NO147883B

NO147883B - PROCEDURE FOR ENCAPLING LABILE BIOLOGICAL MATERIALS

Info

Publication number: NO147883B
Application number: NO763375A
Authority: NO
Inventors: Franklin Lim; Richard D Moss
Original assignee: Damon Corp
Priority date: 1976-10-01
Filing date: 1976-10-01
Publication date: 1983-03-21
Also published as: NO147883C; NO763375L

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for innkapsling av et kjernemateriale i form av labilt biologisk materiale. Med dette menes slike substanser som enzymer og hemoglobin, og de innkapsles i en semipermeabel membran som vil hol- The present invention relates to a method for encapsulating a core material in the form of labile biological material. By this is meant such substances as enzymes and hemoglobin, and they are encapsulated in a semi-permeable membrane that will hold

de på det innkapslede materiale, men fritt vil tillate små molekyler å passere gjennom membranen for å omsette seg med det innkapslede materiale og la reaksjonsproduktene komme ut igjen. those on the encapsulated material, but free will allow small molecules to pass through the membrane to react with the encapsulated material and allow the reaction products to re-emerge.

Den semipermeable membran dannes ved en grenseflatepolymerisasjon. The semipermeable membrane is formed by interfacial polymerization.

Mikroinnkapslingsteknologien har vokst hurtig i de sene-re år og har fått mange anvendelser. Det er blitt forsøkt, med vekslende hell, å innkapsle biologisk virksomme substanser som hemoglobin, karboksylsyreanhydrase, urease, asparaginase, laktat-dehydrogenase (LDH), glutamat-oksaloacetat-transaminase (GOT), kjemisk virksomme materialer slik som ionevekslerharpikser og ak-tivert trekull og forskjellige andre enzymer og kjemisk virksom- Microencapsulation technology has grown rapidly in recent years and has gained many applications. Attempts have been made, with varying success, to encapsulate biologically active substances such as hemoglobin, carboxylic anhydrase, urease, asparaginase, lactate dehydrogenase (LDH), glutamate oxaloacetate transaminase (GOT), chemically active materials such as ion exchange resins and activated charcoal and various other enzymes and chemical act-

me substanser. Slike kapsler har allerede vist seg å ha stor anvendelse f.eks. i kunstige nyrer og faste enzymsystemer og ser lovende ut på en rekke andre områder. US-patent nr. 3 522 34 5 vedrører f.eks. ikke-trombogene mikrokapsler som kan anvendes når de fremstilles rundt enzymer eller avgiftningsmidler og plasseres i en ekstrakorporal anastomose, for å innføre oksygen, legemid-ler, enzymatiske stoffer og lignende i blodstrømmen med reguler-bare hastigheter. me substances. Such capsules have already proven to be of great use, e.g. in artificial kidneys and fixed enzyme systems and shows promise in a number of other areas. US patent no. 3 522 34 5 concerns e.g. non-thrombogenic microcapsules which can be used when produced around enzymes or detoxification agents and placed in an extracorporeal anastomosis, to introduce oxygen, drugs, enzymatic substances and the like into the blood stream at adjustable rates.

I "Artificial Cells" av Thomas M.S. Chang (Charles C. In "Artificial Cells" by Thomas M.S. Chang (Charles C.

Thomas, Springfield, 111, 1972) fremlegges en fremgangsmåte for innkapsling av biologisk virksomme materialer i en semipermeabel membran. Teknikken omfatter oppløsning av materialet som skal innkapsles og en monomer i vann, og fremstilling av en emulsjon med vann som den diskontinuerlige fasen. Når en annen monomer som er i stand til å polymerisere med den første, oppløses i den kontinuerlige fasen i emulsjonen, finner det sted en polymerisasjon i grenseflaten mellom de to faser, og det dannes en membran rundt dråpene av løsningen som normalt er av kolloidal størrelse. Thomas, Springfield, 111, 1972) a method for encapsulating biologically active materials in a semipermeable membrane is presented. The technique involves dissolving the material to be encapsulated and a monomer in water, and producing an emulsion with water as the discontinuous phase. When another monomer capable of polymerizing with the first is dissolved in the continuous phase of the emulsion, polymerization takes place at the interface between the two phases, and a membrane forms around the droplets of the solution, which are normally of colloidal size .

Denne fremgangsmåten har ulemper og begrensninger som inn-skrenker dens potensielt vide anvendelse og kommersielle suksess. Siden mange biologisk virksomme substanser, f.eks. enzymer, er ytterst labile, resulterer de relativt hårde reaksjonsbetingelse? som er nødvendig for polymerisasjon, ofte i et meget lavt utbytte av anvendbart, innkapslet materiale. Innkapslingen av selv relativt hårdføre enzymer, slik som urease, er karakterisert ved utbytter som i beste fall ligger mellom 35 og 40%. Under ett eller flere trinn ved fremgangsmåten denatureres meget av det innkapslede materiale. This method has disadvantages and limitations that limit its potentially wide application and commercial success. Since many biologically active substances, e.g. enzymes, are extremely labile, do they result in relatively harsh reaction conditions? which is necessary for polymerization, often in a very low yield of usable encapsulated material. The encapsulation of even relatively hardy enzymes, such as urease, is characterized by yields that are at best between 35 and 40%. During one or more steps in the method, much of the encapsulated material is denatured.

US-patent nr. 3.522.34 6 vedrører mikrokapsler av regulert permeabilitet. Fremgangsmåten omfatter innkapsling av vandige blandinger i membraner av regulerbar størrelse, tykkelse og permeabilitet. Dråper av en vandig blanding dispergeres i et organisk, flytende medium som ikke er blandbart med dem og en komponent som er løselig i den organiske væsken og som er istand til å omsette seg med en komponent i den hydrofile blandingen, tilsettes til dispersjonen og derved får man dannet en makromolekylær membran ved fasegrense-koascervasjon, polymerisasjon eller kondensasjon på overflaten av dråpene. En polymer, et kondensasjonsprodukt eller en komponent derav tilsettes vanligvis til den organiske væsken og membranen dannes rundt dråpene ved omsetning av polymeren, Kondensasjonsproduktet eller komponenten med en komponent i de dispergerte dråper, som kan være en fellings-, en kondensasjons-eller polymerisasjonskatalysator, eller en forbindelse av det eventuelle kondensasjonsprodukt. Den effektive porestørrelse av len innkapslende membran er en funksjon ikke bare av membran-sammensetningen, men også av tykkelsen av membranen og velges etter den påtenkte anvendelse av kapslene. Ved egnet valg av drifts-oetingelser kan porestørrelsen varieres, men reaksjonsbetingelsen som var nødvendig for å sikre tilstrekkelig sterke, dog selektivt ,yermeable membraner, er i ethvert tilfelle vanskelig å regulere og l noen tilfeller ukjent. Fremgangsmåten gir også kapsler som vanligvis har membraner med tilfeldig jevnhet og porøsitet; og mange er ubrukbare for det tilsiktede formål. US patent no. 3,522,34 6 relates to microcapsules of regulated permeability. The method includes encapsulation of aqueous mixtures in membranes of adjustable size, thickness and permeability. Droplets of an aqueous mixture are dispersed in an organic, liquid medium which is not miscible with them and a component which is soluble in the organic liquid and which is capable of reacting with a component of the hydrophilic mixture is added to the dispersion, thereby obtaining a macromolecular membrane was formed by phase boundary coacervation, polymerization or condensation on the surface of the droplets. A polymer, a condensation product or a component thereof is usually added to the organic liquid and the membrane is formed around the droplets by reaction of the polymer, the condensation product or the component with a component in the dispersed droplets, which may be a precipitation, a condensation or polymerization catalyst, or a compound of the eventual condensation product. The effective pore size of the lean encapsulating membrane is a function not only of the membrane composition, but also of the thickness of the membrane and is chosen according to the intended use of the capsules. By suitable choice of operating conditions, the pore size can be varied, but the reaction condition which was necessary to ensure sufficiently strong, albeit selectively permeable membranes, is in any case difficult to regulate and in some cases unknown. The process also provides capsules that typically have membranes of random uniformity and porosity; and many are unusable for their intended purpose.

Det er derfor et mål ved foreliggende oppfinnelse å skaffe tilveie en fremgangsmåte hvorved labilt, biologisk materiale, f. eks. forskjellige enzymer og mange kjemisk virksomme substanser, It is therefore an aim of the present invention to provide a method whereby labile, biological material, e.g. various enzymes and many chemically active substances,

kan innkapsles i sin aktive tilstand, og å gi et høyere utbytte av anvendbar substans når den innkapsles på denne måten. can be encapsulated in its active state, and to give a higher yield of usable substance when encapsulated in this way.

Ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen tilveiebrin-ges meget sterke semipermeable membraner rundt et hvilket som helst stort antall av labile biologiske materialer. In the method according to the invention, very strong semipermeable membranes are provided around any large number of labile biological materials.

