NO175207B - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av en terapeutisk aktiv teicoplaninforbindelse som har formelen:

hvor Y representerer en gruppe

hvor

R<1> representerer hydrogen, (C^-C^)alkyl, hydroksy(C2-C4)-alkyl, halogen(C2-C4)alkyl, ( C^ C^ )alkoksy(C2-C4)alkyl, amino(C2-C4)alkyl, ( C^ C^)alkylamino(C2-C4)alkyl, dl( Ci-C4 )alkylamino(C2-C4)alkyl,

R** representerer hydrogen, (C^-Cf, )alkyl, hydroksy(C2-C4 )-alkyl, halogen(C2-C4)alkyl, (C1-C4)alkoksy(C2-C4)alkyl, en nitrogenholdig 5-6-leddet heterocyklisk ring som er fullstendig mettet og hvor nitrogenatomer kan være substituert med en benzylrest eller en brodannende C2-alkylenkjede tilknyttet ett av C-atomene i den heterocykliske ring;

en gruppe -alk-W hvor "alk" representerer en lineær alkylenkjede med 1-8 karbonatomer som eventuelt er

substituert med en substituent valgt fra (C1-C4)alkyl, hydroksy(C1-C4)alkyl, hydroksy, karboksy, aminokarbonyl, (C1-C4)alkylaminokarbonyl, di(C^-C4)alkylaminokarbonyl, (C1-C4)alkoksykarbonyl, fenyl(Ci-C4)alkoksykarbonyl, og W representerer karboksy, (C1-C4)alkoksykarbonyl, fenyl(Ci-C4)alkoksykarbonyl, aminokarbonyl, ( C±- C$)aminokarbonyl, di(C1-C4)aminokarbonyl, pentosaminokarbonyl, heksosaminokarbonyl, ureido, guanidino, pyrrolidin hvor N-atomet kan være (C1-C4) alkylsubstituert, pyridin eller morfolin, en gruppe med formelen

hvor R<3> og R<4> hver uavhengig representerer hydrogen, (cl~c6)alkyl, hydroks<y>(C2~C4)alkyl og halogen(C2-C4)alkyl, eller R<4> representerer fenylmetyloksykarbonyl og R<3> representerer hydrogen; en gruppe med formelen: hvor r<6>, r<7> og R<8> hver uavhengig representerer en (C^-C4)alkyl, eller R<*> og R^ representerer sammen med det tilstøtende nitrogenatom piperazino, substituert i 4-stilling med en metylgruppe eller en pyridinylgruppe, morfolino eller tiomorfolino; A representerer hydrogen eller -N[(C^q-Ch)alifatisk acyl]-P-D-2-deoksy-2-amino-glucopyranosyl; B representerer hydrogen eller N-acetyl-p<->D-2-deoksy-2-amino-glucopyranosyl; M representerer hydrogen eller a-D-mannopyranosyl; forutsatt at B representerer hydrogen bare når A og M samtidig er hydrogen og M representerer hydrogen bare når A er hydrogen, og med den ytterligere forutsetning at når W representerer en gruppe en gruppe

, ureido, guanidino

eller en nitrogenholdig 5-6-leddet heterocyklisk ring som definert ovenfor direkte forbundet med "alk"-delen gjennom en binding med et ringnitrogenatom, så må den lineære alkylen-"alk"-delen ha minst to karbonatomer;

samt syreaddisjonssalter derav.

Teicoplanin er det internasjonale ikke-beskyttede navn (INN) på det antibiotiske stoff som tidligere var betegnet teichomycin som oppnås ved dyrking av stammen Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121 i et kulturmedium inneholdende assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter (se US patent 4.239.751). Ifølge metoden som er beskrevet i nevnte patent, utvinnes et antibiotisk kompleks inneholdende Teichomycin A^, A2 og A3 fra den separerte fermenteringsmedium ved ekstraksjon med et egnet vannuoppløselig organisk oppløsningsmiddel og utfelling fra det ekstraherende oppløsningsmiddel ifølge vanlige metoder. Teichomycin A2, som er hovedfaktoren i det isolerte antibiotiske komplekset, separeres deretter fra de andre faktorene ved hjelp av kolonnekromatografi på Sephadex®. Publisert GB-patentsøknad 2.121.401 angir at antibiotikum Teichomycin A2 faktisk er en blanding av fem nær beslektede koproduserte hovedkomponenter.

Ifølge nylige strukturelle studier er det mulig å representere teicoplanin A2 (tidligere Teichomycin A2)-hovedkomponenter 1, 2, 3, 4 og 5 ved den ovenfor angitte formel I hvori R er hydrogen, Y er hydroksy, A representerer -N[(C^q-C^^ )-alifatisk acyl]-p-D-2-deoksy-2-amino-glucopyranosyl, B representerer N-acetyl-g<->D-2-deoksy-2-amino-glucopyranosyl, M representerer oc-D-manno-pyranosyl.

Mer spesielt, i teicoplanin A2 komponent 1 representerer t (c10~^ll)~alifatisk acyl]-substituenten Z-decenoyl, i teicoplanin A2 komponent 2 representerer den 8-metyl-nona-noyl, i teicoplanin A2 komponent 3 representerer den decanoyl, i teicoplanin A2 komponent 4 representerer den 8-metyldecanoyl, i teicoplanin A2 komponent 5 representerer den 9-metyldecanoyl.

Alle sukkerdelene er, når de er til stede, bundet til teico-planinkjernen gjennom O-glycosidiske bindinger.

I tillegg er det funnet at det er mulig å omdanne teicoplanin, en ren faktor derav eller en blanding av en hvilken som helst av nevnte faktorer i et hvilket som helst mengdeforhold, til antibiotiske enhetsprodukter ved hjelp av selektiv hydrolyse av en eller to sukkerdeler eller -grupper. De er betegnet antibiotikum L 17054 og antibiotikum L 17046 er kjent fra henholdsvis EP-patentsøknader publ.nr. 119.574 og 119.575. Foretrukne hydrolysebetingelser for fremstilling av antibiotikum L 17054 er i nevnte EP-patentsøknad, publ.nr. 119.575 angitt å være: 0,5N saltsyre ved en temperatur mellom 70 og 90°C og i en tid som generelt er mellom 45 og 90 min. Antibiotikum L 17054 er representert ved den ovenfor angitte formel I hvori Y er hydroksy, R og A representerer hydrogen, B representerer N-acetyl-p<->D-2-deoksy-2-amino-glucopyranosyl, M representerer _a-D-mannopyranosyl, hvor sukkerdelene er bundet til den peptidiske kjernen gjennom en O-glycosidisk binding.

Foretrukne hydrolysebetingelser angitt i nevnte EP-patent-søknad, publ.nr. 119.574 for fremstilling av antibiotikum L 17046 er: 1-3N saltsyre, ved en temperatur mellom 50 og 90°C og en tid som generelt er mellom 40 og 60 min.

Antibiotikum L 17046 er representert ved formel I ovenfor hvori Y er hydroksy, R, A og M representerer hydrogenatomer, og B er N-acetyl-p<->D-2-deoksy-2-amino-glucopyranosyl, hvor sukkerdelen er bundet til den peptidiske kjernen gjennom en O-glycosidisk binding.

Den fullstendige selektive spalting av alle sukkerdelene eller -gruppene i teicoplaninforbindelsene gir et aglycon-molekyl som er betegnet antibiotikum L 17392 eller deglucoteicoplanin, og er representert ved den ovenfor angitte formel I hvori Y er hydroksy, og R, A, B og M hver indivi-duelt representerer en hydrogengruppe. Denne selektive hydrolyseprosess er kjent fra NO-patent 170.019.

Et stoff som har den samme strukturelle formel er kjent fra EP-patentsøknad, publ.nr. 0090578 og er betegnet antibiotikum A 41030 faktor B. Dette stoffet oppnås ved hjelp av en mikrobiologisk prosess som innebærer fermentering av stammen Streptomyces virginiae NRRL 12525 eller Streptomyces virginiae NRRL 15156 i et egnet medium, isolering, rensing og separering i dets komponenter av antibiotikum A 41030, et antibiotisk kompleks av minst syv faktorer, antibiotikum A 41030 faktor B, inkludert.

Alle de ovenfor navngitte forbindelser, dvs. teicoplanin, teicoplanin A2-kompleks, teicoplanin A2 komponent 1, teicoplanin A2 komponent 2, teicoplanin A2 komponent 3, teicoplanin A2 komponent 4, teicoplanin A2 komponent 5, antibiotikum L 17054, antibiotikum L 17046, antibiotikum L 17392 og en hvilken som helst blanding derav i et hvilket som helst mengdeforhold, er egnede utgangsmaterialer for fremstilling av amid-derivatene av formel I.

I foreliggende sammenheng anvendes "teicoplaninforbindelse" eller "teicoplanin-utgangsmateriale" for å indikere en av de ovenfor angitte utgangsmaterialer, dvs. teicoplanin som oppnådd ifølge US patent 4.239.751, en hvilken som helst ytterligere rensing derav, teicoplanin Å2-kompleks, en forbindelse med den ovenfor angitte formel I hvori R er hydrogen, Y er hydroksy, A representerer hydrogen -N[(C^o~ Cu)alifatisk acyl]-p<->D-2-deoksy-2-amino-glucopyranosyl, B representerer hydrogen eller N-acetyl-g<->D-2-deoksy-2-amino-glucopyranosyl, M representerer hydrogen eller a-D-manno-pyranosyl, forutsatt at B kan være hydrogen bare når A og M samtidig er hydrogen, og M kan representere hydrogen bare når A er hydrogen, et salt derav, eller en blanding derav i et hvilket som helst mengdeforhold.

Den her benyttede betegnelse "alkyl" innbefatter, enten alene eller i kombinasjon med andre substituenter, både rette og forgrenede hydrokarbongrupper; mer spesielt representerer "(Ci-Cfc)alkyl" en rett eller forgrenet alifatisk hydrokarbonkjede med 1-6 karbonatomer slik som metyl, etyl, propyl, 1-metyletyl, butyl, 1-metylpropyl, 1,1-dimetyletyl, pentyl, 1-metylbutyl, 2-metylbutyl, 1-heksanyl, 2-heksanyl, 3-heksanyl, 3,3-dimetyl-l-butanyl, 4-metyl-l-pentanyl og 3-metyl-l-pentanyl; likeledes representerer "(C1-C4)alkyl" en rett eller forgrenet hydrokarbonkjede med 1-4 karbonatomer slik som alkylgruppene med 1-4 karbonatomer eksemplifisert ovenfor. Betegnelsen "halogen" representerer et halogenatom valgt fra fluor, klor, brom eller jod.

Pentosamino-delene i pentosaminokarbonyl-substituenten er 2-eller 3-amino (2- eller 3-deoksy) enten D- eller L- eller D,L-pentosegruppe i enten anomer form eller i en anomer blanding slik som 2- eller 3-amino(2- eller 3-deoksy)-ribose, 2- eller 3-amino(2- eller 3-deoksy)arabinose, 2-eller 3-amino(2- eller 3-deoksy)xylose og 2- eller 3-amino(2-eller 3-deoksy)lyksose.

