NO165510B

NO165510B - MONOCLONAL ANTIBODIES, AND USE OF THEM IN VITRO FOR DETERMINING THE PRESENCE OF NEOPLASMS.

Info

Publication number: NO165510B
Application number: NO84840215A
Authority: NO
Inventors: Harold H Handley; Mark C Glassy; Hideaki Hagiwara; Yoshihide Hagiwara
Original assignee: Univ California
Priority date: 1982-05-21
Filing date: 1984-01-20
Publication date: 1990-11-12
Also published as: NO840215L; NO165510C

Description

Oppfinnelsen vedrører monoklonale antistoffer til anvendelse in vitro. Den vedrører også anvendelse av disse antistoffer eller fragmenter derav. Det henvises således til de medfølgende patent-krav. The invention relates to monoclonal antibodies for use in vitro. It also relates to the use of these antibodies or fragments thereof. Reference is thus made to the accompanying patent claims.

Immunsystemet i pattedyr har en makeløs evne til å produsere molekyler med spesifisitet og aviditet (reaksjonsevne) for en spesiell spatial og polar struktur, som kan finnes hos sekven- The immune system in mammals has an unparalleled ability to produce molecules with specificity and avidity (reactivity) for a particular spatial and polar structure, which can be found in sequence-

ser av aminosyrer og sukkere. I et langt tidsrom var man av-hengig av å produsere antistoffer under anvendelse av immunsys-temet in vivo. De resulterende polyklonale antistoffer viste høy spesifisitet for et spesifikt antigen, men kunne ikke dis-kriminere mellom forskjellige punkter på antigenet og var vi- of amino acids and sugars. For a long time, people depended on producing antibodies using the immune system in vivo. The resulting polyclonal antibodies showed high specificity for a specific antigen, but could not discriminate between different points on the antigen and were

dere en blanding av antistoffer med varierende spesifisitet og aviditet. Således observerte man gjennomsnitt over hele pro-duktet og ikke egenskapene til et spesifikt antistoff. a mixture of antibodies with varying specificity and avidity. Thus, averages were observed over the entire product and not the properties of a specific antibody.

Med den seminale oppdagelse av Milstein og Kohler kan man With the seminal discovery of Milstein and Kohler one can

nå produsere homogene produkter av antistoffet ved å sammensmel- now produce homogeneous products of the antibody by fusing

te en B-lymfocytt med en myelomcelle for å produsere en celle som betegnes som et hybridom. For størstedelen er anvendelse av denne teknologi blitt begrenset til museceller, hvor stabi- te a B lymphocyte with a myeloma cell to produce a cell termed a hybridoma. For the most part, application of this technology has been limited to mouse cells, where stable

le myelomlinjer har tjent som fusjonspartnere for å tilveie- le myeloma lines have served as fusion partners to provide

bringe stabile hybridomer som kan produseres med høy effektivi- bring stable hybridomas that can be produced with high efficiency

tet og har evne til å bli opprettholdt som produktive helheter over lange tidsrom. Høyere organismer, spesielt mennesker, har vist seg å ha meget vanskeligere for å utvikle fusjonspartnere og hybridomer. I 1980 ble imidlertid den første menneske-fusjonspartner rapportert av dr. Olsson og dr. Kaplan, og siden den tid er det blitt rapportert ytterligere noen få menneskeli- tet and has the ability to be maintained as productive wholes over long periods of time. Higher organisms, especially humans, have been shown to have much more difficulty developing fusion partners and hybridomas. In 1980, however, the first human fusion partner was reported by Dr. Olsson and Dr. Kaplan, and since then a few more human li-

ge fusjonspartnere. Allikevel har fremstilling av hybridomer ved human-human-kryssinger forblitt vanskelige på grunn av pro-blemer med effektivitet i fusjon, dyrking av cellene og opp-rettholdelse av deres produktive evner. Imidlertid, på grunn av de mange fordeler ved å ha human-hybridomer som produserer antistoffer som er allogene til en menneskevert, spesielt for anvendelser in vivo, forblir human-hybridomer av stor interesse. give merger partners. However, the production of hybridomas by human-human crosses has remained difficult due to problems with efficiency in fusion, culturing the cells and maintaining their productive capabilities. However, because of the many advantages of having human hybridomas that produce antibodies that are allogeneic to a human host, especially for in vivo applications, human hybridomas remain of great interest.

I andre tilfeller, selv med de vanskeligheter som påtreffes med human-human-kryssinger, kan human-hybridomet være å foretrekke for en heterogen kryssing, hvor det resulterende hybridom kan tape den genetiske informasjon for de monoklonale antistoffer etter et antall generasjoner. In other cases, even with the difficulties encountered with human-human crosses, the human hybridoma may be preferable to a heterogeneous cross, where the resulting hybridoma may lose the genetic information for the monoclonal antibodies after a number of generations.