Ved hjelp av fremgangsmåten kan det fremstilles enzymholdi-ge mikrokapsler, hvor mikrokapselmembranen har en mer jevn semiper-meabilitet, slik at man får kapsler med jevne vegger uten porede-fekter og med en slik porestørrelse at det innkapslede materiale ikke kan unnslippe fra innsiden av kapselen, men lett kan omsette seg med substanser i omgivelser hvor kapslene plasseres. With the help of the method, enzyme-containing microcapsules can be produced, where the microcapsule membrane has a more uniform semi-permeability, so that you get capsules with smooth walls without pore defects and with such a pore size that the encapsulated material cannot escape from the inside of the capsule , but can easily interact with substances in the environment where the capsules are placed.

Videre kan man ved hjelp av fremgangsmåten innkapsle en rekke forskjellige, kjemisk virksomme substanser i en semipermeabel membran av høy kvalitet ved å anvende en rekke forskjellige polymersystemer og forskjellige grenseflatepolymerisasjonsteknik-ker. Fremgangsmåten har noen variable parametre, hvilke kan velges for å bli tilpasset en spesiell substans som skal innkapsles, variere egenskapene til kapselmembranen og gjøre utbyttet av anvendbart, innkapslet materiale størst mulig. Furthermore, with the help of the method, a number of different, chemically active substances can be encapsulated in a high-quality semipermeable membrane by using a number of different polymer systems and different interfacial polymerization techniques. The method has some variable parameters, which can be selected to be adapted to a particular substance to be encapsulated, vary the properties of the capsule membrane and maximize the yield of usable, encapsulated material.

Videre kan man ved fremgangsmåten innkapsle en høy konsentrasjon av hemoglobin i en kapsel som er permeabel overfor oksygen, karbondioksyd og andre små molekyler. Furthermore, with the method, a high concentration of hemoglobin can be encapsulated in a capsule which is permeable to oxygen, carbon dioxide and other small molecules.

Det er også mulig, ved hjelp av fremgangsmåten, å regulere kapselmembranens porestørrelse i vesentlig grad, idet metoden har bred anvendelse på en rekke forskjellige innkapslingsteknikker. It is also possible, with the help of the method, to regulate the pore size of the capsule membrane to a significant extent, as the method has wide application to a number of different encapsulation techniques.

Ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen fåes sterke By the method according to the invention, strong

semipermeable mikrokapsler med membraner som har porestørrelse som ligger innenfor et hvilket som helst av en rekke størrelsesområder, og således er selektivt permeable overfor molekyler som har dimen-sjoner som er mindre enn den øvre grense av det valgte område. semipermeable microcapsules with membranes having pore sizes that lie within any of a number of size ranges, and thus are selectively permeable to molecules having dimensions smaller than the upper limit of the selected range.

Grenseflatepolymerisasjonen for dannelse av den semipermeable membran omfatter følgende trinn: The interfacial polymerization to form the semipermeable membrane includes the following steps:

A) oppløsning av en diaminmonomer og nevnte kjernemateriale A) dissolution of a diamine monomer and said core material

i en vannfase; in an aqueous phase;

B) dannelse av en emulsjon i hvilken vannfasen fra trinn A B) formation of an emulsion in which the water phase from step A

er den diskontinuerlige fase, idet diaminet er svakt løselig i den kontinuerlige fase i emulsjonen og den kontinuerlige fase omfatter et hydrofobt løsningsmiddel; is the discontinuous phase, the diamine being slightly soluble in the continuous phase in the emulsion and the continuous phase comprising a hydrophobic solvent;

C) dannelse av en sterkt permeabel kapselmembran rundt C) formation of a highly permeable capsular membrane around

delene av den diskontinuerlige fase ved omsetning av diaminet med et disyrehalogenid som inneholdes i nevnte kontinuerlige fase, idet disyrehalogenidet er i stand til å danne en polymer ned nevnte diaminmonomer ved en polykondensasjonsreaksjon, og nevnte disyrehalogenid er sterkt løselig i nevnte hydrofobe løsningsmiddel; D) stansing av polymerisasjonsreaksjonen ved separering av det hydrofobe løsningsmiddel fra emulsjonen. the parts of the discontinuous phase by reacting the diamine with a diacid halide contained in said continuous phase, the diacid halide being able to form a polymer down said diamine monomer by a polycondensation reaction, and said diacid halide being highly soluble in said hydrophobic solvent; D) stopping the polymerization reaction by separating the hydrophobic solvent from the emulsion.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er karakterisert ved at de kapsler som er produsert i ovennevnte trinn C), utsettes for følgende trinn: E) resuspendering av kapslene i en annen hydrofob væske, idet diaminmonomeren er praktisk talt uløselig i denne; F) omsetning av en ytterligere mengde av nevnte disyrehalogenid oppløst i nevnte annen hydrofobe væske med nevnte diaminmonomer for å bevirke ytterligere polymerisering på de nevnte kapselmembraner, slik at disse styrkes, og å gjøre dem ugjennomtrengelige for kjernematerialet; og The method according to the invention is characterized in that the capsules produced in the above-mentioned step C) are subjected to the following steps: E) resuspension of the capsules in another hydrophobic liquid, the diamine monomer being practically insoluble in this; F) reacting a further amount of said diacid halide dissolved in said other hydrophobic liquid with said diamine monomer to effect further polymerization on said capsule membranes, so as to strengthen them, and to make them impermeable to the core material; and

G) stansing av polymerisasjonen. G) stopping the polymerization.

Mer i detalj utføres fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen slik: Først fremstilles en hydrofil løsning, fortrinnsvis med vann, ved å oppløse materialet som skal innkapsles, i vann sammen med diaminmonomeren. Siden mange monomerløsninger har en pH-verdi som ville denaturere mange labile biologiske substanser, må mo-nomerløsningen ofte pufres til et pH-område mellom 5 og 9 før det labile biologiske materiale tilsettes. In more detail, the method according to the invention is carried out as follows: First, a hydrophilic solution is prepared, preferably with water, by dissolving the material to be encapsulated in water together with the diamine monomer. Since many monomer solutions have a pH value that would denature many labile biological substances, the monomer solution must often be buffered to a pH range between 5 and 9 before the labile biological material is added.

FYi hydrofob, organisk væske som har de følgende egenskaper, fremstilles deretter. Først bør løseligheten av den annen monomer som skal anvendes ved polymerisasjonen, nemlig et disyrehalogenid, være meget høy i den hydrofobe, organiske væsken. For det annet bør den hydrofobe væske ha liten affinitet til den første mondmeren. For det tredje bør det hydrofobe løsningsmiddel være et slikt løsningsmiddel at det hydrofile løsningsmiddel, når det tilsettes, vil danne en god emulsjon. FYi hydrophobic, organic liquid having the following properties is then produced. First, the solubility of the other monomer to be used in the polymerization, namely a diacid halide, should be very high in the hydrophobic, organic liquid. Second, the hydrophobic liquid should have little affinity for the first monomer. Third, the hydrophobic solvent should be such a solvent that the hydrophilic solvent, when added, will form a good emulsion.

De to løsningsmidler kombineres deretter og emulgeres. Det hydrofile ]øsningsmiddel er den diskontinerlige fase* Emulgeringen foretas ved en hvilken som helst av en rekke velkjente teknikker, vanligvis ved hjelp av et emulgeringsmiddel. Stør-relsen av dråpene som fremstilles bestemmer størrelsen av mikrokapslene som dannes. The two solvents are then combined and emulsified. The hydrophilic emulsifying agent is the discontinuous phase* Emulsification is accomplished by any of a number of well-known techniques, usually by means of an emulsifying agent. The size of the droplets that are produced determines the size of the microcapsules that are formed.

Når det ønskede dråpestørrelsesområdet er blitt opp-nådd, tilsettes den annen monomer til emulsjonen, og polymerisasjon eller kondensasjon finner sted ved grenseflaten av tofasesystemet. Siden den første monomer, som er oppløst primært i den diskontinuerlige fase, er lite løselig i den kontinuerlige, hydrofobe, organiske fase, finner det sted litt diffusjon inn i den kontinuerlige fase. Mikrokapselmembranen dannes tvers over grenseflatesonen idet polymerisasjonen for-løper. Membranen som dannes, begrenser ytterligere diffusjon av den første monomer inn i den kontinuerlige fase, og membran-egenskapene er meget avhengige av den detaljerte sekvens av random-sammenstøt mellom monomerene. When the desired droplet size range has been reached, the second monomer is added to the emulsion, and polymerization or condensation takes place at the interface of the two-phase system. Since the first monomer, which is dissolved primarily in the discontinuous phase, is poorly soluble in the continuous, hydrophobic, organic phase, some diffusion into the continuous phase takes place. The microcapsule membrane is formed across the interface zone as the polymerization proceeds. The membrane that forms limits further diffusion of the first monomer into the continuous phase, and the membrane properties are highly dependent on the detailed sequence of random collisions between the monomers.

