NO165599B - A METHOD FOR DETERMINING DTK ISOENZYM ACTIVITY AND USING THIS FOR IN VITRO DIAGNOSIS OF DISEASES - Google Patents
A METHOD FOR DETERMINING DTK ISOENZYM ACTIVITY AND USING THIS FOR IN VITRO DIAGNOSIS OF DISEASES Download PDFInfo
- Publication number
- NO165599B NO165599B NO84840117A NO840117A NO165599B NO 165599 B NO165599 B NO 165599B NO 84840117 A NO84840117 A NO 84840117A NO 840117 A NO840117 A NO 840117A NO 165599 B NO165599 B NO 165599B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- dtk
- substrate
- activity
- serum
- isoenzyme
- Prior art date
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 49
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 35
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 28
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 claims description 19
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 19
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 16
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 16
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 16
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 10
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 claims description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 claims 1
- 239000012928 buffer substance Substances 0.000 claims 1
- 235000021170 buffet Nutrition 0.000 claims 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 claims 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 54
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 7
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 5
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 5
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 3
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 2
- 208000001572 Mycoplasma Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 201000008235 Mycoplasma pneumoniae pneumonia Diseases 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 201000006747 infectious mononucleosis Diseases 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 description 1
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical group C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000004068 Morbillivirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000287531 Psittacidae Species 0.000 description 1
- 206010037151 Psittacosis Diseases 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L adenosine triphosphate disodium Chemical compound [Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003602 anti-herpes Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000007449 liver function test Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 201000000901 ornithosis Diseases 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Oppfinnelsen angår en metode for Ln vitro bestemmel.se The invention relates to a method for Ln vitro determination.se
av dTk-isoenzym-aktivitet i menneskers eller dyrs kroppsvæske eller celleprøve som angitt i den innledende del av patentkrav 1. Oppfinnelsen angår videre anvendeLse av den nevnte metoden for å gi diagnose og prognose for sykdommer dominert av ATP (adenosintrifosfat) - forenet mod dTk-aktivitet, slik som kreft, tumor og spesielle virale infeksjoner så vel som sykdommer karakterisert av CTlJ (cytidintrifosfat) forenet med dTk-aktivitet, så som HSV of dTk isoenzyme activity in human or animal body fluid or cell sample as stated in the introductory part of patent claim 1. The invention further relates to the use of the aforementioned method to provide diagnosis and prognosis for diseases dominated by ATP (adenosine triphosphate) - united against dTk- activity, such as cancer, tumor and particular viral infections as well as diseases characterized by CTlJ (cytidine triphosphate) associated with dTk activity, such as HSV
(Herpes Simplex Virus) type 1 og type 2 og VZv (Varixel.La Zoster Virus)-infeks joner. Oppfinnelsen angår også (Herpes Simplex Virus) type 1 and type 2 and VZv (Varixel.La Zoster Virus) infect ions. The invention also concerns
anvendelsen av nevnte metode for dTk isoenzym karakterisering. the application of said method for dTk isoenzyme characterization.
Enzymet deoksythymidin kinase (dTk) gir den The enzyme deoxythymidine kinase (dTk) provides it
eukaryotiske cellen hjelpemidler for å utnytte deoksythymidin (dT), som ikke er et mellomprodukt i thymidylat syntesen de novo. Derfor er dTk betraktet som et "reddende" enzym, som fører dT inn i UNA metabolismen. Idet hovedmengden av dTK-form av en pattedyrcelle ikke er tilstede under celledelingen , er dTK kalt The eukaryotic cell aids in utilizing deoxythymidine (dT), which is not an intermediate in thymidylate synthesis de novo. Therefore, dTk is considered a "rescue" enzyme, which leads dT into the UNA metabolism. Since the majority of the dTK form of a mammalian cell is not present during cell division, the dTK is called
"rengjørings"-enzym. "cleaning" enzyme.
Tre forskjellige cellulære isoenzymer i mennskets Three different cellular isoenzymes in humans
celler er beskrevet. Cytosolar dTk, kalt dTk-F, som opptrer i optimale mengder ved celledeling (trinn Gl til S) (Bollo, Exptl. Cell.Res: 09:263, 1974; Littlefield, Biochi.m. cells are described. Cytosolar dTk, called dTk-F, which appears in optimal amounts during cell division (stages Gl to S) (Bollo, Exptl. Cell.Res: 09:263, 1974; Littlefield, Biochi.m.
Biophys. Acta. 115:398, 1963) og er mer eller mindre fraværende i hvilende celler. I mennsker er dette enzymet kodet i kromosom 17 nær området for galaktokinase. Det andre cellulære ieoenzymet er det mitokondriske, kalt dTK A, som er tilstede i mitokondrisk livmor. Aktiviteten av dette dTk forblir relativt konstant i løpet av de forskjellige celletrinnene (Adelstein et al., Develop. Biol. 26:537: 1971) og dTk-A er kodet ved kromosom 16. Det tredje dTk, en mindre aktivitet kalt dTk-B, er bare rapportert i kontinuerlige cellelinjer HeLa og KB, og sies å være begrenset til innsiden av den mitokondriske membranen (Kit, Pharmacol. Ther. 4:501, 1979). Biophys. Acta. 115:398, 1963) and is more or less absent in quiescent cells. In humans, this enzyme is encoded in chromosome 17 near the region of galactokinase. The second cellular ieoenzyme is the mitochondrial one, called dTK A, which is present in the mitochondrial uterus. The activity of this dTk remains relatively constant during the different cell stages (Adelstein et al., Develop. Biol. 26:537: 1971) and dTk-A is encoded by chromosome 16. The third dTk, a lesser activity called dTk-B , has only been reported in continuous cell lines HeLa and KB, and is said to be restricted to the inside of the mitochondrial membrane (Kit, Pharmacol. Ther. 4:501, 1979).
l)e tee cellulære dTk har forskjellige biokjemiske egenskaper. dTk-F og dTk-B, som er svært like, men skilles fra hverandre ved siden av lokalisering, ved isoelektrisk fokusering, ved at de hat forskjellig pL og ved elektroforetisk mobilitet. 1 kontrast til dTk-F og dTk-B, aksepterer dTk-A cy t id int: r if osf at (CTP) som en fosfatdonor, og er ikke så følsom som de andre overfor dTTP (deoksythymidinttifosfat)- inhiber ing. dTk-A fosforylerer også deoksycytid in (dC), og inhiberes av dCTP (Kit, Phamacol. Ther. (4:501,1979). l)e tee cellular dTk have different biochemical properties. dTk-F and dTk-B, which are very similar, but are distinguished by adjacent localization, by isoelectric focusing, by having different pL and by electrophoretic mobility. 1 contrast to dTk-F and dTk-B, dTk-A accepts cy t id int: r if osf at (CTP) as a phosphate donor, and is not as sensitive as the others to dTTP (deoxythymidine thiophosphate) inhibition. dTk-A also phosphorylates deoxycytide in (dC), and is inhibited by dCTP (Kit, Phamacol. Ther. (4:501,1979).