Et av interesseområdene for anvendelse av monoklonale antistoffer er ved diagnostisering og behandling av cancer. Monoklonale antistoffer for disse formål er ønskelig spesifikke for en spesiell type av cancer eller undergruppe av cancer, snarere enn å være spesifikke for en spesiell vert-cancercelle. Det er derfor ønskelig å utvikle monoklonale antistoffer som One of the areas of interest for the use of monoclonal antibodies is in the diagnosis and treatment of cancer. Monoclonal antibodies for these purposes are desirably specific for a particular type of cancer or subset of cancer, rather than being specific for a particular host cancer cell. It is therefore desirable to develop monoclonal antibodies that

kan anvendes ved diagnostisering og behandling av human- can be used in the diagnosis and treatment of human

cancer. cancer.

Nowinski et al., Science (1980) 210; 537-539 beskriver human-monoklonale antistoffer mot Forssman-antigen. Corce et al., Nature (1980) 288; 488-489 beskriver human-hybridomer som sekreterer antistoffer mot meslingvirus. Olsson og Kaplan, I NAS USA (1980) 77: 5429-5431 beskriver human-human-hybridomer som produserer monoklonale antistoffer med predefinert antigen spesifisitet så vel som den fusjonspartner som anvendes for produksjon av antistoffene. Det henvises også til den samti-dige US-søknad nr. 247 652, innlevert 26. mars 1981. Nowinski et al., Science (1980) 210; 537-539 describe human monoclonal antibodies against Forssman antigen. Corce et al., Nature (1980) 288; 488-489 describe human hybridomas secreting antibodies to measles virus. Olsson and Kaplan, I NAS USA (1980) 77: 5429-5431 describe human-human hybridomas that produce monoclonal antibodies of predefined antigenic specificity as well as the fusion partner used for production of the antibodies. Reference is also made to the contemporaneous US application No. 247,652, filed on 26 March 1981.

Schlom, PNAS USA (1980) 11_: 6841-6845 beskriver monoklo-nale antistoffer for brystcancer, og Sikora, Brit. J. of Cancer Schlom, PNAS USA (1980) 11: 6841-6845 describes monoclonal antibodies for breast cancer, and Sikora, Brit. J. of Cancer

(1981) 41: 696 beskriver separering av lymfocytter in situ fra en cancer som tilveiebringer antistoffer spesifikke for canceren. I <p>roceedings of the 15th Leukocyte Culture Conference, Parker og 0'Brian (redaktører), Wiley Interscience, N.Y., des. 5-10, 1982, er emnet hybridoma beskrevet. Dette utdrag er inkorporert herved som referanse. (1981) 41: 696 describes the separation of lymphocytes in situ from a cancer which provides antibodies specific for the cancer. In <p>roceedings of the 15th Leukocyte Culture Conference, Parker and 0'Brian (editors), Wiley Interscience, N.Y., Dec. 5-10, 1982, the subject of hybridoma is described. This excerpt is hereby incorporated by reference.

Lymfocytter som stammer fra en neoplastisk human-vert immortaliseres ved fusjon med human-fusjonspartnere for å tilveiebringe human - human - hybridomer som utskiller monoklonale antistoffer som er spesifikke for en neoplastisk celle. Spesielt tilveiebringes monoklonale antistoffer som er spesifikke for faste tumorceller, f.eks. cervikal-cancer-celler, for anvendelse i diagnostikk og terapi. Lymphocytes derived from a neoplastic human host are immortalized by fusion with human fusion partners to provide human-human hybridomas that secrete monoclonal antibodies specific for a neoplastic cell. In particular, monoclonal antibodies specific for solid tumor cells are provided, e.g. cervical cancer cells, for use in diagnostics and therapy.

Human-monoklonale antistoffer som er spesifikke for neoplastiske celler fra faste tumorer oppnås fra human x human-fusjoner under anvendelse av B-lymfocytter, f.eks. fra lymfe-knuter som drenerer en fast tumor. Spesielt er lymfeknuter ut-valgt som viser seg å være aktive basert på nekrose av tumorceller i nærheten av lymfeknuten i en immunokompetent vert. Human monoclonal antibodies specific for neoplastic cells from solid tumors are obtained from human x human fusions using B lymphocytes, e.g. from lymph nodes draining a solid tumor. In particular, lymph nodes are selected that are shown to be active based on necrosis of tumor cells in the vicinity of the lymph node in an immunocompetent host.