De således fremstilte membraner er vanligvis makro-porøse, og vellykkede semipermeable membraner får man bare under spesielle betingelser som er vanskelige å regulere. Det antas at problemet skyldes tilstedeværelse av defekter i membranene som resulterer i makroporøse hull gjennom membranene etter at reaksjonen er stanset og kapslene vasket. Dette er tidligere overvunnet ved å fortsette polymerisasjonen eller konden-sasjonen lenge nok til å lukke disse store hull, og samtidig de små porene. Man antar derfor at man bare får akseptable kapsler over et snevert område for polymerdannelse, i hvilket hullene er lukket og de små porene ennå er åpne. The membranes produced in this way are usually macroporous, and successful semipermeable membranes are only obtained under special conditions that are difficult to regulate. It is believed that the problem is due to the presence of defects in the membranes that result in macroporous holes through the membranes after the reaction is stopped and the capsules are washed. This has previously been overcome by continuing the polymerization or condensation long enough to close these large holes, and at the same time the small pores. It is therefore assumed that acceptable capsules are only obtained over a narrow range of polymer formation, in which the holes are closed and the small pores are still open.

Det har imidlertid vist seg at dersom slike ubehandlede mikrokapsler adskilles fra den kontinuerlige fase, suspenderes igjen i en mengde av slik hydrofob væske hvor løseligheten av den første monomer er sterkt redusert, og deretter - utsatt igjen for den annen monomer - finner den samme polymerisasjons-omsetning sted ved meget lavere hastighet over en meget snevre-re grenseflatesone som bare ligger inne i mellomrommene av den ubehandlede kapselmembran. Dette resulterer i "lapping" av de makroporøse defekter i kapselveggen, reduksjon av porestørrel-sen og styrking av membranene. However, it has been shown that if such untreated microcapsules are separated from the continuous phase, suspended again in a quantity of such hydrophobic liquid where the solubility of the first monomer is greatly reduced, and then - exposed again to the second monomer - find the same polymerization turnover takes place at a much lower rate over a much narrower interfacial zone that lies only within the interstices of the untreated capsule membrane. This results in "patching" of the macroporous defects in the capsule wall, reduction of the pore size and strengthening of the membranes.

Det antas at denne annen polymerisasjonsreaksjon selektivt bygger bro tvers over de store porene hvor den første monomer diffunderer tett opptil den kontinuerlige fase, og at denne "lapping" finner sted hovedsakelig uten noen vesentlig økning i kapselens veggtykkelse. I motsetning til dette øker den kontinuerlige anvendelse av det første løsningsmiddel veggtykkelsen og reduserer permeabiliteten for de fleste membraner når man skal oppnå lukking av hullene. It is believed that this second polymerization reaction selectively bridges across the large pores where the first monomer diffuses close to the continuous phase, and that this "patching" takes place mainly without any significant increase in capsule wall thickness. In contrast, the continuous application of the first solvent increases the wall thickness and reduces the permeability of most membranes when achieving closure of the holes.

Ved utførelse av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen har det vist seg at denne sekundære polymerisasjonstek-nikk er anvendbar på en rekke kjente innkapslingsfremgangsmåter for å fremstille semipermeable kapsler og for å regulere pore-størrelsen av disse. When carrying out the method according to the invention, it has been shown that this secondary polymerization technique can be used in a number of known encapsulation methods to produce semipermeable capsules and to regulate the pore size of these.

Ifølge en utførelsesform av denne totrinnspolymerisa-sjon reguleres mengden av den annen monomer i den kontinuerlige fase som, ved konvensjonelle fremgangsmåter, hurtig ville denaturere labile biologiske materialer som skal innkapsles. Teknikken for å unngå en slik denaturering omfatter regulering av den relative konsentrasjon av de oppløste stoffer i den kontinuerlige og diskontinuerlige fase slik at konsentrasjonen av den annen monomer i den kontinuerlige fase holdes lavere enn optimale verdier, og de oppløste stoffer i den diskontinuerlige fase foreligger i høye konsentrasjoner. I denne situasjon hemmes diffusjonen av den annen monomer inn i den diskontinuerlige fase, og denatureringen av det labile biologiske materiale gjøres minst mulig, men man får en makroporøs, dårlig fremstilt og klart utilfredsstillende kapsel. I det annet polyme-risas jonstrinn kan imidlertid konsentrasjonen av den annen monomer i den kontinuerlige fase i resuspensjonen økes (siden det innkapslede materiale nå er beskyttet av den ubehandlede kapselmembran) for å styrke kapselmembranene og gjøre dem semipermeable . According to an embodiment of this two-stage polymerization, the amount of the second monomer in the continuous phase is regulated which, with conventional methods, would rapidly denature labile biological materials to be encapsulated. The technique to avoid such denaturation includes regulating the relative concentration of the solutes in the continuous and discontinuous phase so that the concentration of the other monomer in the continuous phase is kept lower than optimal values, and the solutes in the discontinuous phase are present in high concentrations. In this situation, the diffusion of the other monomer into the discontinuous phase is inhibited, and the denaturation of the labile biological material is minimized, but a macroporous, poorly produced and clearly unsatisfactory capsule is obtained. In the second polymerization step, however, the concentration of the second monomer in the continuous phase of the resuspension can be increased (since the encapsulated material is now protected by the untreated capsule membrane) to strengthen the capsule membranes and make them semipermeable.

Ifølge en utførelsesform av oppfinnelsen tilsettes According to one embodiment of the invention is added

den annen monomer til emulsjonen i første polymerisasjonstrinn, ikke alt på én gang for å initiere polymerisasjonen, men snare-re i porsjoner, i bestemte tidsintervaller under polymerisasjonen. Denne teknikk bibeholder konsentrasjonen av den annen monomer ved grenseflaten ved et mer konstant optimalt nivå hele tiden ved dannelsen av den første grove membran og hemmer således diffusjon av den annen monomer inn i den diskontinuerlige fase og øker utbyttet av brukbart, labilt, biologisk materiale. Denne teknikk er også ganske nyttig for systemet hvor hydrolyse av den valgte annen monomer er en konkurrerende reaksjon med polymerisasjonen. the other monomer to the emulsion in the first polymerization step, not all at once to initiate the polymerization, but rather in portions, at specific time intervals during the polymerization. This technique maintains the concentration of the second monomer at the interface at a more constant optimal level throughout the formation of the first rough membrane and thus inhibits diffusion of the second monomer into the discontinuous phase and increases the yield of usable, labile, biological material. This technique is also quite useful for the system where hydrolysis of the selected other monomer is a competing reaction with the polymerization.

Som nevnt er den første monomer et diamin og den annen monomer et disyrehalogenid; det initielle hydrofobe løsningsmiddel er en løsning som inneholder 80 % cykloheksan og 20 % kloroform; og ved resuspensjonen er den hydrofobe væske rent cykloheksan. Diaminet er hovedsakelig uløselig i cykloheksan og lite løselig i kloroform. As mentioned, the first monomer is a diamine and the second monomer is a diacid halide; the initial hydrophobic solvent is a solution containing 80% cyclohexane and 20% chloroform; and in the resuspension the hydrophobic liquid is pure cyclohexane. The diamine is mainly insoluble in cyclohexane and slightly soluble in chloroform.

Når man innkapsler hemoglobin har det vist seg at det, hvis de røde blodceller dehydratiseres når de utsettes for hypertonisk saltvannsløsning, kan fremstilles en hemoglobinløs-ning med konsentrasjoner opptil 30 g/dl, og denne høye saltkonsentrasjon hemmer diffusjon av vannmolekyler inn i den kontinuerlige fase hvor de omsettes med molekyler av den annen monomer og gjør dem ubrukbare. When encapsulating hemoglobin, it has been shown that if the red blood cells are dehydrated when exposed to hypertonic saline, a hemoglobin solution with concentrations up to 30 g/dl can be produced, and this high salt concentration inhibits the diffusion of water molecules into the continuous phase where they react with molecules of the other monomer and render them unusable.

Siden det er velkjent at mange labile, biologiske materialer hurtig denaturerer i sterkt sure eller basiske omgivelser, bør, ved alle trinn i den nye innkapslingsfremgangsmåte, pH-verdien i den umiddelbare nærhet av materialet som skal innkapsles, minst holdes i området 5 til 9. Dette oppnås ved å boble C02 gjennom diaminløsningen før den settes til det labile, biologiske materiale. Diaminløsningen, som vanligvis har en pH-verdi av størrelsesorden 11,5, overføres til diaminkar-bonat vanligvis ved en pH-verdi på ca. 8,6-8,7. Dersom den er mettet med C02 og lagret under 100 % C02~gass, kan løsningen bringes til en pH-verdi på ca. 8,4. Since it is well known that many labile, biological materials rapidly denature in strongly acidic or basic environments, at all stages of the new encapsulation process, the pH value in the immediate vicinity of the material to be encapsulated should at least be kept in the range of 5 to 9. This is achieved by bubbling CO2 through the diamine solution before it is added to the labile biological material. The diamine solution, which usually has a pH value of the order of 11.5, is transferred to diamine carbonate usually at a pH value of about 8.6-8.7. If it is saturated with C02 and stored under 100% C02 gas, the solution can be brought to a pH value of approx. 8.4.

