NO174557B

NO174557B - Nye radikale litiumftalocyaninkrystaller, deres fremstillingspros ess og deres bruk til in vivo bestemmelse av molekylaert oksygen

Info

Publication number: NO174557B
Application number: NO912685A
Authority: NO
Inventors: Mehdi Moussavi
Original assignee: Commissariat Energie Atomique
Priority date: 1990-07-10
Filing date: 1991-07-09
Publication date: 1994-02-14
Also published as: NO174557C; FR2664607A1; NO912685D0; FR2664607B1; NO912685L; EP0467747A1; EP0467747B1; DE69100618D1; DE69100618T2; US5112597A; JPH04230386A

Description

Oppfinnelsen angår radikale litiumftalocyaninkrystaller i henhold til innledningen til krav 1. Mer spesielt angår den nye radikale litiumftalocyaninkrystaller som har forbedrede egenskaper sammenlignet med eksisterende radikale litiumftalocyaninkrystaller og som er egnet til bestemmelse av molekylært oksygen ved hjelp av et paramagnetisk elektronresonans-(EPR-)spektrometer under gode betingelser.

Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte til fremstilling av krystallene og en anvendelse av dem til bestemmelse av molekylært oksygen.

Nylig utvikling har funnet sted med hensyn til prosesser for måling av den molekylære oksygenkonsentrasjon i celler ved hjelp av paramagnetisk elektronresonans (EPR). I disse prosesser benyttes et radikalt sporstoff hvis EPR-karakteri-stikk (hovedsakelig linjebredden) varierer som en funksjon av oksygeninnholdet i mediet, hvori det radikale sporstoff befinner seg. Prosedyrer for å bestemme molekylært oksygen ved hjelp av EPR-spektrometri er f.eks. beskrevet i Swartz, Pure & Appl. Chem., Bind 62, nr. 2, s.235-239, 1990, og Woods & Al., Journal of Magnetic Resonance, nr. 85, s. 50-59, 1989.

For å måle intracellulær oksygenkonsentrasjon ved hjelp av denne prosedyre blir et radikalt stoff injisert eller implantert i mediet eller organet hvis oksygeninnhold skal finnes og deretter blir dette stoffet ved hjelp av et paramagnetisk elektronresonansspektrometer undersøkt mens det befinner seg i mediet. På basis av EPR-linjebredden som fås, er det mulig å utlede oksygeninnholdet i mediet ved å referere til en forhåndsbestemt kalibreringskurve av en prøve av det radikale stoff og som gir relasjonen mellom EPR-linjebredden og oksygeninnholdet.

De radikale stoffer som benyttes i slike prosesser, må ha forskjellige egenskaper. De må således være biokompatible og ha EPR-karakteristikker som forandrer seg som funksjon av oksygeninnholdet i mediet, i det minste innen det følgende område av konsentrasjoner, nemlig 0-10% molekylært oksygen ved undersøkelse av menneskelige organer.

Hittil har det radikale stoff benyttet i slike prosesser vært 2,2,6,6-tetrametylpiperidin-N-oksyl-4-on (TANO). Det vil imidlertid være fordelaktig å ha andre radikale stoffer for disse prosesser, fordi variasjonene i EPR-karakteristikkene for TANO i det mest interessante oksygenkonsentrasjonsområde (0-10% oksygen) er utilstrekkelige.

Den foreliggende oppfinnelse angår et radikalt stoff som kan benyttes til in vivo bestemmelse ved hjelp av paramagnetisk elektronresonans og som har mer interessante karakteristikker enn de for TANO i konsentrasjonsområdet mellom 0 og 10%.

Dette radikale stoff utgjøres av radikale litiumftalocyaninkrystaller i samsvar med formelen:

og er i hehold til oppfinnelsen kjennetegnet ved at R-L-R16, som kan være de samme eller forskjellige, representerer et deuterium- eller hydrogenatom og har en tetragonal krystallstruktur tilhørende romgruppen P4/mcc.

En fremgangsmåte til fremstilling av de radikale litiumftalocyaninkrystaller i henhold til oppfinnelsen er kjennetegnet ved de trekk som fremgår av krav 5, mens en anvendelse av dem til bestemmelse av molekylært oksygen fremgår av krav 6.

I samsvar med en første utførelse av oppfinnelsen representerer

R^-R<16> samtlige et hydrogenatom. I dette tilfelle er de krystallografiske parametre for ftalocyanin som følger:

Det radikale litiumftalocyanin med formelen (I) hvor R-L-R16 er hydrogenatomer, er et radikalt stoff som har vært kjent i noen tid, men som til nå aldri er blitt fremskaffet i form av krystaller med tetragonal struktur tilhørende romgruppen P4/mcc.