Den eller de drenerende lymfeknuter kan isoleres i tilknytning til et utvalg av human-vev, f.eks. cervix, brystkjertler, colon, lunger, prostata, huden osv. Av spesiell interesse er lymfeknuter fra spinalområdet. The draining lymph node(s) can be isolated in connection with a selection of human tissue, e.g. cervix, mammary glands, colon, lungs, prostate, skin etc. Of particular interest are lymph nodes from the spinal area.

Fusjonspartneren kan være hvilken som helst egnet immorta-lisert B-celle, som ikke utskiller immunoglobuliner, individu-elle kjeder eller fragmenter derav, kan utvelges mot, som hos HAT-medium, og ønskelig har høy fusjonseffektivitet. Illust-rerende fusjonspartnere er UC729-6, J-4 (SKO-007) og GM1500 6TG-Al2. The fusion partner can be any suitable immortalized B cell, which does not secrete immunoglobulins, individual chains or fragments thereof, can be selected against, as in HAT medium, and desirably has a high fusion efficiency. Illustrative fusion partners are UC729-6, J-4 (SKO-007) and GM1500 6TG-Al2.

Fusjonene kan utføres som beskrevet i litteraturen under anvendelse av PEG1500 som fusogen, ved utplating av cellene i HAT-medium i et flertall av brønner og deretter klassifise-ring av supernatanter i de levedyktige cellebrønner for antistoffer av interesse. Brønner som er positive for reaktivitet klones deretter ved begrensende fortynning og ekspanderer. The fusions can be performed as described in the literature using PEG1500 as a fusogen, by plating the cells in HAT medium in a majority of wells and then classifying supernatants in the viable cell wells for antibodies of interest. Wells positive for reactivity are then cloned by limiting dilution and expanded.

Av spesiell interesse er de nye hybridomer CLNH5 og CLNH11, hybridomer oppnådd fra CLNH5 og 11, antistoffer som stammer fra slike hybridomer, derivater av slike antistoffer og anvendelse av antistoffene og deres derivater for.diagnose og terapi. CLNH5 og 11 oppnås ved fusjon mellom fusjonpartnerens UC729-6 med lymfocytter fra lymfeknuteceller hos en pasient som har cervikal cancer. UC729-6 er deponert hos A.T.CC. med deponerings-nr. CRL 8061. UC729-6 ble deponert for patentformål i tilknytning til innleveringen av US-søknad nr. 247 652. Of particular interest are the new hybridomas CLNH5 and CLNH11, hybridomas obtained from CLNH5 and 11, antibodies derived from such hybridomas, derivatives of such antibodies and use of the antibodies and their derivatives for diagnosis and therapy. CLNH5 and 11 are obtained by fusion between the fusion partner's UC729-6 with lymphocytes from lymph node cells of a patient who have cervical cancer. UC729-6 is deposited with A.T.CC. with deposit no. CRL 8061. UC729-6 was deposited for patent purposes in connection with the filing of US Application No. 247,652.

De lymfocytter som ble anvendt for fusjon var fra en drenerende lymfeknute fra spinalområdet og perifere blodlymfocytter fra en pasient som hadde cervikal carcinoma. Fusjonen utføres ved å kombinere pasientens lymfocytter fra lymfeknuten med fusjonspartneren UC729-6 i et forhold av ca. 2:1 i en løsning av ca. 35 % polyetylenglykol i HEPES-pufret RPMI 1640. Blandingen av celler suspenderes deretter i egnet selektive medium, spesielt HAT-medium som inneholder ca. 10 % føtalt okseserum, anbringes i brønner med ca. 10^ celler pr. brønn og gis tilstrekkelig tid til at cellene kan vokse. Det selektive medium erstattes fra tid til annen. The lymphocytes used for fusion were from a draining lymph node from the spinal area and peripheral blood lymphocytes from a patient who had cervical carcinoma. The fusion is performed by combining the patient's lymphocytes from the lymph node with the fusion partner UC729-6 in a ratio of approx. 2:1 in a solution of approx. 35% polyethylene glycol in HEPES-buffered RPMI 1640. The mixture of cells is then suspended in suitable selective medium, especially HAT medium containing approx. 10% fetal bovine serum, placed in wells with approx. 10^ cells per well and given sufficient time for the cells to grow. The selective medium is replaced from time to time.

