NO155700B

NO155700B - PROCEDURE FOR PREPARING D-FLUCOSON FROM GLUCOSE.

Info

Publication number: NO155700B
Application number: NO82824419A
Authority: NO
Inventors: Saul Lewis Neidleman; William Frederick Amon Jr; John Geigert
Original assignee: Cetus Corp
Priority date: 1979-10-24
Filing date: 1982-12-30
Publication date: 1987-02-02
Also published as: NO824419L; NO155700C

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av D-glukoson hvor man danner en vandig oppløsning av D-glukose og minst omtrent 95 % av D-glukosen i oppløsningen omdannes til D-glukoson i oppløsning ved enzymatisk oksydasjon med et oksidoreduktaseenzym i nærvær av oksygen, og det særegne ved oppfinnelsen er at samtidig fremstilt hydrogenperoksyd fjernes ved enzymatisk spaltning med katalase, eller samtidig fremstilt hydrogenperoksyd anvendes i en samtidig forløpende prosess. The present invention relates to a method for the production of D-glucose where an aqueous solution of D-glucose is formed and at least approximately 95% of the D-glucose in the solution is converted to D-glucose in solution by enzymatic oxidation with an oxidoreductase enzyme in the presence of oxygen, and the peculiarity of the invention is that hydrogen peroxide produced at the same time is removed by enzymatic cleavage with catalase, or hydrogen peroxide produced at the same time is used in a simultaneous ongoing process.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patent-kravene. These and other features of the invention appear in the patent claims.

Litteraturen lærer at lave innhold av fruktose kan fremstilles fra glokoson. Så tidlig som i 1889 ble fruktose dannet ved reduksjon av D-glukoson med sinkstøv i vandig eddiksyre, se Advances in Carbohydrate Chemistry, bind II, utgitt av The literature teaches that low levels of fructose can be produced from glucosone. As early as 1889, fructose was formed by the reduction of D-glucosone with zinc dust in aqueous acetic acid, see Advances in Carbohydrate Chemistry, Volume II, published by

M.L. Wolfrom, 1956, sidene 43-96. Denne reduksjon er anvendt som en analytisk test for påvisning av D-glukoson i forskjellige biologiske materialer, se for dette C. Berkeley, M. L. Wolfrom, 1956, pages 43-96. This reduction has been used as an analytical test for the detection of D-glucosone in various biological materials, see for this C. Berkeley,

Biochem. J., 27, 1357 (1933), videre R.C. Bean og W.Z. Hassid, Science, 124, 171 (1956) samt J. Vole, M. Wurst og V. Musilek, Folia Microbiol, 23, 448 (1978). Reduksjon av D-glukoson til D-fruktose har også være gjennomført ved hjelp av natrium-borhydrid, se B.N. White og R. Carubelli, Carbohydr. Res., 33, 366 (1974). Omdannelse av D-glukoson til fruktose er en gjen-nomførbar enzymatisk reaksjon da reduktaser som gjennomfører reduksjonen av -CHO—^--CF^OH er kjent, se Microbiol Transformation of Non-Steroid Cyclic Compounds, utgitt av Biochem. J., 27, 1357 (1933), further R.C. Bean and W.Z. Hassid, Science, 124, 171 (1956) and J. Vole, M. Wurst and V. Musilek, Folia Microbiol, 23, 448 (1978). Reduction of D-glucosone to D-fructose has also been carried out using sodium borohydride, see B.N. White and R. Carubelli, Carbohydr. Res., 33, 366 (1974). Conversion of D-glucosone to fructose is a feasible enzymatic reaction as reductases that carry out the reduction of -CHO—^--CF^OH are known, see Microbiol Transformation of Non-Steroid Cyclic Compounds, published by

K. Kieslich, Georg Threme Publishers, Stuttgart, 1976, sidene 279-280. K. Kieslich, Georg Threme Publishers, Stuttgart, 1976, pages 279-280.

Litteraturen lærer også at lave innhold av glukoson kan fremstilles fra glukose. Forskjellige metoder for oksydasjon av glukose er foreslått - med H202 - se R. Selby, M.A. Morell og J.M. Crofts, J. Chem. Soc, 75, 787 (1899), eller ved hjelp av kobberacetat, se W.L. Evans, W.D. Nicoll, G.C. Strouse og CE. Waring, J. Amer. Chem. Soc, 50, 2267 (1928). I begge reaksjoner er omdannelsesutbyttene lave (mindre enn 30 %) og mange biprodukter dannes. Glukose er blitt omdannet til D-glukoson ved først å fremstille et derivat av glukosen (for eksempel ved reaksjon med fenylhydrazin til å fremstille glukosazon, se Advances in Carbohydrat Chemistry, bind II, utgitt av M.L. Wolfrom, 1956, sidene 43-96, eller ved reaksjon med p-toluidin, se H.J. Hass og P. Schlimmer, Liebigs Ann. Chem., 759, 208 (1972), og deretter kjemisk behandling av dette derivat til å gi D-glukoson. I disse reaksjoner var utbyttene ikke høyere enn 50 % og de ikke-gjenvinnbare reagenser er for dyre for kommersiell bruk. I tillegg kan bruken av aromatisake reagenser fremby problemer med å fremstille sukkeret med renhet egnet for matvarer. The literature also teaches that low levels of glucosone can be produced from glucose. Various methods for the oxidation of glucose have been proposed - with H202 - see R. Selby, M.A. Morell and J.M. Crofts, J. Chem. Soc, 75, 787 (1899), or by copper acetate, see W.L. Evans, W.D. Nicoll, G.C. Strouse and CE. Waring, J. Amer. Chem. Soc, 50, 2267 (1928). In both reactions, the conversion yields are low (less than 30%) and many by-products are formed. Glucose has been converted to D-glucozone by first preparing a derivative of the glucose (for example, by reaction with phenylhydrazine to prepare glucozone, see Advances in Carbohydrate Chemistry, Volume II, edited by M.L. Wolfrom, 1956, pages 43-96, or by reaction with p-toluidine, see H.J. Hass and P. Schlimmer, Liebigs Ann. Chem., 759, 208 (1972), and then chemical treatment of this derivative to give D-glucosone In these reactions the yields were no higher than 50% and the non-recyclable reagents are too expensive for commercial use.Additionally, the use of aromatic reagents may present difficulties in preparing the sugar with food grade purity.

Omdannelse av glukose til D-glukoson er også en kjent enzymatisk reaksjon. Så tidlig som 1932 ble glukose omtalt oksydert til D-glukoson ved hjelp av den krystallinske pigg av et bløt-dyr, Saxidomus giganteous, se C. Berkeley, Biochem. J., 27, 1357 (1933). I 1937 ble D-glukoson meddelt dannet ved oksydasjon av glukose, stivelse, maltose eller sukrose ved hjelp av plasmolyserte preparater av to sopparter, nemlig Aspergillus parasiticus og Aspergillus flavus-oryzae. I 1956 ble den enzymatiske oksydasjon av glukose til glukoson rapportert i rødalger, Iridophycus flaccidum, se R.C. Bean og W.Z. Hassid, Science, 124, 171 (1956). En karbohydratoksydase ble isolert fra mycel av Basidiomycete, Polyporus obtusus, som oksyderte glukose til D-glukoson, se F.W. Janssen og H.W. Ruelius, Biochem. Biophys, Acta, 167, 501 (1968). Det ble ikke nevnt noe om utbyttene. Endelig ble i 1978 glukose-2-oksydase-aktivitet oppdaget i basidiomycete, se J. Vole, M. Wurst og V. Musilek, Folia Microbiol, 23, 448 (1978). Det beste utbytte som ble rapportert var ikke høyere enn 50 %. I alle disse tilfeller antas det at D-glukosonfremstilling følges av utvikling av hydrogenperoksyd. Conversion of glucose to D-glucosone is also a known enzymatic reaction. As early as 1932, glucose was reported to be oxidized to D-glucosone by means of the crystalline spike of a mollusc, Saxidomus giganteous, see C. Berkeley, Biochem. J., 27, 1357 (1933). In 1937, D-glucosone was reportedly formed by oxidation of glucose, starch, maltose or sucrose using plasmolysed preparations of two fungal species, namely Aspergillus parasiticus and Aspergillus flavus-oryzae. In 1956, the enzymatic oxidation of glucose to glucosone was reported in the red algae, Iridophycus flaccidum, see R.C. Bean and W.Z. Hassid, Science, 124, 171 (1956). A carbohydrate oxidase was isolated from the mycelium of the Basidiomycete, Polyporus obtusus, which oxidized glucose to D-glucosone, see F.W. Janssen and H.W. Ruelius, Biochem. Biophys, Acta, 167, 501 (1968). Nothing was mentioned about the dividends. Finally, in 1978 glucose-2-oxidase activity was discovered in the basidiomycete, see J. Vole, M. Wurst and V. Musilek, Folia Microbiol, 23, 448 (1978). The best yield reported was no higher than 50%. In all these cases, it is believed that D-glucosone production is followed by the evolution of hydrogen peroxide.