De kjente radikale litiumftalocyaninkrystallene har således en tetragonal struktur som hører til romgruppen P4/nnc. Imidlertid er denne forskjellen viktig, da den spesielle krystallinske struktur (tetragonal, romgruppe P4/mcc) for det radikale litiumftalocyanin i henhold til oppfinnelsen gir det langt mere interessante EPR-karakteristikker for bestemmelse av molekylært oksygen.

Således er bredden av EPR-linjen for det radikale litiumftalocyanin i henhold til oppfinnelsen bare 2000nT, mens det utgjør 30 OOOnT i tilfelle av det tetragonale radikale litiumftalocyanin som tilhører romgruppen P4/nnc.

Ved det radikale ftalocyanin i henhold til oppfinnelsen varierer dessuten EPR-linjebredden hovedsakelig lineært med oksygeninnholdet i konsentrasjonsområdet mellom 0 og 10%, mens EPR-linjebredden for det kjente ftalocyanin praktisk talt ikke varierer med oksygeninnholdet.

Som et resultat av disse karakteristikker er det med ftalo-cyaninkrystallene i henhold til oppfinnelsen mulig å oppnå en bedre nøyaktighet ved måling av lave oksygeninnhold i bio-logiske vev. Videre gjør krystallenes høye følsomhet overfor oksygen det mulig enten å injisere mindre mengder av radikalt stoff, hvis dette viser seg å være nødvendig, eller å redusere registreringstiden for EPR-kurven og således få en raskere reaksjon på organenes metabolismer.

I henhold til en annen utførelse av oppfinnelsen blir litiumftalocyaninet i formelen (I) i det minste delvis erstattet av deuteriumatomer. I dette tilfelle fås enda bedre resultater ved nærværet av deuteriumatomer.

Generelt angår substitusjonen minst en av posisjonene R<1>, R<4>, R5, R<8>, R9, R12, R1<3> og R1<6> i formelen (I), fordi det er vanskeligere å substituere med deuteriumatomer i de følgende posisjoner R<2>, R3, R6, R7, R10, R11, R14 og R<15>.

De radikale litiumftalocyaninkrystaller i henhold til formelen (I) kan fås ved en prosess som består i galvanostatisk, monoelektronisk oksidasjon av det dilitierte litiumftalocyanin svarende til formelen:

hvor R<1->R<16> har den ovenfor angitte betydning, i oppløsning i acetonitril som inneholder minst 50 ppm vann og med bruk av en anode bestående av en platinaplate, en katode bestående av en platinatråd og en bærerelektrolytt som utgjøres av tetrabutylammoniumperklorat eller heksafluorfosfat.

I denne prosessen skjer oksidasjonen galvanostatisk, dvs. med en konstant strømstyrke, men det er mulig å gå frem i etapper ved å utføre en rekke trinn med konstant strømstyrke, men med forskjellige strømstyrkeintensiteter mellom de forskjellige trinn. Det er på denne måte mulig å styre krystallvekst-kinetikken eller frembringe en systemutvikling mellom like-vektstUstander når en rekke etapper benyttes og på denne måte å få den søkte krystallform.

Som vanlige har det radikale litiumftalocyanin blitt preparert ved monoelektronisk oksidasjon av det diliterte litiumftalocyanin, men med bruk av den potensiostatiske metode, dvs. et konstant potensial, hvilket gir et godt effektivitetsnivå. Imidlertid blir elektrolysekinetikken i dette tilfelle ikke styrt og det fås et pulver med dårlig definerte og dårlig formede krystaller som ikke svarer til de krystallinske nåler i henhold til oppfinnelsen.

For å frembringe denne spesielle krystallform er det også nødvendig å velge et løsningsmiddel, en bærerelektrolytt og elektroder av egnet art.

Som angitt ovenfor, er det egnede løsningsmiddel acetonitril som inneholder høyst 50 ppm vann og fortrinnsvis er blitt renset med hensyn til spor av eddiksyre, f.eks. ved å føres over en aluminakolonne.

Den således ønskede krystallstruktur fås ikke når det benyttes et annet løsningsmiddel, såsom aceton.

De egnede elektroder er platinaelektroder og bærerelektrolytten kan være tetrabutylammoniumheksafluorfosfat (eller perklorat). Det er også foretrukket at den elektrolytiske celle skal være halvkuleformet.