Brønner fra ovennevnte fusjon tilveiebrakte kloner som var spesifikt reaktive sammen med cervikal-cancer-cellene til vertspasienten som var betegnet CLNH-5 og 11. Disse brønner tilveiebrakte henholdsvis human-IgM og IgG monoklonale antistoffer, som reagerer med antigen som finnes pa et utvalg av cervikal-karsinomer og andre tumorcellelinjer, f.eks. små cellekarsinomer i lungen, men ikke hos normalt vev og normale cellelinjer, som ble testet. Wells from the above fusion yielded clones specifically reactive with the cervical cancer cells of the host patient designated CLNH-5 and 11. These wells yielded human IgM and IgG monoclonal antibodies, respectively, which react with antigen present on a selection of cervical carcinomas and other tumor cell lines, e.g. small cell carcinomas of the lung, but not in normal tissue and normal cell lines, which were tested.

Hybridomene og de monoklonale antistoffer kan finne anvendelse på en rekke måter, spesielt som kilder for genetisk materiale, som reagenser og som forløpere for produkter som finner anvendelse som reagenser. The hybridomas and monoclonal antibodies can be used in a number of ways, in particular as sources of genetic material, as reagents and as precursors for products that are used as reagents.

Hybridomene som er beskrevet ovenfor kan anvendes som kilde for genetisk materiale. Eksempelvis kan hybridomene sammensmeltes med andre fusjonspartnere for tilveiebringelse av nye hybridomer som har de samme sekresjonsevner som CLNH5 og 11 for å tilveiebringe antistoffer som har samme spesifisitet. Slike fusjoner kan resultere i produksjon av antistoffer med forskjellige tunge kjeder slik at det tilveiebringes andre klasser eller underklasser av antistoffer, f.eks. G, A eller M. The hybridomas described above can be used as a source of genetic material. For example, the hybridomas can be fused with other fusion partners to provide new hybridomas that have the same secretion capabilities as CLNH5 and 11 to provide antibodies having the same specificity. Such fusions may result in the production of antibodies with different heavy chains to provide other classes or subclasses of antibodies, e.g. G, A or M.

Hybridomet kan også anvendes som kilde for DNA, f.eks. i hybrid-DNA-teknologi, idet genene kan eksiteres og innføres i et lymfom for produksjon av de modne antistoffer. The hybridoma can also be used as a source for DNA, e.g. in hybrid DNA technology, as the genes can be excited and introduced into a lymphoma for the production of the mature antibodies.

De monoklonale antistoffer kan anvendes på en rekke forskjellige måter, for diagnose både in vivo og in vitro, så vel som i terapi. For mange anvendelser vil antistoffene bli merket med en forbindelse som gir antistoffene en ønsket egenskap, f.eks. tilveiebringer et påviselig signal, tilveiebringer cyto-toksisitet, sørger for lokalisert elektromagnetisk stråling eller lignende. Slik merking kan inkludere radionukleider, enzymer, fluorescerende midler, toksiner eller det cytotoksis-ke fragment i toksiner, partikler, metaller, metalloider osv. Antistoffene kan inkorporeres i liposom-membraner eller modi-fiseres med lipider, slik at de blir inkorporert i slike membraner. Antistoffene i seg selv eller merket kan anvendes for diagnose in vitro for måling av nærvær av antigener assosiert med en neoplasma, f.eks. cervikal cancer, for diagnose in vivo for innføring i en vert, f.eks. intravenøst, i en fysiologisk akseptabel bærer, f.eks. PBS, eller kan innføres for terapeutiske formål på samme måte. The monoclonal antibodies can be used in a number of different ways, for diagnosis both in vivo and in vitro, as well as in therapy. For many applications, the antibodies will be labeled with a compound that gives the antibodies a desired property, e.g. provides a detectable signal, provides cytotoxicity, provides for localized electromagnetic radiation or the like. Such labeling can include radionuclides, enzymes, fluorescent agents, toxins or the cytotoxic fragment in toxins, particles, metals, metalloids, etc. The antibodies can be incorporated into liposome membranes or modified with lipids, so that they are incorporated into such membranes . The antibodies themselves or the label can be used for diagnosis in vitro for measuring the presence of antigens associated with a neoplasm, e.g. cervical cancer, for diagnosis in vivo for introduction into a host, e.g. intravenously, in a physiologically acceptable carrier, e.g. PBS, or can be introduced for therapeutic purposes in the same way.

Antistoffene som sådanne eller merket kan også anvendes for behandling av en neoplasme i human-vert, f.eks. cervikal karsinom, prostata-tumor, colon-karsinom, lungekreft, bryst- The antibodies as such or labeled can also be used for the treatment of a neoplasm in a human host, e.g. cervical carcinoma, prostate tumor, colon carcinoma, lung cancer, breast

melanom. Antistoffene i henhold til oppfinnelsen er lett løse- melanoma. The antibodies according to the invention are easily soluble

lige i fysiologisk saltløsning og kan derfor injiseres intra-venøst eller intramuskulært som saltløsning eller drypp. equal in physiological salt solution and can therefore be injected intravenously or intramuscularly as a saline solution or drip.