I motsetning til dette er det tidligere kjent å anvende det svake NaHCO^ - Na^jCO^-puffersystem, dvs. salter av en sterk base og en svak syre hvor foreliggende oppfinnelse har anvendt den svake syren selv. Den resulterende pH-verdi for den tidligere kjente pufrede diamin-hemolysatløsning var således lik pH 11. In contrast to this, it is previously known to use the weak NaHCO^ - Na^jCO^ buffer system, i.e. salts of a strong base and a weak acid where the present invention has used the weak acid itself. The resulting pH value for the previously known buffered diamine hemolysate solution was thus equal to pH 11.

En prinsipiell fordel ved den beskrevne teknikk for immobi-lisering av biologisk og/eller kjemisk virksomme materialer for fremstilling av faste eller pseudo-faste reaktorer, er at materialene innkapsles i hovedmassen uten direkte konkurranse med forurensnin-ger for tilgjengelige bindingssteder. Det kan således fremstilles meget aktive kapsler fra relativt dårlig rensede materialer. I tillegg er de aktive materialer beskyttet mot angrep fra mikroor-ganismer som ofte er ansvarlige for inaktivering eller hemning av slike reaktorkomponenter. A principle advantage of the described technique for immobilizing biologically and/or chemically active materials for the production of solid or pseudo-solid reactors is that the materials are encapsulated in the main mass without direct competition with pollutants for available binding sites. Thus, highly active capsules can be produced from relatively poorly cleaned materials. In addition, the active materials are protected against attack by micro-organisms which are often responsible for the inactivation or inhibition of such reactor components.

Ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen anvendes In the method according to the invention is used

den kjente fremgangsmåte for mikroinnkapsling, nemlig grenseflate-polymerisas jon . Det velges to innbyrdes ikke-blandbare løsnings-midler, det ene er hydrofobt, det annet er hydrofilt, fortrinns- the known method for microencapsulation, namely interfacial polymerization. Two mutually immiscible solvents are chosen, one is hydrophobic, the other is hydrophilic, preferably

vis vann. Materialet som skal innkapsles og en første monomer opp-løses i vann, de to løsningsmidler blandes og blandingen emulge- show water. The material to be encapsulated and a first monomer are dissolved in water, the two solvents are mixed and the mixture emulsified

res deretter, idet det hydrofobe løsningsmiddel er den kontinuerlige fase. Størrelsen av de kolloidale dråper bestemmer størrel-sen av mikrokapslene som skal fremstilles. Emulgeringen kan oppnås ved en av de kjente emulgeringsteknikker, slik som f.eks. anvendelse av et blandeapparat, og utføres vanligvis ved tilsetning av et emulgeringsmiddel. Siden størrelsen av de fremstilte dråper ved en gitt teknikk vil variere innenfor et gitt område, kan det anvendes et filter for å adskille for store kapsler som er fremstilt fra en viss sats for å minske forskjellen i kapseldiameter. For mer detaljerte opplysninger vedrørende metoden for variasjon av kapselstørrelse kan henvises til Thomas M.S. Chang, res then, the hydrophobic solvent being the continuous phase. The size of the colloidal droplets determines the size of the microcapsules to be produced. The emulsification can be achieved by one of the known emulsification techniques, such as e.g. using a mixing device, and is usually carried out by adding an emulsifier. Since the size of the droplets produced by a given technique will vary within a given range, a filter can be used to separate too large capsules produced from a certain batch to reduce the difference in capsule diameter. For more detailed information regarding the method for variation of capsule size, reference can be made to Thomas M.S. Chang,

"Artifical Cells"> kapittel 2. "Artificial Cells"> Chapter 2.

Når det er fremstilt dråper av tilstrekkelig størrelse, tilsettes en annen monomer som kan danne en polymer sammen med den første monomeren ved polykohdensasjon i suspensjonen. <p>olymerisasjonen finner bare sted ved grenseflaten i tofasesystemet. When droplets of sufficient size have been produced, another monomer is added which can form a polymer together with the first monomer by polycohesion in the suspension. <p>The polymerization only takes place at the interface in the two-phase system.

For å gjøre utbyttet av brukbart biologisk materiale som To make the yield of usable biological material which

er innelukket i kapselen størst mulig, må reaksjonsbetingelsene reguleres omhyggelig slik at det normalt følsomme materiale ikke vil denaturere i noen vesentlig grad under polymerisasjonen. Det har således vist seg at en meget kritisk faktor når det gjelder å oppnå et høyt utbytte av brukbart innkapslet materiale er pH i den diskontinuerlige fasen. For å sikre seg mot denaturering av labilt materiale, må pH reguleres hele tiden under fremstillingen, vanligvis innenfor området på 5 og 9. Løsningsmidlene må velges, særlig det hydrofile som oppløser det innkapslede materiale, fra de som ikke hurtig denaturerer materialet som skal innkapsles. Valget vil være mulig for fagmannen. For å lette egnet dispersjon og adskillelse bør de to løsningsmidler ha spesifikk vekt som er noe forskjellig fra hverandre. is enclosed in the capsule as large as possible, the reaction conditions must be carefully regulated so that the normally sensitive material will not denature to any significant extent during the polymerisation. It has thus been shown that a very critical factor when it comes to achieving a high yield of usable encapsulated material is the pH in the discontinuous phase. To ensure against denaturation of labile material, the pH must be constantly regulated during manufacture, usually within the range of 5 and 9. The solvents must be chosen, especially the hydrophilic one that dissolves the encapsulated material, from those that do not rapidly denature the material to be encapsulated. The choice will be possible for the person skilled in the art. To facilitate proper dispersion and separation, the two solvents should have specific gravities that are somewhat different from each other.

Polymerisasjoner som finner sted i en pH-omgivelse som er uvennlig overfor den spesielle kjemisk virksomme substans som man søker å innkapsle bør ikke anvendes for denne substansen. Mange monomerer som i løsning har en naturlig pH som er istand til å denaturere de fleste labile biologiske materialer, kan imidlertid bufres til det ovenfor angitte pH-område uten å påvirke deres virkning. Andre monomerer kan anvendes uten pufring, avhengig av deres naturlige pH og egenskapen til materialet som man søker å innkapsle. For sterkt alkaliske monomerer foretrekker man en metode hvor man innfører CC^-gass gjennom løsningen for å bringe pH innenfor ikke-denatureringsområdet. Polymerizations that take place in a pH environment that is unfriendly to the particular chemically active substance that one seeks to encapsulate should not be used for this substance. However, many monomers which in solution have a natural pH capable of denaturing most labile biological materials can be buffered to the above pH range without affecting their action. Other monomers can be used without buffering, depending on their natural pH and the properties of the material that is sought to be encapsulated. For strongly alkaline monomers, a method is preferred where CC₂ gas is introduced through the solution to bring the pH into the non-denaturing range.

Ved en utførelsesform av oppfinnelsen har det In one embodiment of the invention, it has

vist seg at en meget sterk kapselmembran har færre defekter, og ved anvendelse av en mindre polymerisasjonsgrad, kan fremstilles ved en totrinns-polymerisasjon. I denne henseende har det vist seg at kapselmembranene som fremstilles ved den ovenfor omtalte ett-trinns prosess, ofte er makroporøse, ujevne og varierer betraktelig i styrke og tykkelse. Dersom imidlertid polymerisasjonen ved grenseflaten av det emulgerte system stoppes ved å fjerne den kontinuerlige fasen, og kapslene deretter suspenderes igjen i friskt løsningsmiddel med redusert løselighet for den første monomer, vil en ytterligere del av den annen monomer som er tilsatt til resuspensjonen forårsake: ytterligere polymerisasjon som vil styrke membranene, forårsake at de største porene i membranene fortrinnsvis fylles og dermed unngår makroporøs tilstand. Fremgangsmåten gir således en semipermeabel membran av høy kvalitet ved anvendelse av en annen minimal mengde proved that a very strong capsule membrane has fewer defects and, by using a lower degree of polymerization, can be produced by a two-stage polymerization. In this respect, it has been shown that the capsule membranes produced by the above-mentioned one-step process are often macroporous, uneven and vary considerably in strength and thickness. If, however, the polymerization at the interface of the emulsified system is stopped by removing the continuous phase, and the capsules are then resuspended in fresh solvent with reduced solubility of the first monomer, a further portion of the second monomer added to the resuspension will cause: further polymerization which will strengthen the membranes, cause the largest pores in the membranes to be preferentially filled and thus avoid a macroporous state. The method thus provides a semipermeable membrane of high quality using another minimal amount

polymerisasjon, idet den sistnevnte utnyttes til maksimal ytterligere fordel for å fylle membrandefektene. polymerization, the latter being utilized to maximum additional advantage to fill the membrane defects.