Heksosamino-delene i heksosaminokarbonyl-substituenten er enten D eller L, eller D,L 2- eller 3-amino (2- eller 3-deoksy)heksosegruppe 1 enten anomer form eller i en anomer blanding slik som 2- eller 3-amino(2- eller 3-deoksy)allose, 2- eller 3-amino(2- eller 3-deoksy)altrose, 2- eller 3-amino(2- eller 3-deoksy)glukose, 2- eller 3-amino(2- eller 3-deoksy)mannose, 2- eller 3-amino(2- eller 3-deoksy)gulose, 2-eller 3-amino(2- eller 3-deoksy)galaktose og 3- eller 4-amino(2- eller 3-deoksy)fruktofuranose.

Definisjonen "lineære alkylenkjeder med 1-8 karbonatomer" er rette alkylenkjeder med 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 eller 8 karbonatomer. Representative eksempler på lineære alkylenkjeder med 1-6 karbonatomer er:

Disse lineære alkylenkjedene kan eventuelt ha substituenter som beskrevet ovenfor.

Det heri benyttede uttrykk "en nitrogenholdig 5-6-leddet heterocyklisk ring" innbefatter ringsystemer slik som pyrrolidinyl, piperidinyl, piperazinyl, pyrazolidinyl, pyrrolinyl og imidazolidinyl.

Definisjonen "nitrogenholdig 5-6-leddet heterocykliske ring" omfatter også de heterocykliske ringer som har to ring-elementer brodannet med en C2-alkylenkjede. Eksempler på nevnte brodannede ringer er følgende: l-azabicyklo[2,2,2]oktan, 1,4-diazabicyklo[3,2,0]nonan, l-azabicyklo[2,2,l]heptan, l-azabicyklo[3,2,1]oktan, 8-azabicyklo[3,2,1]oktan, 3-azabicyklo[3,2,1]oktan, 1- azabicyklo[3,3,l]nonan, 9-azabicyklo[3,3,l]nonan, 3,8-diazabicyklo[3,2,1]oktan, 2-azabicyklo[2,2,l]heptan, 2- azabicyklo[2,2,2]oktan, 3-azabicyklo[3,2,2]nonan. Representative forbindelser med formel I innbefatter følgelig de av den ovenfor angitte generelle formel hvor symbolet representerer en substituent avledet fra en av følgende grupper: l-azabicyklo[2,2,2]oktan-3-amin, l-azabicyklo[2,2,2]oktan-2-amin, l-azabicyklo[2,2,2]oktan-3-amin, 6-metyl l-azabicyklo[2,2,2]oktan-3-amin, N-metyl l-azabicyklo[2,2,2]oktan-3-etanamin, l-azabicyklo[2,2,2]oktan-4-amin, l-azabicyklo[2,2,2]oktan-4-amin, N-metyl l-azabicyklo[2,2,2]oktan-2-metanamin, l-azabicyklo[2,2,l]heptan-3-amin, l-azabicyklo[3,2,l]oktan-3-metanamin, 8-azabicyklo[3,2,l]oktan-3-amin, 8-metyl 8-azabicyklo[3,2,l]oktan-3-amin, 8-etyl 8- azabicyklo[3,2,l]oktan-2-metanamin, 3-azabicyklo[3,2,1]oktan-3-etanamin, l-azabicyklo[3,3,l]nonan-4-amin,

1- azabicyklo[3,3,l]nonan-3-metanamin,

9- azabicyklo[3,3,l]nonan-3-amin, 9-metyl

2- azabicyklo[2,2,l]heptan-5-amin, 2-metyl

2-azabicyklo[2,2,2]oktan-5-amin, 2-metyl.

En foretrukken gruppe forbindelser er de forbindelser med formel I hvor R<1> representerer hydrogen og de andre substi-tuentene har de ovenfor angitte betydninger.

En ytterligere foretrukken gruppe forbindelser med formel I innbefatter de forbindelser hvor R<1> representerer hydrogen og R<**> representerer en gruppe -alk-W hvor "alk" er en lineær alkylenkjede med 2-8 karbonatomer, W representerer pyrroli-dino hvor N-atomet kan være ( C^- C^)alkylsubstituert, morfolino eller piperidino, eller W representerer en gruppe med formelen

hvor R<3> og R<4> hver uavhengig representerer hydrogen, en (cl~c6 )alkylgruppe og A, B og M har de ovenfor angitte betydninger, samt syreaddisjonssalter derav. Foretrukne forbindelser med formel I er også representert ved de forbindelser hvor R<1>, A, B og M representerer hydrogenatomer og R<2> representerer en gruppe

hvor "alk" er en lineær alkylenkjede med 2-6 karbonatomer og R<3> og R<4> representerer (C^-C^, )alkylgrupper, samt farmasøytisk akseptable addisjonssalter derav.

En annen gruppe foretrukne forbindelser med formel I er representert ved de forbindelser hvori A, B og M enten representerer sukkerdelene som definert ovenfor eller hver samtidig representerer et hydrogenatom.

Andre mest foretrukne forbindelser er de med formel I hvor A, B og M enten samtidig representerer sukkerdelene som definert ovenfor eller samtidig representerer hydrogenatomer, og NR1!?2 representerer en gruppe -HN(alk)W hvor "alk" representerer en lineær alkylenkjede med 2, 3, 4, 5, 6, 7 eller 8 enheter og W representerer en gruppe valgt fra: -NH2, -NHCH3, -NHC2H5,

-N(CH3)2, -N(C2H5)2 og -N(CH3)(C2H5), eller en gruppe -HNCH(COOCH3)(CH2)4NH2 eller Representative eksempler på forbindelsene med formel I innbefatter de forbindelser hvor A, B og M har de ovenfor angitte betydninger, og

representerer: -NH2, -NHC4H9, -NH(CH2)4~<0>H, -NHCH2C00H, -NHCH2COOCH2<C>5H5, -NHCH2COOC2H5, -NH-CH2C0NH2,

-NH-CH2-C0N(C2H5)2, hvor m representerer hele tall, 1,2, 3 eller 4, -NH-(CH2)n-NH2, -NH-(CH2)n<N>HCH3, -NH(CH2)n-N(CH3)2, -NH-(CH2)nN(C2H5), -HN(CH2)nN(CH3)(C2H5)

hvor n representerer 2, 3, 4, 5, 6, 7 eller 8

-N(CH3)2, N(CH2CH2OH)2, -N(CH2CH2NH2)2, <->N(CH2CH2NHCH3)2, -N[CH2CH2N(CH3)2]2, -N(CH3)(CH2CH2NH2 ), -N(CH3)[(CH2)NHCH3], -N(CH3)[(CH2)2N(CH3 )2], -N(C2H5)[(CH2)2-NHCH3], -N[CH2CH2CH2N(C2H5)2]2,

Forbindelsene med formel I kan danne salter ifølge konvensjonelle metoder. Spesielt vil forbindelsene med formel I hvor gruppen -NR1!?2 inneholder ytterligere aminfunksjoner danne syreaddisjonssalter.

I tillegg kan de forbindelser med formel I som inneholder syrefunksjoner i -NR<1>R<2>-delen også danne baseaddisjonssalter.

Generelt kan forbindelsene med formel I som inneholder sure og basiske funksjoner, danne indre salter. For oppfinnelsens omfang omfattes "indre salter" av definisjonen for "ikke-salt"-formen. Foretrukne addisjonssalter av forbindelsene med formel I er de farmasøytisk akseptable syre- og/eller baseaddisjonssaltene.

Med betegnelsen "farmasøytisk akseptable syre- og/eller baseaddisjonssalter" menes de salter med syrer og/eller baser som fra et biologisk fremstillings- og formuleringsstandpunkt er forenelige med farmasøytisk praksis samt med anvendelsen i animalsk vekstforøkelse.

Representative og egnede syreaddisjonssalter av forbindelsene med formel I innbefatter saltene dannet ved standard reaksjon med både organiske og uorganiske syrer slik som f.eks. saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre, eddiksyre, trifluoreddiksyre, trikloreddiksyre, ravsyre, sitronsyre, askorbinsyre, melkesyre, maleinsyre, fumarsyre, palmitinsyre, kolinsyre, pamoinsyre, slimsyre, glutaminsyre, kamfersyre, glutarsyre, glykolsyre, ftalsyre, vinsyre, laurinsyre, stearinsyre, salicylsyre, metansulfonsyre, benzensulfonsyre, sorbinsyre, pikrinsyre, benzosyre, kanelsyre og lignende syrer.

Representative eksempler nevnte baser er: alkalimetall- eller jordalkalimetallhydroksyd slik som natrium-, kalium- og kalsiumhydroksyd;_ ammoniakk og organiske alifatiske, alicykliske eller aromatiske aminer slik som metylamin, dimetyl-amin, trimetylamin og pikolin.

Når forbindelsene med formel I inneholder en ( C^- C^)alkyl-pyridiniodel eller en -<+>NR<5>R<7>R8-del hvor R<6>, R7 og R<8> har de ovenfor angitte betydninger, er det respektive anion et anion avledet fra en farmasøytisk akseptabel syre. Representative eksempler på nevnte anion er de som skriver seg fra de ovenfor angitte syrer.

Omdannelsen av de frie aminoforbindelsene eller ikke-salt-forbindelsene med formel I til de tilsvarende syreaddisjonssalter, og motsatt, dvs. omdannelsen av et addisjonssalt av en forbindelse med formel I til ikke-saltformen eller den frie aminform, er kjent for en fagmann på området og omfattes av oppfinnelsen.

En forbindelse med formel I kan f.eks. omdannes til den tilsvarende syre- eller baseaddisjonssalt ved oppløsning av ikke-saltformen i et vandig oppløsningsmiddel og tilsetning av et lite molart overskudd av den valgte syren eller basen. Den resulterende oppløsning eller suspensjon lyofiliseres deretter for å utvinne det ønskede saltet. Istedenfor å lyofilisere er det i noen tilfeller mulig å utvinne sluttsaltet ved ekstraksjon med et organisk oppløsningsmiddel, konsentrasjon til et lite volum av den separerte organiske fasen og utfelling ved tilsetning av et ikke-oppløsnings-mlddel.

I tilfellet sluttsaltet er uoppløselig i et organisk oppløs-ningsmiddel hvor ikke-saltformen er oppløselig, utvinnes det ved filtrering fra den organiske oppløsning av ikke-saltformen etter tilsetning av den støkiometriske mengde eller et lite molart overskudd av den valgte syre eller base.

Ikke-saltformen kan fremstilles fra et tilsvarende syre-eller basesalt oppløst i et vandig oppløsningsmiddel som deretter nøytraliseres til den frie ikke-saltformen. Dette utvinnes deretter f.eks. ved ekstraksjon med et organisk oppløsningsmiddel eller omdannes til et annet base- eller syreaddisjonssalt ved tilsetning av den valgte syre eller base og opparbeiding som angitt ovenfor.

Når det etter nøytralisering er nødvendig med avsalting, kan en vanlig avsaltingsmetode benyttes. F.eks. kan kolonnekromatografi på polydekstranharpikser med regulert porestørrelse (slik som "Sephadex L H 20") eller silanert silisiumdioksydgel hensiktsmessig benyttes. Etter eluering av de uønskede saltene med en vandig oppløsning blir det ønskede produktet eluert ved hjelp av lineær gradient eller trinn-gradient av en blanding av vann og et polart eller apolart organisk oppløsningsmiddel, slik som acetonitril/vann fra 50:50 til 100# acetonitril.

Som kjent på området kan saltdannelsen enten med farmasøytisk akseptable syrer (baser) eller ikke-farmasøytisk akseptable syrer (baser) anvendes som en hensiktsmessig rensingsteknikk. Etter dannelse og isolering kan saltformen av en forbindelse med formel I omdannes til det tilsvarende ikke-salt eller til et farmasøytisk akseptabelt salt.