Videre kan antistoffene i henhold til oppfinnelsen anvendes i Furthermore, the antibodies according to the invention can be used in

form av en salve eller stikkpille. form of an ointment or suppository.

Mengden av antistoff som anvendes vil variere i avhengig- The amount of antibody used will vary depending on

het av det spesielle formål. Innføring av antistoffer for diagnostiske og terapeutiske formål er uttømmende beskrevet i litteraturen. name of the special purpose. The introduction of antibodies for diagnostic and therapeutic purposes is exhaustively described in the literature.

Hele antistoffet trenger ikke å bli anvendt, idet det for mange formål vil være tilstrekkelig med bare et fragment som har intakt variable områder. Eksempelvis kan det være tilstrekkelig med Fab-fragmenter, F (ab')ragmenter eller Fv-fragmenter. The entire antibody does not need to be used, as for many purposes only a fragment that has intact variable regions will be sufficient. For example, Fab fragments, F (ab') fragments or Fv fragments may be sufficient.

Følgende eksempler gis for illustrasjon. The following examples are given for illustration.

EKSPERIEMNTELLE EXPERIMENTAL NUMBERS

MATERIALER OG METODER MATERIALS AND METHODS

Fusjon og valg av hybridomer Fusion and selection of hybridomas

Lymfeknuter ble irritert med "nugent tang" i RPMI 1640-medier, og isolerte lymfocytter ble dyrket natten over ved 37°C og 5 % C02 i RPMI 1640 med 10 % føtalt kalveserum (FCS) Lymph nodes were teased with nugent forceps in RPMI 1640 media, and isolated lymphocytes were cultured overnight at 37°C and 5% CO 2 in RPMI 1640 with 10% fetal calf serum (FCS).

og 2mM L-glutamin. Lymfocytter ble tellet og blandet i et forhold på 2:1 med human-lymfoblastoid B-cellelinjen UC729-6 (Randley og Royston, 1922, i "Hybridomas in Cancer Diagnosis and 2 mM L-glutamine. Lymphocytes were counted and mixed in a 2:1 ratio with the human lymphoblastoid B-cell line UC729-6 (Randley and Royston, 1922, in "Hybridomas in Cancer Diagnosis

and Treatment", red. Mitchell og Oettgen, s.125-132, Raven Press, N.Y.), deretter sammensmeltet med polyetylenglykol 1500 and Treatment", ed. Mitchell and Oettgen, pp.125-132, Raven Press, N.Y.), then fused with polyethylene glycol 1500

ved en modifikasjon av teknikken til Gefter et al., Somatic Cell Genetics (1977) 3:321-336. Sammensmeltede celler ble utplatet, lo^ celler/brønn i en Costar 96-brønns mikrotiterplate med Hypocantin-Amethopterin-Tymidin (HAT, Littlefield, Science by a modification of the technique of Gefter et al., Somatic Cell Genetics (1977) 3:321-336. Confluent cells were plated, lo^ cells/well in a Costar 96-well microtiter plate with Hypocantin-Amethopterin-Thymidine (HAT, Littlefield, Science

(1964) 1£5:709-710)-supplert RPMI 1640 med 10 % FCS og L-glutamin. I løpet av 10-20 dager ble brønner som var positive med hensyn på hyb>ridomvekst undersøkt med hensyn på human-antistoffproduksjon og deres reaktivitet for et begrenset human-cellepanel ved en enzym-immunoanalyse (EIA). Brønner som var positive med hensyn på reaktivitet ble klonet ved begren- _ sende fortynning uten anvendelse av matesjikt, og ekspandert (1964) 1£5:709-710)-supplemented RPMI 1640 with 10% FCS and L-glutamine. Within 10-20 days, wells that were positive for hybrid overgrowth were examined for human antibody production and their reactivity to a limited human cell panel by an enzyme immunoassay (EIA). Wells positive for reactivity were cloned by limiting dilution without the use of a feeder layer, and expanded

for videre studium. for further study.