Ytterligere forbedring av denne totrinns-polymerisasjon Further improvement of this two-stage polymerization

gjør en istand til å regulere styrken, tykkelsen og porøsiteten av membranene i høyere grad. Dersom det hydrofobe løsningsmiddel som utgjør den kontinuerlige fasen av emulsjonen, velges slik at den første monomeren er lite løselig i denne, vil monomeren i dråpene .diffundere lite inn i den kontinuerlige fasen. Dette resulterer i en relativt tykk fasegrense og en tilsvarende tykk og usedvanlig porøs membran, som fremstilles når de to monomerer kommer i berøring med hverandre. Jo større løseligheten av den første monomeren i den kontinuerlige fasen er, dess mer makroporøs blir vanligvis membranen. Dersom, på den annen side, den første monomeren er meget mindre løselig i den kontinuerlige, hydrofobe fasen, vil grensen mellom fasene være skarp og man får en tynn, tett og usedvanlig mikroporøs membran. Når de delvis fremstilte kapslene resuspenderes, anvendes et forskjellig løsningsmiddel som har en løselighet som er annerledes for den første monomeren enn løsningsmidlet som anvendes som den diskontinuerlige fasen ved den første polymerisasjonen. Når det er fremstilt en makroporøs membran ved den første polymerisasjonen, anvendes et løsningsmiddel hvor den første monomeren er hovedsakelig uløselig ved den annen polymerisasjon og som har den virkning at man herder membranene. Det er antatt at ved det annet polymerisasjonstrinn møtes de to forløperne til polymeren bare innenfor de svake stedene av den defekte membranen som er fremstilt inntil da, dvs. der ivor det er fortrinnsvis diffusjon av den første monomer mot løsnings-midlet. Det dannes således mer polymer for å fylle de store porene. makes it possible to regulate the strength, thickness and porosity of the membranes to a greater extent. If the hydrophobic solvent which forms the continuous phase of the emulsion is chosen so that the first monomer is little soluble in it, the monomer in the droplets will diffuse little into the continuous phase. This results in a relatively thick phase boundary and a correspondingly thick and exceptionally porous membrane, which is produced when the two monomers come into contact with each other. The greater the solubility of the first monomer in the continuous phase, the more macroporous the membrane usually becomes. If, on the other hand, the first monomer is much less soluble in the continuous, hydrophobic phase, the boundary between the phases will be sharp and a thin, dense and exceptionally microporous membrane will be obtained. When the partially prepared capsules are resuspended, a different solvent is used which has a different solubility for the first monomer than the solvent used as the discontinuous phase in the first polymerization. When a macroporous membrane has been produced in the first polymerization, a solvent is used in which the first monomer is mainly insoluble in the second polymerization and which has the effect of hardening the membranes. It is assumed that in the second polymerization step, the two precursors to the polymer meet only within the weak points of the defective membrane that has been produced until then, i.e. where there is preferential diffusion of the first monomer towards the solvent. More polymer is thus formed to fill the large pores.

Ved en annen utførelsesform av oppfinnelsen kan konsentra-sjonene av monomerene i de respektive løsningsmidler reguleres med fordel ytterligere. Dersom f.eks. den annen monomer, som er oppløst i den hydrofobe, kontinuerlige fasen i emulsjonen, har den egenskap In another embodiment of the invention, the concentrations of the monomers in the respective solvents can be advantageously further regulated. If e.g. the other monomer, which is dissolved in the hydrophobic, continuous phase of the emulsion, has that property

at den denaturerer det materiale som man søker å innkapsle, kan den første monomeren, som er oppløst i den diskontinuerlige fasen, til-føres ved en høy konsentrasjon i forhold til den annen, i størrelses-orden 100 til 1 for å hindre en eventuell migrering av den de-naturerende monomeren inn i dråpene av løsning under den første polymerisasjonen. Denne teknikken gir ofte en meget porøs mikro-kapsel, men i det annet polymerisasjonstrinn kan konsentrasjonen av den annen monomer uten fare økes, og dersom man anvender et egnet løsningsmiddel, vil kapslene bli styrket og gjort mikroporøse ved that it denatures the material that one seeks to encapsulate, the first monomer, which is dissolved in the discontinuous phase, can be added at a high concentration in relation to the second, in the order of magnitude 100 to 1, to prevent any migration of the denaturing monomer into the droplets of solution during the first polymerization. This technique often gives a very porous micro-capsule, but in the second polymerization step the concentration of the other monomer can be increased without danger, and if a suitable solvent is used, the capsules will be strengthened and made microporous by

selektiv brodannelse tvers over de store porene med en tynn membran som forklart ovenfor, uten å påvirke det innkapslede materiale. selective bridging across the large pores with a thin membrane as explained above, without affecting the encapsulated material.

Ved enda en utførelsesform av oppfinnelsen har det vist In yet another embodiment of the invention it has been shown

seg at konsentrasjonen av hemoglobin som er innkapslet, kan økes vesentlig dersom røde celler som anvendes for å fremstille hemoglobin-hemolysat, vaskes godt i hypertonisk saltløsning. Den relativt høye saltkonsentrasjon i den vandige, diskontinuerlige fasen i emulsjonen vil i tillegg lette grenseflatepolymerisasjonen av den første monomeren ved å begrense løseligheten av vann i den organiske fasen som inneholder en annen monomer, som vanligvis hurtig vil spaltes når den utsettes for vann. Det antas at reaksjonsproduktene ved en slik hydrolyse av den annen monomer bidrar til defekter i membranen dersom den ikke er fjernet i adskillelsestrinnet. stated that the concentration of encapsulated hemoglobin can be increased significantly if red cells used to prepare hemoglobin haemolysate are washed well in hypertonic salt solution. The relatively high salt concentration in the aqueous, discontinuous phase in the emulsion will additionally facilitate the interfacial polymerization of the first monomer by limiting the solubility of water in the organic phase containing another monomer, which will usually rapidly decompose when exposed to water. It is assumed that the reaction products from such hydrolysis of the other monomer contribute to defects in the membrane if it is not removed in the separation step.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen ytterligere. The following examples further illustrate the invention.

Eksempel 1 Example 1

Røde celler fra "expired blood bank" helblod fra mennesker ble adskilt og deretter vasket to ganger i to ganger sitt volum med hypertonisk saltløsning (1,5 g/dl) ved sentrifugering i en avkjølt sentrifuge ved 2800 xg i 5 minutter. Hypertonisk saltløsning ble anvendt for å fjerne vann fra cellene for å få høyest mulig konsentrasjon av hemoglobin etter oppløsning av cellene ("lysis"). Red cells from expired blood bank human whole blood were separated and then washed twice in twice their volume of hypertonic saline (1.5 g/dl) by centrifugation in a refrigerated centrifuge at 2800 xg for 5 minutes. Hypertonic saline was used to remove water from the cells in order to obtain the highest possible concentration of hemoglobin after dissolution of the cells ("lysis").

En tredje sentrifugering i 15 minutter ved 2800 xg tjener til å A third centrifugation for 15 minutes at 2800 xg serves to

pakke cellene. Så meget saltløsning som mulig ble fjernet fra de pakkede cellene som deretter ble oppløst ved å ryste kraftig med 1 ml vannfri eter pr. 10 ml pakkede celler. Denne blandingen ble sentrifugert ved 1000 xg i 20 minutter og cellefragmentene og eter som oppsto på toppen ble fjernet. Hemoglobinkonsentrasjonen ble undersøkt ved å måle absorpsjonen ved 10 yl av hemolysatet i 4,0 ml av isotonisk saltløsning ved en bølgelengde på 540 nm. Absorpsjons-avlesningene fra alle riktig fremstilte hemolysatløsninger lå mellom 0,7 og 0,8, som tilsvarer en konsentrasjon på 28-32 g/dl. Hemoglobin-konsentrasjoner som er større enn 30 g/dl krystalliserer og faller ut ved lagring ved kjøletemperatur (4°C). Hemolysatet kan anvendes i minst en uke dersom det avkjøles. pack the cells. As much salt solution as possible was removed from the packed cells which were then dissolved by vigorous shaking with 1 ml of anhydrous ether per 10 ml packed cells. This mixture was centrifuged at 1000 xg for 20 minutes and the cell fragments and ether that appeared on top were removed. The hemoglobin concentration was examined by measuring the absorbance of 10 µl of the hemolysate in 4.0 ml of isotonic saline at a wavelength of 540 nm. The absorbance readings from all correctly prepared hemolysate solutions were between 0.7 and 0.8, which corresponds to a concentration of 28-32 g/dl. Hemoglobin concentrations greater than 30 g/dl crystallize and precipitate when stored at refrigerated temperature (4°C). The hemolysate can be used for at least one week if it is cooled.

Heksandiaminkarbonat-løsning ble fremstilt ved å boble karbondioksyd ned i en 3M løsning av 1,6-heksandiamin (Eastman Kodak Co.) inntil man fikk en pH på 8,5. Dette krevet ca. 15 g C02 pr. 100 ml løsning. Hexanediamine carbonate solution was prepared by bubbling carbon dioxide into a 3M solution of 1,6-hexanediamine (Eastman Kodak Co.) until a pH of 8.5 was obtained. This required approx. 15 g C02 per 100 ml solution.