Om det er ønskelig å frembringe de deutererte radikale 1itiumftalocyaninkrystaller benyttes den samme prosedyre, men utgangsproduktet er deuterert, dilitiert litiumftalocyanat. Det siste kan fås ved H-D-isotopbytting mellom dilitiert ftalocyanin og deuterert tetrametylpyridin i nærvær av en litiert, deuterert tetrametylpyridinbasert katalysator.

De radikale litiumftalocyaninkrystaller i henhold til oppfinnelsen kan spesielt benyttes til bestemmelse av molekylært oksygen.

Oppfinnelsen angår som nevnt også en prosess til bestemmelse av molekylært oksygen i et medium såsom en væske eller en gass, og består i kontaktering av nevnte medium med minst ett radikalt litiumftalocyaninkrystall i henhold til oppfinnelsen og deretter bestemmelse av bredden av EPR-linjen til krystallet.

De radikale litiumftalocyaniner i henhold til oppfinnelsen kan også benyttes til in vivo bestemmelse av molekylært oksygen, f.eks. i hjertet eller andre organer, med henblikk på å detektere syke celler i organene, dvs. de som har mindre enn normalt oksygeninnhold.

For å utføre slike in vivo undersøkelser, er det mulig å implantere de radikale ftalocyaninkrystaller i henhold til oppfinnelsen direkte i organet som skal undersøkes eller å benytte en suspensjon av disse krystallene i en organisk væske som injiseres i pasienten som skal undersøkes.

Væskene benyttet til fremstilling av slike suspensjoner er ikke-toksiske, biokompatible væsker, f.eks. alkoholer såsom furfurylalkoholer, C^C^g-alkoholer °9 polyalkoholer. Det er også mulig å benytte veratrol.

Om nødvendig kan suspensjonen inneholde andre tilsetninger, såsom midler som stabiliserer suspensjonen eller regulerer dens viskositet til en passende verdi.

Ftalocyaninkonsentrasjonen til suspensjonen kan variere innenfor et bredt område og ligger fortrinnsvis mellom 0,1 og 10 mg/l.

Selv om de radikale litiumftalocyaniner i henhold til oppfinnelsen ikke er giftige, er de tilført i generelt meget lave doser og kan f.eks. være 0,01-01 mg/kg legemsvekt.

Etter implanteringen av krystallene eller tilføringen av suspensjonen, er det mulig å raskt utføre undersøkelsen ved hjelp av EPR-spektrornetri.

Oppfinnelsens trekk og fordeler fremgår bedre ved lesing av den etterfølgende beskrivelse, som er ment å være illustrerende og ikke-begrensende, og med henvisning til den ledsagende tegning. Fig. 1 viser skjematisk en elektrolytisk celle som kan benyttes til å fremstille krystallene i henhold til oppfinnelsen. Fig. 2 viser skjematisk et apparat som er egnet til å danne kalibreringskurven for det benyttede radikale stoff. Fig. 3 viser en graf som gjengir variasjonen av EPR-linjebredden som en funksjon av oksygeninnholdet for litiumftalocyaninet i henhold til oppfinnelsen (PcLi) og for et radikalt stoff benyttet i kjent teknikk (TANO). Fig. 4 viser en graf som gjengir variasjonene av EPR-resonans-linjen for litiumftalocyanin under et eksperiment på en rotte. Fig. 1 viser skjematisk en elektrolytisk celle benyttet til

fremstilling av radikale litiumftalocyaninkrystaller i henhold til oppfinnelsen. Cellen 1 er halvkuleformet og tett forseglet av et deksel 3. En katode 5 bestående av metallisk platinatråd med f.eks. en diameter på 1 mm og en lengde på 4 cm, såvel som en anode 7 bestående av en platinaplate på 25x35 mm plassert inne i cellen. Anoden og katoden er forbundet til en elektrisk strømgenerator forsynt med en innretning som gjør det mulig å drive cellen i henhold til den galvanostatiske eller intensio-statiske prosedyre.

Eksempel 1: Fremstillin<g> av litiumftalocyaninkrystaller i henhold til op<p>finnelsen

Det innføres 300 mg dilitiert ftalocyanin oppløst i 500 ml ultra-anhydrøs acetonitril i cellen 1. Acetonitrilet har et vanninnhold på under 50 ppm og føres straks før bruken over en basisk aluminpulverkolonne med aktiviteten (I) og med en diameter på 5 cm og en høyde på 10 cm for å eliminere even-tuelle eddiksyrerester som kan finnes i den. I cellen innføres også 400 mg av en bærerelektrolytt bestående av tetrabutylammoniumheksafluorfosfat som er blitt rekrystallisert fem ganger i etanol og tørket 24 timer ved vakuum ved 80°C.