Man oppnår høye utbytter av glukoson ved den foreliggende oppfinnelse fordi det samtidig fremstilte hydrogenperoksyd fjernes eller utnyttes i en samtidig prosess. Hydrogenperoksyd har nemlig en ufordelaktig effekt på de mikrobielle enzymenes katalyserende evne. High yields of glucosone are achieved with the present invention because the simultaneously produced hydrogen peroxide is removed or utilized in a simultaneous process. Namely, hydrogen peroxide has an unfavorable effect on the catalytic ability of the microbial enzymes.

Det var derfor tidligere ikke mulig å oppnå en i alt vesentlig fullstendig omdannelse av D-glukose til D-glukoson, før den foreliggende oppfinnelse lærte at samtidig fremstilt hydrogenperoksyd enten må fjernes eller utnyttes. It was therefore previously not possible to achieve an essentially complete conversion of D-glucose to D-glucosone, until the present invention taught that simultaneously produced hydrogen peroxide must either be removed or utilized.

Mengden omdannet glukose er således omtrent den dobbelte av hva som tidligere er kjent. The amount of converted glucose is thus approximately double what was previously known.

Oppfinnelsen kan anvendes for fremstilling av D-glukoson for forskjellige anvendelser, enten i seg selv eller, for eksempel for å tilveiebringe en forbedret metode for fremstilling av hovedsakelig ren fruktose fra glukose, ved hjelp av en frukt-osefremstillingsprosess hvori den dyre fysikalske separering av resterende glukose fra fruktose eller fra en fru.ktoserik sirup er unødvendig og som muliggjør fremstilling av ren fruktose fra glukose på en økonomisk og kommersiell gjennom-førlig måte. Dette kan oppnås ved at oppfinnelsen tilveie-bringer renere D-glukoson enn man tidligere har oppnådd ved industrielle metoder. The invention can be used for the production of D-glucosone for various applications, either by itself or, for example, to provide an improved method for the production of substantially pure fructose from glucose, by means of a fructose production process in which the expensive physical separation of residual glucose from fructose or from a fructose-rich syrup is unnecessary and which enables the production of pure fructose from glucose in an economically and commercially feasible manner. This can be achieved by the invention providing purer D-glucosone than has previously been achieved by industrial methods.

Andre formål for oppfinnelsen vil fremgå av den etterfølgende beskrivelse og eksempler og med henvisning til de vedføyde tegninger, hvori: Fig. 1 er et skjematisk diagram av fremgangsmåten i henhold Other objects of the invention will be apparent from the following description and examples and with reference to the attached drawings, in which: Fig. 1 is a schematic diagram of the method according to

til oppfinnelsen. to the invention.

Fig. 2 viser molekylstrukturen av D-glukose, og Fig. 2 shows the molecular structure of D-glucose, and

Fig. 3 viser molekylstrukturen av D-glukoson. Fig. 3 shows the molecular structure of D-glucosone.

Med hensyn til molekylstrukturen av D-glukoson, erkjennes det av den fagkyndige at forskjellige andre former av molekylet er blitt postulert å foreligge i vandig løsning, og et antall av disse former er cykliske, se CR. Becker og CE. May, J. Amer. Chem. Soc, 71, 1491 (1949) og F. Petuely, Monatsch. fiir Chem., 83, 765 (1952). With respect to the molecular structure of D-glucosone, it is recognized by those skilled in the art that various other forms of the molecule have been postulated to exist in aqueous solution, and a number of these forms are cyclic, see CR. Becker and CE. May, J. Amer. Chem. Soc, 71, 1491 (1949) and F. Petuely, Monatsch. Phyll Chem., 83, 765 (1952).

Som anvendt heri anvendes betegnelsene "glukose", "D-glukose" og "dekstrose" om hverandre for å betegne dette monosakkarid i hvilken som helst form, enten oppløsning eller i tørr til-stand. Fig. 2 representerer glukose. As used herein, the terms "glucose", "D-glucose" and "dextrose" are used interchangeably to denote this monosaccharide in any form, either in solution or in the dry state. Fig. 2 represents glucose.

Betegnelsene "D-glukoson" og "D-arabino-2-heksosulose" anvendes om hverandre. Fig. 3 representerer D-glukoson. The terms "D-glucosone" and "D-arabino-2-hexosulose" are used interchangeably. Fig. 3 represents D-glucosone.

Som anvendt heri anvendes betegnelsene "fruktose", "D-fruktose" og "levulose" om hverandre for å referere til den isomer av glukose som er søtere enn glukose. Betegnelsen "krystallinsk fruktose" anvendes her for å betegne dette monosakkarid i vandig form. As used herein, the terms "fructose", "D-fructose" and "levulose" are used interchangeably to refer to the isomer of glucose that is sweeter than glucose. The term "crystalline fructose" is used here to denote this monosaccharide in aqueous form.

Ved den foreliggende oppfinnelse blir generelt angitt glukose i vandig løsning enzymatisk omdannet til D-glukoson med et passende enzym som for eksempel karbonhydratoksydase eller In the present invention, generally stated glucose in aqueous solution is enzymatically converted to D-glucosone with a suitable enzyme such as, for example, carbon dioxide oxidase or

. glukose-2-oksydase. Denne omdannelse kan fortsette spontant, hurtig og omtrent fullstendig . glucose-2-oxidase. This transformation can proceed spontaneously, quickly and almost completely

Som nevnt og omtalt ovenfor er mindre omdannelser av glukose til D-glukoson kjent innen den vitenskapelige litteratur. D-glukoson ble for eksempel kjemisk syntetisert på grunn av at den var ønskelig som en kjemisk standard. D-glukoson ble oppdaget i biologiske systemer, enten utilsiktet (for eksempel som en ukjent komponent i en biokjemisk reaksjonsrekke under studium) eller med hensikt (som en del av en undersøkelse av den biokjemiske oksydasjon av glukose i blod). D-glukoson kunne reduseres til fruktose som en analytisk såkalt "spot test" for nærvær av D-glukoson. As mentioned and discussed above, minor conversions of glucose to D-glucosone are known in the scientific literature. D-glucosone, for example, was chemically synthesized because it was desirable as a chemical standard. D-glucosone was discovered in biological systems, either accidentally (for example as an unknown component in a biochemical reaction series during study) or intentionally (as part of an investigation of the biochemical oxidation of glucose in blood). D-glucosone could be reduced to fructose as an analytical so-called "spot test" for the presence of D-glucosone.

Med mindre både omdannelsen av glukose til D-glukoson og omdannelse av D-glukoson til fruktose kunne gjennomføres med høyt utbytte, ville en industriell fremstilling av krystal-linsk fruktose ved hjelp av denne metode ikke være mulig da den dyre fysikalske separasjonsbehandling for å fjerne resterende glukose fremdeles ville behøves. Ved den foreliggende oppfinnelse blir glukose lett og fullstendig omdannet til D-glukoson under anvendelse av et renset oksidoreduktaseenzym som for eksempel karbohydratoksydase eller glukose-2-oksydase. Utbyttet oppnådd ved den foreliggende oppfinnelse overstiger det utbyttet som er rapportert i litteraturen for dette enzym. Denne høye omdannelse til D-glukoson eliminerer behovet for fysikalsk separasjon av eventuell resterende uomdannet glukose. Unless both the conversion of glucose to D-glucosone and the conversion of D-glucosone to fructose could be carried out in high yield, an industrial production of crystalline fructose using this method would not be possible as the expensive physical separation treatment to remove residual glucose would still be needed. In the present invention, glucose is easily and completely converted to D-glucosone using a purified oxidoreductase enzyme such as carbohydrate oxidase or glucose-2-oxidase. The yield obtained by the present invention exceeds the yield reported in the literature for this enzyme. This high conversion to D-glucosone eliminates the need for physical separation of any remaining unconverted glucose.