Med hensyn til virus har spesifikke isoenzymer, kodet i virusets genomen, blitt vist i cellen etter infeksjon av virus fra Herpesgruppen eller Pox-gruppen. Enzymatisk likner det mennskelige virus' dTK dTK-A, unntatt for den vaksinasjons-dTK som ikke kan gjøre bruk av CTP som fosfat-donor og heller ikke kan fosforylere deoksycytidln. Dette dTk er enkelt skjelnet fra menneskelige cellulære dTK ved elektroforese (Kit et al., Propgr. Med. Virol. 21:13, Karger Basel 1975). Både HSV dTK og VZV-dTk har et bredere spektrum av mulige fosfatdonorer, og aksepterer forskjellige pyrimidiner og substrater analoge med pyrimidin (Cheng et al., Biochem. Biophys. Acta. 452:370, 1976 og J. Virol. 3:172, 1979). Den konkurrerende blokkeringen av dTk isoenzym forenet dT-omdannelse til dTmp (deoksythymidin-monofosfat) utøvet av det dT-analoge 2'deoksy 5 ioduridin (lUdR), har vært kjent i lang tid. Bruken av isotopmerket lUdR direkte som et substrat for å oppnå høy følsomhet ved prøver av virus dTk er vist. (Gronowitz & Kallandet, T.nfec. Immun 29:425, 1980). With regard to viruses, specific isoenzymes, encoded in the genome of the virus, have been shown in the cell after infection by viruses from the Herpes group or the Pox group. Enzymatically, the dTK of the human virus is similar to dTK-A, except for the vaccination dTK which cannot use CTP as a phosphate donor and cannot phosphorylate deoxycytidine either. This dTk is easily distinguished from human cellular dTKs by electrophoresis (Kit et al., Propgr. Med. Virol. 21:13, Karger Basel 1975). Both HSV dTK and VZV-dTk have a wider spectrum of possible phosphate donors, accepting various pyrimidines and pyrimidine-analogue substrates (Cheng et al., Biochem. Biophys. Acta. 452:370, 1976 and J. Virol. 3:172, 1979). The competitive blockade of dTk isoenzyme united dT conversion to dTmp (deoxythymidine monophosphate) exerted by the dT analog 2'deoxy 5 ioduridine (lUdR) has been known for a long time. The use of isotopically labeled lUdR directly as a substrate to achieve high sensitivity in samples of virus dTk is shown. (Gronowitz & Kallandet, T.nfec. Immun 29:425, 1980).
Som nevnt er tilstedeværelsen av dTk-F i celler koplet tii celLedelingen, og det er mer eller mindre fraværende i den differensierte cellen (Munch-Petersen & Tyrsted, Biochem. Biophys. 478:364, 1977). Studier av dTk-aktivitet i transplanterbare tumorer hos mus har avdekket høye dTk aktiviteter med korrelasjon til veksthastighet (Bresnick et al., Cancer res. 29:1969, og Cancer Res. 31:743, 1971). Nye rapporter har demonstrert økt dTk-F i perifere blodlymfocytter som lider av ondartet non- Hodk in' s lymfomatisk leukemi og lymfe leukemi (Ellims et al., Cancer Res. 41:691 og Br i t. J . Haemato 1. 49:479, 1981). Her er: det også vist økt serum dTk-verdi i noen pasienter fra non-Hodkin's gruppen (Ellims et al., Blood 58:926, 198!.). lJå grunn av den konvensjonelle dTk-prøven som blir brukt, hvor As mentioned, the presence of dTk-F in cells is linked to cell division, and it is more or less absent in the differentiated cell (Munch-Petersen & Tyrsted, Biochem. Biophys. 478:364, 1977). Studies of dTk activity in transplantable tumors in mice have revealed high dTk activities with correlation to growth rate (Bresnick et al., Cancer Res. 29:1969, and Cancer Res. 31:743, 1971). Recent reports have demonstrated increased dTk-F in peripheral blood lymphocytes suffering from malignant non-Hodgkin's lymphomatous leukemia and lymphocytic leukemia (Ellims et al., Cancer Res. 41:691 and Br i t. J . Haemato 1. 49: 479, 1981). Here is: an increased serum dTk value has also been shown in some patients from the non-Hodkin's group (Ellims et al., Blood 58:926, 198!.). Because of the conventional dTk test that is used, where
3 6 3 6
en anvender H-dT i høy konsentrasjon (5 x 10 M) kunne dTk-aktiviteten bate bli funnet hos noen få pasienter med langt framskredet sykdom. Videre kunne dTk-aki: ivi teten bare bli målt som en prognose-markør dersom forskjellige analyser for dTk-F og dTk-A ble brukt. using H-dT in high concentration (5 x 10 M), the dTk activity could be found in a few patients with far-advanced disease. Furthermore, dTk-aki: ivi teten could only be measured as a prognostic marker if different assays for dTk-F and dTk-A were used.
Konvensjonelt har dTk aktiviteten blitt målt slik ved å 3 14 Conventionally, dTk activity has been measured like this by 3 14
følge overføringen av enten H- eller C-merket dT l: 11 dTmp med ATF som fosfat-donor. Nylig er det laget et forbedret dTk-prøvesystem for virus dTk-isoenzymer, som following the transfer of either H- or C-labeled dT l: 11 dTmp with ATF as phosphate donor. Recently, an improved dTk assay system has been created for viral dTk isoenzymes, which
125 125
benytter I-ioddeoksyurldin (lUdR) som substrat. Den forbedrete følsomheten som er oppnådd tillater deteksjon av dTk fra så lite som 25 HSV- inf iser te celler. Den uses I-iododeoxyurldine (lUdR) as substrate. The improved sensitivity achieved allows the detection of dTk from as few as 25 HSV-infected cells. It
3 3
konvensjonelle prøven basert på bruken av H-dT, ved en conventional test based on the use of H-dT, at a
- 5 - 5
normalt brukt konsentrasjon på 10 M, ville kreve minst 450 ganger mere enzym. Imidlertid, selv om det er nyttig i studier av virus-dTk, var dette systemet ikke egnet for langtidsprøvning av cellulære dTk-F, delvis på grunn av ustabiliteten av dette enzymet. Svakheten ved denne metoden for å detektere tilstedeværelsen av svært små mengder serum ser en lett fea studier over opptreden av virus dTk-blokkerende antistoffer (dTk-ab). I disse studiene ble mere enn 275 serumprøver fra mennesket undersøkt for dTk-ab, men forstyrrende dTk-aktiviteter ble funnet i bare to tilfeller (Gronowitz & Kållander, J. Med. Virol. 8:177, 1981, Kållander et al., Infec. immun 36 : 30, 1.982). normally used concentration of 10 M, would require at least 450 times more enzyme. However, although useful in studies of viral dTk, this system was not suitable for long-term testing of cellular dTk-F, in part due to the instability of this enzyme. The weakness of this method for detecting the presence of very small amounts of serum is easily seen in studies of the appearance of viral dTk-blocking antibodies (dTk-ab). In these studies, more than 275 human serum samples were examined for dTk-ab, but interfering dTk activities were found in only two cases (Gronowitz & Kållander, J. Med. Virol. 8:177, 1981, Kållander et al., Infec .immune 36 : 30, 1982).
Hovedformålet med oppfinnelsen er å utvikle hjelpemidler for in vitro diagnostisering av spesielle virusinfeksjoner og ondartete tumorer, omfattende overvåking av ondartetheten av forskjellige grunner. The main purpose of the invention is to develop aids for the in vitro diagnosis of special viral infections and malignant tumors, including monitoring of the malignancy for various reasons.
Et videre mål for oppfinnelsen er å utvikle et følsomt in vitco prøvesystem som er i stand til å detektere små mengder av dTk som er tilstede i menneskers og dyrs kroppsvæsker og celleprøver, f.eks. i serum, blemmesekreter, spinalvæsker, blærevæske og liknende kliniske prøver, hvilket system også er utformet for å minimalisere bidrag av cellulær dTk-A. A further aim of the invention is to develop a sensitive in vitco test system which is capable of detecting small amounts of dTk which are present in human and animal body fluids and cell samples, e.g. in serum, blister secretions, spinal fluids, bladder fluid and similar clinical samples, which system is also designed to minimize the contribution of cellular dTk-A.
lit videre mål for oppfinnelsen er å framskaffe en metode for in vitro undersøkelse av dTk-F for bruk ved detektering og å gi prognose av tumorsykdommer, og for overvåking av endring i sykdommene og detektering av t: i. I.bakef a 1.1. A further aim of the invention is to provide a method for in vitro examination of dTk-F for use in detecting and prognosing tumor diseases, and for monitoring changes in the diseases and detecting t: i. I.bakef a 1.1.