4,4'-diamino-bifenyl-2,2<1->disulfonsyre (DBDSA) (teknisk 4,4'-diamino-biphenyl-2,2<1->disulfonic acid (DBDSA) (technical

kvalitet - Eastman Kodak Co.) ble fremstilt ved å tilsette ca. 50 g DBDSA i 800 ml deionisert vann som inneholder 50 ml av 6M NaOH. Løsningen ble filtrert for å fjerne eventuelt resterende faste stoffer og DBDSA ble utfelt ved å tilsette 70 ml av en 50% volum/volum HC1. Etter at krystallene hadde sedimentert, ble så meget som mulig av den purpurfargede væsken hellet av, og deretter ble tilsatt 500 ml 10% volum/volum HC1. Krystallene ble oppsamlet i en Buchner-trakt og vasket tre ganger med deionisert vann, deretter vasket to ganger med aceton og tørket. Produktet var hvite eller svakt lyse-røde krystaller og ble lagret i en brun flaske for beskyttelse mot lys. Denne forbindelsen anvendes for å fremstille en membran-kopolymer som har en negativ ladning for å hindre klumping. 10 ml av hemolysatløsning som inneholder 30 g, dl hemoglobin ble blandet med 10 ml 3M heksandiaminkarbonatløsning som inneholder 2,88 g DBDSA. Disse to monomerer utgjør når de blandes, den første reaktanten i dette eksempel. Denne vandige løsningen ble deretter tilsatt til 125 ml av på forhånd avkjølt hydrofob organisk væske fremstilt fra 100 ml av 20% kloroform-80% cykloheksanblanding og 25 ml av et emulgeringsmiddel "SPAN-85" (Sorbitantrioleat). quality - Eastman Kodak Co.) was prepared by adding approx. 50 g of DBDSA in 800 ml of deionized water containing 50 ml of 6M NaOH. The solution was filtered to remove any remaining solids and DBDSA was precipitated by adding 70 ml of a 50% v/v HC1. After the crystals had settled, as much of the purple liquid as possible was poured off, and then 500 ml of 10% v/v HCl was added. The crystals were collected in a Buchner funnel and washed three times with deionized water, then washed twice with acetone and dried. The product was white or slightly pale red crystals and was stored in a brown bottle for protection from light. This compound is used to produce a membrane copolymer which has a negative charge to prevent clumping. 10 ml of hemolysate solution containing 30 g, dl of hemoglobin was mixed with 10 ml of 3M hexanediamine carbonate solution containing 2.88 g of DBDSA. These two monomers, when mixed, form the first reactant in this example. This aqueous solution was then added to 125 ml of pre-cooled hydrophobic organic liquid prepared from 100 ml of 20% chloroform-80% cyclohexane mixture and 25 ml of an emulsifier "SPAN-85" (Sorbitan Trioleate).

Emulgeringen ble startet i et på forhånd avkjølt blandeapparat og fortsatt i 1-2 minutter. Emulsification was started in a pre-cooled mixer and continued for 1-2 minutes.

Tereftaloylklorid, den annen monomer, krever forberedende rensning. Varm (nesten kokende) cykloheksan ble mettet med tereftaloylklorid ("practical grade" - Eastman Kodak Co.) og løsningen ble hurtig filtrert. Den klare væsken ble oppsamlet og fikk lov til å avkjøles og krystallisere i et lukket kar. Krystallene ble oppsamlet, idet man mest mulig unngår luftens påvirkning og tørket i vakuum siden forbindelsen omsetter seg med fuktighet i luften. Stam-løsningen av tereftaloylklorid ble fremstilt ved å oppløse 10,15 g renset tereftaloylklorid i 95 ml 20% CHCl3 - 80% CgH12, volum/volum. Man fikk en 0,5M løsning. Denne løsningen bør oppbevares i et tett forseglet beholder og kan anvendes i minst en måned før det begynner å danne seg utfeining. Terephthaloyl chloride, the other monomer, requires preparatory purification. Hot (almost boiling) cyclohexane was saturated with terephthaloyl chloride ("practical grade" - Eastman Kodak Co.) and the solution was quickly filtered. The clear liquid was collected and allowed to cool and crystallize in a closed vessel. The crystals were collected, avoiding the influence of air as much as possible, and dried in a vacuum since the compound reacts with moisture in the air. The stock solution of terephthaloyl chloride was prepared by dissolving 10.15 g of purified terephthaloyl chloride in 95 mL of 20% CHCl 3 - 80% CgH 12 , v/v. A 0.5M solution was obtained. This solution should be stored in a tightly sealed container and can be used for at least one month before it starts to form a scum.

3 ml av en organisk løsning av 0,5M tereftaloylklorid i 3 ml of an organic solution of 0.5 M terephthaloyl chloride i

20% kloroform - 80% cykloheksan ble deretter tilsatt til emulsjonen under langsom omrøring. Det virkelige konsentrasjonsforholdet av diamin/disyrehalogenid var 128 til 1, skjønt en viss variasjon kan tolereres. Etter 3 minutter var den første polymerisasjonen av-sluttet og suspensjonen ble sentrifugert i 15-20 sek. ved 400-500 xg. Den overliggende organiske væsken ble deretter fjernet ved 20% chloroform - 80% cyclohexane was then added to the emulsion with slow stirring. The actual concentration ratio of diamine/diacid halide was 128 to 1, although some variation can be tolerated. After 3 minutes, the first polymerization was finished and the suspension was centrifuged for 15-20 seconds. at 400-500 xg. The overlying organic liquid was then removed by

aspirasjon. aspiration.

Kapslene ble deretter suspendert igjen i en annen væske som består av 100 ml cykloheksan og 10 ml sorbitantrioleat. Mens man blander langsomt ble tilsatt en organisk løsning av 7 ml av 0,5M tereftaloylklorid i 20% kloroform og 80% cykloheksan. Denne hydrofobe væsken inneholder bare 1,0 til 1,5% kloroform mot 20% i det første organiske trinn. Det reduserte kloroforminnholdet reduserer løseligheten av diamin i løsningsmidlet og man får en tynnere membran og lapper hullene i den opprinnelige grove. Konsentrasjonsforholdet diamin/disyrehalogenid var 50 til 1. Om-røringen fortsatte i 3 minutter og deretter ble omsetningen stoppet ved tilsetning av 30 ml 50% "TWEEN-20" (sorbitanmonolaurat) pufret til nøytral pH med 0,3M NaHC03- The capsules were then resuspended in another liquid consisting of 100 ml of cyclohexane and 10 ml of sorbitan trioleate. While mixing slowly, an organic solution of 7 ml of 0.5 M terephthaloyl chloride in 20% chloroform and 80% cyclohexane was added. This hydrophobic liquid contains only 1.0 to 1.5% chloroform against 20% in the first organic stage. The reduced chloroform content reduces the solubility of diamine in the solvent and a thinner membrane is obtained and the holes in the original rough patch are patched. The diamine/diacid halide concentration ratio was 50 to 1. Agitation was continued for 3 minutes and then the reaction was stopped by the addition of 30 ml of 50% "TWEEN-20" (sorbitan monolaurate) buffered to neutral pH with 0.3 M NaHCO 3 -

Legg merke til at hemoglobin-enzym-hemolysatløsningen ikke på noe tidspunkt var utsatt for en pH mindre enn 5 eller større enn 9. Heksan-diaminløsningen har naturlig pH på 11,5 og en pH på ca. 11 når den blandes med hemoglobin. Innbobling av (X^ gjennom denne forårsaker fremstilling av I^CO^ og heksandiaminkarbonat. CX^ virker som en buffer og foretrekkes fremfor natriumsalter eller svake syrer. Før bufring har det anvendte sorbitanmonolaurat vanligvis en pH på ca. 4,5. Lengere tids påvirkning i denne sure omgivelse vil denaturere hemoglobinet og enzymer. Dette kan unngås ved å bufre sorbitanmonolaurat slik at det får en pH i nærheten av 7. Hensikten med sorbitanmonolaurat er å lette overføringen av mikrokapsler til et vandig medium slik som saltvannsløsning. (se "Artificial Cells", kapittel 2). Det bør bemerkes at i dette trinn har sorbitanmonolaurat en tendens til å omsette seg langsomt med tereftaloylklorid og gir et klebrig polymerbelegg og i tillegg gjør mikrokapslene riflede. En bedre alternativ fremgangsmåte er å fjerne så meget som mulig av løsningsmidlet ved sentrifugering og deretter anvende den ovenfor nevnte tilsetning av "TWEEN-20" og påfølgende adskillelse. Note that at no time was the hemoglobin-enzyme-hemolysate solution exposed to a pH less than 5 or greater than 9. The hexane-diamine solution has a natural pH of 11.5 and a pH of approx. 11 when mixed with hemoglobin. Bubbling of (X^ through this causes the production of I^CO^ and hexanediamine carbonate. CX^ acts as a buffer and is preferred over sodium salts or weak acids. Before buffering, the sorbitan monolaurate used usually has a pH of about 4.5. Longer-term effects in this acidic environment will denature the hemoglobin and enzymes. This can be avoided by buffering the sorbitan monolaurate to a pH close to 7. The purpose of the sorbitan monolaurate is to facilitate the transfer of microcapsules into an aqueous medium such as saline. (see "Artificial Cells ", Chapter 2). It should be noted that, in this step, sorbitan monolaurate tends to react slowly with terephthaloyl chloride to produce a sticky polymer coating and, in addition, to make the microcapsules fluted. A better alternative method is to remove as much of the solvent as possible by centrifugation and then apply the above-mentioned addition of "TWEEN-20" and subsequent separation.