Visse oksidoreduktaser har katalytisk aktivitet med hensyn til oksydasjon av hydroksylgruppen på det annet karbonatom i glukose, ved at oksydasjon av denne hydroksylgruppe til en ketogruppe fremmes, for eksempel ved omdannelse av strukturen i fig. 2 til strukturen i fig. 3. De spesifikke oksidoreduk-taseensymer som er beskrevet i eksemplene heri omhandles som "glukose-2-oksydase", "pyranose-2-oksydase" og "karbohydratoksydase", men andre enzymer med samme evne kan også anvendes. Glukose-2-oksydase har en høy spesifikk evne for glukose som et substrat, mens karbohydratoksydase, som har glukose som sitt foretrukne substrat, har en bedre substrat-spesifikk evne. Et hvilket som helst enzym som er i stand til å omdanne hydroksylgruppen på det annet karbonatom i glukose til en ketogruppe og som ellers ikke i særlig grad påvirker resten av glukosemolekylet faller innenfor oppfinnelsens ramme. Et slikt enzym kan spesifiseres som et enzym med glukose-2-oksydase-aktivitet. Certain oxidoreductases have catalytic activity with regard to oxidation of the hydroxyl group on the second carbon atom in glucose, in that oxidation of this hydroxyl group to a keto group is promoted, for example by conversion of the structure in fig. 2 to the structure in fig. 3. The specific oxidoreductase enzymes described in the examples herein are referred to as "glucose-2-oxidase", "pyranose-2-oxidase" and "carbohydrate oxidase", but other enzymes with the same ability may also be used. Glucose-2-oxidase has a high specific ability for glucose as a substrate, while carbohydrate oxidase, which has glucose as its preferred substrate, has a better substrate-specific ability. Any enzyme which is capable of converting the hydroxyl group on the second carbon atom in glucose into a keto group and which otherwise does not particularly affect the rest of the glucose molecule falls within the scope of the invention. Such an enzyme can be specified as an enzyme with glucose-2-oxidase activity.

Et foretrukket karbohydratoksydase enzym avledes fra mikroorganismen Polyporus obtusus. Kilder for glukose-2-oksydase inkluderer forskjellige andre mikroorganismer, bløtdyr og rød-alger omtalt ovenfor. Disse enzymer og deres kilder er bare forslagsvise og betegner bare eksempler på passende enzymer og deres kilder innenfor oppfinnelsens ramme. A preferred carbohydrate oxidase enzyme is derived from the microorganism Polyporus obtusus. Sources of glucose-2-oxidase include various other microorganisms, molluscs and red algae discussed above. These enzymes and their sources are only suggestive and represent only examples of suitable enzymes and their sources within the scope of the invention.

For å lette drøftelsen skal forskjellige aspekter ved oppfinnelsen beskrives mer spesielt i forbindelse med bruk av det foretrukne karbohydratoksydase fra Polyporus obtusus og glukose-2-oksydase fra Aspergillus oryzae. Mikroorganismene kan dyrkes i omrørt, neddykket kultur ved romtemperatur ved hjelp av konvensjonelle metoder. Enzymet fremstilles fra mycel av mikroorganismen dyrket under omrørte, neddykkede dyrkingsbetingelser. To facilitate the discussion, various aspects of the invention will be described more particularly in connection with the use of the preferred carbohydrate oxidase from Polyporus obtusus and glucose-2-oxidase from Aspergillus oryzae. The microorganisms can be grown in stirred, submerged culture at room temperature using conventional methods. The enzyme is produced from the mycelium of the microorganism grown under stirred, submerged culture conditions.

Enzymet anvendes foretrukket i en immobilisert form, selv om fritt enzym også kan anvendes. Prosessene for enzymimmobili-sering er vel kjent for den fagkyndige og består i å omsette en oppløsning av enzymet med en oppløsning av en rekke over-flatebehandlede eller ubehandlede organiske og uorganiske bærere. Inkludert blant disse er polyakrylamid, etylenmalein-syre kopolymerer, metakrylbaserte polymerer, polypeptider, styrenbaserte polymerer, agarose, cellulose, dekstran, silisumoksyd, porøse glasskuler, trekull eller "carbon black", trevirke og sagflis, hydroksyapatitt og aluminium- eller titanhydroksyd. Enzymer i denne form har øket stabilitet, forlenget levetid og brukbarhet og gjenvinnbarhet. Reaksjoner under anvendelse av immobiliserte enzymer kan gjennomføres i kolonner eller reaktortanker eller andre passende reaktorer. The enzyme is preferably used in an immobilized form, although free enzyme can also be used. The processes for enzyme immobilization are well known to those skilled in the art and consist of reacting a solution of the enzyme with a solution of a number of surface-treated or untreated organic and inorganic carriers. Included among these are polyacrylamide, ethylene-maleic acid copolymers, methacrylic-based polymers, polypeptides, styrene-based polymers, agarose, cellulose, dextran, silica, porous glass beads, charcoal or "carbon black", wood and sawdust, hydroxyapatite and aluminum or titanium hydroxide. Enzymes in this form have increased stability, extended life and usability and recyclability. Reactions using immobilized enzymes can be carried out in columns or reactor tanks or other suitable reactors.

I tillegg til karbohydratoksydase eller glukose-2-oksydase enzymer trenges en oksygenkilde. Det kreves også en metode for hydrogenperoksydfjernelse eller utnyttelse ved reaksjonen for å omdanne glukose til glukoson på effektiv måte. Dette er på grunn av at ^ 2°2 oksyderer visse kritiske punkter i enzymmolekylet og skader dets funksjon. Metoder for hydro-genperoksydf jernelse inkluderer (1) spalting av enzymet, katalase, (2) spalting ved hjelp av kjente kjemiske midler, (3) spalting ved å anvende spaltingsmidler som for eksempel manganoksyd eller "carbon black", se for eksempel Z. Diwnjak og M.D. Lilly, Biotechnology og Bioengineering, 18, 737-739 In addition to carbohydrate oxidase or glucose-2-oxidase enzymes, an oxygen source is needed. A method for hydrogen peroxide removal or utilization in the reaction is also required to efficiently convert glucose to glucosone. This is because ^ 2°2 oxidizes certain critical points in the enzyme molecule and damages its function. Methods of hydrogen peroxide removal include (1) cleavage by the enzyme, catalase, (2) cleavage using known chemical agents, (3) cleavage using cleavage agents such as manganese oxide or carbon black, see for example Z. Diwnjak and M.D. Lilly, Biotechnology and Bioengineering, 18, 737-739

(1976) og Y.K. Cho og J.E. Bailey, Biotechnology og Bioengineering, 19, 769-775 (1977) som immobiliserende bærere for oksidoreduktaseenzymet. Foretrukket blir det fremstilte hydrogenperoksyd, i stedet for å spaltes, konsumert til å frembringe et verdifullt sideprodukt. Kobling av D-glukosonfremstilling med propylenhalohydrin- eller propylenoksydfrem-stilling er et foretrukket eksempel, som vist i fig. 1. (1976) and Y.K. Cho and J.E. Bailey, Biotechnology and Bioengineering, 19, 769-775 (1977) as immobilizing carriers for the oxidoreductase enzyme. Preferably, the produced hydrogen peroxide, instead of being decomposed, is consumed to produce a valuable by-product. Coupling D-glucosone production with propylene halohydrin or propylene oxide production is a preferred example, as shown in fig. 1.

Den enzymatiske omdannelse av glukose til D-glukoson gjennom-føres foretrukket i vann ved omtrent nøytral pH, men kan gjennomføres innenfor pH-området fra omtrent 3 til omtrent 8 ved bruk av passende buffere. Denne omdannelse gjennomføres foretrukket ved vanlig temperatur, men kan gjennomføres innenfor temperaturområdet fra omtrent 15°C til omtrent 65°C. Trykkbetingelser er foretrukket atmosfæriske men kan utgjøres fra under atmosfæretrykk til over atmosfæretrykk. Et hvilket som helst karbohydratmaterial, som ved kjemiske eller enzymatiske midler gir glukose, er en passende kilde for glukose for omdannelse til D-glukoson ved hjelp av den nevnte syntese. Disse substanser vil inkludere men er ikke begrenset til cellulose, stivelse, sukrose, maissirup, HFCS og andre siruparter inneholdende forskjellige mengdeforhold av glukose og fruktose. The enzymatic conversion of glucose to D-glucosone is preferably carried out in water at approximately neutral pH, but can be carried out within the pH range from about 3 to about 8 using suitable buffers. This conversion is preferably carried out at ordinary temperature, but can be carried out within the temperature range from about 15°C to about 65°C. Pressure conditions are preferably atmospheric but can range from below atmospheric pressure to above atmospheric pressure. Any carbohydrate material which by chemical or enzymatic means yields glucose is a suitable source of glucose for conversion to D-glucosone by the aforementioned synthesis. These substances will include but are not limited to cellulose, starch, sucrose, corn syrup, HFCS and other types of syrup containing different proportions of glucose and fructose.