Tinda et mål for oppfinnelsen er anvendelsen av nevnte prøvemetode i undersøkelse av metastase i forbindelse med lungekreft av havrecelletypen. At first, an aim of the invention is the application of the aforementioned test method in the investigation of metastasis in connection with lung cancer of the oat cell type.
Kt mål for oppfinnelsen er også anvedelse av nevnte metode i forbindelse med lukemi for bestemmelse, ved måling av dTk tilstede i spinalvæske, om metastase er tilstede i cerebro- spinalsystemet. Another aim of the invention is the use of said method in connection with leukemia to determine, by measuring dTk present in spinal fluid, whether metastasis is present in the cerebro-spinal system.
Kt annet mål for oppfinnelsen er anvendelsen av nevnte undersøkelsesmetode som en gruppe-spesifikk markør for spesielLe infeksjoner i forbindelse med virale sykdommer. Another aim of the invention is the use of said examination method as a group-specific marker for special infections in connection with viral diseases.
Kt videre mål for oppfinnelsen er anvendelsen av en modifikasjon av nevnte undersøkelsesmetode for å oppnå spesifikk detektering av herpes vi rus- spesifikk dTk tilstede i f. eks. serum eller blærevæske. A further aim of the invention is the use of a modification of said examination method to achieve specific detection of herpes virus-specific dTk present in e.g. serum or bladder fluid.
Oppfinnelsen er angitt i den karakteriserende del av pa tontkrav 1. Ytterligere trekk framgår av de ustelvstendige kravene 2 til b, samt anvendelseskravene 6 til 8. The invention is stated in the characterizing part of patent claim 1. Further features are apparent from the non-independent claims 2 to b, as well as application claims 6 to 8.
Oppfinnelsen framskaffet slik et forbedret prøvesys tomf orj. in vitro måling av dTk-aktivitet, særlig rlTk V akt ivitoi.ior i f.eks. serum. Dette prøvesys ternet er atskillig mere følsomt enn tidligere kjente systemer, og det er fimnet at følsomheten er så høy at det er mulig å benytte prøvosystemet, som er svært enkelt i praksis, ikke bare for bestemmelse av patologiske dTk-aktiviteter, men også for normale aktviteter i friske individer (jmfr. fig. 1 og 6). Dette prøvesystemet ble ikke bare funnet å være svært følsomt og reproduserbart for dTk-F bestemmelser, idet det gir lineære omslag i mere enn to timet, men ble også funnet å gi 2 6 ganger høyere omslag enn tidligere kjente systemer med de vitale dTk. En annen viktig fordel, sammenliknet med det konvensjonelle prøvesysternet er det ved sammenlikning Lave omslag av dTk-A, idet dette isoenzym gir minimalt bidrag ved måling av dTk-F eller viral dTk i ikke rensete prøver. The invention thus provided an improved test system tomf orj. in vitro measurement of dTk activity, especially rlTk V act ivitoi.ior in e.g. serum. This test system is considerably more sensitive than previously known systems, and it has been shown that the sensitivity is so high that it is possible to use the test system, which is very simple in practice, not only for the determination of pathological dTk activities, but also for normal activities in healthy individuals (cf. figs. 1 and 6). This test system was not only found to be highly sensitive and reproducible for dTk-F determinations, giving linear covers for more than two hours, but was also found to give 26 times higher covers than previously known systems with the vital dTk. Another important advantage, compared to the conventional test system, is the comparatively low coverage of dTk-A, as this isoenzyme makes a minimal contribution when measuring dTk-F or viral dTk in unpurified samples.
En variant av dette prøvesystemet, ved å bruke CTP istedetfor ATP som fosfat-donor, ble funnet egnet for spesifikk detektering av herpesvirus- indusert dTk når prøvene som skulle analyseres var preinkubert med anti-herpesvirus dTk-blokkerende sera. A variant of this assay system, using CTP instead of ATP as the phosphate donor, was found suitable for specific detection of herpesvirus-induced dTk when the samples to be analyzed were preincubated with anti-herpesvirus dTk-blocking sera.
De fordelaktige og uventete tekniske effektene som her er beskrevet er i samsvar med oppfinnelsen oppnådd ved bruk av en kombinasjon som angitt i krav l's karakteriserende deL. The advantageous and unexpected technical effects described here are, in accordance with the invention, achieved by using a combination as stated in the characterizing part of claim 1.
Oppfinnelsen angår således en metode for in vitro bestemmelse av dTK isoenzymaktivitet i menneskets eller dyrs kroppsvæske eller celleprøve, omfattende reaksjon av nevnte prøve med et substrat for nevnte isoenzym i nærvær av en fosfatdonor og et buffersystem hvor substratet er 2'-deoksy-5-halouridin, hvori en del har isotopmerket 5-halogen, og måling av mengden fosforylert produkt dannet, idet denne mengden er proporsjonal med isoenzymverdien. Metoden i samsvar med oppfinnelsen er karakterisert ved at The invention thus relates to a method for in vitro determination of dTK isoenzyme activity in human or animal body fluids or cell samples, comprising reaction of said sample with a substrate for said isoenzyme in the presence of a phosphate donor and a buffer system where the substrate is 2'-deoxy-5-haluridine , in which a part is isotopically labeled 5-halogen, and measurement of the amount of phosphorylated product formed, this amount being proportional to the isoenzyme value. The method according to the invention is characterized in that
a) buffersystemet er hovedsakelig fritt for maleat og har en pH-verdi fra 5 til 9 og foreligget i en a) the buffer system is mainly free of maleate and has a pH value from 5 to 9 and is present in a
konsentrasjon på ikke mer enn 250 mM, concentration of not more than 250 mM,
b) at substratet foreligger i en konsentrasjon fra 2 x b) that the substrate is present in a concentration of 2 x
IO"<9> til 5 x 10"<6>M, og at IO"<9> to 5 x 10"<6>M, and at
c) fosfatdonoren foreligger i en konsentrasjon som ikke overskrider 20 mM, idet konsentrasjonene er c) the phosphate donor is present in a concentration that does not exceed 20 mM, the concentrations being
konsentrasjonene i prøveblandingen. the concentrations in the sample mixture.
I kontrast til det tidligere beskrevne prøvesystemet 125 In contrast to the previously described sample system 125
som bruker I-IUdR som substrat, gir prøvesystemet i samsvar med oppfinnelsen et lineært omslag av substrat for cellulær dTk-F i mere enn to timer, og følsomheten av detekteringen ble økt drastisk, noe som kan sees i fig. 1. Denne figuren er en sammenlikning mellom prøvesystemets i which uses I-IUdR as substrate, the test system in accordance with the invention provides a linear cover of substrate for cellular dTk-F for more than two hours, and the sensitivity of the detection was increased drastically, which can be seen in fig. 1. This figure is a comparison between the test system's i
samsvar med oppfinnelsen (-0-0-0) og nevnte tidligere kjente prøvesystem (a-a-a-) Gronowitz and Kallandet, Tnfec. Immun 29:42b, 1980). A = to sera inneholdende menneskelig dTk-F som stammer fra pasienter med leukemi. B = HSV type 2 dTk av accordance with the invention (-0-0-0) and said previously known test system (a-a-a-) Gronowitz and Kallandet, Tnfec. Immun 29:42b, 1980). A = two sera containing human dTk-F derived from patients with leukemia. B = HSV type 2 dTk of
175 cellekulturopprinnelse. Total tilgjengelig 1-IUdR var 175 cell culture origin. Total available 1-IUdR was
3 3
550 x 10 cpm. Figur IA og B er diagrammer som viser enzymaktivitet plottet mot tid, og viser den drastisk forbedrete følsomheten ved metoden i samsvar med oppfinnelsen i forhold til hva som er tidligere kjent. Figur 2A og B illusterer, ved hjelp av tic grafer, reduksjonen i radiokjemisk renhet av det ønskete substratet 1 25 550 x 10 cpm. Figures IA and B are diagrams showing enzyme activity plotted against time, and show the drastically improved sensitivity of the method according to the invention compared to what is previously known. Figures 2A and B illustrate, by means of tic graphs, the reduction in radiochemical purity of the desired substrate 1 25
1 samsvar med oppfinnelsen, '' 1-lUdR. 1 accordance with the invention, '' 1-lUdR.
