NO147473B

NO147473B - PROCEDURE AND APPARATUS FOR SEPARATING X-CHROMOSOM SAED CELLS FROM Y-CHROMOSOM SAED CELLS IN A SAD CART

Info

Publication number: NO147473B
Application number: NO772814A
Authority: NO
Inventors: Bhairab Chandra Bhattacharya
Original assignee: Bhairab Chandra Bhattacharya
Priority date: 1976-10-20
Filing date: 1977-08-10
Publication date: 1983-01-10
Also published as: FR2368299B3; NL7708738A; CA1088025A; NO147473C; NZ184883A; NO772814L; FR2368299A1; BR7705336A; AU518797B2; AU2756577A; BE857726A; MX148863A; PH15407A; AR215016A1; JPS6155975B2; JPS5356381A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte og et appa- The present invention relates to a method and an appa-

rat som muliggjør forhåndsbestemmelse av kjønnet for pattedyravkom ved adskillelse av sædceller med x-kromosom, rat which makes it possible to predetermine the sex of mammalian offspring by separating sperm cells with an X chromosome,

som frembringer avkom av hunkjønn og har en viss tetthet og et visst elektrisk potensial, fra sædceller med y-kromo- which produces female offspring and has a certain density and a certain electrical potential, from sperm cells with y-chromo-

som, som frembringer avkom av hunkjønn og har en annen tetthet og et annet elektrisk potensial. which, which produces female offspring and has a different density and electrical potential.

Avkommets kjønn forhåndsbestemmes av kromosomene i den bestemte sædcelle som befrukter vedkommende egg. Sædceller som inneholder x-kromosom og er ansvarlig for frembringelse av avkom av hunkjønn, har en noe større tetthet enn sædceller med y-kromosom som er ansvarlig for frembringelse av avkom av hankjønn. I tillegg er det fastslått at sædceller som inneholder henholdsvis x- og y-kromosomer har innbyrdes forskjellig elektrisk potensial på sine respektive celleoverflater. Disse forskjeller i tetthet og i elektrisk potensial gjør det mulig å innbyrdes adskille sædceller i fraksjoner som henholdsvis inneholder hovedsakelig alle sædceller at enten x- eller y-type. Separeringsmetoder som benytter seg av denne tetthetsforskjell og forskjell i elektrisk potensial, er egnet for anvendelse i forbindelse med alle pattedyr, innbefattet mennesket, og andre primater, samt kveg, svin, får, kaniner, katter, hunder, geiter, The sex of the offspring is predetermined by the chromosomes in the particular sperm that fertilizes the egg in question. Sperm cells that contain an x-chromosome and are responsible for the production of female offspring have a slightly greater density than sperm cells with a y-chromosome that are responsible for the production of male offspring. In addition, it has been established that sperm cells containing respectively x and y chromosomes have mutually different electrical potential on their respective cell surfaces. These differences in density and in electrical potential make it possible to mutually separate sperm cells into fractions which respectively contain mainly all sperm cells of either x- or y-type. Separation methods that make use of this difference in density and difference in electrical potential are suitable for use in connection with all mammals, including humans, and other primates, as well as cattle, pigs, sheep, rabbits, cats, dogs, goats,

hester, esler, bøfler, etc. Den metode for separering på horses, donkeys, buffaloes, etc. The method of separation on

grunn av tetthetsforskjell som hittil har vært anvendt, due to the difference in density that has been used so far,

går ut på å påvirke sædcellene med en flytekraft for å involves influencing the sperm cells with a buoyant force to

bringe de mer flytedyktige sædcellene til å anta et flyte- bring the more buoyant sperm cells to assume a floating

nivå i separeringsmediet som er forskjellig fra flytenivået for de mindre flytedyktige sædceller. Adskillelse av x- level in the separation medium which is different from the float level of the less buoyant sperm cells. Separation of x-

og y-sædceller på grunnlag av cellenes forskjellige elektriske potensial har vært vanskelig på den måten som en sådan separering tidligere har vært utført, på grunn av det forhold at det positive og negative zeta-potensial for henholdsvis feminine og maskuline sædceller danner en likevektstilstand innenfor mediets dielektrisitetskonstant, hvilket gjør det and y-sperm cells on the basis of the cells' different electrical potential has been difficult in the way that such a separation has previously been carried out, due to the fact that the positive and negative zeta potential for feminine and masculine sperm cells respectively form an equilibrium state within the medium's dielectric constant, which makes it

vanskelig å trekke de to ladningstyper fra hverandre i et galvanisk felt. Skjønt forskjellige typer av elektroforese-celler har vært anvendt ved forsøk på å adskille sædceller av de to typer med anvendte potensialer som varierer fra 200 mikrovolt til 10 volt likestrøm, har resultatet vært skuffende, særlig i de tilfeller konsentrasjonen av de utskilte celler viste seg å være for lav til å oppnå noenlunde sikkerhet for befruktning. Anvendelse av sterkere strømmer sammen med eventuell økning av sepa-reringens renhet, er funnet å nedsette sædcellenes leve-dyktighet. difficult to separate the two charge types in a galvanic field. Although different types of electrophoresis cells have been used in attempts to separate sperm cells of the two types with applied potentials varying from 200 microvolts to 10 volts direct current, the results have been disappointing, especially in those cases where the concentration of the separated cells turned out to be be too low to achieve reasonable certainty of fertilization. The use of stronger currents together with any increase in the purity of the separation has been found to reduce the viability of the sperm cells.

På den annen side er det fra US-patentskrift nr. 3.976.197 kjent en fremgangsmåte for separering av sædceller med x-kromosom fra sædceller med y-kromosom i sædvæske, idet sædvæsker tilføres et flytende suspensjonsmedium som anbringes i en kolonne hvor det frembringes en konveksjonssirkulasjon i mediet mellom forskjellige deler av kolonnen. On the other hand, from US patent no. 3,976,197 a method is known for separating sperm cells with an x-chromosome from sperm cells with a y-chromosome in seminal fluid, the seminal fluids being added to a liquid suspension medium which is placed in a column where a convection circulation in the medium between different parts of the column.

På denne bakgrunn av kjent teknikk er det et formål for foreliggende oppfinnelse å angi en fremgangsmåte for forbedret separering av de to typer sædceller, og denne fremgangsmåte har som særtrekk at suspensjonsmediet i konveksjonssirkulasjon utsettes for en galvanisk kraftpåvirkning ved hjelp av et elektrisk -felt som påtrykkes mellom elektroder med elektrisk potensialforskjell på 1-5 volt, fortrinnsvis 2-4 volt, i kontakt med det sirkulerende suspensjonsmedium i kolonnen, således at sædceller med innbyrdes forskjellig overflatepotensial trekkes til og kan tas ut fra hvert sitt område omkring de respektive elektroder. On this background of known technology, it is an object of the present invention to specify a method for improved separation of the two types of sperm cells, and this method has as a distinctive feature that the suspension medium in convection circulation is exposed to a galvanic force effect by means of an electric field that is applied between electrodes with an electrical potential difference of 1-5 volts, preferably 2-4 volts, in contact with the circulating suspension medium in the column, so that sperm cells with mutually different surface potential are attracted to and can be taken out from each area around the respective electrodes.

Det er tidligere bemerket at nærvær av fremmedpartikler i vedkommende separeringsmedium forstyrrer både sædcellenes oppdrifts- eller sedimenteringshastighet og deres bevegelse under påvirkning av galvarliske krefter såvel som deres befruktningsevne etter separeringen. Anvendelse av det universalmedium som er beskrevet i US patentskrift nr. 3.816.249 eliminerer hovedsakelig dette problem, sam--tidig som det oppnås forbedret styring av cellenes hyperaktivitet og forlenget spermaliv. Anvendelse av nevnte universalmedium likesom en lav temperatur for å nedsette spermaets bevegelighet hindrer den lille tett-hetsf orskjell ( 2- 5%) samt forskjell i elektrisk, over- . flatepotensial mellom maskuline og feminine sædceller fra å bli nøytralisert av sædcellenes høye metabolske aktivitet. It has previously been noted that the presence of foreign particles in the respective separation medium disturbs both the buoyancy or sedimentation speed of the sperm cells and their movement under the influence of galvalric forces as well as their fertilizing ability after separation. Use of the universal medium described in US Patent No. 3,816,249 mainly eliminates this problem, while achieving improved control of the cells' hyperactivity and prolonged sperm life. Application of the aforementioned universal medium as well as a low temperature to reduce the mobility of the sperm prevents the small difference in density (2-5%) as well as the difference in electrical, over- . surface potential between masculine and feminine sperm from being neutralized by the sperm's high metabolic activity.

I henhold til en foretrukket utførelse av oppfinnelsens fremgangsmåte utnyttes positive og negative oppdriftskrefter i kombinasjon med galvaniske krefter for å oppnå en mer effektiv separering av maskuline og feminine sædceller fra en blanding av sædvæske og partikkelfritt medium. Under den første del av en sådan fremgangsmåte bringes vedkommende blandingsmedium i en vertikal sedimenteringskolonne under innflytelse av en motstrøm drevet av termisk konveksjon ved lav temperatur, således at det frembringes separasjon av sædceller etter deres tetthet. Etter dette separerings-trinn behandles både den lettere og den tyngre fraksjon,. som hver inneholder ubalansert spermapopulasjon med overveiende innhold av henholdsvis y- og x-sædceller, hver for seg i et galvaniseringsapparat med tvungen konveksjon, idet hver fraksjon innsprøytes i en sentral konveksjonskolonne anbragt mellom de to armer av en elektroforesecelle med positiv og negativ elektrode. Galvanisk potensial påtrykkes sædcellene mens de sirkuleres i kolonnen på en måte som tilsvarer den sirkulasjon som tidligere er oppnådd ved termisk konveksjonsstrømning. Den tvungne konvek-sjonstrømning i kombinasjon med regulerte forhold med hensyn til temperatur, ionestyrke og pH i mediet, samt påtrykt spenning gjør det mulig å oppnå separering av x- og y-sædceller med så høy renhetsgrad som 92% eller mer. According to a preferred embodiment of the method of the invention, positive and negative buoyancy forces are utilized in combination with galvanic forces to achieve a more efficient separation of masculine and feminine sperm cells from a mixture of seminal fluid and particle-free medium. During the first part of such a method, the mixing medium in question is brought into a vertical sedimentation column under the influence of a countercurrent driven by thermal convection at a low temperature, so that sperm cells are separated according to their density. After this separation step, both the lighter and heavier fractions are processed. each of which contains an unbalanced sperm population with a predominant content of y- and x-sperm respectively, each separately in a galvanizing apparatus with forced convection, each fraction being injected into a central convection column placed between the two arms of an electrophoresis cell with a positive and negative electrode. Galvanic potential is applied to the sperm cells while they are circulated in the column in a manner corresponding to the circulation previously achieved by thermal convection flow. The forced convection flow in combination with regulated conditions with regard to temperature, ionic strength and pH in the medium, as well as applied voltage, makes it possible to achieve separation of x- and y-sperm cells with a degree of purity as high as 92% or more.