Enzym- immunoanalyse Enzyme immunoassay

Human-MoAbs og deres reaktivitet overfor celler ble på-vist ved en modifikasjon av en EIA som tidligere er beskrevet (Handley et al., J. of Immunologic Methods (1982), 54:291-296, modifisert av Glassy et al., J. Immunologic Methods (1983) under trykning). Kort sagt, ble 50 pl av enten en affinitets-renset geite-antihuman lg eller en 4x10^ målcelle/ml suspen-sjon immobilisert i triplikatbrønner i en immunofiltrerings-manifold. (Den spesifikt konstruerte mikrotiterplate som tje-ner som både inkubasjonskammer og filtreringsmanifold (VP nr. 107; V og P Scientific, San Diego, CA). Bunnen til hver brønn inneholder et 0,6 mm hull over hvilket det er anbragt et glass-fiberfilter med diameter 6 mm. Overflatespenning hindrer fluid-volumer mindre enn 100 m1 fra å drenere gjennom hullet inntil vakuum er påført. Når vakuum er påført, trekkes fluid gjennom filteret og ut gjennom dreneringshullet og etterlater partikkel-formig materiale som er oppfanget på filteret. Etter vasking 3x med 0,3 % gelatin i fosfatpufret saltløsning ble 50 pl av hybridom-supernatant inkubert 30 min. ved romtemperatur. Filterne ble så vasket og inkubert med 50 ul av en pepperrot-peroksidase-konjugert geite-anti-human-Ig i ytterligere 30 min. Filterne ble vasket igjen og inkubert med 150 ul av en 400 Mg/ml løsning av orto-fenylendiamin i citratpuffer. 100 vi fra hver brønn ble så overført til en ny plate som inneholdt 50 pl av 2,5M H2S04 og avlest på en Dynatek (Alexandria, VA) MR 580 mikro-ELISA-avleser ved 4 92 nm. Human MoAbs and their reactivity to cells were detected by a modification of an EIA previously described (Handley et al., J. of Immunologic Methods (1982), 54:291-296, modified by Glassy et al., J. Immunologic Methods (1983) in press). Briefly, 50 µl of either an affinity-purified goat antihuman Ig or a 4x10 5 target cell/ml suspension was immobilized in triplicate wells of an immunofiltration manifold. (The specifically constructed microtiter plate that serves as both an incubation chamber and a filtration manifold (VP No. 107; V and P Scientific, San Diego, CA). The bottom of each well contains a 0.6 mm hole over which is placed a glass 6 mm diameter fiber filter. Surface tension prevents fluid volumes less than 100 m1 from draining through the hole until vacuum is applied. When vacuum is applied, fluid is drawn through the filter and out through the drain hole, leaving particulate material trapped on the filter. After washing 3x with 0.3% gelatin in phosphate buffered saline, 50 µl of hybridoma supernatant was incubated for 30 min at room temperature.The filters were then washed and incubated with 50 µl of a horseradish peroxidase-conjugated goat anti-human Ig in another 30 min. The filters were washed again and incubated with 150 µl of a 400 Mg/ml solution of ortho-phenylenediamine in citrate buffer. 100 µl from each well was then transferred to a new plate containing 50 µl of 2.5 M H2SO4 and read t on a Dynatek (Alexandria, VA) MR 580 micro-ELISA reader at 4 92 nm.

Hybridomdyrkningsvæsken ble utfelt med 50 % ammoniumsulfat og rå Ig-fraksjoner oppsamlet. Utfellingsproduktene ble opp-løst i fysiologisk saltvann og renset ved affinitetskromatogra-fi under anvendelse av S-aureus Protein A-bundet Sepharose med IgC og Sepharose- (får-anti(humanlgM)antistoff) med IgM. The hybridoma culture fluid was precipitated with 50% ammonium sulfate and crude Ig fractions collected. The precipitation products were dissolved in physiological saline and purified by affinity chromatography using S-aureus Protein A-bound Sepharose with IgC and Sepharose (sheep anti(human IgM) antibody) with IgM.

Av IL av dyrkningsvæsken av CLNH5 ble det oppnådd 2,2 mg IgM mens det av 1 liter av dyrkningsvæsken av CLNH11 ble oppnådd 3,0 mg IgG. From IL of the culture liquid of CLNH5, 2.2 mg of IgM was obtained, while from 1 liter of the culture liquid of CLNH11, 3.0 mg of IgG was obtained.

RESULTATER RESULTS

Tabell 1 gjengir resultatene av fusjonen hvor det ble gjort forsøk på å produsere anti-SCCC (skjellformig celle-karsinom i cervix) human-MoAbs. De fusjonsproduserende CLNH5 og CLNHll, human-human-hybridomer som utskiller en MoIgMk og en MoIgG som er reaktive med SCCC-cellelinjer, utviklet 6 vekstpositive brønner av 80 brønner som var utplatet. Hybridomer CLNH5 og CLNHll ble klonet og ekspandert da de ble fun-net å reagere med de cervikale karsinom-cellelinjer, CaSki og Hela. Table 1 reproduces the results of the fusion where attempts were made to produce anti-SCCC (squamous cell carcinoma of the cervix) human MoAbs. The fusion-producing CLNH5 and CLNHll, human-human hybridomas secreting a MoIgMk and a MoIgG reactive with SCCC cell lines developed 6 growth-positive wells out of 80 wells plated. Hybridomas CLNH5 and CLNH11 were cloned and expanded when they were found to react with the cervical carcinoma cell lines, CaSki and Hela.