Figur 3 er et diagram som viser beregningen av enzymaktivitet i enheter ved bruk av en intern substrat kont ro11. Figur 4 er et diagram som illustrerer den inhiberende effekt av høye serumkonsentras joner i dTk- mål inger. Figur 5 illustrerer, ved hjelp av diagrammer, bestemmelse av vital dTk i forskjellige kliniske prøver. Figur 6 er et diagram som illustrerer den normale fordelingen av dTk aktivitet hos blodgivere og gravide kv in ne r . Figur 7 er et diagram som illustrerer dTk-aktiviteter, målt i samsvar med oppfinnelsen, i sera fra pasienter med infeksjons mononuklerose og relatert til tid etter sykdommens start. Figur 8 er et diagram som illusterer dTk aktiviteter funnet i sera hos pasienter som lider av forskjellige virussykdommer:, mycoplasma lungebetennelse og papegøyesyke. Figur 9a og 9b er diagrammer som viser korrelasjonen mellom se rum dTk-a ktivitet målt i samsvar med oppfinnelsen og stadiet av sykdom for pasienter som lider av NHL. Figur 10a og 10b illustrerer sannsynligheten for overlevelse for NHL -pasienter relatert til prebehandlingsserum dTk-verdier måLt i samsvar med oppf innelsen. Figur 11 og 12 er diagrammer som illustrerer longitudinelle studier av serum dTk-verdier for NHL- pasienter med varierende klinisk retning. 1 en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er nevnte buffersystem tilstede i en konsentrasjon på mindre enn omtrent 150 mM, særlig omtrent 100 mM. Bufferens pH er fortrinnsvis i området 6.5-8, særlig 7.4. De beste resultatene er oppnådd med buffere uten maleat og manglende reaktive eller primære aminogrupper, særlig buffere hovedsakelig uten TR1E-maleat, idet HEPK5buffer er den særlig foretrukne bufferen. Figure 3 is a diagram showing the calculation of enzyme activity in units using an internal substrate control11. Figure 4 is a diagram illustrating the inhibitory effect of high serum concentrations in dTk measurements. Figure 5 illustrates, by means of diagrams, determination of vital dTk in different clinical samples. Figure 6 is a diagram illustrating the normal distribution of dTk activity in blood donors and pregnant women. Figure 7 is a diagram illustrating dTk activities, measured in accordance with the invention, in sera from patients with infectious mononucleosis and related to time after disease onset. Figure 8 is a diagram illustrating dTk activities found in the sera of patients suffering from various viral diseases:, mycoplasma pneumonia and parrot disease. Figures 9a and 9b are graphs showing the correlation between serum dTk activity measured in accordance with the invention and stage of disease for patients suffering from NHL. Figures 10a and 10b illustrate the probability of survival for NHL patients related to pretreatment serum dTk values measured in accordance with the invention. Figures 11 and 12 are diagrams illustrating longitudinal studies of serum dTk values for NHL patients with varying clinical direction. In a preferred embodiment of the invention, said buffer system is present in a concentration of less than approximately 150 mM, in particular approximately 100 mM. The pH of the buffer is preferably in the range 6.5-8, especially 7.4. The best results have been obtained with buffers without maleate and lacking reactive or primary amino groups, especially buffers mainly without TR1E maleate, HEPK5 buffer being the particularly preferred buffer.
Substratet bør være en isotopmerket thymidin-analog, særlig en 2•-deoksy-5-halogen-ur id in, hvori den merkete fortrinnsvis er en reaktiv halogenisotop. Det foretrukkete The substrate should be an isotopically labeled thymidine analog, particularly a 2•-deoxy-5-halogen uridine, wherein the labeled is preferably a reactive halogen isotope. The preferred
1 25 1 25
substratet er I- 2 '-deoksy --5-iodur idin. Den foretrukne substratkonsentrasjonen er i området 1 x 10~ 8 til 5 x 10 M, særlig omtrent 10 M. the substrate is I-2'-deoxy --5-ioduridine. The preferred substrate concentration is in the range of 1 x 10~ 8 to 5 x 10 M, especially about 10 M.
Den foretrukne fosfatdonoren for dTk-F bestemmelse et ATP, og den foretrukne fosfat-donoren for viral dTk-bestemmelse er CTP. Den foretrukne konsentrasjonen av fosfat-donoren er mindre enn omtrent 10 mM, særlig omtrent 0.5-5 mM. Fosfatdonorer kjent per se for å ha samme isoenzym-spesifisitet som ATP og CTP kan også benyttes. The preferred phosphate donor for dTk-F determination is ATP, and the preferred phosphate donor for viral dTk determination is CTP. The preferred concentration of the phosphate donor is less than about 10 mM, especially about 0.5-5 mM. Phosphate donors known per se to have the same isoenzyme specificity as ATP and CTP can also be used.
Mg<2+> bør fortrinnsvis være tilstede i minst ekvi.molar konsentrasjon i forhold til fos fat-donor. Et reduksjonsmiddel, som ditiotreitol, er fortrinnsvis også tilstede. Mg<2+> should preferably be present in at least an equimolar concentration in relation to the phosphate donor. A reducing agent, such as dithiothreitol, is preferably also present.
Målingen av det fosforylerte produktet kan gjøres ved prosedyrer kjent per se (se f.eks. Gronowitz et Kållander, Infec. Immun. 29:425, 1980). The measurement of the phosphorylated product can be done by procedures known per se (see, e.g., Gronowitz et Kållander, Infec. Immun. 29:425, 1980).
Anvendelsen av undersøkelses-systemet i samsvar med oppfinnelsen for detektering av dTk-aktiviteter i kliniske prøver f.eks. serum eller blemmesekret, ga et nytt verktøy fon å diagnostisere spesielle virusinfeksjoner, og ondarete sydommer. Abnorme serum dTk verdier (f.eks. > 10 enheter), oppnådd med en enkel dTk-prøve med den beskrevne prosedyren, ble også funnet å være en utmerket markør for prognose-bruk og slik også sekvensvise dTk-verdier ved overvåking av progresjonen eller regresjonen av ondartet sykdom. Videre vil for disse pasientene serum dTk-verdier være egnet som et tegn på tilbakefall og ved bedømmelse av terapieffekten. Dette blir eksemplifisert senere. The use of the examination system in accordance with the invention for detecting dTk activities in clinical samples, e.g. serum or blister secretion, provided a new tool to diagnose particular viral infections, and malignant diseases. Abnormal serum dTk values (eg, > 10 units), obtained with a simple dTk test using the described procedure, were also found to be an excellent marker for prognostic use and so were sequential dTk values in monitoring the progression or the regression of malignant disease. Furthermore, for these patients, serum dTk values will be suitable as a sign of relapse and when assessing the therapy effect. This will be exemplified later.
1 don foretrukne utførelsesform, som i praksis er benyttet ved utførelsen av testene rapportert nedenfor, er 2' - deoksy-5 ioduridin (lUdR) brukt som substrat, der en del 125 1 don preferred embodiment, which is used in practice in the execution of the tests reported below, is 2'-deoxy-5 ioduridine (lUdR) used as substrate, where a part 125
rui r: isotopir.erket 5 ha Logen i. form av 1. Sammenset ingen og egenskapene, inkludert sluttkonsentrasjoner, av det lotrukne undersøkelses systemet er vist i tabell 1 nedenfor. rui r: isotopir.erket 5 ha The log in. form of 1. Compound none and the properties, including final concentrations, of the randomly drawn survey system are shown in table 1 below.