Etter omdannelse av hovedsakelig all glukosen til D-glukoson kan som et rent eksempel D-glukoson lett og hovedsakelig full-standig omdannes til fruktose. After converting essentially all of the glucose into D-glucose, as a pure example, D-glucose can easily and essentially completely be converted into fructose.

De prøver som anvendes for å analysere sukkerartene ved den foreliggende oppfinnelse er gitt i det følgende: 1. Tynnsjiktkromatografering (TLC). Avicelbelagte glass-plater fremkalles med en 8:8:2:4 (volumdeler) isopropanol: pyridin:eddiksyre:vann-løsningsmiddelblanding. Glukose og fruktose har Rf-verdier på 0,5 - 0,6, D-glukoson har R^The samples used to analyze the sugars in the present invention are given in the following: 1. Thin layer chromatography (TLC). Avicel-coated glass plates are developed with an 8:8:2:4 (parts by volume) isopropanol:pyridine:acetic acid:water solvent mixture. Glucose and fructose have Rf values of 0.5 - 0.6, D-glucosone has R^

0,4 - 0,5 (R^ = avstanden som substansen vandrer fra opp-rinnelse/løsningsmiddel = frontavstanden fra opprinnelsen). Når platene dusjes med trifenyltetrazoliumklorid (2 % TTC i 0,5N NaOH), gir både D-glukoson og fruktose øyeblikkelig røde 0.4 - 0.5 (R^ = the distance that the substance migrates from the origin/solvent = the front distance from the origin). When the plates are showered with triphenyltetrazolium chloride (2% TTC in 0.5N NaOH), both D-glucosone and fructose immediately give red

flekker. Glukose gir en rød flekk bare etter oppvarming i ti minutter ved 100°C. Når platene dusjes med difenylamin/ anilin/fosforsyre/etylacetatreagens (0,15 g/0,8 ml/11 ml/ 100 ml) gir glukose en brun flekk. D-glukoson gir en purpur-formet strek og fruktose gir en gul flekk ved oppvarming i ti minutter ved 95°C. 2. Væskekromatografering med høy yteevne (HPLC). En ^ u-Bondapak-Karbohydratkolonne, anskaffet fra Waters Associates, drives med 15 % vandig acetonitril inneholdende 0,001 M kaliumfosfatbuffer pH7 med en strømningstakt på 2 ml/min. Glukose har en R 11,5, D-glukoson en R 14,0 og fruktose en Rt 9,5 (R = retensjonstid). Forsøk gjennomføres på et Spectra Physics SP8000 instrument under anvendelse av både en Waters Associates brytningsmiddelindeksdetektor og en Schoeffel variabel bølgelengde UV-detektor ved 192 nm. 3. Massespektrometri (MS). Den følgende derivatiserings-protokoll anvendes for å gjøre de kjemiske komponenter flyktige: a) Til omtrent 100 mg av den frysetørkede prøve tilsettes 110 mg av N, N-dif enylhydrazin (H.,NNø2) og 1 ml 75 % vandig etanol. Reaksjonsblandingen utsettes for en vortex-behandling og for deretter å stå i ro over natten ved romtemperatur . b) 3 ml vann tilsettes til reaksjonsblandingen og det resulterende bunnfall separeres fra den overliggende væske-mengde ved sentrifugering og dekantering. Til dette bunnfall tilsettes 1 ml av 1:1 blanding av pyridin-eddiksyre-hydrid. Reaksjonsblandingen anbringes i 35 - 40°C vannbad i 15 minutter med leilighetsvis omrysting. c) 2 ml vann tilsettes for å stoppe reaksjonen og deretter ekstraheres blandingen to ganger med 3 ml porsjoner av etyleter. Eteren tørkes over en liten mengde vannfritt natriumsulfat og deretter avdrives eteren med forsiktig oppvarming (40°C) under gjennombobling av nitrogen. d) Det resulterende faststoff eller sirup er klar for massespektrometrisk analyse. stains. Glucose gives a red spot only after heating for ten minutes at 100°C. When the plates are showered with diphenylamine/aniline/phosphoric acid/ethyl acetate reagent (0.15 g/0.8 ml/11 ml/100 ml) glucose gives a brown spot. D-glucosone gives a purple line and fructose gives a yellow spot when heated for ten minutes at 95°C. 2. High performance liquid chromatography (HPLC). A ^u-Bondapak Carbohydrate column, obtained from Waters Associates, is operated with 15% aqueous acetonitrile containing 0.001 M potassium phosphate buffer pH7 at a flow rate of 2 ml/min. Glucose has an R 11.5, D-glucosone an R 14.0 and fructose an Rt 9.5 (R = retention time). Experiments are conducted on a Spectra Physics SP8000 instrument using both a Waters Associates refractive index detector and a Schoeffel variable wavelength UV detector at 192 nm. 3. Mass spectrometry (MS). The following derivatization protocol is used to make the chemical components volatile: a) To approximately 100 mg of the freeze-dried sample, 110 mg of N, N-diphenylhydrazine (H.,NNø2) and 1 ml of 75% aqueous ethanol are added. The reaction mixture is subjected to a vortex treatment and then allowed to stand overnight at room temperature. b) 3 ml of water is added to the reaction mixture and the resulting precipitate is separated from the overlying amount of liquid by centrifugation and decantation. To this precipitate is added 1 ml of a 1:1 mixture of pyridine-acetic acid hydride. The reaction mixture is placed in a 35 - 40°C water bath for 15 minutes with occasional shaking. c) 2 ml of water are added to stop the reaction and then the mixture is extracted twice with 3 ml portions of ethyl ether. The ether is dried over a small amount of anhydrous sodium sulfate and then the ether is driven off with careful heating (40°C) while bubbling through nitrogen. d) The resulting solid or syrup is ready for mass spectrometric analysis.

Forventede reaksjoner: Expected reactions:

Glukose gir et molekylært ion med masse 556 (C^H^^^O ^ Glucose gives a molecular ion of mass 556 (C^H^^^O ^

og et baseion med masse 168 (Nø2 ionfragment), fruktose gir et molekylært ion med masse 390 (ci5H22°ll' ' D-<3luk°son gir et molekylært ion med masse 512 (<C>2<gH>2<gN>2<Og>) og et intens, diagnostisk fragment ion med masse 223 (OC-CH=N-Nø2-ionfragment). Forsøk kjøes på et Finnigan GC/MS/DS modell 4023 instrument satt til 70 eV elektronstøtionisering og ved 220° prøvetemperatur. and a base ion with mass 168 (Nø2 ion fragment), fructose gives a molecular ion with mass 390 (ci5H22°ll' ' D-<3luk°son gives a molecular ion with mass 512 (<C>2<gH>2<gN> 2<Og>) and an intense, diagnostic fragment ion with mass 223 (OC-CH=N-Nø2 ion fragment). Experiments are run on a Finnigan GC/MS/DS model 4023 instrument set to 70 eV electron ionization and at 220° sample temperature .

