NO144229B

NO144229B - DEVICE WITH RUBBER IMPLEMENTATION IN WALL.

Info

Publication number: NO144229B
Application number: NO753982A
Authority: NO
Inventors: Nils Raknes
Original assignee: Raufoss Ammunisjonsfabrikker
Priority date: 1975-11-26
Filing date: 1975-11-26
Publication date: 1981-04-06
Also published as: NO753982L; NO144229C

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av nye polypeptider med adrenocorticotrop virkning. Process for the production of new polypeptides with adrenocorticotropic action.

Gjenstanden for foreliggende oppfin-nelse er en fremgangsmåte til fremstilling av tetrakosapeptider med formel L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-L-lysyl-L-pro-pyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-propyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin, samt den tilsva-rende forbindelse, som i stedet for glutamylresten oppviser resten av glutaminet, og deres syreaddisjonssalter og tungmetallkomplekser, f. eks. slike av sink, kobber eller kobolt. The object of the present invention is a method for the production of tetracosa peptides with the formula L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyll -glycyl-L-lysyl-L-propyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-propyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl -L-tyrosyl-L-proline, as well as the corresponding compound, which instead of the glutamyl residue exhibits the remainder of the glutamine, and their acid addition salts and heavy metal complexes, e.g. such as zinc, copper or cobalt.

Oppfinnelsen omfatter særlig fremstilling av L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-me-tionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenyl-alanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-propyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin i ren form og den tungtoppløselige sinkkomplekse av denne forbindelse. The invention includes in particular the production of L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenyl-alanyl-L-arginyl-L-tryptophyll-glycyl-L-lysyl -L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-propyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline in pure form and the sparingly soluble zinc complex of this compound.

Disse forbindelser oppviser ved Sayers-prøven en adrenocorticotrop virkning på 106 ± 14 IE/mg. Sinkkomplekset har en prolongert virkning. In the Sayers test, these compounds show an adrenocorticotropic effect of 106 ± 14 IU/mg. The zinc complex has a prolonged effect.

De nye forbindelser har en høy adrenocorticotrop virkning og skal anvendes i human- og veterinærmedisinen som rene, ensartede stoffer i stedet for ACTH. For fremstilling av syntetiske corticotropinde-rivater med protrahert virkning er særlig The new compounds have a high adrenocorticotropic effect and are to be used in human and veterinary medicine as pure, uniform substances instead of ACTH. For the production of synthetic corticotropin derivatives with prolonged action is particular

(144229). (144229).

også den nevnte tungtoppløselige sinkkomplekse egnet. Forbindelsene kan videre anvendes som mellomprodukter til fremstilling av legemidler som inneholder en lengre kjede av aminosyre, slik som selve de adrenocorticotrope hormoner. the aforementioned sparingly soluble zinc complex is also suitable. The compounds can also be used as intermediates for the production of pharmaceuticals containing a longer chain of amino acids, such as the adrenocorticotropic hormones themselves.

De nye tetrakosapeptider fås ifølge de fremgangsmåter som er kjent for peptid-fremstillingen. The new tetracosa peptides are obtained according to the methods known for peptide production.

En fremgangsmåte består i at man kondenserer dekapeptidet L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionyl-L-glutamyl- (eller glutaminyl)-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycin med tetradekapeptidet L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin, slik som f. eks. i skjema fig. 1 for forbindelsen som som 5.aminosyre inneholder L-glutaminsyre. BOC betyr en ter-tiær butyloksykarbonylgruppe, tBu en ter-tiær butylgruppe og iBu en isobutylgruppe. Det som utgangsstoff anvendte dekapep-tid kan fremstilles ifølge fremgangsmåten som angitt i det belgiske patent nr. 604 570. Tetradekapeptidet får man f. eks. ifølge skjemaet i fig. 2. One method consists in condensing the decapeptide L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl- (or glutaminyl)-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyll-glycine with the tetradecapeptide L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L- tyrosyl-L-proline, such as e.g. in form fig. 1 for the compound which contains L-glutamic acid as the 5th amino acid. BOC means a tertiary butyloxycarbonyl group, tBu a tertiary butyl group and iBu an isobutyl group. The decapeptide used as a starting material can be prepared according to the method stated in the Belgian patent no. 604 570. The tetradecapeptide can be obtained, e.g. according to the scheme in fig. 2.

Videre får man tetrakosapeptidet ved kondensasjon av tetrapeptidet L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionin eller dets azid med eikosapeptidet L-glutamyl-(eller glutaminyl)-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl- Furthermore, the tetracosapeptide is obtained by condensation of the tetrapeptide L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionine or its azide with the eicosapeptide L-glutamyl-(or glutaminyl)-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L -tryptophyll-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-

Frie, funksjonelle grupper, som ikke deltar i reaksjonen, blir hensiktsmessig beskyttet, særlig ved hjelp av rester som lett avspaltes ved hydrolyse eller reduk-sjon, og karboksylgruppen fortrinnsvis ved forestring, f. eks. med metanol, tert. -butanol, benzylalkohol, p-nitrobenzylalkohol, aminogruppen f. eks. ved innføring av to-syl-, tritylresten eller av karbobenzoksygruppen eller fargede beskyttelsesgrupper, slik som p-fenylazo-benzyloksykarbonyl-gruppen og p-(p'-metoksy-fenylazo)-ben-zyloksykarbonylgruppen, eller særlig tert. -butyloksykarbonylresten. For beskyttelse av aminogruppen i guanidogrupperingen av argininet er nitrogruppen egnet. Den nevnte aminogruppe i argininet må imidlertid ikke nødvendigvis beskyttes ved reaksjonen. Free, functional groups, which do not participate in the reaction, are suitably protected, in particular by means of residues which are easily split off by hydrolysis or reduction, and the carboxyl group preferably by esterification, e.g. with methanol, tert. -butanol, benzyl alcohol, p-nitrobenzyl alcohol, the amino group e.g. by introducing the tosyl, trityl residue or of the carbobenzoxy group or colored protecting groups, such as the p-phenylazo-benzyloxycarbonyl group and the p-(p'-methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonyl group, or especially tert. -butyloxycarbonyl residue. For protection of the amino group in the guanido grouping of the arginine, the nitro group is suitable. However, the mentioned amino group in the arginine does not necessarily have to be protected during the reaction.