'"'sammensetningen av en dobbel prøve er: 51.5 mikro li tee prøveblanding, 6 in i kr o 1 i. te r subst rat løsning (sluttkonsentrasjon av LUdH på 1 x 10" / M, 130-160 Ci./mM), og 2.5 raikrolitor enzymløsning, f.eks. serum (tilsatt når; reaksjonen starter), som gir et sluttvolum på 6 o in i k r o 1 i t e r . '"'the composition of a double sample is: 51.5 micro li tee sample mixture, 6 in i kro o 1 i. te r substrat solution (final concentration of LUdH of 1 x 10" / M, 130-160 Ci./mM), and 2.5 liters of enzyme solution, e.g. serum (added when; the reaction starts), which gives a final volume of 6 o in i c r o 1 i t e r .
^N-2-hyroksyetylpiperazin N-2-etansuLfonsyce. ^N-2-hyroxyethylpiperazine N-2-ethanesuLfonsyce.
Generelt lages en dobbel prøve, bestående av 51.b mikrolitet reaksjonsblanding, som er blandet med 6 mi.kro1.iter subs t ra t løsning rett før bruk. Reaksjonen startes så ved tilsats av 2.5 mikrolitet enzymløsning (f.eks. serumprøve). Fra dette standardvolumet på totalt 60 mikrolitet, tas to prøver, hver på 25 mikroliter. Sammensetningen av prøveblanding for eksperimenter bestående av flere doble prøver, tatt etter forskjellige inkubasjonstider, er beregnet ved å multiplisere volumene av komponentene i standardløsningen med det ønskete antallet av doble prøver. Prøven blir undersøkt ved 37°C, og alle komponenter er forvarmet i to minutter før reaksjonen startes. Enzymreaksjoen er terminert ved å pipettere prøver In general, a double sample is made, consisting of 51 microliters of reaction mixture, which is mixed with 6 microliters of substrate solution immediately before use. The reaction is then started by adding 2.5 microliters of enzyme solution (e.g. serum sample). From this standard volume of a total of 60 microliters, two samples, each of 25 microliters, are taken. The composition of the sample mixture for experiments consisting of several duplicate samples, taken after different incubation times, is calculated by multiplying the volumes of the components of the standard solution by the desired number of duplicate samples. The sample is examined at 37°C, and all components are preheated for two minutes before the reaction is started. The enzyme reaction is terminated by pipetting samples
2 2
ned på et 1 cm stykke Whatman UEAE-81 papir holdt ved 90- 100°C. For å separere produktet fra substratet vaskes papiret fire ganger i 6 mM ammoniumformat--løsning, en gang i destillert vann og til slutt i metanol. Vaskingen utføres i et 1 liters glassbeger med magnetrører. Ti til femten papirplater, plassert i en sil, er laget samtidig. Silen flyttes til et nytt vaskebad hvert femte minutt. Til slutt måles aktiviteten fra papirplatene i en automatisert gammateller. onto a 1 cm piece of Whatman UEAE-81 paper held at 90-100°C. To separate the product from the substrate, the paper is washed four times in 6 mM ammonium formate solution, once in distilled water and finally in methanol. The washing is carried out in a 1 liter glass beaker with magnetic stirrers. Ten to fifteen paper plates, placed in a strainer, are made at the same time. The strainer is moved to a new washing bath every five minutes. Finally, the activity from the paper plates is measured in an automated gamma counter.
For å eliminere dag-til-dagvariasjon i dTk verdi ble de oppnådde reaksjonshastighetene omregnet til enheter. Grunnen til å frigjøre enheter ved definisjon av enzymmengder, er variasjonen i initiell radiokjemi.sk renhet, kombinert med den funnete biologiske nedbrytning av To eliminate day-to-day variation in the dTk value, the obtained reaction rates were converted to units. The reason for releasing units when defining enzyme quantities is the variation in initial radiochemical purity, combined with the found biological degradation of
1 25 1 25
kommersielt tilgjengelig 1-IUdR som g]ør total radioaktivitet tilsatt pet prøve ikke-relevant for enzymaktivitetsbetegninger. Se figur 2 som viser separasjon av batcher av kommersielt oppnådd ] 25I-IUdR på tynnsjiktkromatografi ved å bruke på forhånd dekkete silikagelplater (Merck 60F„C/1). Som eluent ble det brukt commercially available 1-IUdR which makes total radioactivity added to pet sample not relevant for enzyme activity designations. See Figure 2 showing separation of batches of commercially obtained ] 25 I-IUdR on thin layer chromatography using pre-coated silica gel plates (Merck 60F„C/1). As eluent it was used
z b 4 z b 4
15% metanol og 85% kloroform. A=profiler på dagen for mottak, indikerer 62% readiokjemisk renhet. B=samme batch etter 150 dager i kjøleskap. Først ble 90% radiokjemi.sk 15% methanol and 85% chloroform. A=profiles on the day of receipt, indicating 62% radiochemical purity. B=same batch after 150 days in a refrigerator. First, 90% were radiochemi.sk
tonnet ktevet av produsentene. Istedet ble en intern biologisk kontroll, for måling av tilgjengelig radioaktivitet, inkludert i hver prøve. Denne "kontrollen" var en 100 ganger overskridelse av en HSV type 2 dTk preparering, og gir ekstensiv substtattømming. Mengden radioaktivitet inkorporert i en times undersøkelse ved denne kontrollen ble funnet å være omtrent 85% av verdiene av 125 intakt 1 UJdR, som beregnet fra tynnsjiktkromatografi. Ved betraktning av verdien (85%) funnet for den biologiske kontrollen, vil 1 enzymenhet bli enzymmengden som overfører the tonne kvet by the producers. Instead, an internal biological control, for measuring available radioactivity, was included in each sample. This "control" was a 100-fold excess of an HSV type 2 dTk preparation, and provides extensive substrate depletion. The amount of radioactivity incorporated in a one hour examination at this control was found to be approximately 85% of the values of 125 intact 1 UJdR, as calculated from thin layer chromatography. Considering the value (85%) found for the biological control, 1 enzyme unit will be the amount of enzyme that transfers
- 15 - 15
4.3 x 10 mol substrat per time (under betingelser som beskrevet). Forholdet mellom renhet og omtrentlig molart omslag ble valgt, idet 1 enhet praktisk vil bli uttrykt som omtrent 1000 cpm, ved mengden isotop som normalt brukes (jmfr. tabell 1). Kn annen fordel med denne biologiske isotopkontrollen, er at idet den er laget på samme måte som testprøvene, er de mulige variasjonene i enheter pga. variasjoner i produktgjenfinning eliminert. Prosedyren for beregningen er eksemplifisert i figur 3. Verdier for både prøven ( o o ) og "kontrollen" (-A-A-) er vist. A er verdien for den interne "kontrollen" i cpm, som er proporsjonal med totalt isotopmerket substrat. B er verdien av produktet dannet ved den undersøkte prøven uttrykt som cpm per time. 4.3 x 10 mol substrate per hour (under conditions as described). The ratio between purity and approximate molar cover was chosen, as 1 unit would practically be expressed as approximately 1000 cpm, at the amount of isotope normally used (cf. table 1). Another advantage of this biological isotope control is that, as it is made in the same way as the test samples, the possible variations in units due to variations in product retrieval eliminated. The procedure for the calculation is exemplified in Figure 3. Values for both the sample ( o o ) and the "control" (-A-A-) are shown. A is the value of the internal "control" in cpm, which is proportional to total isotopically labeled substrate. B is the value of the product formed by the examined sample expressed as cpm per hour.
Enheter (U) - TB.(S).v]/[A-5.3 x IO<15>], der (S) er substratkonsentrasjonen (M), og v er prøvevolumet (liter). Units (U) - TB.(S).v]/[A-5.3 x IO<15>], where (S) is the substrate concentration (M), and v is the sample volume (liters).