I noen tilfeller er syreaddisjonssaltet av en forbindelse med formel I mer oppløselig i vann og hydrofile oppløsningsmidler og har en forøket kjemisk stabilitet.

I betraktning av likheten i egenskapene til forbindelsene med formel I og deres salter, så gjelder imidlertid det som er sagt i foreliggende sammenheng i forbindelse med de biolo-giske aktivitetene til forbindelsene med formel I også deres farmasøytisk akseptable salter og vice versa.

Forbindelsene med formel I er nyttige som semi-syntetiske antibakterielle midler hovedsakelig aktive mot gram-positive bakterier, men også aktive mot gram-negative bakterier.

De terapeutisk aktive forbindelsene med formel I som definert

ovenfor fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse ved at man omsetter et teicoplanin-utgangsmateriale med formelen:

hvor R er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for amid-funksjonen; Y er hydroksy; A representerer hydrogen eller -N[(Cio-Cll)-alifatisk acyl]-e-D-2-deoksy-2-amino-gluco-pyranosyl; B representerer hydrogen eller N-acetyl-ø-D-2-deoksy-2-amino-glucopyranosyl, M representerer hydrogen eller a-D-manno-pyranosyl, forutsatt at B kan representere hydrogen bare når A og M samtidig er hydrogen, og M kan representere hydrogen bare når A er hydrogen; et salt derav eller en blanding derav i et hvilket som helst mengdeforhold;

med et molart overskudd av et amin med formelen HNR^R<2>, hvor R<1> og R<2> har de ovenfor angitte betydninger og hvor de reaktive funksjonene, andre enn aminofunksjonen som skal omsettes med karboksyldelen i teicoplanin-utgangsmaterialet, er beskyttet i et inert organisk oppløsningsmiddel og i nærvær av et lite molart overskudd av et kondensasjonsmiddel valgt fra (C1-C4 )alkyl-, fenyl- eller heterocykliske fosforazidater slik som difenylfosforazidat (DPPA), dietylfosforazidat, di(4-nitrofenyl)fosforazidat, dimorfolylfosforazidat og difenylfosforkloridat og fjerner de beskyttende grupper hvis slike er til stede.

En generell fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel I er representert ved omsetningen (amidering) av et egnet teicoplanin-utgangsmateriale (II) som definert ovenfor, med det valgte amin med formel HNR^-R<2> hvor R<1> og R<2 >har de ovenfor angitte betydninger, i et inert organisk oppløsningsmiddel i nærvær av et kondensasjonsmiddel. Når teicoplanin eller teicoplanin Å2-kompleks anvendes som utgangsmateriale, er det relative amid med formel I oppnådd ifølge amideringsreaksjonen ifølge foreliggende fremgangsmåte en blanding av fem amidderivater tilsvarende de fem hoved-komponentene i teicoplanin A2 som nevnt ovenfor. Nevnte blanding kan separeres i fem enkelte amidderivater Ifølge analoge kjente teknikker (se f.eks. publisert GB-patentsøknad 2.121.401). For klarhetens skyld, både selve blandingen som oppnådd fra amideringsreaksjonen og hver av de fem amid-derivatene skal danne en.del av foreliggende oppfinnelse slik den her er definert, idet betydningen av A representerer-N[(Cio~cll)alifatisk acyl]-e-D-2-deoksy-2-amino-gluco-pyranosyl. Omvendt, de enkelte rene amidderivatene av hver teicoplanin A2~komponent oppnås ved å følge foreliggende fremgangsmåte med utgangspunkt i selve den enkelte kompo-nenten istedenfor å starte med komplekset.

Ved utførelse av amideringen for fremstilling av forbindelsene med formel I, er det noen ganger, og spesielt når minst en av A, B og M i teicoplanin-utgangsmaterialet representerer hydrogen, hensiktsmessig å beskytte den primære aminofunksjonen i teicoplanin-utgangsmaterialet for å redusere mulige uønskede sidereaksjoner.

Når aminet HNR<*>R<2> inneholder ytterligere reaktive funksjoner slik som amino- eller karboksygrupper, som på ugunstig måte kan forstyrre amideringens forløp, blir de også beskyttet ved hjelp av i og for seg kjente metoder slik som de som er beskrevet i lærebøker slik som T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, New York, 1981, og M. Mc. Omie , "Protecting Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973. Disse beskyttelses-gruppene må være stabile ved betingelsene for reaksjons-prosessen, de må ikke på ugunstig måte forstyrre hoved-amideringsreaksjonen, og må lett kunne spaltes og fjernes fra reaksjonsmediet ved slutten av reaksjonen uten å endre den nylig dannede amidbinding.

Representative eksempler på N-beskyttelsesgrupper som med fordel kan benyttes i foreliggende fremgangsmåte for beskyttelse av en aminofunksjon både i teicoplanin-utgangsmaterialet og, når det er hensiktsmessig, i R<1-> og R<2->delen av aminet HNR^R<2>, er karbamat-dannende reagenser kjennetegnet ved følgende oksykarbonylgrupper: 1,1-dimetylpropynyloksy-karbonyl, t-butyloksykarbonyl, vinyloksykarbonyl, aryloksy-karbonyl, cinnamyloksykarbonyl, benzyloksykarbonyl, p-n i trobenzyloksykarbonyl-3 , 4-dimetoksy-6-nitrobenzyloksy-karbonyl, 2,4-diklorbenzyloksykarbonyl, 5-benzisoksazolyl-metyloksykarbonyl, 9-antanylmetyloksykarbonyl, difenyl-metyloksykarbonyl, isonikotlnyloksykarbonyl, difenylmetyl-oksykarbonyl, isonikotlnyloksykarbonyl, S-benzyloksykarbonyl og lignende.

Andre egnede N-beskyttende midler er aldehyder eller ketoner, eller derivater derav som kan danne Schiff-baser med aminogruppen i teicoplanin-kjernen som skal beskyttes.

Foretrukne eksempler på slike Schiff-base-dannende midler er benzaldehyder og særlig foretrukket er 2-hydroksybenzaldehyd (salicylaldehyd).

En hensiktsmessig metode for beskyttelse i det tilfellet aminreaktanten HNR^-R2 inneholder en primære aminofunksjon som substituent for R<1> og/eller R<2>, er 1 noen tilfeller dannelsen av et benzylidenderivat som kan fremstilles ved omsetning av aminet HNR<*>R<2> med benzaldehyd i en laverealkanol, slik som etanol, fortrinnsvis ved romtemperatur. Etter reaksjonen med det valgte teicoplanin-utgangsmaterialet har blitt fullført, kan benzyliden-beskyttelsesgruppen fjernes som kjent Innen teknikken, f.eks. ved behandling med fortynnet mineralsyre, fortrinnsvis saltsyre, ved romtemperatur.

Når sluttforbindelsen med formel I inneholder grupper som er labile under sure betingelser, f.eks. når A, B eller M representerer sukkerdeler eller -grupper som definert ovenfor som kan hydrolyseres i et surt medium, må åpenbart andre fjerningsbetingelser benyttes, slik som katalytisk hydrogenering ved bruk f.eks. av palladium på karbon som katalysator for å fjerne den riktige beskyttelsesgruppen. I dette tilfellet bør man imidlertid være oppmerksom på tilstede-værelsen av grupper som kan modifiseres ved katalytisk hydrogenering. En typisk konsekvens av den katalytiske hydrogenering av et derivat med formel I, hvori A representerer en gruppe som definert ovenfor hvis acyldel er Z-decenoyl (dvs. et teicoplanin A2 komponent 1 derivat eller en blanding inneholdende dette), er at det i det minste delvis omdannes til det tilsvarende decanoylderivat (dvs. et derivat av teicoplanin A2 komponent 3).

En fagmann på området kan, også på grunnlag av det som heri angis, avgjøre hvilke funksjoner i aminet HNE^-R2 som må beskyttes, hvordan de må beskyttes og den riktige beskyttelsesfjernende reaksjon som er nødvendig for å frigjøre sluttforbindelsen. En egnet beskyttelse for reaktiv karboksylsyrefunksjon er f.eks. dannelse av en esterfunksjon. Som det vil forstås av en fagmann på området avhenger det endelige valg av den spesifikke beskyttelsesgruppe av egenskapene til det spesielle amidderivat som er ønsket. Denne amidfunksjon i sluttforbindelsen bør faktisk være stabil ved betingelsene for fjerning av beskyttelsesgruppen^) .

Siden betingelsene for fjerning av de forskjellige beskyt-telsesgruppene er kjente, kan en fagmann på området velge den riktige beskyttelsesgruppen. F.eks., når sluttforbindelsen også har en benzylesterfunksjon eller N-benzylfunksjon, bør de beskyttelsesgrupper som vanligvis kan fjernes ved katalytisk hydrogenering, slik som benzyloksykarbonylgruppen, unngås, mens de beskyttelsesgrupper som kan fjernes under sure betingelser, slik som t.butoksykarbonyl, hensiktsmessig kan benyttes. Derimot kan katalytisk hydrogenering hensiktsmessig anvendes i et tilfelle lik det ovenfor når det er ønskelig å omdanne en forbindelse med formel I inneholdende nevnte N-benzyl- eller benzylesterfunksjon I -NR<1>R<2>-delen til den tilsvarende forbindelse hvori nevnte N-benzyl- eller benzylesterfunksjon er erstattet med et hydrogenatom.

Inerte organiske oppløsningsmidler som er nyttige for kondensasjonsreaksjonen er de organiske aprotiske opp-løsningsmidler som ikke på ugunstig måte forstyrrer reak-sjonsforløpet og som i det minste delvis kan oppløseliggjøre teicoplanin-utgangsmaterialet. Eksempler på nevnte Inerte organiske oppløsningsmidler er organiske amider, alkyletere, etere av glykoler og polyoler, fosforamider, sulfoksyder og aromatiske forbindelser. Foretrukne eksempler på inerte organiske oppløsningsmidler er: dimetylformamid, dimetoksy-etan, heksametylfosforamid, dimetylsulfoksyd, benzen, toluen og blandinger derav.

Kondensasjonsmidlet i foreliggende fremgangsmåte er et som er egnet for dannelse av amidbindinger i organiske forbindelser og spesielt i peptidsyntese. Representative og foretrukne eksempler på kondensasjonsmidler er (C1-C4 )alkyl-, fenyl-eller heterocykliske fosforazidater slik som difenylfosforazidat (DPPA), dietylfosforazidat, di(4-nitrofenyl)fosfor-azidat, dimorfolylfosforazidat og difenylfosforkloridat. Det foretrukne kondensasjonsmidlet er difenylfosforazidat (DPPA).

I foreliggende fremgangsmåte blir aminreaktanten HNR^R<2 >normalt benyttet i et molar overskudd. Generelt anvendes et fra 2- til 6-gangers molart overskudd mens et fra 3- til 4-gangers molart overskudd er foretrukket.

For at amideringen skal forløpe er det nødvendig at aminet HNr<I>r<2> kan danne et salt med karboksyfunksjonen i teicoplanin-utgangsmaterialet. I det tilfellet HNR<1>R<2> ikke er sterkt nok til å danne et salt i det valgte reaksjonsmediet, er det nødvendig å tilsette en saltdannende base til reaksjon sb land i ngen i det minste i en ekvimolekylær mengde med teicoplanin-utgangsmaterialet.