4. Kalorimetrisk prøverørforsøk. Analyse av D-glukoson i nærvær av et overskudd av glukose bestemmes lett ved hjelp av to kolorimetriske metoder. Under anvendelse av trifenyltetrazoliumklorid (TTC) er påvisningsmetoden basert på en forskjel-lig reduksjonstakt for de to sukkerarter. Inn i et 20 ml prøverør tilsettes en 0,5 ml prøve, pluss 0,1 ml 1 % vandig TTC, pluss 0,4 ml 6N NaOH. Etter nøyaktig to minutter tilsettes 15 ml eddiksyre:etanol (1:9) og prøverørinnholdet blir vortexbehandlet. Med vann anvendt som en blindprøve måles absorpsjonen ved 480 nm under anvendelse av et Varian 635 UV/VIS spektrometer. Glukose reduserer TTC til et rødt pig-ment - et trifenylformazan - omtrent 100 ganger saktere enn en ekvivalent mengde av D-glukoson. Under anvendelse av difenylamin/anilin/fosforsyrereagens er påvisningsmetoden basert på de forskjellige farger frembragt med sukkerarter av forskjellige strukturer. Inn i et 20 ml prøverør tilsettes en 0,2 ml prøve, pluss 5 ml av følgende reagensblanding: 4. Calorimetric test tube experiment. Analysis of D-glucosone in the presence of an excess of glucose is easily determined by two colorimetric methods. Using triphenyltetrazolium chloride (TTC), the detection method is based on a different reduction rate for the two sugars. Into a 20 ml test tube add a 0.5 ml sample, plus 0.1 ml 1% aqueous TTC, plus 0.4 ml 6N NaOH. After exactly two minutes, 15 ml of acetic acid:ethanol (1:9) is added and the test tube contents are vortexed. With water used as a blank, the absorbance is measured at 480 nm using a Varian 635 UV/VIS spectrometer. Glucose reduces TTC to a red pigment - a triphenyl formazan - about 100 times slower than an equivalent amount of D-glucosone. Using diphenylamine/aniline/phosphoric acid reagent, the detection method is based on the different colors produced by sugars of different structures. Into a 20 ml test tube, add a 0.2 ml sample, plus 5 ml of the following reagent mixture:

Prøverørene anbringes i et 37°C vannbad i 60 minutter. Glukose gir en gulfarget oppløsning og D-glukoson gir en pur-purfarget oppløsning. The test tubes are placed in a 37°C water bath for 60 minutes. Glucose gives a yellow colored solution and D-glucosone gives a purplish colored solution.

Kildene for de rene sukkerarter anvendt ved de forskjellige analytiske aspekter av oppfinnelsen er gitt i det følgende: The sources for the pure sugars used in the various analytical aspects of the invention are given below:

1. D-glukose ble erholdt fra Applied Science Laboratories, 1. D-glucose was obtained from Applied Science Laboratories,

99 % renhet. 99% purity.

2. D-fruktose ble anskaffet fra Applied Science Laboratories, 99+% renhet. 2. D-Fructose was procured from Applied Science Laboratories, 99+% purity.

3. D-glukoson ble kjemisk syntetisert ved følgende metode: 3. D-glucosone was chemically synthesized by the following method:

20 g glukose blandes med 1 1 destillert vann inneholdende 27 ml iseddik. 44 g fenylhydrazin tilsettes. Reaksjonen 20 g of glucose are mixed with 1 1 of distilled water containing 27 ml of glacial acetic acid. 44 g of phenylhydrazine are added. The reaction

gjennomføres i tre timer ved 80°C under kraftig omrøring fra et mekanisk røreverk og deretter foretas avkjøling til romtemperatur i løpet av natten. Faststoffet frafiltreres og vaskes med 10 % eddiksyre, vann og deretter med etyleter. Faststoffet tørkes godt i en vakuumovn ved 50°C. Det eksperimentelle utbytte er 16,1 g glukosazon. Gluko-sazonet anbringes i en trehalskolbe på 3 1 og 450 ml etanol, 750 ml destillert vann og 9 ml iseddik tilsettes. 27,8 g friskt benzaldehyd tilsettes og bringes til tilbake-løp under kraftig omrøring ved hjelp av en mekanisk røre-innretning. Reaksjonen kjøres under tilbakeløp i fem timer. Kondensatoren snus og 450 ml destilleres over mens det tilsettes 750 ml destillert vann (vis en tilsetnings-trakt) til kolben. Reaksjonen pågår saktere i løpet av natten for å la benzaldehyd-fenylhydrazonet felles ut. Oppløsningen filtreres og resten vaskes med destillert vann (omtrent 1 1) inntil vannet blir klart. Filtratet pluss vaskevannet inndampes til 500 ml og deretter ekstraheres med ti stykker 300 ml porsjoner av etyleter. For å bli kvitt resterende etyleter i den vandige løsning anbringes is carried out for three hours at 80°C with vigorous stirring from a mechanical stirrer and then cooled to room temperature overnight. The solid is filtered off and washed with 10% acetic acid, water and then with ethyl ether. The solid is dried well in a vacuum oven at 50°C. The experimental yield is 16.1 g of glucosazone. The glucosazone is placed in a 3 L three-necked flask and 450 ml of ethanol, 750 ml of distilled water and 9 ml of glacial acetic acid are added. 27.8 g of fresh benzaldehyde are added and brought to reflux with vigorous stirring using a mechanical stirring device. The reaction is run under reflux for five hours. The condenser is turned over and 450 ml is distilled over while 750 ml of distilled water (show an addition funnel) is added to the flask. The reaction proceeds more slowly during the night to allow the benzaldehyde-phenylhydrazone to precipitate. The solution is filtered and the residue is washed with distilled water (approximately 1 1) until the water becomes clear. The filtrate plus the washing water is evaporated to 500 ml and then extracted with ten 300 ml portions of ethyl ether. To get rid of residual ethyl ethers in the aqueous solution is placed

denne på en rotasjonsevaporator i 30 minutter. Den vandige løsning føres gjennom en fire ganger 100 cm kolonne inneholdende kraftig acetonvasket "Amberlite XAD-2". Kolonnen vaskes med ytterligere 200 ml vann for å fjerne resterende glukoson. De kombinerte vandige porsjoner frysetørkes. Eksperimentelt utbytte av glukoson er 3,4 g (16 % totalt utbytte). this on a rotary evaporator for 30 minutes. The aqueous solution is passed through a four by 100 cm column containing heavily acetone-washed "Amberlite XAD-2". The column is washed with an additional 200 ml of water to remove residual glucosone. The combined aqueous portions are freeze-dried. Experimental yield of glucosone is 3.4 g (16% total yield).

De følgende eksempler illustrerer forskjellige trekk ved oppfinnelsen og med mindre annet er angitt er alle temperaturene målt ved romtemperatur (omtrent 25°C) og alle vanlige trykk (omtrent 1 atmosfære). The following examples illustrate various features of the invention and unless otherwise stated, all temperatures are measured at room temperature (approximately 25°C) and all normal pressures (approximately 1 atmosphere).

EKSEMPEL I ( med spalting av hydrogenperoksydet). EXAMPLE I (with cleavage of the hydrogen peroxide).

Omtrent fullstendig omdannelse av glukose til D-glukoson under anvendelse av immobilisert karbohydratoksydase er vist i dette eksempel. Almost complete conversion of glucose to D-glucosone using immobilized carbohydrate oxidase is shown in this example.

Glukose (2 g) tilsettes til 20 ml destillert vann i 100 ml Pyrexkolbe og sukkeroppløsningen omrøres. Oksygengass bobles inn i koblen og 3 mg katalase (Sigma Chemical Co., C-40, fra bovinlever) tilsettes. Agaroseimmobilisert karbohydratoksydase fremstilt som angitt herunder fra 200 ml dyrking tilsettes også til kolben. Glucose (2 g) is added to 20 ml of distilled water in a 100 ml Pyrex flask and the sugar solution is stirred. Oxygen gas is bubbled into the coupling and 3 mg of catalase (Sigma Chemical Co., C-40, from bovine liver) is added. Agarose immobilized carbohydrate oxidase prepared as indicated below from 200 ml culture is also added to the flask.

For å fremstille enzymet dyrkes mycelklumper av Polyporus obtusus ATCC nr. 26733 på gjær/maltekstrakt-agar-skrå som følger: gjærekstrakt (3 g), maltekstrakt (3 g), agar (20 g), pepton (5 g) og glukose (10 g) tilsettes til destillert vann (1 1) og pH innstilles til 6,7. Blandingen steriliseres ved 121°C i 15 minutter. pH innstilles så til 6,4. Organismen podes på skrå-agaren og dyrkes i syv døgn ved 25°C. Den dyrkede organisme blir så anvendt for å inokkulere gjær/malt-ekstraktmedium (20 ml medium i 125 ml Erlenmeyerkolbe), fremstilt som ovenfor (men ikke noe agar tilsatt). Organismen dyrkes i ni døgn på en roterende rystemaskin ved 25°C. Kulturen vakuumfiltreres gjennom nr. 541 Whatman papir på en Buchnertrakt. Mycelet, tilbakeholdt på filterpapiret, inneholder enzymet. To prepare the enzyme, mycelial clumps of Polyporus obtusus ATCC No. 26733 are grown on yeast/malt extract agar slants as follows: yeast extract (3 g), malt extract (3 g), agar (20 g), peptone (5 g) and glucose ( 10 g) is added to distilled water (1 1) and the pH is adjusted to 6.7. The mixture is sterilized at 121°C for 15 minutes. The pH is then adjusted to 6.4. The organism is inoculated onto the agar slant and grown for seven days at 25°C. The cultured organism is then used to inoculate yeast/malt extract medium (20 ml medium in 125 ml Erlenmeyer flask), prepared as above (but no agar added). The organism is grown for nine days on a rotary shaker at 25°C. The culture is vacuum filtered through No. 541 Whatman paper on a Buchner funnel. The mycelium, retained on the filter paper, contains the enzyme.