Bestemmelse av dTk-aktiviteter Determination of dTk activities
Kvantifisering av serum dTk ble gjort i microtitier pLater. For hver 20. ser.umprve ble bakgrunns" kont roi ler" og en intern subst rat"kont roi 1" (se ovenfor) inkludert, og settet: ble senere behandlet som en enhet. Mengdene av serumprøve som ble brukt var 5 mikroliter (eller mindre) per 120 mikroliter sluttvolum, idet mere serum kunne virke inhiberende. Se figur 4. dTk-aktiviteter ble bestemt ved prøver ved 120 minuttet. Quantification of serum dTk was done in microtitier plates. For every 20 samples, a background "control" and an internal substrate "control 1" (see above) were included, and the set: was later treated as a unit. The amounts of serum sample used were 5 microliters (or less) per 120 microliters final volume, as more serum could be inhibitory. See Figure 4. dTk activities were determined by samples at the 120 minute mark.
Enzymaktivitet plottet mot serumkonsentras jon per 60 mikrolitet prøve, (o-o) serum fra et individ som Lider av NHL, (A-A) serum fra et individ som Lider av aktiv CI.L. Den inhiberende effekten skyldes troLig t ilstedovæee Lsen av nukleotider eller nukleosider, slik som f.eks. thymidin, thymidintrifosfat eller katabolske enzymer tilstede i noe sera. Doble prøver ble tatt etter 60 og 120 minutter. Medium omslag per time og 2b mikroliter prøve, etter korreksjon for; bakgrunnen, ble beregnet fra hver dobbelt prøve separat. Gjennomsnittlig hastighetsverd i for 60 og 120 minutters prøvetakning ble så bestemt, og brukt i videre beregninger (se ovenfor), dersom < 20% variasjon ble funnet. Enzyme activity plotted against serum concentration per 60 microliter sample, (o-o) serum from a subject suffering from NHL, (A-A) serum from a subject suffering from active CI.L. The inhibitory effect is probably due to ilstedovæee Lsen of nucleotides or nucleosides, such as e.g. thymidine, thymidine triphosphate or catabolic enzymes present in some sera. Duplicate samples were taken after 60 and 120 minutes. Medium cover per hour and 2b microliter sample, after correction for; the background, was calculated from each duplicate sample separately. The average speed value for 60 and 120 minutes of sampling was then determined, and used in further calculations (see above), if < 20% variation was found.
Bestemmelse av dTk-aktiviteter tilstede i spinalvæske Hovedsakelig samme prosedyre som for serum ble brukt. Determination of dTk activities present in spinal fluid Essentially the same procedure as for serum was used.
12b 12b
Den spesifikke aktiviteten av I-lUdR var økt til rundt 320 Ci/mM. Spinalvæsker kan bli konsentrert før enzymbestemmelset. The specific activity of I-lUdR was increased to about 320 Ci/mM. Spinal fluids can be concentrated before the enzyme determination.
Kvalitativ best emmelse av dTk isoenzymer Qualitative optimization of dTk isoenzymes
Kliniske prøver, f.eks. blemmevæsker eller serum, som inneholder dTk-aktivitet ble preinkubert med izoenzym spesifikk dTk blokkerende antistoff og resterende enzymaktivitet ble bestemt i samsvar med prosedyren beskrevet ovenfor. ATF i en prøveblanding ble erstattet av CTP, noe som resulterer i eksklusjon av dTk-F aktivitet. Prøvene som skulle undersøkes ble i serier fortynnet to ganger (vanligvis start ved 1:6) i reaksjonsblanding, og lb mikroliter ble overført fra hver fortynning til fire kar i en microtitier-plate, for å oppnå fire identiske fortynningssett. På forhånd fortynnet VZV dTk- blokkerende serum (2b ml) ble tilsatt til et kar, et HSV type 1 dTk-blokkerende serum til et annet kar, et HSV type 2 dTk-blokkerende serum til et tredje kar og til det fjerde karet et negativt serum. Blandingene ble inkubert ved 37°C i 90 minutter, for å la enzymantistoffreaksjonen skje. Så ble den resterende enzymaktiviteten bestemt. Reaksjonen ble startet ved tilsats av 20 mikroliter av en løsning bestående av 6 mikroliter substrat Løsning blandet med 14 mikroliter reaksjons Løsning. For hver fortynning ble verdiene oppnådd ved tilstedeværelsen av forskjellige antisera omregnet til prosent; ,-iv verdiene oppnådd med negativt serum. Eksempler på slike resterende enzymaktiviteter plottet mot Log2 fortynningen av prøver er vist i figur 5, hvori den resterende aktiviteten etter inkubasjon med anti VZV dTk serum (A-A) i relasjon til kont roLLinkubasjon med negativt serum er plottet mot forskjellige fortynninger av følgende prøver: A - blærevæske fra et individ som lider av HSV type 2 infeksjon; C = blærevæske fea et individ som lider av HSV type L infeksjon; D - serum fra et individ som lider av VZV infeksjon. Fra inhiberingsmønstrene kan dTk-typen ekelt f i nnes. Clinical tests, e.g. blister fluids or serum, containing dTk activity were preincubated with isoenzyme specific dTk blocking antibody and residual enzyme activity was determined according to the procedure described above. ATF in a sample mixture was replaced by CTP, resulting in the exclusion of dTk-F activity. The samples to be examined were serially diluted twofold (usually starting at 1:6) in reaction mixture, and 1 lb microliters were transferred from each dilution to four wells in a microtiter plate, to obtain four identical dilution sets. Prediluted VZV dTk blocking serum (2b ml) was added to one vessel, an HSV type 1 dTk blocking serum to another vessel, an HSV type 2 dTk blocking serum to a third vessel and to the fourth vessel a negative serum. The mixtures were incubated at 37°C for 90 minutes to allow the enzyme antibody reaction to occur. Then the remaining enzyme activity was determined. The reaction was started by adding 20 microliters of a solution consisting of 6 microliters of substrate solution mixed with 14 microliters of reaction solution. For each dilution, the values obtained in the presence of different antisera were converted into percentages; ,-iv the values obtained with negative serum. Examples of such residual enzyme activities plotted against the Log2 dilution of samples are shown in Figure 5, in which the residual activity after incubation with anti VZV dTk serum (A-A) in relation to control incubation with negative serum is plotted against different dilutions of the following samples: A - bladder fluid from an individual suffering from HSV type 2 infection; C = bladder fluid fea an individual suffering from HSV type L infection; D - serum from an individual suffering from VZV infection. From the inhibition patterns, the dTk type can clearly be found.
Kt viktig trekk ved oppfinnelsen er slik den drastisk økte detetkeringsfølsomheten, som tillater målinger også av normale serumverdier av dTk-F i friske individer, som kan sees av figur 6, som viser fordeligen av dTk-aktivitet funnet i serum fra 99 blodgivere (utfylte kolonner) og 25 gravide kvinner i det første kvartalet (skyggelagte kolonner). Gjennomsnittet er 2.4 enheter/mikroliter med et standardavvik på 1.25. Undersøkelser av serumprøver fra individer som lider av infeksjonssykdommer førte til oppdagelsen av 10-40 ganger forhøyet dTk-verdier i serum fra pasienter i aktutte stadier av spesielle virusinfeksjoner, f.eks. monomucleosis infectiosa, tubella- og morbillivirus infeksjoner. Figur 7 viser dTk-akvitiet/miktoliter dannet i sera fra pasienter med infeksjonsmononukleose relatert til tid etter start av sykdom. Symboler merket med samme bokstav indikerer sera fra samme pasient, og de prikkete linjene viser den normale verdien for friske individer. Figur 8 viser dTk-aktiviteten/mikroliter funnet i akutt (•) og konvalesent (o) sera fra pasienter som lider av forskjellige virusinfeksjoner, mycoplasma pneumonia og psittacosis. De prikkete linjene indikerer en verdi som er fire ganger den normale verdien for friske individer. An important feature of the invention is the drastically increased detection sensitivity, which allows measurements also of normal serum values of dTk-F in healthy individuals, which can be seen from figure 6, which shows the advantage of dTk activity found in serum from 99 blood donors (filled columns ) and 25 pregnant women in the first trimester (shaded columns). The average is 2.4 units/microliter with a standard deviation of 1.25. Investigations of serum samples from individuals suffering from infectious diseases led to the discovery of 10-40 times elevated dTk values in serum from patients in acute stages of particular viral infections, e.g. monomucleosis infectiosa, tubella and morbillivirus infections. Figure 7 shows the dTk activity/mycoliths formed in sera from patients with infectious mononucleosis related to time after onset of illness. Symbols marked with the same letter indicate sera from the same patient, and the dotted lines show the normal value for healthy individuals. Figure 8 shows the dTk activity/microliter found in acute (•) and convalescent (o) sera from patients suffering from various viral infections, mycoplasma pneumonia and psittacosis. The dotted lines indicate a value four times the normal value for healthy individuals.