Eksempler på nevnte saltdannende baser er tertiære organiske alifatiske eller alicykliske aminer slik som trimetylamin, trietylamin, N-metylpyrrolidin eller heterocykliske baser slik som pikolin og lignende.

Kondensasjonsmidlet anvendes generelt i et lite molart overskudd slik som fra 1,2 til 1,7 og er fortrinnsvis 1,5 ganger teicoplanin-utgangsforbindelsen. I tillegg kan aminreaktanten ENR^-R2 også hensiktsmessig innføres i reaksjonsmediet som et tilsvarende syreaddisjonssalt, f.eks. hydrokloridet. I dette tilfellet anvendes minst en dobbel molar mengde og fortrinnsvis et 2-4 gangers molart overskudd av en sterk base som kan frigjøre HNR<1>R<2->aminet fra dets salter. Også i dette tilfellet er den egnede basen et tertiært organisk alifatisk eller alicyklisk amin slik som de som er eksemplifisert ovenfor. Bruken av salt av aminet HNr<I>r<2>, som deretter frigjøres in situ med de ovennevnte baser, er faktisk, i hvert fall i noen tilfeller, meget foretrukket spesielt når saltet er mer stabilt enn det tilsvarende frie amin.

Reaksjonstemperaturen vil variere betydelig avhengig av de spesifikke utgangsmaterialene og reaksjonsbetingelsene. Det er generelt foretrukket å utføre reaksjonen ved temperaturer mellom 0 og 20°C. Reaksjonstiden varierer også betydelig avhengig av andre reaksjonsparametre. Kondensasjonsreaksjonen fullføres vanligvis i løpet av 24-48 timer.

I alle tilfeller blir reaksjonsforløpet overvåket ved TLC eller fortrinnsvis ved hjelp av HPLC ifølge i og for seg kjente metoder. På basis av resultatene av disse analyser vil en fagmann på området være i stand til å bedømme reaksjons-f or løpet og avgjøre når reaksjonen skal stoppes og når man skal starte opparbeidelse av reaksjonsmassen ifølge i og for seg kjente teknikker som f.eks. innbefatter ekstraksjon med oppløsningsmiddel, utfelling ved tilsetning av ikke-opp-løsningsmidler osv., i forbindelse med ytterligere sepa-reringer og rensinger ved kolonnekromatografi.

Når beskyttelse av HNR^R<2->reaktanten eller teicoplanin-utgangsmaterialet, eller begge disse forbindelser, er nødvendig, blir som allerede nevnt beskyttelsen fjernet fra den beskyttede sluttforbindelsen ifølge i og for seg kjente metoder og disse avhenger hovedsakelig av den beskyttelsesgruppen som er involvert. I det tilfellet både aminet HNR^-R2 og teicoplanin-utgangsmaterialet er beskyttet, kan det være hensiktsmessig å benytte en lik type beskyttelse som kan fjernes under de samme betingelsene slik at bare et trinn med beskyttelsesfjerning er nødvendig for å frigjøre begge funksjoner.

Det er også åpenbart at en forbindelse med formel I i mange tilfeller kan fremstilles på mer enn en måte og at en forbindelse med formel I kan omdannes til en annen ved hjelp av i og for seg kjente reaksjoner. Når f.eks. HNR^-R2-aminet er en diaminforbindelse slik som HN(R<l>)-alk-NR<3>R<4> som definert ovenfor, kan den ønskede aminforbindelsen med formel I fremstilles enten direkte ved kondensasjon av nevnte amin, hensiktsmessig beskyttet om nødvendig, med det valgte utgangsmaterialet eller det kan fremstilles ved omsetning av et amid med formel I hvori substituenten R<2> er alk-halogen, hvor halogen fortrinnsvis er et klor- eller bromatom, med et amin med formel HNR<3>R<4>. Dessuten kan en amidforbindelse med formel I som inneholder en karboksyfunksjon på -NR^-R^-delen, omdannes til det tilsvarende amid eller substituert amidderivat ved hjelp av vanlige teknikker.

Nevnte karboksyfunksjon kan dessuten også omdannes til den tilsvarende ester av acylhalogenidfunksjon ved hjelp av vanlige teknikker. Mer spesielt blir en esterfunksjon generelt dannet ved omsetning av det karboksyholdige produkt med et preparat av en alkohol i nærvær av en syrekatalysator ved en temperatur varierende mellom romtemperatur og kokepunktet for reaksjonsblandingen. Syren er fortrinnsvis en mineralsyre og alkoholen inneholder den delen som skal bindes til den karboksyliske funksjon i esterderivatet. Et inert oppløsningsmiddel kan også benyttes. En forbindelse med formel I som inneholder en karboksylisk esterfunksjon på-NR<1>R<2->substituenten kan åpenbart omdannes til den tilsvarende karboksylforbindelse ved hydrolyse.

En foretrukket hydrolyseteknikk innebærer en vandig opp-løsning av et alkalimetallkarbonat slik som natrium- eller kaliumkarbonat, ved en temperatur fra romtemperatur til kokepunktet for reaksjonsblandingen. En forbindelse med formel I som inneholder en -NH2~funksjon på -NR<1>R<2>-delen kan omdannes til det tilsvarende monoalkylaminoderivat ved hjelp av en "reduktiv alkylering" som innebærer omsetning av forbindelsen med det valgte karbonylderivat (som kan gi den ønskede alkylsubstituent ved reduksjon) for dannelse av det tilsvarende Schiff-base-mellomprodukt som deretter reduseres i nærvær av et egnet reduksjonsmiddel slik som natrium- eller kaliumborhydrid.

Når en fri aminogruppe er til stede i -NR<1>R<2>-delen i formel I, kan den alkyleres som kjent innen teknikken, f.eks. ved at den omsettes, eller eventuelt at den tilsvarende forbindelse hvori den primære aminogruppen i teicoplanin-delen har blitt beskyttet med alkylhalogenid (bromid, klorid eller jodid). Likeledes kan en sekundær aminofunksjon omdannes til en tertiær funksjon eller en tertiær aminofunksjon kan kvaterni-seres.

I følgende tabell (tabell I) er strukturformlene for representative eksempler av forbindelser med formel I angitt.

Følgende tabell (Tabell II) angir fremgangsmåtene for fremstilling, utgangsmateriale og reaksjonsutbytter av representative eksempler av forbindelser med formel I:

HPLC- analyse

Følgende tabell angir R^-verdien til representative eksempler av forbindelsene med formel I. Analysene ble foretatt med en Varian modell 5000 LC-pumpe utstyrt med en 20 pl løkke-injektor. Rheodyne-modell 7125 og en Perkin-Elmer LC 15 UV-detektor ved 254 pm.

Kolonner: pre-kolonne (1,9 cm) Hibar LiChro Cart 25-4 Merck forhåndspakket med LiChrosorb RP-8 (20-30 pm) fulgt av en kolonne Hibar RT 250-4 Merck forhåndspakket med LiChrosorb RP-8 (10 pm).

Eluerlngsmidler: A, 0, 2% vandig HC00NH4 og B, CH3CN

In. 1eks. 1on: 20 pl - Strømningshastighet: 2 ml/min.

Reaksjonen overvåkes ved å injisere, ved faste tidspunkter, prøver av oppløsningene (eller suspensjoner) fortynnet med oppløsningsmiddelblandingen (CH3CN : H2O, 6:4 (v/v)) nok til å oppnå sluttkonsentrasjoner på enten 1, 2 eller 3 mg/ml.

Metode A: Lineær trinngradient fra 5 til 75$ av B i A i 35 min. ifølge nedenstående program:

Metode B: Lineær gradient fra 5 til 6056 av B i A i 30 min.

Metode C: Lineær gradient fra 20 til b0% av B i A i 30 min.

Metode D: Egnede kromatografiske betingelser for å sammen-ligne alle teicoplanin-amidene med deglucoteicoplanin.

HPLC automatisk apparat: Hewlett-Packard modell 1084

Kolonne: Hibar (Merck) LiChrosorb RP-8 (7 pm) Strømningshastighet: 1,5 ml/min.

Elueringsmidler: A, 0,02 M vandig NaH2P04/CH3CN

25/75 (v/v)

B, 0,02 M vandig NaH2P04/CH3CN

95/5 (v/v)

Eluering: lineær trinngradient fra 8 til 6056 av B i A i 48 min., ifølge nedenstående program:

TABELL III

a) HPLC-analyse av amider av teicoplanin A2 (formel I hvori A er N[(<C>i<g>~<c>ll)alifatisk acyl]-p<->D-2-deoksy-2-amino-glucopyranosyl, B er N-acetyl-P-D-2-deoksy-2-amino-glucopyranosyl, M er oc-D-mannopyranosyl)

(metode A)

62

b) HPLC-analyse av amider av antibiotikum L 17054 (formel I hvori A representerer hydrogen, B er N-acetyl-g-D-2-deoksy-2-aminoglucopyranosyl, M er a-D-mannopyranosyl) (Metode B)

c) HPLC-analyse av amider av antibiotikum L 17046 (formel I hvori A og M representerer hydrogen, B representerer N—acetyl-p<->D-2-deoksy-aminoglucopyranosyl) (Metode B) d) HPLC-analyse av amider av deglucoteicoplanin (formel I hvori A, B og M representerer hydrogenatomer) (Metode C) e) HPLC-analyse ifølge metode D (K' = tjj/tjj for deglucoteicoplanin)

K'-verdiene for de komplekse derivatene refererer til komponent 2.

Følgende tabell (Tabell IV) angir syre-base-titreringsdata for noen representative forbindelse i oppfinnelsen. Analysene ble utført i Methylcellosolve <R>/H20, 4:1 (v/v). En prøve (10 pmol i ca. 20 ml) deretter 0,01N HC1 (2 ml), tilsettes og blandingen titreres med 0.01N KOH i den samme oppløsnings-middelblandingen.

Tabell VII angir % NMR-data oppnådd ved 250 MHz med et Bruker AM-250 spektrometer 1 DMSO-d^, ved 20° C, ved en prøvekonsentrasjon på 20 mg/ml (indre standard: TMS, = 0,00 ppm).

Isoelektrlskpunkt ( pl)

Den isolelektrofokuserende (IEF) teknikk koblet med bioautografi-detektering har blitt benyttet for bestemmelse av pl-verdien til representative forbindelser med formel I ved bruk av følgende materialer: Ampholine-bærer amfolytter ( 40% vekt/vol) ble innkjøpt fra LKB Produketer AB, Bromma, Sverige. Akrylamid, N,N'-metylen-bisakrylamid (BIS), N,N,N',N'-tetrametyletylendiamin (TEMED) og ammoniumpersulfat var fra Bio Rad Laboratorie, Richmond, California, USA. Glyserol og antibiotisk agar N. 1 (Grove and Randall medium N. 1) var fra E. Merck Darmstadt FRG. Gel Fix-polyesterark ble innkjøpt fra Serva Feinbiochemica, Heidelberg. Fenolindo (2,6-diklorfenol) kom fra BDH Chemicals Ltd., Poole, England.

Isoelektrlsk fokusering

IEF ble foretatt på gelplate ved bruk av en LKB Multiphor 2117 celle og en Bio-Rad Power Supply Model 1420A. Plater av dimensjon 24,5 x 11,5 cm og 1 mm tykkelse ble preparert på et ark av Gel Fix.