Den mycel som oppnås fra 400 ml dyrkingskultur vaskes to ganger med 0,05M kaliumfosfatbuffer ved pH 7,0. Mycelet blir så anbragt i en Waring-blandeinnretning som inneholder 70 ml 0,05M kaliumfosfatbuffer ved 7,0 og blir så homogenisert i tre minutter. Blandingen blir så sentrifugert ved 6000 omdreininger pr. minutt i 20 minutter og den overliggende væske helt av fra faststoffene. Til den avhelte væske, anbragt i en 500 ml Erlenmeyerkolbe, tilsettes 19 g polyetylenglykol (mole-kylvekt 4000) og oppløsningen omrøres i 30 minutter. Sus-pensjonen blir så sentrifugert ved 7000 omdreininger pr. minutt i 20 minutter. Den overliggende væske helles av og slås ut. 15 ml 0,2M natriumklorid pluss 15 ml 0,05 kaliumfosfatbuffer ved pH 7 tilsettes så til bunnfallet og utsettes for en vortextbehandling. Oppløsningen får stå i 30 minutter og under det dannes et bunnfall. Blandingen sentrifugeres ved 14.000 omdreininger pr. minutt i 20 minutter. Et opakt hvitt overliggende væskelag inneholdende cellefritt, renset enzym helles av. The mycelium obtained from 400 ml culture is washed twice with 0.05 M potassium phosphate buffer at pH 7.0. The mycelium is then placed in a Waring mixer containing 70 ml of 0.05M potassium phosphate buffer at 7.0 and then homogenized for three minutes. The mixture is then centrifuged at 6000 rpm. minute for 20 minutes and the overlying liquid completely off the solids. To the drained liquid, placed in a 500 ml Erlenmeyer flask, 19 g of polyethylene glycol (molecular weight 4000) are added and the solution is stirred for 30 minutes. The suspension is then centrifuged at 7,000 rpm. minute for 20 minutes. The overlying liquid is poured off and knocked out. 15 ml of 0.2M sodium chloride plus 15 ml of 0.05 potassium phosphate buffer at pH 7 is then added to the precipitate and subjected to a vortex treatment. The solution is allowed to stand for 30 minutes, during which time a precipitate forms. The mixture is centrifuged at 14,000 revolutions per minute for 20 minutes. An opaque white overlying liquid layer containing cell-free, purified enzyme is poured off.

Immobilisering av enzymet på agarose kan gjennomføres på følgende måte: Det cellefri rensede; enzym dialyseres mot 500 ml destillert vann over natten. Deretter tilsettes 5 ml 0,1M natriumbikarbonat ved pH 8,0. Til denne oppløsning tilsettes 5 g aktivert CH-Sepharose 4B (vasket og svellet på nytt på et sintret glassfilter under anvendelse av 500 ml ImN HC1). Under anvendelse av en ende-overende-blandeinnretning blandes gelsuspensjonen i en time ved 25°C. Gelsuspensjonen blir så vasket først med 40 ml 0,1M natriumbikarbonat ved pH 8,0 og deretter med 40 ml 0,05M Trisbuffer ved pH 8,0 inneholdende 0,5M natriumklorid, og deretter med 0,5M natriumformiatbuffer ved pH 4,0 også inneholdende 0,5M natriumklorid. Immobilization of the enzyme on agarose can be carried out in the following way: The cell-free purified; enzyme is dialysed against 500 ml of distilled water overnight. 5 ml of 0.1M sodium bicarbonate at pH 8.0 is then added. To this solution is added 5 g of activated CH-Sepharose 4B (washed and re-swelled on a sintered glass filter using 500 ml of 1N HC1). Using an end-to-end mixing device, the gel suspension is mixed for one hour at 25°C. The gel suspension is then washed first with 40 ml of 0.1 M sodium bicarbonate at pH 8.0 and then with 40 ml of 0.05 M Tris buffer at pH 8.0 containing 0.5 M sodium chloride, and then with 0.5 M sodium formate buffer at pH 4.0 as well containing 0.5M sodium chloride.

Prøver av reaksjonsblandingen trekkes ut ved forskjellige tidspunkt og analyseres med hensyn til glukose og D-glukoson. Under anvendelse av HPLC bedømmes topparealene for toppene ved Rt 11,5 min. (glukose) og Rt 14,0 min. (D-glukoson) kvan-titativt, og innhold av tilstedeværende sukkerarter beregnes. De følgende resultater oppnås: Samples of the reaction mixture are withdrawn at different time points and analyzed for glucose and D-glucosone. Using HPLC, the peak areas of the peaks at Rt 11.5 min are judged. (glucose) and Rt 14.0 min. (D-glucosone) quantitatively, and the content of sugars present is calculated. The following results are obtained:

Den nesten fullstendige omdannelse av glukose til D-glukoson vises også ved forsvinningen av flekken ved Rf 0,58 (glukose) og tilsynekomsten av streken ved Rf 0,43 - 0,49 (D-glukoson) over forløpet av reaksjonen, og ved økningen i absorpsjon ved 480 nm over reaksjonsforløpet under anvendelse av TTC kalorimetrisk prøverøranalyse. The almost complete conversion of glucose to D-glucosone is also shown by the disappearance of the spot at Rf 0.58 (glucose) and the appearance of the line at Rf 0.43 - 0.49 (D-glucosone) over the course of the reaction, and by the increase in absorption at 480 nm over the course of the reaction using TTC calorimetric test tube analysis.

At produktet faktisk er D-glukoson bekreftes ved derivat-dannelse etterfulgt av massespektrometri som beskrevet tidligere. Det diagnostiske D-glukoson viser masseion ved masse 512 (molekylært ion) og masse 223 (OC-CH=N-N02~ionfragment) oppnås for produktet. That the product is actually D-glucosone is confirmed by derivative formation followed by mass spectrometry as described earlier. The diagnostic D-glucosone shows mass ion at mass 512 (molecular ion) and mass 223 (OC-CH=N-N02 ion fragment) is obtained for the product.

EKSEMPEL II ( med spalting av hydrogenperoksydet). EXAMPLE II (with cleavage of the hydrogen peroxide).

Dette eksempel viser hovedsakelig fullstendig enzymatisk omdannelse av glukose til D-glukoson under anvendelse av glukose-2-oksydase. This example shows substantially complete enzymatic conversion of glucose to D-glucosone using glucose-2-oxidase.

Reaksjonen og betingelsene fra eksempel I (under anvendelse av agarose som immobiliserende bærer) gjentas under erstatning av karbohydratoksydase med glukose-2-oksydase. Etter fem timers reaksjon var mer enn 99 % av glukosen omdannet til D-glukoson. For å fremstille enzymet, glukose-2-oksydase, dyrkes mycel-kulturer av Aspergillus oryzae ATTC nr. 7252 i kjøtt/gjærekstrakt/tryptonmedium som følger: kjøttekstrakt (5 g), gjærekstrakt (5 g), trypton (3 g), dekstrose (1 g) og Difcostiv-else (24 g) tilsettes til destillert vann (1 1) og pH innstilles til 7,3. Blandingen steriliseres ved 121°C i 35 minutter. Under anvendelse av sporer oppnådd på vanlig kjent måte, inokkuleres mediet til å gi omtrent 3 x 10^ sporer/ml og dyrkes på en roterende rysteinnretning (180 omdreininger pr. minutt) ved 30°C i to døgn. Kulturen vakuumfiltreres gjennom filterpapir (nr. 541 Whatman) i en Buchnertrakt og vaskes flere ganger med vann. Mycelet, tilbakeholdt på filterpapiret, inneholder enzymet. The reaction and conditions of Example I (using agarose as immobilizing support) are repeated substituting glucose-2-oxidase for carbohydrate oxidase. After five hours of reaction, more than 99% of the glucose had been converted to D-glucosone. To prepare the enzyme, glucose-2-oxidase, mycelial cultures of Aspergillus oryzae ATTC No. 7252 are grown in meat/yeast extract/tryptone medium as follows: meat extract (5 g), yeast extract (5 g), tryptone (3 g), dextrose (1 g) and Difcostiv-else (24 g) are added to distilled water (1 1) and the pH is adjusted to 7.3. The mixture is sterilized at 121°C for 35 minutes. Using spores obtained in a conventional manner, the medium is inoculated to give approximately 3 x 10^ spores/ml and grown on a rotary shaker (180 revolutions per minute) at 30°C for two days. The culture is vacuum filtered through filter paper (no. 541 Whatman) in a Buchner funnel and washed several times with water. The mycelium, retained on the filter paper, contains the enzyme.