Etter forsegling av den elektrolytiske celle utføres elektro-syntese med bruk av en konstant strømstyrke på 5juA i 24 h, deretter med en konstant strømstyrke på 20juA i 48 h og en konstant strømstyrke på 50/xA i 72 h.

Ved slutten av operasjonen samles 150 mg radikalt litiumftalocyanin i form av svarte, monokrystallinske nåler som har de krystallinske karakterstikker som gitt i tabell 1.

Eksempel 2

I dette eksempel finner det sted bestemmelse av EPR-karakteristikkene til krystallene i eksempel 1 i nærvær av forskjellige oksygenkonsentrasjoner for å skaffe kalibreringskurver som svarer til EPR-linjebredden med variasjoner som en funksjon av oksygeninnholdet i mediet.

For dette formål innføres de tidligere dannede litiumftalocyaninkrystaller i et rør hvor det dannes et vakuum og bredden av EPR-linjen måles etter at røret, holdt i vakuum, er ført inn i et EPR-spektrometer. De samme målinger blir deretter gjentatt etter kontaktering av krystallene med forskjellige oksygenmengder.

Dette kan utføres ved å benytte innretningen som er vist skjematisk på fig. 2 og som omfatter et vakuumsystem 11 forsynt med en pumpemontasje 13 for å danne vakuum i systemet, og som kan forbindes via en ventil 15 til et rør 17 som inneholder litiumftalocyaninkrystallene og med en ventil 19 til en beholder 21 som inneholder et gitt oksygenvolum.

For å utføre den første måling åpnes ventilen 15 etter at røret 17 i er plassert i apparatet og danner et vakuum med pumpemontasjen 13. Ventilen 15 blir deretter lukket igjen og det forseglede rør 17 føres inn i EPR-spektrometeret. Etter denne måling blir røret 17 igjen plassert i vakuumsystemet 11. Ventilen 15 og ventilen 19 blir deretter åpnet for å kontaktere litiumftalocyanet med det gitte oksygenvolum til beholderen 21. Etter kontakteringen lukkes ventilen 15 og røret 17 føres inn i EPR-spektrometeret for å få linjebredden ved 9 GHz.

Etter dette trinn blir litiumftalocyaninet igjen avgasset ved å plassere røret 17 i vakuumsystemet 11 og frembringe et vakuum i installasjonen. Det avgassede ftalocyanin blir deretter kontaktert med et annet oksygenvolum ved bruk av en annen beholder 21. EPR-linjebreddeverdiene som således fås, er en funksjon av oksygenkonsentrasjonen.

Fig. 3 viser på kontinuerlig linjeform kurven for EPR-linje-breddevariasjonene i 10~<7> T som funksjon av oksygeninnholdet i prosent.

På fig. 3 kan det ses at linjebreddevariasjonen er hovedsakelig lineær i konsentrasjonsområdet fra 0 til 10% og at det er mulig å detektere meget små oksygeninnholdsvariasjoner i dette konsentrasj onsområde.

For sammenligningsformål (vist som strekpunktert linje) vises EPR-linjebreddevariasjoner funnet under de samme betingelser med TANO, som tidligere ble benyttet til oksygenbestemmelse med

EPR.

Ved sammenligning av de to kurver kan det ses at TANO gjør det mulig å detektere oksygenkonsentrasjonsvariasjoner i området 0-6%, hvilket klart tilkjennegir oppfinnelsens betydning.

Sammenlignende eksempel 1

I dette eksempel fremstilles radikal litiumftalocyanin fra det samme dilitierte litiumftalocyanin som det som ble benyttet i eksempel 1, men den elektrokjemiske oksidasjon finner sted potensiostatisk i aceton ved +o,5V. På denne måte fås tetragonale ftalocyaninkrystaller, som tilhører romgruppen P4/nnc og med de krystallografiske karakteristikker som er gitt i tabell 1.

Dette følges av bestemmelse av EPR-linjebredden for litiumftalocyaninet ved å arbeide under de samme betingelser som i eksempel 1. Det ble funnet at linjebredden var 30 OOOnT som ligger godt over det som fås med litiumftalocyaninet i henhold til oppfinnelsen. I tillegg varierer ikke linjebredden med mediets oksygeninnhold.