Vedrørende herpesvirus indikerer resultatene forhøyet serum dTk aktiviteter i forbindelse med primære infeksjoner. Ingen konsekvent økning i dTk aktiviteter (>10 enheter) ble funnet i forbindelse med andre infeksjoner (figur 8). Karakteriseringen av serumaktivitetene som er funnet har hittil vist tilstedeværelse av Varizella Zoster Virus (VZV) spesifikk dTk (tabell 2) og celle-dTk-F. Det er også vist at metoden i samsvar med oppfinnelsen kan benyttes for bestemmelse av virus-spesifikk dTk tilstede i blærevæsker lor rask diagnose av infeksjoner (tabell 2). All serum dTk-aktivitet funnet i forbindelse med vira le infeksjoner forsvant gradvis og nådde normale verdier i løpet av 2-6 uker. Ved betraktning av pasienter som lider av ondartete sykdommer, viser et begrenset studium ved å bruke målemetoden i samsvar med oppfinnelsen, forhøyet serum dTk-verdier ikke bare hos pasienter med onda r tet heter med opprinnelse fra det lymf. o- pr o 1 ifera t i ve systemet, men også hos pasienter med onda rtethetet av andre celler med metastase i det lymf.olif erat ive systemet (se tabell 3). Regarding herpes viruses, the results indicate elevated serum dTk activities in connection with primary infections. No consistent increase in dTk activities (>10 units) was found in association with other infections (Figure 8). The characterization of the serum activities found has so far shown the presence of Varizella Zoster Virus (VZV) specific dTk (Table 2) and cellular dTk-F. It has also been shown that the method according to the invention can be used for the determination of virus-specific dTk present in bladder fluids for rapid diagnosis of infections (table 2). All serum dTk activity found in association with viral infections gradually disappeared and reached normal values within 2-6 weeks. When considering patients suffering from malignant diseases, a limited study using the measurement method according to the invention shows elevated serum dTk values not only in patients with malignancies of lymphatic origin. o- pr o 1 ifera tive system, but also in patients with the malignancy of other cells with metastasis in the lymph.olif erat ive system (see table 3).
ForkorteJser brukt: Abbreviations used:
I!!): liodgki ns' sykdom :\HL: non-liodgkins' lymfomatisk sykdom CMI,: Kronisk myeloisk leukemi I!!): liodgkin ns' disease :\HL: non-liodgkins' lymphomatic disease CMI,: Chronic myelogenous leukemia
VAA. : Kronisk lymfeleukemi Wow. : Chronic lymphocytic leukemia
Utstrakte studier er utført med veldefinert stort serummatetiale fra pasienter med lymfo-profilferative sykdommer så som non-Hodgkins' lymfomatisk sykdom (NHL), Hodgkins<*> sykdom (HD), kronisk og aktiv lymfe-leukemi (CLL) Extensive studies have been carried out with well-defined large serum materials from patients with lympho-proliferative diseases such as non-Hodgkins' lymphoma (NHL), Hodgkins<*> disease (HD), chronic and active lymphocytic leukemia (CLL)
og myelomas. Detaljerte resultater i NHL-gruppen var som følger: Normal serum dTk og oppnådde dTk-verdier av forskjellige størrelser ble funnet. Disse dTk-verdiene korrelerte til stadier av sykdommen, (se figur 9a som viser serum-dTk i 155 ubehandlete pasienter med NHL korrelert til stadiet for sykdommen), dvs. jo mer framskreden sykdom jo høyere dTk-verdi. Da dTk-verdiene ble relatert til onda rtetheten for tumorcellene (klassifikasjon i samsvar med Kiel-systemet), ble en god korrelasjon mellom høye and myeloma. Detailed results in the NHL group were as follows: Normal serum dTk and obtained dTk values of different magnitudes were found. These dTk values correlated to stages of the disease, (see Figure 9a which shows serum dTk in 155 untreated patients with NHL correlated to the stage of the disease), i.e. the more advanced the disease, the higher the dTk value. When the dTk values were related to the malignancy of the tumor cells (classification according to the Kiel system), a good correlation between high
dTk-verdier og ondattetheten funnet (se figur 9b som viser serum dTk i LOI NHL pasienter i trinn III-IV inndelt i tre trinn av ondartethet).• dTk values and the malignancy rate found (see Figure 9b showing serum dTk in LOI NHL patients in stages III-IV divided into three stages of malignancy).•
Nytten av prøvemetoden i samsvar med oppfinnelsen for prognose-tilfeller ble demonstrert med høyt signifikante forskjeller i overlevelsestid mellom pasientgrupper dannet ved inndeling i samsvar med de målte dTk-verdiene hhv. <10 enheter og >10 enheter. Figur 10a viser sannsynligheten for overlevelse for NHL pasienter i stadium 1I1-IV med forbehandling serum dTk <10 enheter (o-o-, n=50) og >10 The usefulness of the trial method in accordance with the invention for prognosis cases was demonstrated with highly significant differences in survival time between patient groups formed by division in accordance with the measured dTk values or <10 units and >10 units. Figure 10a shows the probability of survival for NHL patients in stage 1I1-IV with pre-treatment serum dTk <10 units (o-o-, n=50) and >10
enheter (•-•-, n=51). Tallene i parentes indikerer gjenværende individer ved observasjon etter 32 måneder. units (•-•-, n=51). The numbers in parentheses indicate remaining individuals at observation after 32 months.
Figur 10b viser sannsynligheten for overlevelse for NHL-pasienter på stadium 111-IV med "høygrad" ondartethet av tumor, førbehandlingsverdi av serum dTk <10 (o-o, n^ll) og >10 enheter (-•-•- , n = 27). Figure 10b shows the probability of survival for stage 111-IV NHL patients with "high-grade" tumor malignancy, pretreatment value of serum dTk <10 (o-o, n^ll) and >10 units (-•-•- , n = 27 ).
Tallene i parentes indikerer gjenværende individer ved obervasjon etter 32 måneder. The numbers in brackets indicate remaining individuals at observation after 32 months.