I henhold til foreliggende oppfinnelse kan det også frembringes en termisk drevet konveksjonsstrøm i sedimenteringskolonnen, hvilket får en del av mediet i denne kolonnen til å bevege seg med en hastighet V i retning oppover, mens en annen andel av mediet beveger seg med en hastighet V i retning nedover. X- og y-sædceller som befinner seg sus-pendert i nevnte medium, vil bringes til bevegelse med hastighet henholdsvis V og V y, idet disse hastigheter vil bli påvirket av mediets hastighet V, retning oppover eller nedover samt av tyngdekraften som vil påvirke x-cellene og y-cellene med forskjellig kraft i samsvar med deres tetthet. Som en følge av alle disse faktorer vil en y-sædcelle som har mindre tetthet enn en x-sædcelle ha en tendens til å stige raskere i den del av mediet som beveger seg i retning oppover, samt å synke langsommere i den del av mediet som beveger seg i retning nedover. According to the present invention, a thermally driven convection current can also be produced in the sedimentation column, which causes part of the medium in this column to move with a speed V in the upward direction, while another part of the medium moves with a speed V in downward direction. X and y sperm that are suspended in said medium will be set in motion with speeds V and V y respectively, as these speeds will be affected by the medium's speed V, direction upwards or downwards and by the force of gravity which will affect x the -cells and the y-cells with different power in accordance with their density. As a result of all these factors, a y-sperm that has a lower density than an x-sperm will tend to rise faster in the part of the medium that moves in an upward direction, and to sink more slowly in the part of the medium that moves in a downward direction.

I løpet av en viss tidsperiode vil disse forhold bringe y-partiklene med mindre tetthet til å samle seg nær den øvre ende av sedimenteringskolonnen, mens x-partiklene med større tetthet samler seg nær bunnen av sedimenteringskolonnen. Konveksjonsstrømmene vil befordre og aksellerere denne separeringsprosessen for adskillelse av de to partikkelklasser. Over a period of time, these conditions will cause the less dense y-particles to collect near the upper end of the settling column, while the more dense x-particles collect near the bottom of the settling column. The convection currents will promote and accelerate this separation process for the separation of the two particle classes.

Under en siste del av oppfinnelsens fremgangsmåte adskilles så ytterligere og konsentreres ved konveksjonsgalvanisering mediumfraksjonene med ubalanserte populasjoner av sædceller med overvekt av enten x- eller y-kromosomer som foreligger som resultat av den ovenfor beskrevne sedimentering i forbindelse med termisk drevet konveksjonsstrømning, idet de forskjellige elektriske overflatepotensialer for x- og y-sædceller hensiktsmessig utnyttes. During a final part of the method of the invention, the medium fractions with unbalanced populations of sperm cells with a predominance of either x or y chromosomes which are present as a result of the above-described sedimentation in connection with thermally driven convection flow are then further separated and concentrated by convection galvanization, as the different electrical surface potentials for x- and y-sperm cells are appropriately utilized.

Det er alminnelig erkjent at både x- og y-sædceller har en overveiende negativ ladning i nøytrale omgivelser (pH 7,0) og således begge vil vandre mot anoden ved elektroforese. Det er imidlertid funnet at maskuline sædceller som inneholder y-kromosom har en mer negativ ladning på hodet enn på halen og således trekkes mot anoden med hodet først, mens feminine sædceller med x-kromosom trekkes mot anoden med halen først, på grunn av en høyere negativ ladning på halen enn på hodet. Aktive eller mobile sperma er således funnet å svømme i forskjellig retning under sådan elektroforese, idet sperma med innhold av y-kromosom svømmer i retning av anoden, og således adderer svømmehastigheten til elektroforesehastigheten. I motsetning til dette svømmer sperma som inneholder x-kromosom mot katoden, således at elektroforesebevegelsen er motsatt rettet svømmebevegelsen. Lammede sperma, f.eks. sådanne som befinner seg ved lav temperatur (f.eks. 3-5°C) bidrar med meget liten svømme-hastighet, således at sædcellenes bevegelse i dette tilfellet overveiende bestemmes av deres elektroforesehastighet, som er hovedsakelig den samme for begge spermaarter i nøytrale bufferløsninger. Det er imidlertid funnet at sædceller med henholdsvis x- og y-kromosom kan bringes til å anta forskjellig resulterende overflate-ladning, alt etter den buffertype som anvendes, og som et resultat av vedkommende bufferløsnings pH-verdi. Adskillelse av sædceller med innhold av henholdsvis x- og y-kromosom er således avhengig av innstillingen av den resulterende overflateladningen på de respektive x- og y-celler, som varierer i avhengighet av pH-verdien, ionestyrken og konsentrasjonen av divalente ioner i bufferløsningen, så vel som den anvendte temperatur, strøm og spenning i elektroforesecellen. It is generally recognized that both x- and y-sperm cells have a predominantly negative charge in neutral environments (pH 7.0) and thus both will migrate towards the anode during electrophoresis. However, it has been found that male sperm containing a y-chromosome have a more negative charge on the head than on the tail and are thus drawn to the anode head first, while female sperm with an x-chromosome are drawn to the anode tail first, due to a higher negative charge on the tail than on the head. Active or mobile sperm have thus been found to swim in different directions during such electrophoresis, as sperm containing a y-chromosome swim in the direction of the anode, and thus the swimming speed adds to the electrophoresis speed. In contrast, sperm containing an x-chromosome swim towards the cathode, so that the electrophoresis movement is in the opposite direction to the swimming movement. Paralyzed sperm, e.g. those at low temperature (e.g. 3-5°C) contribute very little swimming speed, so that the movement of the sperm cells in this case is predominantly determined by their electrophoresis speed, which is essentially the same for both sperm species in neutral buffer solutions . However, it has been found that sperm cells with respectively x and y chromosomes can be made to assume a different resulting surface charge, depending on the type of buffer used, and as a result of the pH value of the buffer solution in question. Separation of sperm cells containing respectively x and y chromosomes is thus dependent on the setting of the resulting surface charge on the respective x and y cells, which varies depending on the pH value, the ionic strength and the concentration of divalent ions in the buffer solution, as well as the applied temperature, current and voltage in the electrophoresis cell.

Skjønt større separasjonshastighet kan forventes i elektro-foresecellene når spermacellene er mobile, Although greater separation speed can be expected in the electrophoresis cells when the sperm cells are mobile,

er det funnet mødvendig for å oppnå is found necessary to achieve

mest mulig effektiv separasjon på den måte som praktiseres i foreliggende oppfinnelse, nemlig å lamme spermacellene umiddelbart etter utløsningen, således at cellene hindres fra å absorbere materialer fra det omgivende fluid eller fra å frembringe metaboliske biprodukter, idet hver og en av disse prosesser i vesentlig grad vil forandre de feno-typiske forskjeller som muliggjør separasjon på grunnlag av forskjell i elektrisk potensial så vel som adskillelse som en følge av forskjellig tetthet. Det vil således være åpenbart at anvendelse av det partikkelfrie universalmedium som er beskrevet i US patentskrift nr. 3.816.249 er av vesentlig betydning ved begge prosesstrinn i henhold til foreliggende oppfinnelse for å oppnå en hensiktsmessig regulering av spermacellenes metabolisme og hyperaktivitet, for derved å tillate utnyttelse av de feno-typiske forskjeller i tetthet og elektrisk cellepotensial. the most efficient separation possible in the manner practiced in the present invention, namely to paralyze the sperm cells immediately after ejaculation, so that the cells are prevented from absorbing materials from the surrounding fluid or from producing metabolic by-products, each and every one of these processes to a significant extent will change the phenotypic differences that enable separation on the basis of difference in electrical potential as well as separation as a result of different density. It will thus be obvious that the use of the particle-free universal medium described in US Patent No. 3,816,249 is of significant importance in both process steps according to the present invention in order to achieve an appropriate regulation of the metabolism and hyperactivity of the sperm cells, thereby allowing utilization of the pheno-typic differences in density and electrical cell potential.

Det er videre funnet at anvendelse av en ubalansert populasjon under konveksjons- og galvaniseringsprosessen, It has further been found that the application of an unbalanced population during the convection and electroplating process,

nemlig anvendelse av en mediumfraksjon som inneholder vesentlig flere av den ene celletype enn den annen celletype, er av vesentlig betydning for oppnåelse av et godt resultat ved galvanisk separering og konsentrasjon. namely the use of a medium fraction which contains significantly more of one cell type than the other cell type, is of significant importance for achieving a good result in galvanic separation and concentration.