Polyakrylamidgeler med en konsentrasjon på 8% T og med en kryssbinding på 4% C ( 30% T forrådoppløsning ble fremstilt ved oppløsning av 28,8 g akrylamid og 1,2 g bis-akrylamid i 100 ml destillert vann), glyserol, 3, 5% v/v, 2% Ampholine, 0, 05% ammoniumpersulfat som katalysator og 0,05$ Temed som akselerator.

Bæreramfolyttsammensetningen for 35 ml geldannende oppløsning var som følger: 1) pH 3,5-10: 1,6 ml Ampholine 3,3-10, 0,05 ml Ampholine 4-6, 0,05 ml Ampholine 7,9 og 0,05 ml Ampholine 8-9,5. 2) pH 2,5-6: 0,4 ml Ampholine 2,5-4; 1,1 ml Ampholine 4-6, 0,2 ml Ampholine 3-10.

3) pH 7-10; 0,5 Ampholine 7-9, 0,8 ml Ampholine 8-9,5, 0,4 ml Ampholine 9-11.

Elektrodeoppløsningene, som anbefalt av LKB for det respektive pH-område, var:

Forsøksbetingelser

Gelen ble avkjølt til 4°C ved hjelp av en LKB 2209 avkjølt, konstant temperatur-sirkulator. Etter prefokusering i 30 minutter ved 5 W, ble prøvene (20 pl inneholdende 0,2-2,5 pg antibiotikum) anbragt i spalten ved den katodiske siden. Elektrofokusering ble foretatt ved bruk av 10 W konstant effekt og ble fullført etter 3- 3Yt time med et sluttpotensial på 1400 V.

pl- bestemmelse

pH-verdiene ble bestemt ved å oppdele en del av gelen i 1 cm seksjoner og eluere de individuelle stykkene ved romtemperatur med 1 ml av 10 mM CK1 før pB-avlesninger.

Det isoelektriske punktet for hvert antibiotikum ble bestemt ved interpolasjon på en kurve oppnådd ved å plotte pH-verdier mot avstanden fra anoden. Resultatene oppnådd ved de to separate pE-områdene er gitt i nedenstående tabell VIII.

Mikrobiologisk utvikling

De antibiotiske stoffene ble påvist ved bioautografi. Polyakrylamidgel ble anbragt på et 3 mm lag av agarmedium N.

1 inokulert med 1% Bacillus subtills ATCC 6633 spore (0,5 OD ved 600 nm). Etter 10 min. ble gelen fjernet og platen ble inkubert natten over ved 37°C og undersøkt med henblikk på inhiberingssoner. Kontrasten mellom lyseringsarealet og det for bakteriell vekst ble forøket ved bruk av Phenolindo (2,6-diklorfenol) 1% vekt/vol (oksydasjon-reduksjonsindikator).

Den antibakterielle aktiviteten til forbindelsene med formel I kan demonstreres in vitro ved hjelp av standard agar-fortynningstester.

Isosennsitest-medium (Oxoid) og Todd-Hewitt-medium (Difco) benyttes for dyrking av henholdsvis stafylokokker og strepto-kokker. Mediumkulturer fortynnes slik at det endelige inokulum er ca. IO<4> kolonidannende enheter/ml (CFTJ/ml). Minimal inhiberende konsentrasjon (MIC) ansees som den laveste konsentrasjon som ikke viser noen synlig vekst etter 18-24 timers inkubasjon ved 37 °C. Resultatene for den antibakterielle testing av representative forbindelser med formel I er oppsummert i nedenstående tabell IX.

Tabell IXa nedenfor rapporterer MIC-data for et betydelig antall av forbindelsene som fremstilt ifølge oppfinnelsen på et klinisk isolat av S.haemolyticus sammenlignet med data for teicoplanin (dvs. de strukturelt "tilsvarende" kjente forbindelsene hvor gruppen Y i formel I representerer OH). Forsøkene har blitt utført vesentlig som beskrevet heri.

I tillegg har følgende forbindelser som faller inn under definisjonen for formel I hvor A, B og M er de deri definerte sukkergrupper, i de samme forsøkene vist forbedret MIC i forhold til teicoplanin:

Når det gjelder forbindelsene med formel I hvor A representerer hydrogen og B og M representerer de definerte sukker-ene, så viser de forbedret aktivitet p. S.epidermidis (se ovenfor med henblikk på den patologiske relevans til denne mikroorganismen) og S.pyogenes, som vanligvis forekommer i forbindelser med infeksjoner i luftveien og kan være ansvarlig for reumatoid feber og sykdommer. Også i dette tilfellet er resistenshyppigheten overfor vanlig benyttede bredspektrede antibiotika slik som penicilliner og cephalo-sporiner voksende.

Data for de eksemplifiserte forbindelsene er angitt i beskrivelsens tabell IX, mens data for referanseforbindelsen, dvs. "antibiotikum L 17054" er 0,25 for S.epidermidis ATCC 12228 og 0,5 for S.pyogenes C203. Data for de definerte forbindelsene viser seg konsekvent å være bedre. In vivo-data på et lite antall av slike forbindelser bekrefter denne forbedring.

En lignende type av forbedring finnes også for de forbindelser med formel I hvor gruppene A og M representerer hydrogen og B representerer de definerte sukkergruppene sammenlignet med den tilsvarende forbindelse hvor Y er OH, dvs. "antibiotikum L 17046". I tillegg til den forbedrede aktivitet på S.pyogenes og S.epidermidis så viser disse forbindelsene også forbedringer når det gjelder S.aureus og S.faecalis. Dataene for eksempler på de definerte forbindelsene er rapportert i beskrivelsens tabell IX, mens referanseforbindelsen (antibiotikum L 17046) viser følgende MIC i pg/ml under de samme forsøksbetingelsene:

Den totale signifikans med hensyn til forbedret aktivitet vil fremgår fra de ovenfor angitte og omtalte data.

EDsø-verdiene (mg/kg) for representative forbindelser med formel I funnet ved hjelp av in vivo-tester i mus eksperi-mentelt infisert med S. pyogenes L 49 ifølge metoden beskrevet av V. Arioli et al., Journal of Antibiotics .29, 511

(1976), er angitt i nedenstående tabell X:

I betraktning av den ovenfor angitte antimikrobielle aktivitet kan forbindelsene med formel I oppfinnelse effektivt benyttes som aktiv bestanddel i antimikrobielle preparater benyttet i human- og veterinærmedisinen for lindring og behandling av infeksjonssykdommer forårsaket av patogene bakterier som er mottagelige for nevnte aktive bestanddeler.

Ved slik behandling kan disse forbindelsene benyttes som sådan eller i form av blandinger i et hvilket som helst mengdeforhold. Forbindelsene med formel I kan administreres oralt, topisk eller parenteralt, idet parenteral administrasjon imidlertid er foretrukket. Avhengig av admini-strasjonsmåten kan disse forbindelsene formuleres til forskjellige doseringsformer. Preparater for oral administrasjon kan være i form av kapsler, tabletter, flytende oppløs-ninger eller suspensjoner. Som kjent innen teknikken kan kapslene og tablettene i tillegg til den aktive bestanddel innehalde konvensjonelle eksipienser slik som fortynnings-midler, f.eks. laktose, kalsiumfosfat, sorbitol og lignende, smøremidler f.eks. magneslumstearat, talk, polyetylenglykol, bindemidler, f.eks. polyvinylpyrrolidon, gelatin, sorbitol, tragakant, akasie, smaksstoffer og akseptable disinte-grerings- og fuktemidler. De flytende preparatene som generelt er i form av vandige eller oljeaktige oppløsninger eller suspensjoner, kan inneholde konvensjonelle additiver slik som suspenderingsmidler. For topisk bruk kan forbindelsene med formel I også fremstilles i egnede former for absorpsjon gjennom slimhinnen i nesen og svelget eller bronkialvevet og kan hensiktsmessig ha form av flytende spray eller inhaleringsmidler, pastiller eller svelg-penslingsmaterialer.

For medikering av øyne eller ører kan preparatet være i form av væske eller semi-væske. Topiske anvendelser kan formuleres i hydrofobe eller hydroflle basiser som salver, kremer, lotioner, pensl inger eller pulvere.

For rektal administrasjon administreres forbindelsene i form av suppositorier blandet med konvensjonelle bærere slik som f.eks. kokossmør, voks, spermacett eller polyetylenglykoler og deres derivater.

Preparater for injeksjon kan ha slike former som suspensjoner, oppløsninger eller emulsjoner i oljeholdige eller vandige bærere, og kan inneholde formuleringsmidler slik som suspenderings-, stabiliserings- og/eller dispergeringsmidler. Den aktive bestanddel kan alternativt være i pulverform for rekonstituering ved tidspunktet for avlevering med en egnet bærer, slik som sterilt vann.

Mengden av aktiv bestanddel som skal administreres avhenger av forskjellige faktorer slik som størrelsen på og tilstanden hos det individ som skal behandles, veien og hyppigheten av administrasjon, og det kausative middel som er involvert.

Forbindelsen med formel I er generelt effektiv ved en dosering mellom 0,5 og 30 mg aktiv bestanddel pr. kg legemsvekt, fortrinnsvis delt i 2-4 administrasjoner pr. dag. Særlig ønskede preparater er de fremstilt i form av dose-ringsenheter inneholdende fra 20-300 mg pr. enhet.

Representative eksempler på fremstilling av farmasøytiske preparater er som følger: En parenteral oppløsning fremstilles med 100 mg forbindelse nr. 3 oppløst i 2 ml sterilt vann for injeksjon. En parenteral oppløsning fremstilles med 250 mg av forbindelse nr. 19 hydroklorid oppløst i 3 ml sterilt vann for injeksjon.

En topisk salve fremstilles med 200 mg av forbindelse nr. 19.

3,6 g polyetylenglykol 4000 U.S.P.

6,2 g polyetylenglykol 400 U.S.P.

EKSEMPEL 1: (Fremgangsmåte : Omsetning av ubeskyttet teicoplanin-utgangsmateriale med det valgte amin og fremstilling av acetatsaltet til sluttforbindelsen)

Fremstilling av forbindelser nr. 1- 6. 26. 34. 35. 82. 87. 88 og 95

Til en omrørt oppløsning av 1 mmol teicoplanin Ag kompleks fremstilt som beskrevet i US 4.239.751 og 2 mmol av det valgte amin i 20 ml dimetylformamid (DMF), tilsettes en oppløsning av 1,1 mmol difenylfosforylazid (DPPA) i 5 ml DMF dråpevis i 10 minutter under avkjøling til 0-5'C. Reaksjonsblandingen omrøres i ca. 6 timer ved 5°C natten over ved romtemperatur, hvoretter en oppløsning av 0,5 mmol DPPA i 2,5 ml DMF tilsettes dråpevis ved 0-5°C. Omrøring fortsettes ved romtemperatur i ytterligere 24 timer, deretter tilsettes 125 ml etyleter og det faste stoffet som utskilles oppsamles, vaskes med 100 ml eter og gjenoppløses i 100 ml av en blanding av vann:acetonitril, 8:2 (v/v), justert ved pH 2,5 med IN HC1. Den resulterende oppløsning anbringes på en kromatografisk kolonne, preparert med 250 g silanert sili-slumdioksydgel (0,063-0,2 mm; Merck) pre-ekvilibrert med en blanding av vann:aceton!tril 8:2 (v/v). Kolonnen utvikles med en lineær gradienteluering fra 20% CH3CN i 0.001N HC1 til 80* CH3CN i 0.01N HC1 i 20 timer ved en hastighet på 250 ml/time.