De relative mengder av human-MoAb bundet til hver av de oppførte cellelinjer ble målt ved EIA. The relative amounts of human MoAb bound to each of the listed cell lines were measured by EIA.

Antistoff (IgM) utskilt av CLNH5 viser positiv reaktivitet med karsinomer fra cervix (CaSki, Hela), lunge(T293, Calu-1, og SK-MES-1), melanom (SK-MEL-28) og prostata (LnCap) og var negative med hensyn på normal-fibroblaster, T-lymfocytter og perifere blodlymfocytter. Antistoff (IgG) utskilt av CLNHll viser positiv reaktivitet med karsinomer fra cervix (CaSki, Hela), prostata (PC-3), bryst (ZR-76-1), colon (COLO-205) og melanom (G-361) og var negativ for normale fibroblaster (WI'38 og MRC-9), T.-lymfocytter og perifere blod-lymfocytter. Antibody (IgM) secreted by CLNH5 shows positive reactivity with carcinomas from the cervix (CaSki, Hela), lung (T293, Calu-1, and SK-MES-1), melanoma (SK-MEL-28) and prostate (LnCap) and were negative with regard to normal fibroblasts, T-lymphocytes and peripheral blood lymphocytes. Antibody (IgG) secreted by CLNHll shows positive reactivity with carcinomas from the cervix (CaSki, Hela), prostate (PC-3), breast (ZR-76-1), colon (COLO-205) and melanoma (G-361) and was negative for normal fibroblasts (WI'38 and MRC-9), T. lymphocytes and peripheral blood lymphocytes.

De cytobiokjemiske egenskaper ved hybridomene som anvendes ved oppfinnelsen er vist nedenunder: The cytobiochemical properties of the hybridomas used in the invention are shown below:

Hybridom CLNH5: Hybridoma CLNH5:

(1) Antall kromosomer: 60-90 (maksimal frekvens 80). (1) Number of chromosomes: 60-90 (maximum frequency 80).

(2) Det utskiller human-immunoglobulin M (IgM). (2) It secretes human immunoglobulin M (IgM).

(3) Fordoblingstid:30-40 timer. (3) Doubling time: 30-40 hours.

(4) Lymfocyttisk enkeltcelle. (4) Lymphocytic single cell.

(5) Dets DNA-innhold er minst to ganger, f.eks. 2-2,5 ganger, verdien for normale human-lymfocytter. (5) Its DNA content is at least twice, e.g. 2-2.5 times the value for normal human lymphocytes.

(6) IgM binder seg til human-cervikale karsinomceller (6) IgM binds to human cervical carcinoma cells

og de andre karsinomer som er nevnt ovenfor. and the other carcinomas mentioned above.

I tillegg kan ovennevnte hybridom CLNH5 proliferes i HAT-medium (medium som inneholder hypoxantin, amethopterin og tvmidin). In addition, the above hybridoma CLNH5 can be proliferated in HAT medium (medium containing hypoxanthine, amethopterin and tvmidine).

Hybridom CLNHll: Hybridoma CLNHll:

(2) Det utskiller human-immunoglobuliner G (IgG). (2) It secretes human immunoglobulins G (IgG).

(3) Fordoblingstid: 30-40 timer. (3) Doubling time: 30-40 hours.

(4) Lymfocyttisk enkeltcelle. (4) Lymphocytic single cell.

(5) Dets DNA-innhold er minst to ganger, f.eks. 2-2,5 ganger, verdien for normale human-lymfocytter. (6) IgG binder seg til human-cervikale karsinomceller og de andre karsinomer som er nevnt ovenfor. (5) Its DNA content is at least twice, e.g. 2-2.5 times the value for normal human lymphocytes. (6) IgG binds to human cervical carcinoma cells and the other carcinomas mentioned above.

I tillegg kan ovennevnte hybridom CLNHll proliferes i HAT-medium. In addition, the above-mentioned hybridoma CLNHll can be proliferated in HAT medium.

Det relative DNA-innhold (forholdet mellom DNA-innholdet i normale human-lymfocytter) ble bestemt ved en metode som om-fatter å farve hybridomet og deretter separere og analysere det ved hjelp av et cytofluorometer. The relative DNA content (ratio of the DNA content of normal human lymphocytes) was determined by a method which involves staining the hybridoma and then separating and analyzing it using a cytofluorometer.

Egenskapene til de monoklonale human-immunoglobuliner i overensstemmelse med oppfinnelsen er vist nedenunder. The properties of the monoclonal human immunoglobulins in accordance with the invention are shown below.