Mikrokapsler fremstilt etter denne fremgangsmåte gir ikke lekkasje av enzymer eller hemoglobin. Halve likevektstider (t 1/2) for de oppløste stoffer av forskjellige molekylvekter er angitt i tabell I. Microcapsules produced according to this method do not leak enzymes or hemoglobin. Half-equilibrium times (t 1/2) for the solutes of different molecular weights are given in Table I.

Virkningen av fire enzymer, laktat-dehydrogenase (LDH), glutamat-oksaloacetat-transaminase (GOT), urease og 3-glukuronidase ble målt før og etter innkapsling. LDH og GOT finnes naturlig i det røde cellehemolysat. Urease og 3-glukuronidase ble tilsatt til hemolysatet i form av lyofilisert, delvis renset enzym, som fås fra kommersielle kilder. Resultatet av sammenligningene for LDH, GOT og urease er angitt i tabell II. Virkningen ble målt i internasjonale enheter (IU) pr. liter prøve under forsøkets reaksjonsbetingelser. Utbytter bestemt for 3-glukuronidase lå. jevnt rundt ca. 50%. The activity of four enzymes, lactate dehydrogenase (LDH), glutamate oxaloacetate transaminase (GOT), urease and 3-glucuronidase, was measured before and after encapsulation. LDH and GOT are found naturally in the red cell hemolysate. Urease and 3-glucuronidase were added to the hemolysate in the form of lyophilized, partially purified enzyme, which is obtained from commercial sources. The result of the comparisons for LDH, GOT and urease is given in Table II. The effect was measured in international units (IU) per liter of sample under the experimental reaction conditions. Yields determined for 3-glucuronidase lay. evenly around approx. 50%.

Tabell III viser en sammenligning ved tilstedeværende oksygenmetning i hemolysatløsningen som anvendes for å fremstille mikrokapsler med innkapslet hemoglobin, ved forskjellige G^-trykk. Table III shows a comparison of the oxygen saturation present in the hemolysate solution used to produce microcapsules with encapsulated hemoglobin, at different G^ pressures.

Tabell IV viser virkningen av å variere mengden av syre-halogenid i den diskontinuerlige fasen ved hver polymerisasjon på porøsiteten av mikrokapsler fremstilt i en serie av forsøk, idet porøsiteten måles indirekte ved å observere hvorvidt det innkapslede materiale lekker gjennom membranen eller ikke. Som tabellen klart viser er konsentrasjonen av den annen monomer i hvert polymerisasjonstrinn vesentlig for god kapseldannelse. Fagmannen vil ha liten vanskelighet mad å bestemme de optimale konsentrasjonsforhold som skal anvendes sammen med andre polymersystemer. Kapslene i tabell IV ble fremstilt slik som angitt ovenfor, bortsett fra at emulgeringen ble utført i "SPAN 85" alene før det blandede, organiske løsningsmiddel ble tilsatt. Resultater av andre variasjoner ved fremstillingen er kvalitativt tilsvarende. Table IV shows the effect of varying the amount of acid halide in the discontinuous phase at each polymerization on the porosity of microcapsules prepared in a series of experiments, the porosity being measured indirectly by observing whether or not the encapsulated material leaks through the membrane. As the table clearly shows, the concentration of the second monomer in each polymerization step is essential for good capsule formation. The person skilled in the art will have little difficulty in determining the optimum concentration ratios to be used together with other polymer systems. The capsules in Table IV were prepared as indicated above, except that the emulsification was carried out in "SPAN 85" alone before the mixed organic solvent was added. Results of other variations in manufacturing are qualitatively similar.

Mikrokapsler adskilt fra den organiske løsningen etter Microcapsules separated from the organic solution after

den første omsetningen var røde, noe som viste at det hadde funnet sted liten eller ingen denaturering, men var lekke og dårlig fremstilt. Økende tereftaloylkloridkonsentrasjon under disse betingelser ga mikrokapsler som var brune og viser hemoglobin-denaturering og lekkasje. Økning av reaksjonstiden ved første omsetning opp til 5 minutter hadde liten tilsynelatende virkning på mikrokapslene, the first turnover was red, showing that little or no denaturation had taken place, but was leaky and poorly made. Increasing terephthaloyl chloride concentration under these conditions produced microcapsules that were brown and show hemoglobin denaturation and leakage. Increasing the reaction time at first turnover up to 5 minutes had little apparent effect on the microcapsules,

men en økning i den annen reaksjonstid til mer enn 4 minutter gjorde mikrokapslene brune og viser hemoglobin-denaturering. but an increase in the second reaction time to more than 4 minutes turned the microcapsules brown and shows hemoglobin denaturation.

Reduksjon av den ene eller den annen reaksjonstid med ett minutt Reduction of one or the other reaction time by one minute

eller mer resulterte i lekke mikrokapsler. Tilstedeværelsen av mindre mengder etanol, som vanligvis anvendes som et stabiliserings-middel for kloroform, kan nødvendiggjøre justering av optimale volumer. For å oppnå den største reproduserbarhet og mest drifts-sikker kapseldannelse bør etanol fjernes. Kloroform som anvendes i tabell IV inneholder noe etanol. Når etanolen tas bort er det optimale annet reaksjonsvolum normalt 3-4 ml, heller enn 7. or more resulted in leaking microcapsules. The presence of minor amounts of ethanol, which is usually used as a stabilizer for chloroform, may necessitate adjustment of optimal volumes. To achieve the greatest reproducibility and most operationally reliable capsule formation, ethanol should be removed. Chloroform used in Table IV contains some ethanol. When the ethanol is removed, the optimal second reaction volume is normally 3-4 ml, rather than 7.

Reduksjon av mengden av "TWEEN-20" som anvendes i adskillelsestrinnet, resulterte i dårlig adskillelse av mikrokapsler fra det organiske løsningsmiddel. Mikrokapsler som fikk lov til å forbli i "TWEEN 20" i lengere tid (> \ time), ble brune. Mikrokapsler som var lagret i ikke pufret saltløsning som hadde en pH på 5,5, ble brune etter noen dager, mens de som var lagret i en løsning som var pufret til pH 7,4 forble røde i månedsvis. Reducing the amount of "TWEEN-20" used in the separation step resulted in poor separation of microcapsules from the organic solvent. Microcapsules allowed to remain in "TWEEN 20" for longer periods (> \ hour) turned brown. Microcapsules stored in unbuffered saline having a pH of 5.5 turned brown after a few days, while those stored in a solution buffered to pH 7.4 remained red for months.

Ytterligere undersøkelse av kapslene fremstilt i dette eksempel viser at de har et forhold mellom veggvolum og kapselvolum i størrelsesorden 0,028. Når t er veggtykkelsen og D er diameteren, er forholdet mellom veggvolum og kapselvolum gitt ved: Further examination of the capsules produced in this example shows that they have a ratio between wall volume and capsule volume of the order of 0.028. When t is the wall thickness and D is the diameter, the ratio between wall volume and capsule volume is given by:

Kapslene har en gjennomsnittlig veggtykkelse (t) på 700Å eller 0,07Mffi og en gjennomsnittlig diameter (D) på 15Mm. Følgelig er R 6 x 0,07/15 eller 0,028. Siden nylon har en tetthet som er omtrentlig lik 1, vil det være nødvendig med 28 mg nylon for å fremstille solide membraner pr. ml kapsler. Tilstedeværende total mengde diamin, som kan beregnes fra den anvendte konsentrasjon, er 1,5 mM/ml eller 174 mg/ml. Siden nylonveggen er 46 vekt% diamin, vil 12,9 mg diamin, eller ca. 7,5% av totalmengden, være nødvendig for å fremstille en fast nylonvegg. Siden imidlertid syrekloridet er den reaksjonsbegrensende bestanddel og forholdet diamin/syreklorid i beste fall er 50/1, er den øvre grense for fremstilt nylon i størrelsesorden 2,0% av totalt diamin. Dette antyder at de fremstilte membraner er nesten svamplignende med en åpen cellestruktur. The capsules have an average wall thickness (t) of 700Å or 0.07Mffi and an average diameter (D) of 15Mm. Consequently, R is 6 x 0.07/15 or 0.028. Since nylon has a density approximately equal to 1, 28 mg of nylon will be required to produce solid membranes per ml capsules. The total amount of diamine present, which can be calculated from the concentration used, is 1.5 mM/ml or 174 mg/ml. Since the nylon wall is 46% diamine by weight, 12.9 mg of diamine, or approx. 7.5% of the total quantity, be necessary to produce a solid nylon wall. However, since the acid chloride is the reaction-limiting component and the diamine/acid chloride ratio is at best 50/1, the upper limit for produced nylon is in the order of 2.0% of total diamine. This suggests that the fabricated membranes are almost sponge-like with an open cell structure.