Fraksjoner på 25 ml oppsamles og overvåkes ved HPLC. Fraksjoner inneholdende den rene tittelforbindelsen oppsamles og den resulterende oppløsning bringes til pH 8,5 med IN NaOH, og et likt volum (v/v) vann tilsettes deretter. Denne blanding ekstraheres deretter med butanol (v/v) og det organiske laget separeres, vaskes med vann og konsentreres under vakuum ved 40°C inntil mesteparten av vannet er fjernet. Den uklare butanoliske oppløsning filtreres, etylacetat (0,5 v/v, dvs. en halv volumdel oppløsningsmiddel pr. volumdel oppløsning) tilsettes og suspensjonen (eller uklar oppløsning) som dannes ekstraheres med vann (0,5 v/v). Det organiske laget konsentreres til et lite volum, etyleter tilsettes og det faste stoffet som utskilles oppsamles, vaskes med eter, tørkes deretter i vakuum ved 50°C natten over, hvilket gir tittelforbindelsen som den tilsvarende frie base som deretter oppløses i metanol (vanligvis 1 g i 50-100 ml). Iseddik (0,5 ml pr. g av den frie basen) tilsettes og den resulterende oppløsning omrøres i noen minutter ved romtemperatur. Ved tilsetning av etyleter (300-500 ml) utskilles et fast stoff som oppsamles, vaskes med eter (100 ml) og tørkes natten over ved romtemperatur, og dette gir tittelforbindelsene som det tilsvarende monoacetatsalt.

Fremstilling av forbindelser nr. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 28. 43.

44. 47

Den ovenfor angitte fremgangsmåte blir i det vesentlige fulgt ved å benytte antibiotikum L 17054 istedenfor for teicoplanin Ag.

Fremstilling av forbindelser nr. 14. 17. 50

Den ovenfor angitte fremgangsmåte blir i det vesentlige fulgt ved å benytte antibiotikum L 17046 istedenfor teicoplanin Ag.

EKSEMPEL 2: (Fremgangsmåte Ag: Omsetning av ubeskyttet teicoplanin-utgangsmateriale med det valgte amin og fremstilling av hydrokloridsaltet av sluttforbindelsen)

Fremstilling av forbindelser nr. 13. 18. 76. 77. 80. 81. 89 og 91

Reaksjonen mellom teicoplanin Ag kompleks og det valgte amin utføres som beskrevet i eksempel 1. Når først råproduktet av tittelforbindelsen er utfelt med etyleter og separert som et fast stoff, blir det suspendert i metanol (ca. 1 g stoff i 100 ml oppløsningsmiddel). Vann tilsettes (v/v) og den resulterende oppløsning (eller suspensjon) bringes til pH 2,5 med IN EC1. Deretter tilsettes silanert silisiumdioksydgel (0,063-0,2 mm, 5 g pr. g urent produkt - Merck) og n-butanol (200 ml). Den resulterende suspensjon omrøres i noen minutter ved romtemperatur hvoretter oppløsningsmidlene fullstendig fordampes og resten anbringes på toppen av en kromatografisk kolonne inneholdende den samme type silanert silisiumdioksydgel (100 g) likevektsinnstilt med blandingen vann:acetonitril, 95:5 (v/v). Kolonnen utvikles med lineære gradient-elueringer fra 5 til 40# (i tilfellet for forbindelse 13) eller 15-60* (i tilfellet for forbindelse 18) av CH3CN i 0.001N HC1, i 20 timer ved en hastighet på 100 ml/time. Fraksjoner på 10 ml oppsamles og analyseres ved hjelp av HPLC (metode b). Fraksjoner inneholdende tittelforbindelsen oppsamles og konsentreres under vakuum ved 45 °C og ved tilsetning av egnede mengder n-butanol oppnås en vannfri, butanolisk uklar sluttoppløsning (ca. 200 ml). Etter tilsetning IN HC1 (0,2 ml) konsentreres oppløsningen til et lite volum under vakuum ved romtemperatur (under 25"C). Utfelling med etyleter, vasking med eter og tørking i vakuum ved 40°C natten over, gir tittelforbindelsen (som det tilsvarende dihydroklorid).

EKSEMPEL 3: (Fremgangsmåte A3: Omsetning av et ubeskyttet teicoplanin-utgangsmateriale med et syreaddisjonssalt av det valgte amin i nærvær av en base)

Fremstilling av forbindelser nr. 16. 38. 75. 85. 92 og 105 En oppløsning av 0,6 ml (2,8 mmol) DPPA i 2 ml DMF tilsettes til en omrørt oppløsning av 2,8 g (2 mmol) antibiotikum L 17046 og 0,6 g (4,2 mmol) glycinetylester, hydroklorid, i 100 ml DMF ved 0-5° C. Etter tilsetning av 1,1 ml (8 mmol) trietylamin (TEA) omrøres reaksjonsblandingen i 2 timer ved 5°C natten over ved romtemperatur. Reaksjonsforløpet overvåkes ved HPLC (metode b). Den resulterende oppløsning helles i 500 ml etyleter og bunnfallet som dannes oppsamles og gjenoppløses i 500 ml av en blanding av vann:acetonitril, 7:3 (v/v), mens pH-verdien justeres til 2,3 med IN HC1. Etter tilsetning av 600 ml n-butanol og 200 ml vann, bringes blandingen til pH 8,2 med IN NaOH under kraftig omrøring. Det organiske laget separeres, vaskes med 400 ml (2 x 200 ml) vann, og konsentreres deretter til et lite volum (ca. 50 ml) ved 50°C under vakuum. Ved tilsetning av etyleter (200 ml) utskilles et fast stoff (tittelforbindelsen som den frie basen) som oppsamles og gjenoppløses i 200 ml metanolisk

0,02 M HC1. Ved tilsetning av etyleter (500 ml) utskilles et bunnfall som oppsamles, vaskes med eter og tørkes i vakuum ved 40°C natten over, og dette gir 1,62 g av forbindelse 16 (som det tilsvarende hydroklorid).

EKSEMPEL 4; (Fremgangsmåte A4: Omsetning av et ubeskyttet teicoplanin-utgangsmateriale med et HNR<1>R<2->amin som har en ytterligere aminogruppe og/eller ytterligere karboksylgrupper, som alle er beskyttet, og etterfølgende fjerning av beskyttelse ved katalytisk hydrogenering).

Fremstilling av forbindelser nr. 29. 36. 37. 39. 40. 46. 51.

64. 71. 84 og 90

Fremgangsmåten i den første delen av eksempel 1 (fremgangsmåte Ai) blir i alt vesentlig fulgt.

Når først kondensasjonsproduktet inneholdende enten beskyttet ytterligere amino- eller karboksyfunksjoner er oppnådd, blir beskyttelsen fjernet ved katalytisk hydrogenering ved bruk av palladium på karbon som beskrevet i den andre delen av eksempel 6 nedenfor, fremgangsmåte ).

EKSEMPEL 5: (Fremgangsmåte A5: Omsetning av et ubeskyttet teicoplanin-utgangsmateriale med et HNR<1>R<2->amin som har en ytterligere aminogruppe og/eller ytterligere karboksylgrupper som er beskyttet samt etterfølgende fjerning av beskyttelse i surt medium).

Fremstilling av forbindelser nr. 48 og 57

Fremgangsmåten i den første delen av eksempel 1 (fremgangsmåte Ai) blir i det vesentlige fulgt.

Det valgte amin er i dette tilfellet en aminforbindelse som inneholder ytterligere karboksylfunksjoner som er beskyttet med grupper som kan fjernes under vannfrie sure betingelser slik som glutaminsyre-di-butylester. Når først kondensasjonsproduktet som inneholder de beskyttede karboksyfunksjonene er oppnådd, blir beskyttelsen fjernet i et surt medium bestående av vannfri trifluoreddiksyre (som beskrevet i annen del av eksempel 7 nedenfor, fremgangsmåte Bg).

EKSEMPEL 6: (Fremgangsmåte Bj_: Omsetning av et N-beskyttet teicoplanin-utgangsmateriale og et valgt amin fulgt av fjerning av beskyttelse ved katalytisk hydrogenering).

Fremstilling av forbindelser nr. 9. 13. 22. 54. 55. 61 og 73

a) Fremstilling av det N-benzyloksykarbonyl-beskyttede utgangsmaterialet (NCBzO-ST)

En oppløsning av 0,45 ml benzylklorformiat i 10 ml tørr aceton tilsettes dråpevis under avkjøling ved 0-3°C, til en omrørt oppløsning av 2 mmol av det valgte teicoplanin-utgangsmaterialet og 0,5 g NaHC03 i 150 ml av en blanding av aceton:vann, 2:1 (v/v). Etter ca. 30 min. tilsettes 500 ml vann og den resulterende oppløsning ekstraheres med 500 ml etyleter. Det vandige laget justeres til ca. pH 3,5 med IN HC1 og ekstraheres deretter med 500 ml n-butanol. Det organiske laget separeres, vaskes med 400 ml vann (2 x 200 ml) og konsentreres deretter til et lite volum ved 45°C under vakuum. Ved tilsetning av etyleter utskilles et fast stoff som oppsamles, vaskes med eter og tørkes ved romtemperatur i vakuum natten over, og dette gir N-CBzO-derivatet av teicoplanin-utgangsmaterialet med en renhet (HPLC-titer > 90$, metode c) som er tilstrekkelig for det neste trinnet (utbytte

> 80%).

b) Fremstilling av N-CBzO-derivatet av teicoplanin-amid-forbindelsen

Kondensasjonen av ovennevnte N-benzoyloksykarbonyl-utgangsmaterialet med det valgte amin utføres i DMF (HPLC, metode c) i nærvær av DPPA under de samme reaksjonsbetingelsene som beskrevet i eksempel 1. N-CBzO-teicoplanin-amldforbindelsen oppnås som et fast stoff som utfelles fra reaksjonsblandingen ved tilsetning av etyleter.

c) Fremstilling av teicoplanin-amid-derivatet av tittelforbindelsen

Det ovenfor angitte oppnådde urene N-CBzO-teicoplanin-amid (1

g) oppløses i en blanding (100 ml) av metanol:0,IN saltsyre, 7:3 (v/v) og den resulterende oppløsning hydrogeneres ved

romtemperatur og -trykk i nærvær av 0,5 g 5* Pd/C. Reaksjonsblandingen filtreres og til de klare filtratene tilsettes en blanding av silanert silisiumdioksydgel (0,063-0,2 mm; 4 g Merck) og n-butanol (60 ml). Oppløsningsmidlene blir deretter fordampet under vakuum ved 45°C og resten anbringes på en kromatografisk kolonne inneholdende den samme type silanert silisiumdioksydgel (100 g) fremstilt i en blanding av vann:acetonitril, 95:5 (v/v).

Kolonnen utvikles med en lineær-gradienteluering fra 5*

(forbindelse 9), 10* (forbindelse 13) og 20* (forbindelse 22) CH3CN i 0,001N HC1 til 30*. 40* og 55*, respektivt, CH3CN i HgO i 15 timer i en hastighet på 120 ml/time. Fraksjoner på 12 ml hver oppsamles og analyseres ved HPLC. Fraksjoner inneholdende de rene forbindelsene av tittelforbindelsen oppsamles og til den resulterende oppløsning tilsettes n-butanol (v/v) og IN HC1 (2 ml). Etter konsentrasjon til et lite volum under vakuum ved 40°C oppnås tittelforbindelsene (som det tilsvarende dihydroklorld) ved utfelling med etyleter fra den butanoliske fasen, vasking og tørking natten over i vakuum ved 40°C.