Rensing og immobilisering av enzymet kan deretter foregå under anvendelse av metoden angitt under eksempel I. Purification and immobilization of the enzyme can then take place using the method indicated under example I.

EKSEMPEL III ( kombinasjonsprosess). EXAMPLE III (combination process).

I eksempel I ble innholdet av fritt hydrogenperoksyd utviklet ved reaksjonen mellom glukose og karbohydratoksydase i forbindelse med D-glukosondannelsen nedsatt til et minimum ved å anvende katalase for å spalte hydrogenperoksydet. En alterna-tiv metode for å nedsette innholdet av fritt hydrogenperoksyd til et minimum er å forbinde dets fremstilling med en hydro-genperoksydforbrukende reaksjon som gir et ønskelig (verdifullt) sideprodukt. In Example I, the content of free hydrogen peroxide developed by the reaction between glucose and carbohydrate oxidase in connection with the formation of D-glucose was reduced to a minimum by using catalase to split the hydrogen peroxide. An alternative method to reduce the content of free hydrogen peroxide to a minimum is to connect its production with a hydrogen peroxide-consuming reaction which gives a desirable (valuable) by-product.

I dette eksempel kobles hydrogenperoksydfremstillingen til fremstillingen av propylenbromhydrin, et mellomprodukt ved propylenoksydsyntesen, som her ikke behøver nærmere behandling. Reaksjonen av glukose med immobilisert karbohydratoksydase av Polyporus obtusus ATCC nr. 26733 til å gi D-glukoson og hydrogenperoksyd kobles til reaksjonen av immobilisert tangperoksydase fra Coralina sp. i nærvær av bromid og propylen til å gi propylenbromhydrin. Sluttresultat av denne koblede reaksjon, er da fremstilling av glukoson for etterfølgende fruktosefremstilling og biproduktet propylenbromhydrin, som lett kan omdannes til propylenoksyd ved kjent teknikk. Et hvilket som helst enzym som er i stand til å oksydere hydroksylgruppen på 2-karbonatomet i glukose med dertil forbundet fremstilling av hydrogenperoksyd kan kobles til en hvilken som helst halogenerende peroksydase og blandingen anvendes for alken-halohydrinfremstilling ved å følge læren i henhold til det ovennevnte. In this example, the production of hydrogen peroxide is linked to the production of propylene bromohydrin, an intermediate product in the propylene oxide synthesis, which does not need further treatment here. The reaction of glucose with immobilized carbohydrate oxidase of Polyporus obtusus ATCC No. 26733 to give D-glucosone and hydrogen peroxide is coupled to the reaction of immobilized seaweed peroxidase from Coralina sp. in the presence of bromide and propylene to give propylene bromohydrin. The end result of this coupled reaction is the production of glucosone for subsequent fructose production and the by-product propylene bromohydrin, which can easily be converted to propylene oxide by known techniques. Any enzyme capable of oxidizing the hydroxyl group on the 2-carbon atom of glucose with the associated production of hydrogen peroxide can be coupled to any halogenating peroxidase and the mixture used for alkene-halohydrin preparation following the teachings as set forth above .

Cellefritt, renset tangperoksydaseenzym fremstilles på følgende måte: Coralina sp. oppnådd fra kysten av La Jolla, California, males i en homogenisator ("Virtis 45") i fem minutter i destillert vann. Homogenisatet separeres ved 20.000 omdreininger pr. minutt i 20 minutter. Overliggende væske avhelles og opp-samles. Kaken oppslemmes på nytt i destillert vann og sentrifugeres på nytt. Overliggende væske og tidligere overliggende væske kombineres og oppløsningen bringes først til 33 % og deretter til 55 % metning i ammoniumsulfat. Sentrifugering og separering av kaken gjennomføres i hvert trinn. Kaken med 33 % til 55 % føres gjennom en DEAE-kolonne under anvendelse av en 0,3M til IM fosfatbuffer (pH 6,0) gradient. Fraksjonen som elueres ved IM dialyseres mot 20 mM fosfatbuffer (pH 6) over natten. Cell-free, purified seaweed peroxidase enzyme is prepared as follows: Coralina sp. obtained from the coast of La Jolla, California, is ground in a homogenizer ("Virtis 45") for five minutes in distilled water. The homogenate is separated at 20,000 revolutions per minute for 20 minutes. The overlying liquid is poured off and collected. The cake is resuspended in distilled water and centrifuged again. Overhead liquid and previous overhead liquid are combined and the solution is first brought to 33% and then to 55% saturation in ammonium sulfate. Centrifugation and separation of the cake is carried out in each step. The 33% to 55% cake is passed through a DEAE column using a 0.3M to 1M phosphate buffer (pH 6.0) gradient. The fraction eluted by IM is dialysed against 20 mM phosphate buffer (pH 6) overnight.

Den immobiliserte tangperoksydase fremstilles som følger: Glasskuler (oppnådd fra Sigma Chemical Company, PG-700-200) aktiveres ved å suspendere 1 g glasskuler i 18 ml av deioni-sert vann. 2 ml 10 % (volum/volum) 0( -amino-propyltrietoksy-silan tilsettes og pH i blandingen innstilles til 3-5 med 6N HC1. Blandingen rystes ved 75°C i to timer. Glasskulene The immobilized seaweed peroxidase is prepared as follows: Glass beads (obtained from Sigma Chemical Company, PG-700-200) are activated by suspending 1 g of glass beads in 18 ml of deionized water. 2 ml of 10% (vol/vol) 0(-amino-propyltriethoxy-silane is added and the pH of the mixture is adjusted to 3-5 with 6N HCl. The mixture is shaken at 75°C for two hours. The glass beads

blir så vakuumtørket over natten med 80°C. 3,2 ml renset Coraline sp. enzym, fremstilt som ovenfor, og 50 mg vann-oppløselig karbodiimid tilsettes til glasskulene. pH innstilles til 4,5 og blandingen rystes så ved 4°C over natten. is then vacuum dried overnight at 80°C. 3.2 ml purified Coraline sp. enzyme, prepared as above, and 50 mg of water-soluble carbodiimide are added to the glass beads. The pH is adjusted to 4.5 and the mixture is then shaken at 4°C overnight.

Produktet (enzymbelagte kuler) vaskes med vann. Aktiviteten måles som 2-monoklordimedonenheter/g kuler. Immobilisert karbohydratoksydase på agarose fremstilles som i eksempel I fra 10 ml cellefritt, renset enzym. The product (enzyme-coated beads) is washed with water. The activity is measured as 2-monochlorodimedone units/g beads. Immobilized carbohydrate oxidase on agarose is prepared as in example I from 10 ml of cell-free, purified enzyme.

En reaksjonsblanding inneholdende følgende bestanddeler fremstilles i en 100 ml Pyrexkolbe: A reaction mixture containing the following components is prepared in a 100 ml Pyrex flask:

a) lg tangperoksydasebelagte glasskuler, a) lg seaweed peroxidase-coated glass beads,

b) den immobiliserte karbohydratoksydase som er fremstilt ovenfor, b) the immobilized carbohydrate oxidase prepared above;

c) 800 mg kaliumbromid, og c) 800 mg potassium bromide, and

d) 20 ml 0.01M kaliumfosfatbuffer, pH 7,0. d) 20 ml of 0.01M potassium phosphate buffer, pH 7.0.

Både propylen og oksygen bobles kontinuerlig inn i kolbene. Both propylene and oxygen are continuously bubbled into the flasks.