Den beskrevede sedimenteringsprosess ved hjelp av termisk motstrømskonveksjon gjør den galvaniske separeringsprosess mer virkningsfull og frembringer den nødvendige ubalan- The described sedimentation process using thermal countercurrent convection makes the galvanic separation process more effective and produces the necessary imbalance

serte populasjon for den mest effektive celleseparering ved hjelp av galvaniske midler. Selv om sedimentering ved termisk motstrømskonveksjon er den foretrukkede fremgangsmåte for frembringelse av en ubalansert sperraa-populasjon for anvendelse i galvaniseringsprosessen under tvungen konveksjon i henhold til foreliggende oppfinnelse, kan også forskjellige andre fremgangsmåter for innledende separasjon av x- og y-sædceller anvendes i kombinasjon med den galvaniseringsprosess under tvungen konveksjon som er beskrevet her, med varierende grad av heldig ut- serte population for the most efficient cell separation using galvanic means. Although sedimentation by thermal countercurrent convection is the preferred method for producing an unbalanced sperraa population for use in the forced convection electroplating process of the present invention, various other methods for initial separation of x and y sperm can also be used in combination with the galvanizing process under forced convection described here, with varying degrees of successful out-

fall i samsvar med den separeringsgrad som er oppnådd ved den første og innledende separeringsmetode. Sedimentering ved termisk motstrømskonveksjon er funnet å være den mest effektive av disse metoder for innledende separasjon og er foretrukket ved kombinasjon med galvanisk separasjon under tvungen konveksjon i henhold til foreliggende oppfinnelse. fall in accordance with the degree of separation achieved by the first and initial separation method. Sedimentation by thermal countercurrent convection has been found to be the most effective of these methods for initial separation and is preferred in combination with galvanic separation under forced convection according to the present invention.

Det bør også bemerkes at den konveksjonssirkulasjon som frembringes under konveksjonsgalvaniseringen enten kan være basert på tvungen konveksjon eller termisk'konveksjon. I det følgende vil det således være underforstått at termisk konveksjon kan anvendes i stedet for tvungen konveksjon. It should also be noted that the convection circulation produced during convection electroplating can either be based on forced convection or thermal convection. In the following, it will thus be understood that thermal convection can be used instead of forced convection.

Det er også mulig å kombinere sedimenteringskolonnen for den termiske motstrømskonveksjon og galvaniseringscellen med tvungen konveksjon i ett og sanne apparat og utføre begge prosesser i en o samme kolonne. I denne utførelse finner sedimenteringen ved termisk konveksjon sted inntil den ønskede separasjonsgrad med hensyn til tetthet er oppnådd, hvorpå galvaniske krefter påtrykkes mediet i kolonnen uten overføring til et annet apparat. Hvis så ønskes, kan da den foreliggende termiske konveksjon fortsette under galvaniserings- It is also possible to combine the sedimentation column for the thermal countercurrent convection and the galvanization cell with forced convection in one true device and carry out both processes in one and the same column. In this embodiment, the sedimentation by thermal convection takes place until the desired degree of separation with regard to density is achieved, after which galvanic forces are applied to the medium in the column without transfer to another device. If desired, the present thermal convection can then continue during galvanizing

prosessen . the process.

Selv om enhver tidligere kjent ionisk bufferløsning kan anvendes ved galvaniseringsprosessen med tvungen konveksjon i henhold til foreliggende oppfinnelse, foretrekkes imidlertid det universalmedium som er beskrevet i US patentskrift nr. 3.816.249. Dette universalmediumet kan ha en pH-verdi fra omkring 6 til omkring 8, samt osmoseevne som vanligvis ligger mellom 250 og 350 mos/kg. Fortrinnsvis vil den universelle mediumsammensetningen bli anvendt med pH i området fra omkring 6,8 til 7,0 med en osmoseevne på omtrent 300 mos/kg. Det er funnet at anvendelse av et svakt surt medium under galvanisering ved tvungen konveksjon er å fore-trekke, idet en sådan syrlighet fremhever forskjellen i overflatepotensial mellom de respektive sædceller med henholdsvis x- og y-kromosom. Although any previously known ionic buffer solution can be used in the electroplating process with forced convection according to the present invention, the universal medium described in US Patent No. 3,816,249 is preferred. This universal medium can have a pH value from around 6 to around 8, as well as osmosis which is usually between 250 and 350 mos/kg. Preferably, the universal medium composition will be used with a pH in the range from about 6.8 to 7.0 with an osmotic capacity of about 300 mos/kg. It has been found that the use of a weakly acidic medium during galvanization by forced convection is preferable, as such acidity emphasizes the difference in surface potential between the respective sperm cells with respectively x and y chromosomes.

Oppfinnelsen gjelder også et apparat for separering av sædceller med x-kromosom fra sædceller med y-kromosom i en sædvæske, idet apparatet omfatter en kolonne (1,73) for konveksjonssirkulasjon av et suspensjonsmedium med iblandet sædvæske mellom forskjellige deler av kolonnen. The invention also applies to an apparatus for separating sperm cells with an x-chromosome from sperm cells with a y-chromosome in a seminal fluid, the apparatus comprising a column (1.73) for convection circulation of a suspension medium with mixed seminal fluid between different parts of the column.

Apparatets særtrekk i henhold til oppfinnelsen består The special features of the device according to the invention consist

herunder i at elektroder anordnet for å påtrykkes forskjellig elektrisk potensial er anbragt i hvert sitt elektroderom i kommunikasjon med kolonnen mens uttaksorganer er anordnet i forbindelse med de respektive elektroderom for uttak av sædceller med innbyrdes forskjellig overflatepotensial fra hvert sitt elektroderom. including in that electrodes arranged to apply a different electrical potential are placed in each electrode compartment in communication with the column, while extraction means are arranged in connection with the respective electrode compartments for extracting sperm cells with mutually different surface potential from each electrode compartment.

Fortrinnsvis er kolonnen en sedimenteringskolonne som befinner seg i kommunikasjon med elektroderommene over rør-avsnitt i forskjellig høydenivå langs kolonnen. Preferably, the column is a sedimentation column that is in communication with the electrode spaces over pipe sections at different height levels along the column.

Oppfinnelsen vil nå bli nærmere beskrevet ved hjelp av utførelseseksempler og under henvisning til de vedføyde tegninger, hvorpå: The invention will now be described in more detail with the help of design examples and with reference to the attached drawings, after which:

Fig. 1 viser en i og for seg kjent sedimenteringskolonne Fig. 1 shows a sedimentation column known per se

for separering av sædceller under termisk motstrøms-konveks jon . for the separation of sperm cells during thermal counter-current convection.

Fig. 2 er en skjematisk skisse som anskueliggjør sedi-menteringskolonnens virkemåte. Fig. 3 viser et konveksjons- og galvaniseringsapparat i henhold til oppfinnelsen. Fig. 4 viser en foretrukket utførelse hvor sedimenteringskolonnen i fig. 1 og galvaniseringsapparatet i fig. 3 er kombinert. Fig. 2 is a schematic sketch which illustrates the mode of operation of the sedimentation column. Fig. 3 shows a convection and galvanizing apparatus according to the invention. Fig. 4 shows a preferred embodiment where the sedimentation column in fig. 1 and the galvanizing apparatus in fig. 3 are combined.

I fig. 1 er det vist en sedimenteringskolonne 1 for ut-førelse av en sedimentering på kjent måte under termisk motstrømskonveksjon. Sedimenteringskolonnen 1 inneholder det tidligere nevnte universalmedium 3 samt både x-sædceller og y-sædceller oppslemmet i dette medium, og er omgitt av en vannkappe 5 som en første vannstrøm pumpes gjennom 7 av en vannpumpe 9. Vannet trekkes ut gjennom en vanntank 11 In fig. 1 shows a sedimentation column 1 for carrying out a sedimentation in a known manner during thermal countercurrent convection. The sedimentation column 1 contains the previously mentioned universal medium 3 as well as both x-sperm cells and y-sperm cells suspended in this medium, and is surrounded by a water jacket 5 through which a first flow of water is pumped 7 by a water pump 9. The water is extracted through a water tank 11

hvor vannets temperatur kan reguleres av temperaturregulerings-utstyr 13. Dette utstyret kan omfatte et kjøleelement med nøyaktig termostatisk styring. Inne i mediet 3 er det vist en annen vannkappe 15 som forløper koaksialt med sedimenteringskolonnen 1 og er utstyrt med innløp 17 og utløp 19. En annen vannstrøm 21 flyter gjennom vannkappe 15 og kan ved hjelp av organer 22 pumpes gjennom vanntanken 25, where the temperature of the water can be regulated by temperature control equipment 13. This equipment can include a cooling element with precise thermostatic control. Inside the medium 3, another water jacket 15 is shown which runs coaxially with the sedimentation column 1 and is equipped with inlet 17 and outlet 19. Another water stream 21 flows through water jacket 15 and can be pumped through the water tank 25 with the help of organs 22.

idet vannets temperatur styres av separate organer 26. as the temperature of the water is controlled by separate organs 26.

I det tilfellet temperaturen av vannstrømmen 7 er den samme som for vannstrømmen 21, vil hele mediet inne i sedimenteringskolonnen befinne seg ved samme temperatur. Hvis imidlertid en temperaturforskjell opprettes mellom de to vannstrømmer, vil dette resultere i en termisk motstrøms-kojiveksjon i det medium som befinner seg i sedimenteringskolonnen. Det vil naturligvis forstås at andre flytende varmeutvekslingsmedier kan anvendes i stedet for vann. In the event that the temperature of the water stream 7 is the same as that of the water stream 21, the entire medium inside the sedimentation column will be at the same temperature. If, however, a temperature difference is created between the two water streams, this will result in a thermal counter-flow cojevction in the medium located in the sedimentation column. It will of course be understood that other liquid heat exchange media can be used instead of water.

En innløpsinnretning 2 3 er anordnet for innføring av sædceller i det medium som befinner seg i sedimenteringskolonnen, mens en utløpsinnretning 25 er anordnet for eventuelt å ta ut spermafraksjoner med hovedsakelig en og samme kromosomtype etter fullført sedimentering, An inlet device 2 3 is arranged for the introduction of sperm cells into the medium located in the sedimentation column, while an outlet device 25 is arranged to possibly take out sperm fractions with essentially one and the same chromosome type after completion of sedimentation,

samt oppsamling av disse fraksjoner i beholderen 27. as well as collection of these fractions in the container 27.

For å kunne følge sedimenteringsprosessens forløp og bestemme nivåplassering og konsentrasjon av de forskjellige typer sædceller innenfor mediet, er det anordnet utstyr for avsøkning av sedimenteringskolonnen over hele dens lengde, samt for herunder å bestemme relativ gjennom-skinnelighet for de forskjellige deler av kolonnen. Dette utstyret er detaljert beskrevet i US-patentskrift nr. 3.976.197 som utgjør en bakgrunn for foreliggende oppfinnelse. In order to be able to follow the course of the sedimentation process and determine the level location and concentration of the different types of sperm cells within the medium, equipment is provided for scanning the sedimentation column over its entire length, as well as for determining relative translucency for the different parts of the column. This equipment is described in detail in US Patent No. 3,976,197, which forms the background for the present invention.