EKSEMPEL 7: (Fremgangsmåte Bg: Omsetning av et N-beskyttet teicoplanin-utgangsmateriale med et valgt amin fulgt av fjerning av beskyttelse ved syrehydrolyse). Fremstilling av forbindelser nr. 11. 14. 18. 19. 20. 21. 23. 24. 25. 31. 52. 53. 78. 79. 83. 94. 97. 99. 100. 101 og 102

a) Fremstilling av det N-tert-butoksykarbonyl-beskyttede teicoplanin-utgangsmaterialet (N-t-BOC-ST)

En blanding av 4 mmol av det valgte teicoplanin-utgangsmaterialet, 2 ml (14,5 mmol) TEA og 2 g (~7 mmol) tert-butyl-2,4,5-triklorfenylkarbonat i 100 ml DMF omrøres i 24 timer ved romtemperatur. Ved tilsetning av eter (900 ml) utskilles et fast stoff som oppsamles og gjenoppløses i en blanding (1:1) av vann:metanol, 7:3. Den resulterende oppløsning bringes til pH 3,5 med IN HC1, og ekstraheres deretter med eter (500 ml). Det vandige laget ekstraheres igjen med n—butanol (1 1). Det butanoliske laget vaskes med vann (2 x 500 ml) og konsentreres til et lite volum under vakuum ved 35°C. Ved tilsetning av etyleter utfelles et fast stoff som oppsamles, vaskes med eter og tørkes i vakuum ved 40°C natten over, og dette gir (utbyttene er alltid høyere enn 90*) det N-t-BOC-beskyttede teicoplanin-utgangsmaterialet som er rent nok (HPLC-titer > 90*, metode c) for det neste trinnet.

b) Fremstilling av N-t-BOC-derivatet av teicoplanin-amid-forbindelsen

Kondensasjonen av ovenfor angitte oppnådde N-t-BOC-beskyttede teicoplanin-utgangsmateriale med det valgte amin utføres i DMF (HPLC, metode C) i nærvær av DPPA under de samme betingelser som beskrevet i eksempel 1. Slik som tilfellet er for N-CBzO-teicoplanin-amidet (se eksempel 4 b), er det urene N-t-BOC-teicoplanin-amidet oppnådd fra reaksjonsblandingen etter utfelling med etyleter rent nok for bruk i trinnet for fjerning av beskyttelse. c) Fremstilling av teicoplanin-amid-derivatet av tittelforbindelsen .

En oppløsning av 1 mmol N-t-BOC-teicoplanin-amid i 40 ml 100* trlfluoreddiksyre (TFA) omrøres i 10-20 min. ved 5°C, hvoretter oppløsningsmidlet fordampes under vakuum ved 25°C. Den oljeaktige resten tritureres med eter, oppsamles deretter og gjenoppløses i 150 ml metanol. Silanert silisiumdioksydgel (0,063-0,2 mm 5 g Merck) tilsettes og oppløsningsmidlet inndampes under vakuum ved 40°C. Resten anbringes på toppen av en kolonne inneholdende den samme silanert silisiumdioksydgel (150 g) fremstilt i blandingen vann:acetonitril, 95:5 (v/v). Kolonnekromatografi utføres vesentlig ifølge metoden beskrevet i eksempel 4 c. Mer spesielt, kolonnen utvikles med en lineær-gradienteluering fra 5* CH3CN i 0.001N HC1 til 30* CH3CN i H20 i tilfellet for forbindelse 9, med en lineær-gradienteluering fra 10* CH3CN i 0.001N HC1 til 40* CH3CN i H20 i tilfellet for forbindelse 14, og med en lineær-gradient fra 20* CH3CN i 0.001N HC1 til 55* CH3CN i vann i tilfellet for forbindelse 22. Strømningshastigheten er 120 ml/time og tiden er 15 timer. Fraksjoner på 12 ml oppsamles, overvåkes ved HPLC og opparbeides vesentlig som allerede beskrevet i eksempel 4 c.

Fraksjoner inneholdende de rene tittelforbindelsene oppsamles og til den resulterende oppløsning tilsettes n-butanol (v/v) og IN HC1 (2 ml). Etter konsentrasjon til et lite volum under vakuum ved 40°C oppnås tittelforbindelsen (som det tilsvarende dihydroklorid, med unntagelse for forbindelse nr. 25 som utvinnes som mono-hydrokloridet) ved utfelling med etyleter fra den butanoliske fasen, vasking og tørking_natten over i vakuum ved 40°C.

EKSEMPEL 8:

Fremstilling av trifluoracetatsaltene av teicoplanin-amid-forbindelsene 18-25.

En teicoplanin-amid-forbindelse (amider 18-25) oppløses (1 g i 300 ml) i en blanding av vann: acetonitril, 8:2 (v/v). Den resulterende oppløsning "bringes til pH 8,5 med 0,1N NaOH og ekstraheres (v/v) med n-butanol. Det organiske laget separeres, vaskes med vann (v/v) og konsentreres til et lite volum. Ved tilsetning av eter oppsamles det faste stoffet som utskilles, vaskes med eter og tørkes natten over i vakuum ved 35°C, og dette gir den tilsvarende frie basen som gjenopp-løses (1 g i 10 ml) og utfelles med etyleter (100-200 ml). Etter oppsamling av det faste stoffet ved filtrering, vasking med eter og tørking i vakuum i 24 timer ved romtemperatur, oppnås tittelforbindelsene (18-24, di-trifluoracetater og 25 trifluoracetat).

EKSEMPEL 9: (Fremgangsmåte Fj: Transforestring og esterfunksjon-hydrolyse av en forbindelse med formel I)

Fremstilling av forbindelse 17

I en beholder beskyttet med en soda-kalk-ventil, tilsettes dråpevis en oppløsning av 3 ml metanolisk IM KOE (85* kommersielle pellets) ved romtemperatur til en omrørt oppløsning av 1,05 g (~0,7 mmol) av forbindelse 16 (hydroklorid) i 60 ml metanol. Etter en time tilsettes ytterligere 0,75 ml av 1 M KOE i metanol og omrøring fortsettes i 30 min. (HPLC, metode b). Deretter avkjøles reaksjonsblandingen til ca. 5°C og 3,75 ml IN EC1 tilsettes. Den resulterende oppløsning fortynnes med 200 ml H20 og 100 ml CE3CN. Silanert silisiumdioksydgel (0,063-0,2 mm, 5 g; Merck) og n-butanol (400 ml) tilsettes deretter og oppløsningsmidlene inndampes under vakuum ved 40°C.

Resten anbringes på toppen av en kolonne inneholdende 200 g av den samme silanert silisiumdioksydgel preparert i E20. Kolonnen utvikles med en lineær-gradient fra 1-60* CE3CN i E20 i 20 timer ved en hastighet på 250 ml/time og deretter med en lineær-gradient fra 60* CE3CN i E20 til 70* CE3CN i 0.01N EC1 i 60 timer ved en hastighet på 150 ml/time. Fraksjoner på 25 ml hver oppsamles, analyseres ved HPLC og fraksjonene som inneholder forbindelse 17 (241-254) oppsamles. 200 ml n-butanol tilsettes til den resulterende oppløsning som deretter konsentreres til et lite volum under vakuum ved 45°C for oppnåelse av en butanolisk suspensjon. Ved tilsetning av etyleter utskilles et fast stoff som oppsamles, vaskes med eter og tørkes i vakuum ved 30"C natten over, hvilket gir 0,795 g (~78*) av ren forbindelse 17.

Ved i det vesentlige å følge denne metoden, men ved bruk av større mengder metanolisk KOH og/eller ved å forlenge reaksjonstiden etter behov, kan den tilsvarende forbindelse som har en fri karboksyfunksjon istedenfor metoksykarbonyl-funksj onen, oppnås.

EKSEMPEL 10: (Fremgangsmåte B3: Omsetning av et ubeskyttet eller N^-beskyttet teicoplanin-utgangsmateriale med et HNR^R<2->amin som har en ytterligere aminogruppe og/eller ytterligere karboksygrupper, som alle er beskyttet)

Fremstilling av forbindelser 68 og 72

En oppløsning av 3 ml (ca. 14 mmol) DPPA i 25 ml DMF tilsettes dråpevis til en omrørt oppløsning av 12 mmol teicoplanin Ag kompleks (i tilfellet for fremstilling av forbindelse 68) eller N<15->CBzO-deglucoteicoplanin (i tilfellet for fremstilling av forbindelse 72), 13 mmol N<c->CBzO-lysin-metylester, hydroklorid og 24 mmol trietylamin (TEA) i 225 ml DMF, i 10 min. under opprettholdelse av temperaturen ved 0-5°C. Etter omrøring i 4 timer ved 0-5"C og 24 timer ved 20°C, helles reaksjonsblandingen i 1,5 1 etyleter og bunnfallet som dannes oppsamles ved filtrering og gjenoppløses i 500 ml en blanding av metanol:vann, 4:1 (v/v). Den resulterende oppløsning avkjøles til 10°C og 800 ml n-butanol tilsettes dertil under omrøring. Etter justering av pH-verdien ved ca. 8,3 (med IN NaOH), separeres det organiske laget, vaskes med 800 ml (2 x 400 ml) vann, og konsentreres deretter til et lite volum (ca. 100 ml) under redusert trykk ved 40°C. Ved tilsetning av etyleter (400 ml) utskilles et fast stoff som oppsamles og tørkes i vakuum ved 40° C natten over, og dette gir tittelforbindelsen.

Ved i det vesentlige å gjenta den samme fremgangsmåten, men ved å starte med teicoplanin Ag komponent 1, 2, 3, 4 eller 5, oppnås det tilsvarende derivat av de rene enkeltkomponentene.

EKSEMPEL 11: (Fremgangsmåte Fg: Esterfunksjon-hydrolyse av en forbindelse med formel I)

Fremstilling av forbindelser 64. 69. 86 og 104

En oppløsning av 5 g KgC03 i 500 ml HgO tilsettes under omrøring ved romtemperatur til en oppløsning av 4 mmol av forbindelse 63 (for fremstilling av forbindelse 64), 68 (for fremstilling av forbindelse 69), 85 (for fremstilling av forbindelse 86), og 105 (for fremstilling av forbindelse 104), i 500 ml av en blanding av metanol: vann, 1:1 (v/v). Etter tilsetning av 750 ml n-butanol omrøres den resulterende blanding kraftig i 36 timer. Det organiske laget separeres, den vandige fasen bringes til pH 3,5 med IN HC1 og ekstraheres deretter med 500 ml n-butanol. De butanoliske opp-løsningene kombineres, vaskes med 600 ml HgO (2 x 300 ml) og konsentreres til et lite volum (50 ml) under vakuum ved 40°C. Ved tilsetning av etyleter (350 ml) utskilles et fast stoff som oppsamles og tørkes i vakuum ved romtemperatur natten over, hvilket gir tittelforbindelsen.