Videre har longitudinelle studier av serum dTk-verdier Furthermore, longitudinal studies of serum dTk values have
i NHL-pasienter avdekket endringer som korrelerer med endringer i sykdomen, dvs. lavere verdier ved regresjon av sykdom, høyere ved progresjon og uendret ved konstant sykdom. Figur 11 viser variasjonene i de målte serum dTk verdiene for A: tre pasienter med progressiv sykdom, B: to pasienter behandlet til sykdommen ble holdt delvis i sjakk og C: fite pasienter behandlet til sykdommen ble holdt fullstendig i sjakk. I figur 12 er et serum dTk fulgt longitudinelt i pasienter hvor både progressiv sykdom (a) og sykdom holdt i sjakk (b) opptrer. A) var to pasienter med progressiv sykdom som etter endring i terapi ble behandlet til sykdommen var holdt delvis i sjakk før sykdommen viste progresjon igjen. B) var tre pasienter behandlet til sykdommen var holdt i sjakk. A.H. og E.L. til delvis, og G.E. til sykdommen var holdt fullstendig i sjakk. Alle disse fikk tilbakefall senere. A.H. viste respons for terapi for en kort tid en gang til. Disse resultatene viset klart muligheten for å følge terapieffekten og også å raskt detektere tilbakefall både i løpet av og etter behandling som økende dTK-verdier. in NHL patients revealed changes that correlate with changes in the disease, i.e. lower values in case of regression of disease, higher in case of progression and unchanged in case of constant disease. Figure 11 shows the variations in the measured serum dTk values for A: three patients with progressive disease, B: two patients treated until the disease was partially controlled and C: obese patients treated until the disease was completely controlled. In Figure 12, a serum dTk is followed longitudinally in patients where both progressive disease (a) and disease kept in check (b) occur. A) were two patients with progressive disease who, after a change in therapy, were treated until the disease was kept partially in check before the disease showed progression again. B) three patients were treated until the disease was kept in check. A.H. and E.L. to partial, and G.E. until the disease was kept completely at bay. All of these relapsed later. A.H. showed response to therapy for a short time once more. These results clearly showed the possibility to follow the therapy effect and also to quickly detect relapse both during and after treatment as increasing dTK values.
Ved bruk av undersøkelsesmetoden i samsvar med oppfinnelsen i forbindelse med andre ovenfor nevnte lymfoproliferative sykdommer, ble variable serum dTk verdier funnet, f.eks. i kronisk CLL ble normale verdier funnet, mens halvt aktiv CLL ga lave, men patologiske verdier (>10 enheter), og aktiv CLL høye. Mulige anvendelser av dTk-verdier, som eksemplifisert for NHL, er også relevant for CLL. Videre viser studier av spinalvæske fra pasienter med leukemi tilstedeværelse av dTk når leukemiceller er tilstede i cerebro-spinalsystemet. Når det gjelder kreft, indikerer resultater funnet fra pasienter med lungekreft av havre-celletypen muligheten for å frigjøre serum dTk verdier som et tegn på metastase så vel som for annen kreft. Disse konklusjonene framgår av tabell 3. When using the examination method in accordance with the invention in connection with other lymphoproliferative diseases mentioned above, variable serum dTk values were found, e.g. in chronic CLL normal values were found, while semi-active CLL gave low but pathological values (>10 units), and active CLL high. Possible applications of dTk values, as exemplified for NHL, are also relevant for CLL. Furthermore, studies of spinal fluid from patients with leukemia show the presence of dTk when leukemia cells are present in the cerebro-spinal system. In the case of cancer, results obtained from patients with oat-cell lung cancer indicate the possibility of releasing serum dTk values as a sign of metastasis as well as of other cancers. These conclusions appear in table 3.
Naturligvis må en være oppmerksom på mulig fLyktig forhøyet serum dTk-verdi i pasienter med ondartet sykdom pga. de ovennevnte virusinfeksjonene. Imidlertid er disse virussykdommene normalt oppstått i barndommen, mens ondartete tumorsykdommer vanligvis forekommer hos voksne. En annen faktor relevant for bruk av serum dTk-verdier for de beskrevne tilfellene er den sjeldne forekomsten av forhøyet dTk-aktivitet indikert i et studium av et tilfeldig serummateriale fea pasienter: med udefinerte sykdommer, og derved oppnådd i diagnosehensikt. Studier av medisinske notater for disse og andre pasienter har vist at verken patologiske verdier i leverfunksjonstester eller leucocytosis normalt er fulgt av forhøyete serum dTk-verdier. Naturally, one must be aware of possible transiently elevated serum dTk values in patients with malignant disease due to the above-mentioned viral infections. However, these viral diseases normally occur in childhood, while malignant tumor diseases usually occur in adults. Another factor relevant to the use of serum dTk values for the described cases is the rare occurrence of elevated dTk activity indicated in a study of a random serum material fea patients: with undefined diseases, and thereby obtained for diagnostic purposes. Studies of medical notes for these and other patients have shown that neither pathological values in liver function tests nor leucocytosis are normally followed by elevated serum dTk values.
Claims (8)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8203041A SE453514B (en) | 1982-05-14 | 1982-05-14 | SET TO DETERMINE DEOXITYMIDINKINAS-DTK ISOENZYM LEVELS IN BODY LIQUID OR CELL SAMPLES AND THE APPLICATION OF THE ISOENZYM TYPE PROCEDURE |
| PCT/SE1983/000190 WO1983004054A1 (en) | 1982-05-14 | 1983-05-10 | A method for determination of deoxythymidine kinase (dtk) isoenzyme activity and use thereof for the diagnosis of diseases |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO840117L NO840117L (en) | 1984-01-13 |
| NO165599B true NO165599B (en) | 1990-11-26 |
| NO165599C NO165599C (en) | 1991-03-13 |
Family
ID=26658180
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO840117A NO165599C (en) | 1982-05-14 | 1984-01-13 | A METHOD FOR DETERMINING DTK ISOENZYM ACTIVITY AND USING THIS FOR IN VITRO DIAGNOSIS OF DISEASES |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| NO (1) | NO165599C (en) |
-
1984
- 1984-01-13 NO NO840117A patent/NO165599C/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO165599C (en) | 1991-03-13 |
| NO840117L (en) | 1984-01-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4067775A (en) | Process and composition for determining the activity of creatinekinase-MB | |
| Erice | Resistance of human cytomegalovirus to antiviral drugs | |
| CA1125151A (en) | Triglycerides assay and reagents therefor | |
| US5985565A (en) | Chronic fatigue syndrome diagnosis | |
| Lundin et al. | Sensitive assay of creatine kinase isoenzymes in human serum using M subunit inhibiting antibody and firefly luciferase | |
| US5576177A (en) | Bioassay for reverse transcriptase inhibitors | |
| ES2333181T3 (en) | METHOD FOR THE DETECTION OF A GLUCOSE LIGHT INTOLERANCE OR INSULIN HYPOSECRETION. | |
| WO2018174336A1 (en) | Method for detecting atp by using personal blood glucose meter | |
| Anstiss et al. | An automated technique for segregating populations with a high incidence of Regan isoenzyme in serum | |
| JPH0687799B2 (en) | Analytical element, composition and method for analysis of theophylline by enzyme inhibition | |
| CN111057746B (en) | Creatine kinase isoenzyme determination kit | |
| Orfanos et al. | A rapid screening test for Duchenne muscular dystrophy using dried blood specimens | |
| US4237044A (en) | Antibodies against creatinekinase-M8 and process for the production thereof | |
| JPH01257266A (en) | Reagent for measuring activity of creatine kinase and measuring method using said agent | |
| US6861225B1 (en) | Method and reagent kit for determining activity of 5-nucleotidase | |
| Fujimura et al. | Microdetermination of galactose and galactose 1-phosphate in dried blood spots | |
| DK167692B1 (en) | Process for determining deoxythymidine kinase (dTk) isoenzyme levels, and use of the process | |
| NO165599B (en) | A METHOD FOR DETERMINING DTK ISOENZYM ACTIVITY AND USING THIS FOR IN VITRO DIAGNOSIS OF DISEASES | |
| Jyssum | UTILIZATION OF THYMINE, THYMIDINE AND TMP BY NEISSERIA MENINGITIDIS: 2. Lack of Enzymes for Specific Incorporation of Exogenous Thymine, Thymidine and TMP into DNA | |
| WO1997039352A1 (en) | Assays for detection of purine metabolites | |
| Bernstein et al. | Adenylate kinase in human tissue: II. Serum adenylate kinase and myocardial infarction | |
| JPH0698031B2 (en) | LD-1 isozyme assay and reagents | |
| Baillie | CK Isoenzymes: Part 1. Clinical Aspects | |
| EP0071087B1 (en) | Improved determination of creatine phosphokinase in body fluids | |
| JP2877703B2 (en) | Method for quantifying 1,5-anhydroglucitol |