Reaksjonen igangsettes med 1 gm glukose. Etter 20 timer tas det prøve fra reaksjonen som analyseres for resterende glukose, D-glukoson, og propylenbromhydrin. Det fremstilte propylenbromhydrin analyseres på følgende måte: 5 ^,ul av reaks jonsblandingen injiseres i en gasskromatograf ("Hewlett-Packard modell 402") utstyrt med en glasskolonne ca. 1,5 meter x 3 mm, fylt med "Porapak" ^jT) (80/100 mesh). Strømningshastigheten innstilles til 30 ml/minutt for helium og kolonnetemperaturen innstilles ved 200°C. Retensjons-tiden for propylenbromhydrinene er ni minutter for l-brom-2-propanol og ti minutter for 2-brom-l-propanol. The reaction is initiated with 1 gm of glucose. After 20 hours, a sample is taken from the reaction and analyzed for residual glucose, D-glucosone and propylene bromohydrin. The produced propylene bromohydrin is analyzed in the following way: 5 µl of the reaction mixture is injected into a gas chromatograph ("Hewlett-Packard model 402") equipped with a glass column approx. 1.5 meters x 3 mm, filled with "Porapak" ^jT) (80/100 mesh). The flow rate is set at 30 ml/minute for helium and the column temperature is set at 200°C. The retention time for the propylene bromohydrins is nine minutes for l-bromo-2-propanol and ten minutes for 2-bromo-1-propanol.

Produktidentitet bekreftes ved sammenligning med autentiske prøver av propylenbromhydrin: l-brom-2-propanol erholdt fra Pfaltz & Bauer, Inc., 2-brom-l-propanol fra syntese ved litiumaluminiumhydridreduksjon av 1-brompropionylklorid. Reaksjonsproduktene og de autentiske prøver viser de samme retensjonstider og identiske massespektra. Brom identifiseres ved nærvær av M og M+2 isotopsamlinger med lik intensitet. Det molekylære ion for begge isomerer bekreftes ved kjemisk ionisering med isobutanreagensgass (M<+>, m/e 138+140). For l-brom-2-propanol er den vesentlige fragmentering det forventede tap av C^Br, mens for 2-brom-l-propanol er den vesentlige fragmentering det forventede tap av CH^CHBr. Analyse av prøven viste mer enn 99 % omdannelse av glukose til D-glukoson og propylenbromhydrinfremstilling med 20 gm/1. Product identity is confirmed by comparison with authentic samples of propylene bromohydrin: 1-bromo-2-propanol obtained from Pfaltz & Bauer, Inc., 2-bromo-1-propanol from synthesis by lithium aluminum hydride reduction of 1-bromopropionyl chloride. The reaction products and the authentic samples show the same retention times and identical mass spectra. Bromine is identified by the presence of M and M+2 isotope collections of equal intensity. The molecular ion for both isomers is confirmed by chemical ionization with isobutane reagent gas (M<+>, m/e 138+140). For 1-bromo-2-propanol the essential fragmentation is the expected loss of C^Br, while for 2-bromo-1-propanol the essential fragmentation is the expected loss of CH^CHBr. Analysis of the sample showed greater than 99% conversion of glucose to D-glucosone and propylene bromohydrin production at 20 gm/1.

EKSEMPEL IV ( kombinasjonsprosess). EXAMPLE IV (combination process).

Dette eksempel tjener til ytterligere illustrering av de for-hold som er angitt og vist i eksempel III. I dette tilfelle erstattes immobilisert karbohydratoksydase med immobilisert glukose-2-oksydase. Det immobiliserte tangperoksydaseenzym fremstilles som i eksempel III. Den immobiliserte glukose-2-oksydase fremstilles som i eksempel II. This example serves to further illustrate the conditions stated and shown in example III. In this case, immobilized carbohydrate oxidase is replaced by immobilized glucose-2-oxidase. The immobilized seaweed peroxidase enzyme is prepared as in example III. The immobilized glucose-2-oxidase is prepared as in example II.

Reaksjonsblandingen tildannes som i eksempel III, idet immobilisert karbohydratoksydase erstattes med immobilisert glukose-2-oksydase. The reaction mixture is prepared as in example III, whereby immobilized carbohydrate oxidase is replaced by immobilized glucose-2-oxidase.

Etter 20 timer tas prøver fra reaksjonen og analyseres for resterende glukose, D-glukoson og propylenbromhydrin. Resul-tatene viste mer enn 99 % omdannelse av glukose til D-glukoson og propylenbromhydrinfremstilling med 19,5 gm/1). After 20 hours, samples are taken from the reaction and analyzed for residual glucose, D-glucosone and propylene bromohydrin. The results showed more than 99% conversion of glucose to D-glucosone and propylene bromohydrin production with 19.5 gm/1).

EKSEMPEL V ( spalting av hydrogenperoksydet). EXAMPLE V (cleavage of the hydrogen peroxide).

Dette eksempel illustrerer høy omdannelse av glukose til D-glukoson i løpet av et forlenget tidsrom under anvendelse av immobilisert karbohydratoksydase i en kolonnereaktor. Karbohydratoksydase (cellefritt, renset enzym) (10 ml) frem- This example illustrates high conversion of glucose to D-glucosone over an extended period of time using immobilized carbohydrate oxidase in a column reactor. Carbohydrate oxidase (cell-free, purified enzyme) (10 ml) pre-

stilt som i eksempel I, immobiliseres på hydroksyapatitt (kalsiumfosfathydroksyd) som følger: Til 100 ml cellefritt, renset enzym, tilsettes 20 g hydroksyapatitt i 100 ml 1 mM kalsiumfosfatbuffer med pH 7,0. Blandingen omrøres i 30 minutter og deretter separeres faststoffene fra væsken ved dekantering, og faststoffene vaskes først med 200 ml 10 mM kalsiumfosfatbuffer ved pH 7,0, og deretter med 200 ml destillert vann. set as in example I, is immobilized on hydroxyapatite (calcium phosphate hydroxide) as follows: To 100 ml of cell-free, purified enzyme, 20 g of hydroxyapatite in 100 ml of 1 mM calcium phosphate buffer with pH 7.0 is added. The mixture is stirred for 30 minutes and then the solids are separated from the liquid by decantation, and the solids are washed first with 200 ml of 10 mM calcium phosphate buffer at pH 7.0, and then with 200 ml of distilled water.

Dette material fylles i en glasskolonne (0,5 cm x 4,5 cm). This material is filled into a glass column (0.5 cm x 4.5 cm).

1 % glukoseløsning føres gjennom kolonnen med en strømnings-takt på 1,5 ml pr. time. Elueringsmiddelet analyseres periodevis for resterende glukose og fremstilt D-glukoson. 1% glucose solution is passed through the column at a flow rate of 1.5 ml per hour. The eluent is periodically analyzed for residual glucose and produced D-glucosone.

Elueringsmiddelet, kontinuerlig fremstilt i løpet av fem døgns kjøring, viste at mer enn 95 % av glukosen var omdannet til D-glukoson. Noe hydrogenperoksyd ble ikke påvist. Undersøk-elsen ble avsluttet før halv-levetiden for enzymet var bestemt. Ved den sakte strømningstakt ved dette forsøk bidro både oksygentilgjengelighet og fravær av akkumulert hydrogenperoksyd til den vesentlig fullstendige omdannelse av glukose til D-glukoson. I dette tilfelle bevirket den bærende grunn-masse, hydroksyapatitt, hydrogenperoksydspaltingen. The eluent, continuously prepared during a five-day run, showed that more than 95% of the glucose had been converted to D-glucosone. No hydrogen peroxide was detected. The study was terminated before the half-life of the enzyme was determined. At the slow flow rate of this experiment, both the availability of oxygen and the absence of accumulated hydrogen peroxide contributed to the substantially complete conversion of glucose to D-glucosone. In this case, the supporting matrix, hydroxyapatite, caused the hydrogen peroxide cleavage.

Claims

1. Process for the production of D-glucose where an aqueous solution of D-glucose is formed and at least approximately 95% of the D-glucose in the solution is converted to D-glucose in solution by enzymatic oxidation with an oxidoreductase enzyme in the presence of oxygen, characterized in that simultaneously produced hydrogen peroxide is removed by enzymatic cleavage with catalase, or simultaneously produced hydrogen peroxide is used in a simultaneous, continuous process.

2. Method as stated in claim 1, characterized in that an enzyme with glucose-2-oxidase activity is used as the oxidoreductase enzyme.

3. Method as stated in claim 1 or 2, characterized in that glucose-2-oxidase from Aspergillus oryzae or pyranoze from Polyporus obtusus is used as the oxidoreductase enzyme.