EKSEMPEL 12: (Fremgangsmåte F3: Forestring av en forbindelse med formel I hvori gruppen -NR^-R<2> inneholder karboksyl i ske funksjoner)

Fremstilling av forbindelse 51

En omrørt suspensjon av 4,1 g (~2 mmol) av forbindelse 27 i 200 ml 2.5M HC1 i absolutt etanol, kokes under tilbakeløp i 5 timer. Reaksjonsblandingen konsentreres deretter til et lite volum (~40 ml) ved 50° C under vakuum. Ved tilsetning av etyleter (~260 ml) utskilles et fast stoff som oppsamles ved filtrering og gjenoppløses i 50 ml av en blanding av acetonitril:vann, 1:1 (v/v). Etter tilsetning av 150 ml HgO anbringes den resulterende oppløsning på en kolonne av 400 g silanert silisiumdioksydgel (Merck) i HgO. Kolonnen utvikles med en lineær-gradient fra 20-70* av CH3CN i 0.001N HC1 i 20 timer ved en hastighet på 200 ml/time, mens det oppsamles 20 ml fraksjoner og disse analyseres ved HPLC. De fraksjoner som inneholder den rene tittelforbindelsen kombineres og den resulterende oppløsning bringes til pH 8,0 med 2* NaHC03. Etter ekstraksjon med n-butanol (v/v), tilsettes IN HC1 (2,5 ml IN HC1 pr. 100 ml av den butanoliske oppløsning) og den resulterende organiske oppløsning konsentreres til et lite volum og dette gir en tørr butanolisk suspensjon som ved tilsetning av etyleter (v/v) gir et fast stoff som oppsamles ved filtrering og tørkes i vakuum ved 40°C natten over, og dette gir 0,97 g av ren forbindelse 51, som di-hydrokloridet.

EKSEMPEL 13: (Fremgangsmåte G: Separering av amidene av teicoplanin Ag kompleks i deres komponenter ved reversfase-kolonnekromatografi)

Fremstilling av forbindelser 2b. 32b. 32c og 71

En oppløsning av 5 mmol av amid-utgangsderivatet av teicoplanin Ag kompleks i 250 ml av en blanding av acetonitril:-vann, 1:1 (v/v) justeres til pH 3,5 med IN HC1, hvoretter mesteparten av det organiske oppløsningsmidlet fordampes under vakuum ved 20° C for oppnåelse av en svakt uklar oppløsning som anbringes på en kolonne av 1 kg silanert silisiumdioksydgel (Merck) i HgO. Kolonnen utvikles med en lineær-gradient fra 20* av CH3CN i HgO til 60* av CH3CN i 0,001N HC1 i 20 timer ved en hastighet på 200 ml/time, mens 20 ml fraksjoner som er overvåket ved HPLC oppsamles. De fraksjoner som inneholder amidet av teicoplanin Ag komponent

2 oppsamles. Hensiktsmessig blir også fraksjonene som inneholder amidene av komponenter 1-3 og 4 og 5 oppsamlet, respektivt. Hver oppløsning konsentreres deretter til et lite volum etter tilsetning av egnede mengder n-butanol for å oppnå en tørr butanolisk suspensjon hvorfra tittelforbindelsene, som de frie baser, utfelles som vanlig med etyleter. Tilsetningen av et lite overskudd av IN HC1 eller trifluoreddiksyre før konsentrasjon gir de tilsvarende hydroklorider eller trifluoracetater, respektivt.

EKSEMPEL 14: (Fremgangsmåte A^,: Omsetning av et ubeskyttet teicoplanin-utgangsmateriale med a-aminogruppen i Nco-nitro-arginin, metylesterhydrokloridet, fulgt av spalting av den beskyttende nitrogruppen i den resulterende forbindelse)

Fremstilling av forbindelser 33 og 42

Den første delen av reaksjonen, som startet fra 16 g (~8 mmol) teicoplanin Ag og 12 mmol Nco-nitro-arginin-metylester-hydroklorid, utføres ifølge fremgangsmåte A3 beskrevet i eksempel 3, hvilket gir 14 g av forbindelse 105.

En oppløsning av 14 g (~6,5 mmol) av denne forbindelsen i 200 ml 90* vandig eddiksyre behandles med 3,6 g (~55 gatom) sinkpulver under kraftig omrøring ved romtemperatur. Den resulterende suspensjonen omrøres i 30 minutter ved romtemperatur og blir deretter filtrert. Ved tilsetning av etylacetat (-800 ml) til filtratet, utskilles et pulver (~13 g) som oppsamles ved filtrering og renses ved reversfase-kolonnekromatografi på 700 g silanert silisiumdioksydgel ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1, og dette gir 10,2 g av tittelforbindelsen som den frie basen (utbytte av denne reaksjonen fra forbindelse 105 er ca. 75*).

EKSEMPEL 15: (Fremgangsmåte A7: Omsetning av et N<15->beskyttet eller ubeskyttet teicoplanin-utgangsmateriale med a-aminogruppen i Nco-nitro-argininmetylester eller -benzyl-ester, respektivt, fulgt av fjerning av de N<15->t-B0C- eller N^-CBzO- og benzylbeskyttelsesgruppene i syremedium ifølge fremgangsmåte A^, eller ved katalytisk hydrogenering, ifølge fremgangsmåte A<4>, respektivt, og sluttelig fortrengning av nitrogruppen ifølge fremgangsmåte A^,).

Fremstilling av forbindelser 32a. 32b. 32c. 41. 59. 60. 98. 103 og 104

I det første trinnet, ved å starte fra teicoplanin Ag (kompleks eller en enkeltkomponent derav), gir N^-t-BOC-deglucoteicoplanin eller N<15->CBzO-deglucoteicoplanin og det passende Nu-nitro-arginin-derivatet, de respektive beskyttede tittelforbindelsene. Ved behandling med 100* trifluoreddiksyre fjernes N^-^-t-BOC-beskyttelsesgruppen og ved katalytisk hydrogenering over 5-10* Pd/C fortrenges også N<15->CBzO- og benzylgruppene.

Nu-nltro-derivatene av forbindelsene 32a, 59, 60 og 98 blir dermed oppnådd. Nco-nitrogruppen blir deretter fjernet ved å følge fremgangsmåte A^,, som beskrevet i eksempel 14, hvilket gir tittelforbindelsene.

EKSEMPEL 16: (Fremgangsmåte As: Omsetning av teicoplanin med 4-morfolinetanamin fulgt av syrehydrolyse).

Teicoplanin Ag og 4-morfolinetanamin omsettes ifølge fremgangsmåten angitt i eksempel 1 (fremgangsmåte A^) og det oppnådde produkt suspenderes i 50 ml absolutt trifluoretanol (TFE), omrøres ved 75"C i 12-16 timer under bobling av tørr HC1, hvoretter det foretas avkjøling til 10°C og hensetnlng natten over ved denne temperaturen. Etter tilsetning av 20 ml etyleter utvinnes den urene sluttforbindelsen fra reaksjonsblandingen som et mørkegult pulver. Rensing ved kolonnekromatografi som angitt i eksempel 6c gir den rene forbindelsen.

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv teicoplaninforbindelse som har formelen:

   hvor

   Y representerer en gruppe

   hvor

   R<1> representerer hydrogen, (C1-C5)alkyl, hydroksy(C2-C4)-

   alkyl, halogen(C2-C4)<a>lkyl, (C1-C4)alkoksy(C2-C4)alkyl, amino(C2-C4)alkyl, (C1-C4)alkylamino(C2-C4)alkyl, di(C1-C4)alkylamino(C2-C4)alkyl,

   R<2> representerer hydrogen, (C^-Cf, )alkyl, hydroksy(C2-C4 )-

   alkyl, halogen(C2-C4)alkyl, (Ci~C4)alkoksy(C2-C4)alkyl, en nitrogenholdig 5-6-leddet heterocyklisk ring som er fullstendig mettet og hvor nitrogenatomer kan være substituert med en benzylrest eller en brodannende C2-alkylenkjede tilknyttet ett av C-atomene i den heterocykliske ring;

   en gruppe -alk-W hvor "alk" representerer en lineær alkylenkjede med 1-8 karbonatomer som eventuelt er substituert med en substituent valgt fra (C1-C4)alkyl, hydroksy(C1-C4)alkyl, hydroksy, karboksy, aminokarbonyl, (cl~c4)alkylaminokarbonyl, di(C1-C4)alkylaminokarbonyl, (cl~c4 )alkoksykarbonyl, fenyl(Ci~C4)alkoksykarbonyl, og W representerer karboksy, (C1-C4)alkoksykarbonyl, fenyl(Ci~ C4)alkoksykarbonyl, aminokarbonyl, ()aminokarbonyl, di(C1-C4)aminokarbonyl, pentosaminokarbonyl, heksosaminokarbonyl, ureido, guanidino, pyrrolldin hvor N-atomet kan være (C1-C4) alkylsubstituert, pyridin eller morfolin, en gruppe med formelen

   hvor R<3> og R<4> hver uavhengig representerer hydrogen, (cl~c6)alkyl, hydroksy(C2-C4 )alkyl og halogen(C2~C4)alkyl, eller R<4> representerer fenylmetyloksykarbonyl og R<3> representerer hydrogen; en gruppe med formelen:

   hvor R*1, R<7> og R<8> hver uavhengig representerer en (C^-C4)alkyl,

   eller R<1> og R<2> representerer sammen med det tilstøtende nitrogenatom piperazino, substituert i 4-stilling med en metylgruppe eller en pyridinylgruppe, morfolino eller tiomorfolino;

   A representerer hydrogen eller -N[(C^o-Cn)alifatisk acyl]-

   3-D-2-deoksy-2-amino-glucopyranosyl;

   B representerer hydrogen eller N-acetyl-e-D-2-deoksy-2-

   amino-glucopyranosyl;

   M representerer hydrogen eller a-D-mannopyranosyl; forutsatt at B representerer hydrogen bare når A og M samtidig er hydrogen og M representerer hydrogen bare når A er hydrogen, og med den ytterligere forutsetning at når W representerer

   en gruppe

   en gruppe

   ureido, guanidino

   eller en nitrogenholdig 5-6-leddet heterocyklisk ring som definert ovenfor direkte forbundet med "alk"-delen gjennom en binding med et ringnitrogenatom, så må den lineære alkylen-"alk"-delen ha minst to karbonatomer;

   samt syreaddisjonssalter derav, karakterisert ved at man omsetter et teicoplanin-utgangsmateriale med formelen:

   hvor R er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for amid-funksjonen; Y er hydroksy; A representerer hydrogen eller -N[(<C>iø~<c>ll)-alifatlsk acyl]-e-D-2-deoksy-2-amino-gluco-pyranosyl; B representerer hydrogen eller N-acetyl-p<->D-2-deoksy-2-amino-glucopyranosyl, M representerer hydrogen eller a-D-manno-pyranosyl, forutsatt at B kan representere hydrogen bare når A og M samtidig er hydrogen, og M kan representere hydrogen bare når A er hydrogen; et salt derav eller en blanding derav i et hvilket som helst mengdeforhold;

   med et molart overskudd av et amin med formelen HNR^R<2>, hvor R<1> og R<2> har de ovenfor angitte betydninger og hvor de reaktive funksjonene, andre enn amlnofunksjonen som skal omsettes med karboksyldelen i teicoplanin-utgangsmaterialet, er beskyttet i et inert organisk oppløsningsmiddel og i nærvær av et lite molart overskudd av et kondensasjonsmiddel valgt fra (C1-C4)alkyl-, fenyl- eller heterocykliske fosforazidater slik som dlfenylfosforazidat (DPPA), dietylfosforazidat, di(4-nitrofenyl)fosforazidat, dimorfolylfosforazidat og difenylfosforkloridat og fjerner de beskyttende grupper hvis slike er til stede.