Det således beskrevede apparat er i stand til effektivt The apparatus thus described is capable of effective

å frembringe den ønskede termiske motstrømskonveksjon samt også bestemme nivåplasseringen og konsentrasjonen av de separerte x- og y-sædceller. to produce the desired thermal countercurrent convection and also to determine the level location and concentration of the separated x and y sperm.

I fig. 3 er det vist en skisse av en foretrukket utførelse av et konveksjons- og galvaniseringsapparat for utførelse av fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse, idet den ubalanserte spermapopulasjon som frembringes ved den ovenfor angitte sedimentering ved termisk motstrømskonveksjon, ytterligere separeres og konsentreres. Selv om tvungen konveksjon er angitt anvendt i den følgende beskrivelse, In fig. 3 shows a sketch of a preferred embodiment of a convection and galvanization apparatus for carrying out the method according to the present invention, the unbalanced sperm population produced by the above-mentioned sedimentation by thermal countercurrent convection being further separated and concentrated. Although forced convection is indicated as used in the following description,

vil det forstås at termisk konveksjon også kan anvendes innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse. it will be understood that thermal convection can also be used within the scope of the present invention.

Ved henvisningstallet 71 er det generelt angitt en elektroforesecelle utstyrt med en midtre kolonne 73 med tvungen konveksjon, samt to bøyde rør 75 og 77 i kommunikasjon med konveksjonskolonnen og med innhold av henholdsvis positiv og negativ elektrode 79 og 81. Disse rør, som således inneholder henholdsvis en anode og katode, står i forbindelse med kolonnen for tvungen konveksjon på hver sin side av kolonnen, for derved å oppnå størst mulig adskillelse av motsatt ladede sædceller under påvirkning av galvaniske krefter. Konveksjonsrøret 73 består av et øvre avsnitt som er betegnet med 83 og et nedre avsnitt som er betegnet med 85, idet det øvre avsnitt i foreliggende tilfelle har en diameter på 1 cm og er betraktelig smalere enn det nedre avsnitt, som har en diameter på 1,5 cm i foreliggende tilfelle. Den nedre ende av konveksjonsrøret er utstyrt med en innløpsinnretning 87 for tilslutning til en peristaltisk pumpe 89 gjennom rør 81, varmeutvekslings-utstyr 129 samt rør 92. Pumpen er gjennom rør 93 forbundet med utløpet for et sædvæske-reservoar 95, som kan være en Erlenmeyer-beholder. Sædvæske-reservoarets innløp er i sin tur forbundet med rør 97 som står i forbindelse med et utløp 99 ved den øvre enden av konveksjonsrøret 73. Reservoaret 95 er videre utstyrt med et innløp 101 for inn-føring av en sædblanding som inneholder en ubalansert spermapopulasjon av x- og y-sædceller.Varm vekslingsutstyret 129 er anordnet nær inntil innløpsinnretningen 87. Temperaturen av det medium som strømmer gjennom cellen kan således reguleres med det formål å holde sædcellene i lammet tilstand og på lavt metabolisk nivå. Reference number 71 generally indicates an electrophoresis cell equipped with a central column 73 with forced convection, as well as two bent tubes 75 and 77 in communication with the convection column and containing respectively positive and negative electrodes 79 and 81. These tubes, which thus contain respectively an anode and cathode, are connected to the column for forced convection on either side of the column, thereby achieving the greatest possible separation of oppositely charged sperm cells under the influence of galvanic forces. The convection tube 73 consists of an upper section designated by 83 and a lower section designated by 85, the upper section in the present case having a diameter of 1 cm and being considerably narrower than the lower section, which has a diameter of 1 .5 cm in the present case. The lower end of the convection tube is equipped with an inlet device 87 for connection to a peristaltic pump 89 through tube 81, heat exchange equipment 129 and tube 92. The pump is connected through tube 93 to the outlet of a seminal fluid reservoir 95, which can be an Erlenmeyer -container. The seminal fluid reservoir's inlet is in turn connected to pipe 97 which is connected to an outlet 99 at the upper end of the convection pipe 73. The reservoir 95 is further equipped with an inlet 101 for the introduction of a semen mixture containing an unbalanced sperm population of x and y sperm cells. The heat exchange equipment 129 is arranged close to the inlet device 87. The temperature of the medium flowing through the cell can thus be regulated with the aim of keeping the sperm cells in a paralyzed state and at a low metabolic level.

Tilordnet elektroforesecellen 71 foreligger videre en krafttilførselsenhet som generelt er betegnet ved henvisningstallet 103 og omfatter en likestrømskilde eller en likeretter 105 som kan tilsluttes et hvilket som helst standard vekselstrømuttak, idet krafttilførselens utgang kan styres ved hjelp av et potensiometer 107 for å frembringe en hvilket som helst ønsket spenning målt av voltmeteret 109. Et amperemeter 111 er også anordnet for overvåkning av den strøm som flyter gjennom elektroforesecellen og ledningene 113 og 115 som er tilsluttet henholdsvis anode og katode i celle. For å kunne utføre galvanisk separasjon under konveksjon av sædceller som inneholder henholdsvis x- og y-kromosom i ønsket grad, tas de frembragte fraksjoner ut gjennom utløpene 117 og 119, som står i forbindelse med de bøyde rør som inneholder henholdsvis anoden 79 og katoden 81. Den mediumfraksjonen som tas ut gjennom ventilen 117 fra den cellegren som inneholder anoden 79, vil hovedsakelig omfatte sædceller med y-kromosomer, da disse celler er blitt trukket til den positive anode på grunn av sitt negative overflatepotensial. Den andel av mediet, som tas ut gjennom utløpet 114 Assigned to the electrophoresis cell 71 there is also a power supply unit which is generally denoted by the reference number 103 and comprises a direct current source or a rectifier 105 which can be connected to any standard alternating current outlet, the output of the power supply can be controlled by means of a potentiometer 107 to produce any desired voltage measured by the voltmeter 109. An ammeter 111 is also arranged for monitoring the current flowing through the electrophoresis cell and the wires 113 and 115 which are connected respectively to the anode and cathode in the cell. In order to be able to carry out galvanic separation during convection of sperm cells containing respectively x and y chromosomes to the desired extent, the produced fractions are taken out through the outlets 117 and 119, which are in connection with the bent tubes containing the anode 79 and the cathode 81 respectively The medium fraction taken out through the valve 117 from the cell branch containing the anode 79 will mainly comprise sperm cells with y-chromosomes, as these cells have been drawn to the positive anode due to their negative surface potential. The proportion of the medium which is taken out through the outlet 114

i forbindelse med den cellegren som inneholder katoden 81, inneholder overveiende sædceller med x-kromosom, idet disse celler er blitt trukket til den negative katode på grunn av sitt positive overflatepotensial. Det vil bemerkes at de avsnitt av de elektrodeomsluttende cellegrener som er vist ved 121 og 123 er noe mindre enn 1 cm i diameter, mens de avsnitt av disse cellegrener som direkte omslutter elektrodene og er vist med 125 og 127, er videre, nemlig 1,5 cm. Den foreliggende innsnevring av de horisontale avsnitt av cellegrenene 121 og 123, likesom den lille innsnevring av den øvre del av konveksjonsrøret 8 3 i forhold til den nedre del 85 av dette rør, er funnet å bidra både til frembringelse av en konveksasjons-sirkulasjon innenfor det nedre avsnitt 85 av konveksjons-røret og til å lette innføring av y- og x-sædceller i elektroderørene 75 og 77. in connection with the branch of cells containing the cathode 81, contains predominantly x-chromosome sperm cells, these cells having been drawn to the negative cathode due to their positive surface potential. It will be noted that the sections of the electrode-enclosing cell branches shown at 121 and 123 are somewhat less than 1 cm in diameter, while the sections of these cell branches which directly enclose the electrodes and are shown at 125 and 127 are further, namely 1, 5 cm. The present narrowing of the horizontal sections of the cell branches 121 and 123, as well as the slight narrowing of the upper part of the convection tube 83 in relation to the lower part 85 of this tube, have been found to contribute both to the production of a convection circulation within the lower section 85 of the convection tube and to facilitate the introduction of y and x sperm into the electrode tubes 75 and 77.

Ved en alternativ utførelse av foreliggende oppfinnelse kan sedimenteringsapparatet og galvaniseringsapparatet kombi-neres, slik som vist i fig. 4. I fig. 4 er alle de elementer som tidligere er beskrevet i forbindelse med sedimenteringskolonnen med termisk motstrømskonveksjon identisk med de tilsvarende elementer som er vist i fig. 1. Følgende tillegg er imidlertid gjort til apparatet. In an alternative embodiment of the present invention, the sedimentation apparatus and the galvanizing apparatus can be combined, as shown in fig. 4. In fig. 4, all the elements previously described in connection with the sedimentation column with thermal countercurrent convection are identical to the corresponding elements shown in fig. 1. However, the following additions have been made to the apparatus.

Sedimenteringskolonnen 1 er utstyrt med to bøyde glassrør 141 og 143, som står i forbindelse med kolonnen i forskjellige høydenivåer. Disse glassrør inneholder henholdsvis en anode 145 og en katode 147, og er utstyrt med hvert sitt utløp, henholdsvis 149 og 151. Likestrømseffekt kan tilføres ved hjelp av tilsvarende midler som er vist ved 103 i fig. 3. Det vil være klart at sedimenteringskolonnen 1 i denne ut-førelse utfører samme funksjon som konveksjonskolonnen 73 i fig. 3. The sedimentation column 1 is equipped with two bent glass tubes 141 and 143, which are connected to the column at different height levels. These glass tubes respectively contain an anode 145 and a cathode 147, and are each equipped with a separate outlet, respectively 149 and 151. Direct current power can be supplied by means of corresponding means which are shown at 103 in fig. 3. It will be clear that the sedimentation column 1 in this embodiment performs the same function as the convection column 73 in fig. 3.