Disse kapsler er ugjennomtrengelige for hemoglobin These capsules are impermeable to hemoglobin

(mw - 68.000), men gjennomtrengelige for insulin (mw 12.000, (mw - 68,000), but permeable to insulin (mw 12,000,

halve likevektstider ligger mellom 2 og 3 minutter). En sammenligning av halvtiden for insulin med de for substanser med lav molekylvekt slik som angitt i tabell I viser et ikke-lineær forhold. Det antas at dette fenomen skyldes steriske egenskaper eller ladningstilstanden av insulinmolkylene. equilibrium half-times are between 2 and 3 minutes). A comparison of the half-lives of insulin with those of low molecular weight substances as indicated in Table I shows a non-linear relationship. It is believed that this phenomenon is due to steric properties or the charge state of the insulin molecules.

E ksempel 2 Example 2

Fremgangsmåten var den samme som i eksempel 1, bortsett fra at en løsning bestående av 1 dellM 4,4'-diaminostilben-2,2'-di-sulfonsyre (Pfaltz og Bauer, Inc.) i isotonisk, pH 7,4, fosfat-puffer pluss 10 deler 3M heksandiaminkarbonat tilsatt til et tilsvarende volum hemolysat, ble anvendt istedenfor diamin-DBDSA i hemolysatløsningen. De fremstilte kapsler har de tilsvarende egenskaper som de i eksempel 1. The procedure was the same as in Example 1, except that a solution consisting of 1 mM 4,4'-diaminostilbene-2,2'-disulfonic acid (Pfaltz and Bauer, Inc.) in isotonic, pH 7.4, phosphate -buffer plus 10 parts of 3M hexanediamine carbonate added to an equivalent volume of hemolysate was used instead of diamine-DBDSA in the hemolysate solution. The manufactured capsules have the same properties as those in example 1.

Eksempel 3 Example 3

Fremgangsmåten er den samme som angitt i eksempel 1, bortsett fra det følgende. DBDSA tilsettes ikke til hemolysat-løsningen, og mengden av syrekloridet som anvendes i begge polymerisasjonstrinn, dvs. 0,35 ml syreklorid pr. ml hemolysat-diamin-løsning, er den samme. Syrehalogenidet tilsettes i like porsjoner ved hver polymerisasjon i intervaller på 30 sekunder, istedenfor å tilsette alt på én gang ved begynnelsen av polymeri-sas jonen. Denne fremgangsmåten holder den lokale konsentrasjon av syreklorid lav og gir en membran av høy kvalitet. Prosent utbytte er sammenlignbart med det som er angitt i eksempel 1. The procedure is the same as stated in Example 1, except for the following. DBDSA is not added to the hemolysate solution, and the amount of acid chloride used in both polymerization steps, i.e. 0.35 ml of acid chloride per ml hemolysate-diamine solution, is the same. The acid halide is added in equal portions at each polymerization at intervals of 30 seconds, instead of being added all at once at the beginning of the polymerization. This method keeps the local concentration of acid chloride low and provides a high quality membrane. Percentage yield is comparable to that stated in example 1.

Eksempel 4 Example 4

Det ble fremstilt kapsler med tereftaloylklorid og heksandiamin som inneholder 2,5-diaminobenzensulfonsyre ved å anvende den samme fremgangsmåte som er angitt i eksempel 1, bortsett fra at det ble tilsatt 2,5-diaminobenzensulfonsyre til heksandiamin istedenfor DMDSA. De fremstilte kapsler har lignende egenskaper som de i Capsules of terephthaloyl chloride and hexanediamine containing 2,5-diaminobenzenesulfonic acid were prepared using the same procedure as in Example 1, except that 2,5-diaminobenzenesulfonic acid was added to hexanediamine instead of DMDSA. The manufactured capsules have similar properties to those in

eksempel 1. example 1.

Eksempel 5 Example 5

Mikrokapsler av sebacylklorid-heksandiaminkarbonat ble fremstilt ved å anvende fremgangsmåten i eksempel 1, bortsett fra at sebacylklorid ble anvendt istedenfor tereftaloylklorid og det ble ikke anvendt DBDSA. Denne fremgangsmåten gir mikrokapsler med lignende egenskaper som mikrokapslene i eksempel 1. Sebacyl chloride-hexanediamine carbonate microcapsules were prepared using the procedure of Example 1, except that sebacyl chloride was used instead of terephthaloyl chloride and DBDSA was not used. This method produces microcapsules with similar properties to the microcapsules in example 1.

Eksempel 6 Example 6

Kapsler av sebacylklorid-lysin ble fremstilt etter fremgangsmåten angitt i eksempel 5, bortsett fra at enten 3M lysin eller en løsning som består av like store mengder av 3M heksandiaminkarbonat og 3M lysin ble anvendt istedenfor 3M heksandiaminkarbonat. Noen få mikrokapsler som ble fremstilt ved denne metoden, var lekke og lite tilfredsstillende. Andre viste tilsvarende egenskaper som de som ble fremstilt i eksempel 1. Capsules of sebacyl chloride-lysine were prepared according to the procedure given in Example 5, except that either 3M lysine or a solution consisting of equal amounts of 3M hexanediamine carbonate and 3M lysine was used instead of 3M hexanediamine carbonate. A few microcapsules produced by this method were leaky and unsatisfactory. Others showed similar properties to those produced in Example 1.

Eksempel 7 Example 7

1,5 ml bovin-albumin (30%) ble tilsatt til 1 ml av DBDSA-heksandiaminkarbonatløsningen i eksempel 1 sammen med 0,4 ml 36% KC1 og 0,1 ml 2,9M tetraetylenpentamin (på forhånd justert til 1.5 ml of bovine albumin (30%) was added to 1 ml of the DBDSA-hexanediamine carbonate solution of Example 1 along with 0.4 ml of 36% KCl and 0.1 ml of 2.9 M tetraethylenepentamine (adjusted beforehand to

pH 9,5 med HC1). Det ble deretter tilsatt 4,0 ml "SPAN 85" og 10 ml heksan-kloroform-løsningen fra eksempel 1 til blandingen og man fikk en emulsjon, i løpet av 1-2 minutter, ved kraftig om-røring ved anvendelse av en magnetisk rører. Det tilsettes 0,4 ml tereftaloylkloridløsning (0,5M i heksan-kloroform fra eksempel 1) i 0,1 ml porsjoner hvert 30. sekund, etterfulgt av ytterligere tilsetninger av 0,1 ml hvert minutt i de neste 6 minutter. pH 9.5 with HCl). 4.0 ml of "SPAN 85" and 10 ml of the hexane-chloroform solution from Example 1 were then added to the mixture and an emulsion was obtained, within 1-2 minutes, with vigorous stirring using a magnetic stirrer . 0.4 ml of terephthaloyl chloride solution (0.5M in hexane-chloroform from Example 1) is added in 0.1 ml portions every 30 seconds, followed by further additions of 0.1 ml every minute for the next 6 minutes.

Etter sentrifugering for å adskille kapslene ble overliggende væske kastet og de ubehandlede mikrokapsler resuspendert i cykloheksan som inneholder 5% "SPAN 85". Det ble tilsatt 0,7 ml tereftaloylklorid og suspensjonen ble omrørt i 3 minutter. Etter adskillelse av fasene ved sentrifugering ble mikrokapslene vasket en gang i rent cykloheksan og underkastet endelig vasking og gjen-vinning som angitt i eksempel 1. After centrifugation to separate the capsules, the supernatant was discarded and the untreated microcapsules were resuspended in cyclohexane containing 5% "SPAN 85". 0.7 ml of terephthaloyl chloride was added and the suspension was stirred for 3 minutes. After separation of the phases by centrifugation, the microcapsules were washed once in pure cyclohexane and subjected to final washing and recycling as indicated in example 1.

Labile, biologiske materialer, inklusive enzymer, kan oppløses i albuminløsning om ønsket. Tetraetylenpentamin hjelper til å tverrbinde polymeren for fremstilling av sterke, semipermeable membraner med jevn porestørrelse. Labile, biological materials, including enzymes, can be dissolved in albumin solution if desired. Tetraethylenepentamine helps to crosslink the polymer to produce strong, semipermeable membranes with uniform pore size.

Claims

1. Method for encapsulating a core material, in the form of a labile biological material, in a semipermeable membrane formed by an interfacial polymerization, comprising the following steps: A) dissolving a diamine monomer and said core material in a water phase; B) formation of an emulsion in which the water phase from step A is the discontinuous phase, the diamine being slightly soluble in the continuous phase in the emulsion and the continuous phase comprising a hydrophobic solvent; C) formation of a highly permeable capsule membrane around the parts of the discontinuous phase by reacting the diamine with a diacid halide contained in said continuous phase, the diacid halide being able to form a polymer with said diamine monomer by a polycondensation reaction, and said diacid halide being strong soluble in said hydrophobic solvent;D) stopping the polymerization reaction by separating the hydrophobic solvent from the emulsion; characterized by subjecting the capsules produced in step C to the following step: E) resuspending the capsules in another hydrophobic liquid, the diamine monomer being practically insoluble in this; F) reacting a further amount of said diacid halide dissolved in said other hydrophobic liquid with said diamine monomer to effect further polymerization on said capsule membranes, so as to strengthen them, and to make them impermeable to the core material; and G) stopping the polymerization.

2. Method as stated in claim 1, characterized in that the diacid halide which is reacted with the diamine in step C is added to the continuous phase in portions during the course of the capsule membrane formation.