Monoklonalt human-immunoglobulin Monoclonal human immunoglobulin

produsert av hybridom CLNH5 produced by hybridoma CLNH5

(a) Det er human-immunoglobulin M (IgM). (a) It is human immunoglobulin M (IgM).

(b) Det har sterkere bindingsaffinitet til cellelinjer, Hela og CaSki, enn til normale fibroblaster (WI-38). (c) Det reagerer ikke med røde blodlegemer fra mennesker, og viser heller ikke agglutineringsreaksjon på røde blodlegemer fra mennesker. (d) Det er sammensatt av tunge kjeder (H-kjeder) og let-te kjeder (L-kjeder), har en molekylvekt på ca. 180 000 (mono-mer) og eksisterer som en pentamer i dyrkningsvæsken. (b) It has stronger binding affinity to cell lines, Hela and CaSki, than to normal fibroblasts (WI-38). (c) It does not react with human red blood cells, nor does it show agglutination reaction on human red blood cells. (d) It is composed of heavy chains (H-chains) and light chains (L-chains), has a molecular weight of approx. 180,000 (mono-mer) and exists as a pentamer in the culture medium.

Monoklonalt human-immunoglobulin Monoclonal human immunoglobulin

produsert av hybridom CLNHll produced by hybridoma CLNHll

(a) Det er human-immunoglobulin G (IgG). (a) It is human immunoglobulin G (IgG).

(b) Det har sterkere bindingsaffinitet til cellelinjer, Hela og CaSki, enn til normale fibroblaster (WI-38). (c) Det reagerer ikke med røde blodlegemer fra mennesker, og viser heller ikke agglutineringsreaks;jon på røde blodlegemer fra mennesker. (d) Det er sammensatt av H-kjeder og L-kjeder og har en molekylvekt på ca. 150 000. (b) It has stronger binding affinity to cell lines, Hela and CaSki, than to normal fibroblasts (WI-38). (c) It does not react with human red blood cells, nor does it show agglutination reaction on human red blood cells. (d) It is composed of H chains and L chains and has a molecular weight of approx. 150,000.

Bindingsaktiviteten for human-monoklonale antistoffer som skjelner neoplastiske celler fra normale celler ble målt som følger: En original menneskevevseksjon inklusive karsinomceller og normale celler ble fiksert på en glassplate ved hjelp av glutaraldehyd, og deretter farvet ved hjelp av enzym-immunoanalyse i henhold til metoden til Sternberger et al., J. Hist. Cyto., 18 315 (1970). The binding activity of human monoclonal antibodies that distinguish neoplastic cells from normal cells was measured as follows: An original human tissue section including carcinoma cells and normal cells was fixed on a glass slide using glutaraldehyde, and then stained by enzyme immunoassay according to the method of Sternberger et al., J. Hist. Cyto., 18 315 (1970).

De monoklonale antistoffer i henhold til oppfinnelsen er nyttige for diagnostisering, bildeopptak og potensielt for behandling av cervikalt karsinom så vel som andre reaktive tumorer. På grunn av spesifisiteten til de monoklonale antistoffer over et område av cervikale karsinomer fra forskjellige verter kan antistoffene i henhold til oppfinnelsen anvendes i forskjellige verter, snarere enn utelukkende hos anti-genets vertskilde. Fordi antistoffene i henhold til oppfinnelsen er av human opprinnelse, er det mindre sannsynlig at de vil produsere en signifikant immun-respons når de anvendes i diagnose in vivo eller terapi. The monoclonal antibodies according to the invention are useful for diagnosis, imaging and potentially for the treatment of cervical carcinoma as well as other reactive tumors. Due to the specificity of the monoclonal antibodies over a range of cervical carcinomas from different hosts, the antibodies according to the invention can be used in different hosts, rather than exclusively at the host source of the antigen. Because the antibodies according to the invention are of human origin, it is less likely that they will produce a significant immune response when used in in vivo diagnosis or therapy.

Claims

1. Monoclonal antibodies for use in vitro characterized in that they are produced from the hybridoma CLNH5 with ATCC No. HB8206 or from the hybridoma CLNH11 with ATCC No. HB8307, where the antibodies bind to neoplastic cells with a significantly higher specificity than the antibodies bind to non - cancer cells.

2. Use of the monoclonal antibody according to claim 1, or a fragment thereof, in a method for in vitro determination of the presence of a neoplasm, by: combining a sample from a host suspected of having a neoplasm with said monoclonal antibody or antibody fragments, and to detect the presence of the binding of said monoclonal antibody or fragments thereof, or the presence of said antibody or fragments capable of providing a detectable signal.