Som tidligere nevnt, er det foretrukkede medium for anvendelse i sedimenteringskolonnen under utførelse av oppfinnelsens fremgangsmåte det universalmedium som er beskrevet i US patentskrift nr. 3.816.249. Dette medium pmfatter en blanding av glysin, ct-amino-propionsyre og eggeplomme i andeler som er virksomme i vandig løsning for forlengelse av sædcellenes liv. Den foretrukkede sammensetning av dette medium omfatter en vandig løsning med pH-verdi i området fra omkring 6,0 til 8,0, samt inneholder, regnet i vekt%, fra omkring 0,01 til 1,0% glysin, fra omkring 0,01 til 1,0% ct-aminopropionsyre, fra omkringO-,-1 til 2,0% natriumklorid, kaliumklorid eller kalsiumklorid, fra omkring 30 til omkring 55% eggeplomme, samt fra omkring 30 til omkring 70% vann, idet denne blanding filtreres gjennom et filter med maskestørrelse 0, 2 ja. As previously mentioned, the preferred medium for use in the sedimentation column during execution of the method of the invention is the universal medium described in US Patent No. 3,816,249. This medium contains a mixture of glycine, ct-amino-propionic acid and egg yolk in proportions which are effective in aqueous solution for prolonging the life of sperm cells. The preferred composition of this medium comprises an aqueous solution with a pH value in the range from about 6.0 to 8.0, and contains, calculated in weight%, from about 0.01 to 1.0% glycine, from about 0, 01 to 1.0% ct-aminopropionic acid, from about 0.01 to 2.0% sodium chloride, potassium chloride or calcium chloride, from about 30 to about 55% egg yolk, and from about 30 to about 70% water, this mixture being filtered through a filter with mesh size 0.2 yes.

Osmoseevnen for dette universalmedium ligger i området fra omkring 250 til 350 mos/kg. Skjønt dette medium er å fore-trekke, er det likevel mulig å utføre oppfinnelsens fremgangsmåte med andre partikkelfrie medier av hensiktsmessig sammensetning, samt særlig medier med hensiktsmessig pH-verdi og ionisk ledningsevne for galvaniseringstrinnet i foreliggende fremgangsmåte. The osmosis capacity of this universal medium lies in the range from around 250 to 350 mos/kg. Although this medium is preferable, it is nevertheless possible to carry out the method of the invention with other particle-free media of appropriate composition, as well as in particular media with an appropriate pH value and ionic conductivity for the electroplating step in the present method.

Frisk sperma, som inneholder like mengder av x- og y-sædceller, oppsamles fra hanndyr og blandes umiddelbart med universalmediet ved 22°C. Denne spermablanding utspes videre til en konsentrasjon på 30 millioner celler pr. milliliter og kontrolleres mikroskopisk med hensyn på blandings-kvalitet. Fresh sperm, containing equal amounts of x and y sperm, are collected from male animals and immediately mixed with the universal medium at 22°C. This sperm mixture is further diluted to a concentration of 30 million cells per milliliters and is checked microscopically with regard to mixture quality.

Spermablandingens temperatur senkes så gradvis til 15°C The temperature of the sperm mixture is then gradually lowered to 15°C

og innføres derpå i en sedimenteringskolonne, for eksempel i kolonnen 1 i figur 1. Den ytre vannstrøm 7 (fig. 1) bibeholdes ved en temperatur på 3,5°C under hele prosessen, mens vannstrømmen 21 som føres gjennom den koaksiale vannkappe 15 har en temperatur på 10°C i en halv time og senkes derpå til 3/5°c i løpet av en ytterligere halv time, and is then introduced into a sedimentation column, for example in column 1 in Figure 1. The outer water flow 7 (Fig. 1) is maintained at a temperature of 3.5°C throughout the process, while the water flow 21 which is passed through the coaxial water jacket 15 has a temperature of 10°C for half an hour and then lowered to 3/5°c during a further half hour,

ved ganske enkelt å avbryte strømningen gjennom det koaksiale kapperør. Det bør forstås at temperaturene ovenfor bare er angitt som typiske eksempler. I praksis kan vedkommende prosess utføres ved hvilken som hels temperatur som er tilstrekkelig lav til å hindre sperma-cellenes aktivitet fra å påvirke sedimenteringsprosessen. Under den periode hvor det foreligger temperaturforskjell mellom indre og ytre del av mediet i sedimenteringskolonnen, finner det sted en termisk motstrømskonveksjon som er skjematisk vist ved 55 i fig. 2, idet denne strøm frembringer den ønskede positive oppdriftskraft i denne utførelse. Sedimentering under tyngdekraftpåvirkning representerer den negative oppdrift, og fortsetter når nevnte temperaturforskjell er blitt 0 og mediets strømningsbevegelse opphører. Det tar en 1/2 til 8 timer å oppnå tilfredsstillende separasjon etter innføringen av spermablandingen i det universalmedium som inneholdes i sedimenteringskolonnen. Under denne periode bestemmes fordelingen av sperma i sedimenteringskolonnen ved forskjellige tidspunkter, slik som vist ved 57, 59, 61 og 63 i figur 2, fortrinnsvis ved hjelp av det laser-avsøkningssystemet som er beskrevet i detalj i US patentskrift nr. 3. 976.197. Når konveksjonssepareringen opphører, vil konsentrasjonen ved sedimentering likevel fortsette, idet både lettere og tyngre sperma trekkes mot kolonnens bunn. Ved anvendelse av en diagramskriver 51 til-koblet laser-avsøkningsutstyret 33, kan fordelingen av sperma ved forskjellige tidspunkter innenfor separerings-perioden registreres og observeres. Når fordelingen betraktes som tilfredsstillende, kan utløpsinnretningen 25 åpnes for å tillate vedkommende væske å dryppe ned i beholderen 27 i en takt på omtrent 20 dråper pr. minutt. by simply interrupting the flow through the coaxial jacket tube. It should be understood that the above temperatures are given as typical examples only. In practice, the process in question can be carried out at any temperature that is sufficiently low to prevent the activity of the sperm cells from affecting the sedimentation process. During the period where there is a temperature difference between the inner and outer part of the medium in the sedimentation column, a thermal countercurrent convection takes place, which is schematically shown at 55 in fig. 2, as this current produces the desired positive buoyancy force in this embodiment. Sedimentation under the influence of gravity represents the negative buoyancy, and continues when said temperature difference has become 0 and the medium's flow movement ceases. It takes 1/2 to 8 hours to achieve satisfactory separation after the introduction of the sperm mixture into the universal medium contained in the sedimentation column. During this period, the distribution of sperm in the settling column is determined at various times, as shown at 57, 59, 61 and 63 in Figure 2, preferably by means of the laser scanning system described in detail in US Patent No. 3,976,197. When the convection separation ceases, concentration by sedimentation will nevertheless continue, as both lighter and heavier sperm are drawn towards the bottom of the column. By using a chart recorder 51 connected to the laser scanning equipment 33, the distribution of sperm at different times within the separation period can be registered and observed. When the distribution is considered satisfactory, the outlet device 25 can be opened to allow the relevant liquid to drip into the container 27 at a rate of approximately 20 drops per second. minute.

Den første fraksjon som tas ut fra sedimenteringskolonnen vil hovedsakelig inneholde de tyngre sædceller med x-kromosom, mens påfølgende fraksjoner etter hvert vil inneholde færre x-sædceller og flere y-sædceller, inntil den siste fraksjon som opptas hovedsakelig vil inneholde bare sædceller med y-kromosom. Ved dette tidspunkt er det mulig å sentrifugere hver for seg den lettere fraksjon som inneholder y-kromosom, samt den tyngre fraksjon som inneholder x-kromosom, for derved å konsentrere og ytterligere rendyrke disse produkter. Både x- og y-fraksjonen kan ved dette punkt i prosessen anvendes for inseminasjon. Det er imidlertid ønskelig å ytterligere konsentrere og rendyrke fraksjonene med innhold av henholdsvis x- og y-kromosom ved galvanisering under tvungen konveksjon, slik som beskrevet nedenfor. The first fraction taken from the sedimentation column will mainly contain the heavier sperm cells with an x-chromosome, while subsequent fractions will gradually contain fewer x-sperm cells and more y-sperm cells, until the last fraction taken up will mainly contain only sperm cells with a y- chromosome. At this point, it is possible to separately centrifuge the lighter fraction containing the y-chromosome, as well as the heavier fraction containing the x-chromosome, thereby concentrating and further purifying these products. Both the x and y fractions can be used for insemination at this point in the process. However, it is desirable to further concentrate and purify the fractions containing x- and y-chromosomes, respectively, by electroplating under forced convection, as described below.

Etter fjerning av den ønskede mediumfraksjon fra sedimenteringsapparatet med innhold av en ubalansert spermapopulasjon med hensyn til x- og y-kromosomer, blandes vedkommende fraksjon, som fortrinnsvis er av størrelsesorden omtrent 50 cm"^, med 150 cm^ fersk medium ved 3 til 5°C. Denne blandingen tilføres Erlenmeyer-beholderen 95 i fig. 3 og den peristaltiske pumpe 89 innstilles til en meget lav pumpetakt og driver fluid fra Erlenmeyerbeholderen inn 1 midten av konveksjonskolonnen gjennom innløpsinnretningen After removal of the desired medium fraction from the sedimentation apparatus containing an unbalanced sperm population with respect to x and y chromosomes, the relevant fraction, which is preferably of the order of about 50 cm"^, is mixed with 150 cm^ of fresh medium at 3 to 5° C. This mixture is fed to the Erlenmeyer vessel 95 in Fig. 3 and the peristaltic pump 89 is set to a very low pump stroke and drives fluid from the Erlenmeyer vessel into the center of the convection column through the inlet device

