in accordance with one of the preceding claims, characterized in that said alkadienal is extracted from peanut oil, potato juice, diatoms, algae, marine fungus, a vegetal volatile fraction or an organic fraction.

6. Feed in accordance with one of the preceding claims, characterized in that the feed further comprises commonly used feed ingredients such as proteins, lipids, vitamins, carbohydrates and minerals.

7. Lining in accordance with one of the preceding claims, characterized in that said trans-trans-2-4-decadienal is in a concentration of at least 0.009% by weight of the lining, wet weight.

8. For in accordance with one of the preceding claims, characterized in that the animal is an aquatic animal, preferably a fish, most preferably a species selected from the Salmonidae family.

9. For in accordance with claim 8, characterized in that said Salmonidae is selected from Atlantic salmon (Salmo salar), Rainbow trout (Onchorhynkuss mykiss), silver salmon (Oncorhynchus kisutch), and Arctic trout (Salvelinus alpinus).

10. Feed in accordance with one of the preceding requirements, characterized in that said feed is for a fish and is administered to fish in fish farming.

11. For in accordance with one of the preceding claims, for use in the treatment and/or prophylaxis of parasitic infections and/or infestations in an animal.

12. For in accordance with claim 5, for use in treatment and/or prophylaxis of lice infestation in salmon.

13. Alkadienal, which is preferably an alkadiene where the unit of said alkadiene contains 6 to 16 carbons, more preferably 7 to 12 carbons, more preferably an alkadienal is a decadienal, even more preferably a 2-4 decadienal and most preferably a trans-trans -2-4-decadienal for use in the treatment and prophylaxis of a parasitic infection and/or attack in an animal.

14. Alkadienal in accordance with claim 13, for use in the treatment and/or prophylaxis of a parasitic infection and/or attack in accordance with claim 13, wherein the animal is an aquatic animal, preferably a fish, and the parasite is preferably an ectoparasite.

15. Alkadienal in accordance with claim 13, for use in the treatment and/or prophylaxis of a louse infection and/or attack, wherein the louse is preferably a copepod species belonging to the Caligidae family, preferably selected from Caligus rogercresseyi, Caligus elongateus, and Lepeophtheirus salmonis and the fish is a species selected from the family of Salmonidae, preferably selected from Atlantic salmon (Salmo salar), Rainbow trout (Onchorhynkuss mykiss), Silver salmon (Oncorhynchus kisutch) and Arctic trout (Salvelinus alpinus).

16. Alkadienal in accordance with claim 13 for use in treatment and/or prophylaxis of a parasitic infection and/or attack in accordance with one of claims 13-15, wherein said alkadienal compound is injected intraperitoneally.

17. Alkadienal in accordance with claim 13 for use in the treatment and/or prophylaxis of a parasitic infection and/or attack in accordance with one of claims 13-16, where said alkadienal compound is injected in an amount corresponding to 0.1 ml of 0, 5 mg/l to 60 mg/l of said alkadienal per day, preferably a concentration of less than 28 mg/l/day.

18. Alkadienal in accordance with claim 13 for use in the treatment and/or prophylaxis of a parasitic infection and/or attack in accordance with one of claims 13-15, wherein said alkadienal compound is administered orally.

19. Application of a line in accordance with one of the claims 1-12 for farming fish.

20. Use of an alkadienal, which is preferably an alkadiene where the unit of said alkadienal contains 6 to 16 carbons, more preferably 7 to 12 carbons, more preferably an alkadienal is a decadienal, even more preferably a 2-4-decadienal, most preferred a trans-trans-2-4-decadienal for the production of a biocative for and/or a drug for the prophylaxis and/or treatment of a disease caused by an (ecto)parasite in an animal.

21. Method for producing a lining in accordance with one of claims 1-12, characterized in that said alkadienal is dissolved in a solvent and then coated on and/or added to the lining.

22. Method for preventing an infection and/or attack of lice in fish, characterized in that said fish is primed with an alkadienal too extensive, which is preferably an alkadiene where the unit of said alkadienal contains 6 to 16 carbons, more preferably 7 to 12 carbons, more preferably that said alkadienal is a decadienal, even more preferably a 2-4-decadienal, and most preferably a trans-trans-2-4-decadienal and/or that said fish is injected with a composition comprising said alkadienal.

23. Method in accordance with claim 22, characterized in that the concentration of trans-trans-2-4-decadienal in the feed is at least 0.009% by weight of the wet weight of the feed.

24. Method in accordance with claim 22, characterized in that the amount of trans-trans-2-4-decadienal inserted is at least 0.052 ml/fish, preferably from 0.052 mg to 0.311 mg/fish.

25. Method in accordance with one of the claims 22-24, characterized in that the fish is fed with said feed for at least 4 days, preferably for a period of between 4 and 12 days.

26. Use of an alkadienal, which is preferably an alkadiene where a unit of said alkadienal contains 6 to 16 carbons, more preferably 7 to 12 carbons, more preferably that said alkadienal is a decadienal, even more preferably a 2-4-decadienal, most preferably a trans-trans-2-4-decadioenal, or a fish too comprehensively mentioned alkadienal, to inhibit eversion of frontal filament in lice copepodids and/or to reduce maturation, reproductive ability of lice and/or for occurrence of lice larvae .

27. Use of alkadienal in accordance with claim 26 or a fish feed comprising said alkadienal to reduce the number of lice in the neuplius II development phase, feeding it to a fish for at least 12 days.