Således kan litiumftalocyanin i henhold til kjent teknikk ikke benyttes til bestemmelse av molekylært oksygen.

Eksempel 3

I dette eksempel benyttes litiumftalocyaninkrystaller funnet i eksempel 1 for å undersøke utviklingen av oksygennivået i et rottehjerte. For dette formål ble rotten bedøvet og det ble i dens hjerte implantert et krystall av det radikale litiumftalocyanin i eksempel 1. Rotten ble deretter drept og dens hjerte fjernet og innført i et EPR-spektrometer.

Det signal som fås straks etter innføringen av hjertet i spektrometeret, undersøkes på 1 GHz, fulgt av EPR-signalet som fås etter 6 min, og deretter av de som fås hvert 3. minutt.

Resultatene som ble funnet er gitt i fig. 1, mens kurve 31 refererer seg til signalet som ble funnet ved tidspunktet 0, kurve 32 til det som ble funnet etter 6 min og kurvene 33, 34, 35, 36 og 37 til signalene som ble funnet etter henholdsvis 19, 12, 14, 17 og 20 min.

Disse resultater viser at oksygenkonsentrasjonen som initialt var 17,2%, faller til 1,5% etter 20 min, og at disse variasjoner lett kan følges for å undersøke EPR-signalet.

Således kan litiumftalocyaninkrystallene i henhold til oppfinnelsen benyttes til intracellulær oksygenbestemmelse.

De følgende eksempler viser fremstillingen av disse krystallene som kan benyttes til bestemmelse av oksygen i levende vesener.

Eksempel 4

1 mg av det radikale litiumftalocyaninkrystall som ble funnet i eksempel 1 innføres i et glassrør som inneholder 10 ml heksanol. Rørets innhold fryses deretter i flytende nitrogen fulgt av avgassing ved pumping under sekundært vakuum (10~<4> Pa) i 30 min, hvoretter røret forsegles. For å gjøre blandingen homogen, blir det forseglede rør innført i en ultralydbeholder i 15 min.

Under bruk åpnes røret i en inert atmosfære, f.eks. i en hanskeboks, og med bruk av en tett injeksjonssprøyte blir 0,1-0,5 ml av suspensjonen samplet for injeksjon i organet som skal undersøkes.

I henhold til en variant er det mulig å benytte flasker som har en ende som kan krympelukkes tilsvarende flasker for farma-søytisk injiserbare oppløsninger og som forsegles av en aluminiumhette forsynt med en gummipakning. I dette tilfelle kan avgassing utføres ved å boble argon gjennom flasken med en hastighet på 4 l/h i 20 min for 10 ml suspensjon.

Claims

1. Radikale litiumftalocyaninkrystaller i henhold til formelen: karakterisert ved at R<1->R<16>, som kan være de samme eller forskjellige, representerer et deuterium- eller hydrogenatom og med en tetragonal krystallstruktur tilhørende romgruppen P4/mcc.

2. Radikale litiumftalocyaninkrystaller i henhold til krav 1, karakterisert ved at R-^-R<16> representerer et hydrogenatom.

3. Radikale litiumftalocyaninkrystaller i henhold til krav 1, karakterisert ved at R<2>, R<3>, R6, R7, R<10>, R11, R14 og R<15> representerer et hydrogenatom og minst en av R1, R4, R5, R8, R9, R1<2>, R<13> og R<16> representerer et deuterium-atom.

4. Radikale litiumftalocyaninkrystaller i henhold til 2, karakterisert ved at deres krystallografiske parametre er som følger:

5. Fremgangsmåte til fremstilling av radikale litiumftalocyaninkrystaller i henhold til et av kravene 1-4, karakterisert ved at den omfatter galvanostatisk monoelektronisk og oksiderte dilitierte litiumftalocyaniner med formelen: hvor R^—R<16> har den betydning som er gitt i krav 1, i en oppløsning i acetonnitril som inneholder høyst 50 ppm vann, med bruk av en anode bestående av en platinaplate, en katode bestående av en platinatråd og en bærerelektrolytt bestående av tetrabutylammoniumperklorat eller heksafluorfosfat.

6. Anvendelse av radikale litiumftalocyaninkrystaller i henhold til krav 1-4 til bestemmelse av molekylært oksygen i et medium, hvorunder mediet kontakteres med et radikalt litiumftalocyaninkrystall og den paramagnetiske elektronresonans-(EPR-)linjebredde for det radikale litiumftalocyaninkrystall bestemmes.