87. Hele elektroforesecellen med sidegrener 75 og 77 så 87. The entire electrophoresis cell with side branches 75 and 77 so

vel som konveksjonskolonnen 73, har tidligere blitt fylt med fersk medium ved den ønskede temperatur, som opprett-holde* ved hjelp av varmevekslingsutstyret 129 og pumpen 89. Etter hvert som universalmediet med innhold av sædvæske drives gjennom innløpsinnretningen 87 til midtområdet av røret, vil den smalere del av konveksjonskolonnen som er vist ved 83, frembringe en tilbakestrømning i motsatt retning, hvilket lettes av den videre del av røret ved 85, således at det frembringes en konveksjonssirkulasjon som angitt ved 3 piler i den lavere del av konveksjonsrøret 73. Denne konveksjon fører motsatt ladede sædceller forbi åpningene til siderørene 75 og 77, som inneholder henholdsvis anode og katode for elektroforesecellen. Effektforsyningen 105 settes i gang og potensiometret 107 anvendes for nøyaktig innstilling av den ønskede spenning og strøm i systemet. Skjønt den anvendte spenning i henhold til foreliggende oppfinnelse kan ligge hvor som helst i området 1 til omkring 5 volt, med strømstyrke av størrelsesorden flere hundre mikroamper, ligger det foretrukkede spenningsområdet fra omkring as well as the convection column 73, has previously been filled with fresh medium at the desired temperature, which is maintained* by means of the heat exchange equipment 129 and the pump 89. As the universal medium containing seminal fluid is driven through the inlet device 87 to the middle area of the tube, it will narrower part of the convection column shown at 83 produces a backflow in the opposite direction, which is facilitated by the wider part of the tube at 85, so that a convection circulation is produced as indicated by 3 arrows in the lower part of the convection tube 73. This convection leads oppositely charged spermatozoa past the openings of the side tubes 75 and 77, which contain the anode and cathode respectively of the electrophoresis cell. The power supply 105 is started and the potentiometer 107 is used to accurately set the desired voltage and current in the system. Although the voltage used in accordance with the present invention may be anywhere in the range of 1 to about 5 volts, with amperage on the order of several hundred microamps, the preferred voltage range is from about

2 til omkring 4 volt galvanisk kraft, som frembringer en strøm fra omkring 100 til omkring 400 mikroamper avhengig av ione-konsentrasjonen i det anvendte medium. Den nedre grense for det anvendbare spenningsområdet er i praksis den spenning som er nødvendig for å frembringe vesentlig vandring av spermaceller mot sine respektive elektroder innenfor et praktisk rimelig tidsrom, mens den øvre grensespenning utgjøres av en spenningsverdi som ikke varig vil påvirke spermacellenes bevegelighet eller virilitet. Det bør bemerkes at den sirkulerende fluid i systemet inneholder en relativt lav konsentrasjon av sperma (ca. 15 millioner sædceller pr. cm 3), idet denne lave konsentrasjon forhindrer sammenklumpning av sædceller som beveger seg i motsatt retning i det galvaniske felt. 2 to about 4 volts of galvanic force, producing a current of about 100 to about 400 microamps depending on the ion concentration in the medium used. The lower limit of the applicable voltage range is, in practice, the voltage that is necessary to produce substantial migration of sperm cells towards their respective electrodes within a practically reasonable period of time, while the upper limit voltage is constituted by a voltage value that will not permanently affect the sperm cells' motility or virility. It should be noted that the circulating fluid in the system contains a relatively low concentration of sperm (approx. 15 million sperm cells per cm 3 ), as this low concentration prevents clumping of sperm cells moving in the opposite direction in the galvanic field.

Etter påtrykning og innstilling av spenningen på elektrodene 79 og 81, utsettes de sirkulerende sædceller i konveksjonskolonnen for galvaniske krefter. Disse galvaniske krefter forsterkes ved anvendelse av et medium med hensiktsmessig pH-verdi og ionekonsentrasjon i elektroforesecellen. Selv om media med pH-verdi fra omkring 6,9 til 8,0 kan anvendes i henhold til foreliggende oppfinnelse, er det funnet at den effektive elektriske potensialforskjell mellom de respektive celleoverflater for henholdsvis x- og y-sædceller særlig fremheves i et medium med pH-verdi fra omkring 6,8 After pressing and setting the voltage on the electrodes 79 and 81, the circulating sperm cells in the convection column are exposed to galvanic forces. These galvanic forces are amplified by using a medium with an appropriate pH value and ion concentration in the electrophoresis cell. Although media with a pH value of from about 6.9 to 8.0 can be used according to the present invention, it has been found that the effective electrical potential difference between the respective cell surfaces for x- and y-sperm cells, respectively, is particularly accentuated in a medium with pH value from around 6.8

til omkring 7,9. to around 7.9.

Som tidligere bemerket, er mediets ionekonsentrasjon eller osmoseevne også av betydning ved den foreliggende prosess, As previously noted, the ion concentration or osmotic capacity of the medium is also of importance in the present process,

og skjønt blandinger med osmoseevne fra omkring 200 til omkring 400 mos/kg, eller innenfor et ennå større område kan anvendes, foretrekkes verdier fra 250 til 350 mos/kg, and although mixtures with an osmotic capacity of from about 200 to about 400 mos/kg, or within an even larger range can be used, values from 250 to 350 mos/kg are preferred,

og den osmoseevne som er funnet å være mest hensiktsmessig i forbindelse med foreliggende utførelse er omkring 300 mos/kg. and the osmosis ability which has been found to be most appropriate in connection with the present embodiment is about 300 mos/kg.

Ved galvanisering under tvungen konveksjon, oppfanges det hydrogen og oksygen som avgis ved de respektive elektroder ved den øvre enden av de bøyde siderør 75 og 77, hvorfra gassene lett kan unnslippe og blandes med et sirkulerende fluid. Dette er en klar fordel fremfor andre behandlings-celler, hvor skadelig hydrogen og oksygen kan påvirke sædcellen på uheldig måte. Den langsomme sirkulasjon av medium gjennom elektroforesecellen, slik som beskrevet ovenfor, bibeholdes inntil det er oppnådd en ønsket separeringsgrad, hvilket i den foreliggende utførelse kan ta omkring 30 minutter for hver behandlet fraksjon. Etter at separeringen er full-ført i ønsket grad, stoppes sirkuleringen og effektforsyningen til elektrodene avbrytes. De ønskede maskuline og feminine mediumfraksjoner tas ut fra de to elektroderør gjennom utløp 117 og 119, idet den mediummengde som trekkes ut omhyggelig reguleres på sådan måte at vesentlige mengder av den mediumandel som fremdeles sirkuleres i det midtre kon-veks jonsrør ikke trekkes ut. Væsken fra midtkolonnen kan deretter drives tilbake til beholderen. In galvanizing under forced convection, the hydrogen and oxygen emitted at the respective electrodes are captured at the upper end of the bent side pipes 75 and 77, from which the gases can easily escape and mix with a circulating fluid. This is a clear advantage over other treatment cells, where harmful hydrogen and oxygen can adversely affect the sperm cell. The slow circulation of medium through the electrophoresis cell, as described above, is maintained until a desired degree of separation is achieved, which in the present embodiment can take about 30 minutes for each treated fraction. After the separation has been completed to the desired extent, the circulation is stopped and the power supply to the electrodes is interrupted. The desired masculine and feminine medium fractions are taken out from the two electrode tubes through outlets 117 and 119, the amount of medium that is extracted being carefully regulated in such a way that significant amounts of the medium proportion that is still circulated in the central convection tube are not extracted. The liquid from the center column can then be driven back to the container.

Som et alternativ til den ovenfor beskrevede prosess, kan væske fra midtområdet av kolonnen først trekkes ut og tilføres Erlenmeyerbeholderen, idet det er nødvendig i dette tilfellet å sikre at all separert spermapopulasjon er blitt trukket mot elektrodene forbi de bøyde grener av siderørene 75 og 77, således at når medium trekkes ut fra midtkolonnen, vil de medium-bestanddeler som strømmer ut av siderørseksjonene 121 og 123, ikke inneholde vesentlige mengder av separerte spermapopulasjoner som kan oppblandes ved strømning tilbake til den midtre konveksjonskolonne. Fraksjonene i de nedre delene av sidegrenene, hvilket vil As an alternative to the process described above, liquid from the middle region of the column may first be withdrawn and added to the Erlenmeyer flask, it being necessary in this case to ensure that all separated sperm population has been drawn towards the electrodes past the bent branches of the side tubes 75 and 77, so that when medium is withdrawn from the central column, the medium constituents flowing out of the side tube sections 121 and 123 will not contain significant amounts of separated sperm populations which can be mixed up by flow back to the central convection column. The fractions in the lower parts of the side branches, which will

si områdene 125 og 127, kan da tas ut gjennom utløpene 117 og 119. say the areas 125 and 127, can then be taken out through the outlets 117 and 119.

I det tilfellet det kombinerte sedimenterings- og galvaniseringsapparat som er vist i figur 4 anvendes, følges omtrent samme fremgangsmåte som beskrevet ovenfor, men naturligvis uten at det er nødvendig å overføre spermaceller fra et apparat til et annet. In the case where the combined sedimentation and galvanization apparatus shown in figure 4 is used, approximately the same procedure as described above is followed, but of course without the need to transfer sperm cells from one apparatus to another.

Etter at sedimenteringen ved termisk motstrømskonveksjon er fullført, nedsettes sirkulasjonstakten og galvaniske krefter påtrykkes elektrodene 145 og 147 i figur 4. En populasjon med overveiende celler med y-kromosom har samlet seg nær toppen av sedimenteringskolonnen, og idet disse sædceller har et negativt overflatepotensial, vil de ytterligere konsentreres ved å trekkes inn i siderøret 141 mot den positive anode 145. En populasjon av lignende art, men som overveier i x-sædceller og således har dominerende positiv ladning, befinner seg nær bunnen av kolonnen og konsentreres ytterligere ved å trekkes inn i siderøret 14 3 mot katoden 147. De ønskede fraksjoner kan så trekkes ut gjennom henholdsvis utløpet 149 og utløpet 151. Selv om de separerte fraksjoner kan behandles etter ønske, anvendes fortrinnsvis følgende fremgangsmåte. After the sedimentation by thermal countercurrent convection is complete, the circulation rate is reduced and galvanic forces are applied to the electrodes 145 and 147 in figure 4. A population of predominantly y-chromosome cells has gathered near the top of the sedimentation column, and as these sperm cells have a negative surface potential, they are further concentrated by being drawn into the side tube 141 towards the positive anode 145. A population of a similar nature, but which predominates in x-sperm cells and thus has a dominant positive charge, is located near the bottom of the column and is further concentrated by being drawn into the side pipe 14 3 towards the cathode 147. The desired fractions can then be extracted through outlet 149 and outlet 151, respectively. Although the separated fractions can be treated as desired, the following method is preferably used.

Like mengder av universalmedium (med innhold av omkring 20% glyserol) anvendes for utspedning av de fraksjoner som er tatt ut fra utløpene 117 og 119 til det ønskede volum og sædcelleantall, som fortrinnsvis ligger på omtrent 60 millioner celler pr. ml, hvorpå de fremstilte blandinger bibeholdes ved en temperatur på 5 til 8°C i 4-6 timer med det formål å utbalansere glyserolet med cellene. Det fremstilte material kan så innføres i ampuller på 1 ml, forsegles og merkes som maskulin eller feminin spermablanding, eller eventuelt nøytral blanding når det gjelder den fraksjon som trekkes ut fra det midtre konveksjonsrør. Ampullene fryses så og lagres i flytende nitrogen. Renhetsgraden av de maskuline og feminine fraksjoner som oppnås ved en ovenfor angitt fremgangsmåte, kan utprøves enten zerologisk ved frembringelse av anti-kropper eller de kan kontrolleres ved hjelp av B-kropper eller F-kropper. Det bør påpekes at spermafraksjoner som skriver seg direkte fra hvilken som helst av de ovenfor angitte utførelser eller kombinasjoner av disse, kan behandles på følgende måte. De lettere og tyngre fraksjoner fra sedimenteringskolonnen eller anode- Equal amounts of universal medium (with a content of around 20% glycerol) are used to dilute the fractions taken from outlets 117 and 119 to the desired volume and sperm count, which is preferably approximately 60 million cells per ml, after which the prepared mixtures are maintained at a temperature of 5 to 8°C for 4-6 hours with the aim of equilibrating the glycerol with the cells. The produced material can then be introduced into ampoules of 1 ml, sealed and labeled as masculine or feminine sperm mixture, or possibly neutral mixture in the case of the fraction extracted from the central convection tube. The ampoules are then frozen and stored in liquid nitrogen. The degree of purity of the masculine and feminine fractions obtained by a method indicated above can be tested either serologically by producing antibodies or they can be checked using B-bodies or F-bodies. It should be pointed out that sperm fractions obtained directly from any of the above embodiments or combinations thereof may be processed in the following manner. The lighter and heavier fractions from the settling column or anode

og katodefraksjoner fra galvaniseringsapparatet med tvungen konveksjon sentrifugeres gjentatte ganger med fersk medium med det formål å konsentrere og rendyrke de forskjellige and cathode fractions from the forced convection electroplating apparatus are repeatedly centrifuged with fresh medium with the aim of concentrating and purifying the various

spermatyper. Sedimentet av de tyngre fraksjoner og supernatanten av de lettere fraksjoner etter gjentatt sentrifugering og skylling antas å gi mest rene former av henholdsvis feminin og maskulin sperma. Den påfølgende prosess for zerologisk utprøvning utføres som beskrevet i US-patentskrift nr. 3.692.897, spalte 3, linjene 11 sperm types. The sediment of the heavier fractions and the supernatant of the lighter fractions after repeated centrifugation and rinsing are believed to give the purest forms of feminine and masculine sperm, respectively. The subsequent process for zerological testing is carried out as described in US Patent No. 3,692,897, column 3, lines 11

til og med 43, samt spalte 5, linjene 5 til og med 55. through 43, as well as column 5, lines 5 through 55.

Som et alternativ til det som er angitt ovenfor, kan renhetsgraden av separert og/eller ikke-separert sædvæske utprøves ved hjelp av en prøve med B-kropper. Denne prøve er basert på den erkjennelse av y-sædceller fra mennesker og primater har en .tendens til fluorescens med en spesiell lysstyrke etter farging med kinakrin-HCl eller kinakrin-sennep. Denne fargingsteknikk er enkel og alminnelig kjent på dette fagområdet. Skjønt det tidligere er gjort forsøk på å utvide denne teknikk med det formål å identifisere maskuline og feminine sædceller fra husdyr i tillegg til den nevnte identifisering av sædceller fra mennesker og primater, er mislykkede forsøk rapportert i mange tilfeller. En vellykket fremgangsmåte for farging av y-sædceller for andre arter ved denne metode er imidlertid overraskende blitt oppdaget. Etter anvendelse av forskjellige enzymer ved forskjellige konsentrasjoner, temperaturer og pH-verdier, ble papaya protease (tilgjenge-lig fra Sigma Chemicals, USA) funnet å være egnet for det formål å utføre en lignende funksjon kunstig på celle-membraner av sperma fra husdyr. As an alternative to what is indicated above, the degree of purity of separated and/or non-separated seminal fluid can be tested using a B-body sample. This test is based on the recognition that γ-sperm cells from humans and primates have a tendency to fluoresce with a particular brightness after staining with quinacrine-HCl or quinacrine-mustard. This staining technique is simple and generally known in this field. Although attempts have previously been made to extend this technique for the purpose of identifying male and female sperm from domestic animals in addition to the aforementioned identification of sperm from humans and primates, unsuccessful attempts have been reported in many cases. However, a successful method for staining γ-sperm cells for other species by this method has surprisingly been discovered. After using different enzymes at different concentrations, temperatures and pH values, papaya protease (available from Sigma Chemicals, USA) was found to be suitable for the purpose of performing a similar function artificially on the cell membranes of livestock sperm.

Den ovenfor angitte prosess utføres på følgende måte: The above process is carried out as follows:

Omtrent 1 ml sædvæske eller mediumblanding (med innhold Approximately 1 ml of seminal fluid or medium mixture (containing

fra omkring 20 millioner til 50 millioner celler) skylles med fysiologisk saltløsning og kan sentrifugeres 3 ganger ved 2500 gram i 15 minutter. Denne sentrifugering og skylling behøver ikke å være absolutt nødvendig, hvis den kommer i tillegg til den som først er beskrevet ovenfor. Etter utspedning av sedimentet med 1 milliliter av fersk fysiologisk saltløsning blandes i foreliggende utførelseseksempel 3 dråper av den frembragte suspensjon med 5 milligram protease og tillates tilpasning i omtrent 10 minutter ved romtemperatur. from around 20 million to 50 million cells) are rinsed with physiological salt solution and can be centrifuged 3 times at 2500 grams for 15 minutes. This centrifugation and rinsing need not be absolutely necessary, if it comes in addition to that first described above. After diluting the sediment with 1 milliliter of fresh physiological salt solution, in the present embodiment, 3 drops of the resulting suspension are mixed with 5 milligrams of protease and allowed to adapt for approximately 10 minutes at room temperature.

Deretter tilsettes 1 dråpe av 0,005% kinakrin-sennep til Then add 1 drop of 0.005% quinacrine mustard

1 dråpe av den tilpassede blanding, anbringes på en skive og monteres umiddelbart for mikroskopisk undersøkelse. Etter å ha gitt fargen 40 minutter til å trenge inn i den indre struktur av sædcellen, og denne prosess eventuelt lettes ved oppløsning av det ytre membran ved hjelp av protease, kan sædcellen betraktes med et Leitz Ortholux mikroskop ved anvendelse av KP-490 Eciter filter med en transmisjonsbølgelengde på 530 nanometer samt 2 varme-barrierer, nemlig HP 430 og HP 460. Sædceller fra mennesker behandlet på ovenfor angitte måte, kan anta en dyp fargetone uten at sperma med innhold av y-kromosom identifiseres. Sædceller fra okse og hest med y-kromosom oppviser imidlertid et distinkt lyspunkt med utmerket synbarhet (B-legeme), mens sperma med x-kromosom antar.en lite fremtredende og diffus fargetone. Ikke-behandlet sæd fra okse, hest og menneske, samt behandlet oksesæd er utprøvet med henblikk på B-legemer som en rutineprosess for bestemmelse av produktets separasjonsgrad i forbindelse med foreliggende oppfinnelse. Resultatet av 523 sådanne eksperimenter er angitt nedenfor i tabell 1, hvor resultatene av B-legeme-prøver er sammenlignet med resultatene av biologiske prøver. 1 drop of the appropriate mixture is placed on a slide and immediately mounted for microscopic examination. After giving the dye 40 minutes to penetrate the internal structure of the sperm, and this process possibly facilitated by dissolution of the outer membrane with the help of protease, the sperm can be viewed with a Leitz Ortholux microscope using the KP-490 Eciter filter with a transmission wavelength of 530 nanometers as well as 2 heat barriers, namely HP 430 and HP 460. Sperm cells from humans treated in the above-mentioned manner can assume a deep color tone without the sperm containing the y-chromosome being identified. Sperm cells from bulls and horses with a y-chromosome, however, show a distinct point of light with excellent visibility (B-body), while sperm with an x-chromosome assume an inconspicuous and diffuse hue. Untreated bull, horse and human semen, as well as treated bull semen, have been tested for B-bodies as a routine process for determining the degree of separation of the product in connection with the present invention. The results of 523 such experiments are set out below in Table 1, where the results of B-body samples are compared with the results of biological samples.

Det vil bemerkes at kombinasjonen av sedimentering ved motstrømskonveksjon og galvanisering under konveksjons-strømning frembringer som vist i linje 3 en betraktelig økning av produktets separasjonsgrad utover det som oppnås ved sedimentering i motstrømskonveksjon utført alene. It will be noted that the combination of sedimentation by countercurrent convection and galvanization under convection flow produces, as shown in line 3, a considerable increase in the degree of separation of the product beyond what is achieved by sedimentation in countercurrent convection carried out alone.

En annen metode for å identifisere maskulin sperma fra menneske og primater er F-legeme-prøven som er basert på det forhold at den ene arm av y-kromosomet i summatiske celler har en tendens til å fluoriscere med kinakrinfarge. Ubehandlet menneskelig sædvæske som underkastes en fargingsprosess for frembringelse av F-legeme er funnet å fremvise fluoriscering av omtrent halvparten av spermapopulasjonen. Skjønt en biologisk prøve er umulig i forbindelse med mennesker, er den åpenbare konklusjon som må trekkes at den fluoriscerende populasjon er synonym med det fluoriscerende symmatiske y-kromosom, og således at de fluoriscerende celler er celler som inneholder y-kromosom og derfor sædceller som vil kunne frembringe avkom av hannkjønn. Reproduserbarheten av sådanne Another method for identifying male sperm from humans and primates is the F-body test, which is based on the fact that one arm of the y chromosome in summatic cells tends to fluoresce with quinacrine dye. Untreated human seminal fluid subjected to a staining process for F-body production has been found to exhibit fluorescence of approximately half of the sperm population. Although a biological test is impossible in connection with humans, the obvious conclusion that must be drawn is that the fluorescent population is synonymous with the fluorescent symmetric y-chromosome, and thus that the fluorescing cells are cells containing the y-chromosome and therefore sperm that will could produce male offspring. The reproducibility of such

F-legeme-prøver er blitt verifisert og prøvene er nå F body samples have been verified and the samples are now

akseptert som en standardteknikk for å identifisere maskulin sperma i menneskelig sædvæske. accepted as a standard technique for identifying male sperm in human seminal fluid.

Ved anvendelse av sedimentering ved termisk motstrøms-konveksjons som først beskrevet ovenfor, kombinert med konveksjonsgalvanisering vil det trolig være mulig å unngå When using sedimentation by thermal countercurrent convection as first described above, combined with convection galvanizing, it will probably be possible to avoid

de aller tyngste og letteste sædceller eller sperma med abnormale feno-typiske egenskaper, som antas å utgjøre bare en liten andel av hele spermapopulasjonen, men er bærere av abnormale kromosomer som kan frembringe fødselsdefekter. Dette vil kunne redusere de tilfeller av Klinefelters og Turners syndromer samt autosomale defekter som forårsakes the very heaviest and lightest sperm or sperm with abnormal phenotypic characteristics, which are believed to make up only a small proportion of the entire sperm population, but are carriers of abnormal chromosomes that can produce birth defects. This will be able to reduce the cases of Klinefelter's and Turner's syndromes as well as autosomal defects that are caused

av manglende adskillelse og stillingsforskyvning av kromosomer. Dette er således mulig ved avvisning av defektive tyngre og lettere sperma eller sperma med uvanlig feno-typiske egenskaper som har sammenheng med det elektriske potensial på vedkommende cellers overflate. Som angitt tidligere, har denne elektriske potensialforskjell for celleoverflatene direkte sammenheng med kromosomstrukturen i hver celle og en omsorgsfull klassifisering av sperma i samsvar med sådanne elektriske potensialforskjeller kan således muliggjøre enkel påvisning og fjerning av uvanlige eller abnormale kromosomer. of non-separation and displacement of chromosomes. This is thus possible by rejecting defective heavier and lighter sperm or sperm with unusual phenotypic properties that are related to the electrical potential on the surface of the cells in question. As stated earlier, this electrical potential difference for the cell surfaces is directly related to the chromosome structure in each cell and a careful classification of sperm in accordance with such electrical potential differences can thus enable easy detection and removal of unusual or abnormal chromosomes.

Fra det som er angitt ovenfor, vil det være åpenbart at sedimentering i termisk motstrømskonveksjon kombinert med konveksjonsgalvanisering i henhold til oppfinnelsens fremgangsmåte kan finne anvendelse over alt hvor det er ønskelig å forutbestemme kjønnet for pattedyravkom. Kombinasjonen av de ovenfor angitte prosesser er av ytterst praktisk og kommer-siell viktighet når det gjelder å oppfylle de store fordringer som er oppstått i forbindelse med de stadig økende husdyrflokker, særlig kveg- og svineflokker, ved utvelgelse av avkom av hunkjønn. Dette tillater oppdretteren eller vedkommende gårdbruker å kunne velge et ønsket kjønn for dyrenes avkom. En kvegoppdretter kan således etter ønske velge om det fortrinnsvis skal frembringes mslkeproduserende kuer heller enn okser, eller om det på den annen side skal oppdrettes kjøtt-produserende okser heller enn kuer, alt etter som forholdene ligger til rette. From what has been stated above, it will be obvious that sedimentation in thermal countercurrent convection combined with convection galvanization according to the method of the invention can find application everywhere where it is desirable to predetermine the sex of mammalian offspring. The combination of the above-mentioned processes is of extremely practical and commercial importance when it comes to meeting the great demands that have arisen in connection with the ever-increasing herds of livestock, particularly cattle and pig herds, when selecting female offspring. This allows the breeder or the relevant farmer to be able to choose a desired gender for the animal's offspring. A cattle breeder can thus, as desired, choose whether milk-producing cows should preferably be bred rather than bulls, or whether, on the other hand, meat-producing bulls should be bred rather than cows, depending on the circumstances.

Når det gjelder menneskelige avkom, tillater foreliggende apparat normale foreldre å velge eller forutbestemme kjønnet for sine barn med det formål å raskt tilfredsstille et ønske om å få et barn av et bestemt kjønn, således at det i denne forbindelse også foreligger muligheter for å nedsette det totale antall barn i familien. Den påviste høye fruktbarhet for spermaceller som har gjennomgåttde angitte prosesser i henhold til foreliggende oppfinnelse vil vanligvis bidra til at det oppnås godt resultat ved kunstig inseminasjon. In the case of human offspring, the present apparatus allows normal parents to choose or predetermine the sex of their children with the aim of quickly satisfying a desire to have a child of a certain sex, so that in this connection there are also possibilities to reduce it total number of children in the family. The proven high fertility of sperm cells that have undergone the stated processes according to the present invention will usually contribute to good results being achieved by artificial insemination.

Når det gjelder foreldre som er bærere av skadelige gener, In the case of parents who are carriers of harmful genes,

vil dette innebære en sikker og klart definert metode for å will this involve a safe and clearly defined method to

gi dem økede muligheter for å oppnå å få et normalt barn ved å eliminere defektiv sperma med feno-typiske egenskaper utenfor det normale med hensyn til tetthet og overflatepotensial. give them increased chances of achieving a normal child by eliminating defective sperm with phenotypic characteristics outside of normal in terms of density and surface potential.

Oppfinnelsens fremgangsmåte kan imidlertid ikke gjøres til gjenstand for patentbeskyttelse når det gjelder sæd fra mennesker, da fremgangsmåten i dette tilfelle ikke er egnet for industriell utnyttelse. However, the method of the invention cannot be made the subject of patent protection when it comes to sperm from humans, as the method in this case is not suitable for industrial use.

Claims

1. Procedure for the separation of sperm cells with an X chromosome from sperm cells with a y chromosome in seminal fluid, from mammals, except humans, where seed fluids are added to a liquid suspension medium which is placed in a column where a convection circulation is produced in the medium between different parts of the column, characterized in that the suspension medium in convection circulation is exposed to a galvanic force effect with the help of an electric field which is applied between electrodes with electrical potential difference of 1 - 5 volts, preferably 2-4 volts, in contact with the circulating suspension medium in the column, so that sperm cells with mutually different surface potential are attracted to and can be taken out from each area around the respective electrodes. St

2. Method as stated in claim 1, characterized in that the liquid suspension medium in the column with the addition of seminal fluid is subjected to a separation process which produces an unbalanced population ratio between cells with an x-chromosome and cells with a y-chromosome within the liquid medium before it is exposed to said galvanic force influence.

3. Method as stated in claim 1 or 2, characterized in that the convection circulation is produced by forced flow of the suspension medium.

4. Method as stated in claim 1 or 2, characterized in that the convection circulation is produced by thermal influence of the suspension medium.

5. Method as set out in claim 2 -r- 4, characterized in that the separation process includes paralyzing the sperm cells by cooling the suspension medium with added seminal fluid, after which the sperm cells are exposed to both positive and negative buoyancy forces in order to thereby bring sperm cells with greater density to enter a different height level in the liquid suspension medium than sperm cells with lower density.

6. Procedure as stated in claim 5, characterized in that said positive and negative buoyancy forces are produced by means of a temperature difference between different areas of the suspension medium with added seminal fluid, with the aim of causing the sperm to circulate in a thermally produced countercurrent convection.

7. Method as stated in claims 1-6, characterized in that it further comprises centrifugation of the medium fraction which is taken out, in order to further purify the desired sperm cell type.

8. Method as stated in claims 2-7, characterized in that a suspension medium is used which comprises a mixture of glycine, O-amino-propionic acid and egg yolk in quantities which effectively contribute to increasing the lifespan of the cells in aqueous solution.

9. Method as stated in claims 1-8, characterized in that the ratio between sperm cells with an x-chromosome and sperm cells with a y-chromosome present in the extracted medium fraction is determined by subjecting said medium fraction to a sample with regard to B bodies.

10. Apparatus for separating sperm cells with an x-chromosome from sperm cells with a y-chromosome in a seminal fluid, the apparatus comprising a column (1.73) for convection circulation of a suspension medium with mixed seminal fluid between different parts of the column, characterized in that electrodes (79, 81, 145, 147) arranged to apply different electrical potentials are placed in each electrode compartment (125, 127, 141, 143) in communication with the column (1, 73) while outlet means (117, 119, and 149, 151) is arranged in connection with the respective electrode compartments for extracting sperm cells with mutually different surface potential from each electrode compartment (125,127,141,143).

11. Apparatus as stated in claim 10, characterized in that the column is a sedimentation column (1) which is in communication with the electrode spaces (141,143) over pipe sections at different height levels along the column.

12. Apparatus as stated in claim 11, characterized in that the column (73) comprises an upper part (83) and a lower part (85), with either the upper or the lower part having a smaller diameter than the other part, and the electrode spaces (125,127) communicate with the column at a location between the upper and lower parts.

13. Apparatus as stated in claims 10 - 12, characterized in that the column (73) comprises an inlet device (87) at its end and an outlet device (99) at its other end, while the device further comprises a pump (89) connected between the inlet and the outlet device for producing a forced convection flow of suspension medium with added seminal fluid through the column (73).

14. Apparatus as stated in claim 11, characterized in that it comprises equipment (29,31,33,39,51) for determining variations in the sperm cell distribution inside the sedimentation column (1).