Omdannelsen av en beskyttet HN2-gruppe til en fri gruppe samt overføringen av en funksjonelt avledet karboksylgruppe til en fri karboksylgruppe under fremgangsmåten til fremstilling av tetrakosapeptidene og mellomprodukter foregår ifølge i og for seg kjente fremgangsmåter ved behandling med hydrolyserende henholdsvis reduserende midler. The conversion of a protected HN2 group into a free group as well as the transfer of a functionally derived carboxyl group into a free carboxyl group during the process for producing the tetracosa peptides and intermediates takes place according to per se known methods by treatment with hydrolyzing or reducing agents.

Alt etter arbeidsmåten får man de nye forbindelser i form av baser eller deres salter. Fra saltene kan basene fremstilles på i og for seg kjent måte. Av de siste kan det igjen fremstilles salter ved omsetning med syrer som er egnet for dannelse av terapeutisk anvendelige salter, slik som f. eks. slike med organiske syrer, som halo-genhydrogensyrer, f. eks. saltsyre eller bromhydrogensyre, perklorsyre, salpeter-syre eller tiocyansyre, svovel- eller fosfor-syrer, eller organiske syrer, slik som maur-syre, eddiksyre, propionsyre, glykolsyre, melkesyre, pyrodruesyre, oksalsyre, malon-syre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, eple-syre, vinsyre, sitronsyre, ascorbinsyre, hydroksymaleinsyre, dihydroksymaleinsyre, benzoesyre, fenyleddiksyre, 4-amino-benzoesyre, 4-hydroksy-benzoesyre, antranil-syre, kanelsyre, mandelsyre, salicylsyre, 4-amino-salicylsyre, 2-fenoksy-benzoesyre, 2-acetoksy-benzoesyre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, hydroksyetansulfonsyre, benzoesulfonsyre, p-toluol-sulfonsyre, naf-talinsulfonsyre eller sulfanylsyre. Depending on the working method, the new compounds are obtained in the form of bases or their salts. The bases can be prepared from the salts in a manner known per se. Of the latter, salts can again be produced by reaction with acids which are suitable for the formation of therapeutically applicable salts, such as e.g. those with organic acids, such as halogen hydrogen acids, e.g. hydrochloric or hydrobromic acid, perchloric acid, nitric acid or thiocyanic acid, sulfuric or phosphoric acids, or organic acids, such as formic acid, acetic acid, propionic acid, glycolic acid, lactic acid, pyruvic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid , malic acid, tartaric acid, citric acid, ascorbic acid, hydroxymaleic acid, dihydroxymaleic acid, benzoic acid, phenylacetic acid, 4-amino-benzoic acid, 4-hydroxy-benzoic acid, anthranilic acid, cinnamic acid, mandelic acid, salicylic acid, 4-amino-salicylic acid, 2-phenoxy -benzoic acid, 2-acetoxybenzoic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, hydroxyethanesulfonic acid, benzoesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, naphthalene sulfonic acid or sulfanyl acid.

Tetrakosapeptidene som fås ifølge fremgangsmåten kan anvendes i form av farmasøytiske preparater. Disse inneholder peptidene i blanding med et for ente-ral eller parenteral anvendelse egnet far-masøytisk, organisk eller anorganisk bæ-remateriale. For dette kommer slike stoffer på tale som ikke reagerer med polypepti-dene, slik som f. eks. gelatiner, melkesuk-ker, glukose, koksalt, stivelse, magnesium-stearat, talkum, vegetabilske oljer, ben-zylalkoholer, gummi, polyalkylenglykoler, vaseliner, cholesterin eller andre kjente legemiddelbærere. De farmasøytiske preparater kan foreligge f. eks. som tabletter, dragéer, pulvere, salver, kremer, supposi-torier eller i flytende form som oppløsnin-ger, suspensjoner eller emulsjoner. Eventuelt er de sterilisert og henholdsvis eller inneholder hjelpestoffer, slik som konser-verings-, stabiliserings-, fuktnings- eller emulgeringsmidler. De kan også inneholde andre terapeutisk verdifulle stoffer. The tetracosa peptides obtained according to the method can be used in the form of pharmaceutical preparations. These contain the peptides in mixture with a pharmaceutical, organic or inorganic carrier material suitable for enteral or parenteral use. For this, such substances come into question which do not react with the polypeptides, such as e.g. gelatins, milk sugar, glucose, table salt, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohols, rubber, polyalkylene glycols, petroleum jelly, cholesterol or other known drug carriers. The pharmaceutical preparations may be present, e.g. as tablets, dragées, powders, ointments, creams, suppositories or in liquid form as solutions, suspensions or emulsions. Optionally, they are sterilized and respectively or contain auxiliary substances, such as preservatives, stabilisers, wetting or emulsifying agents. They may also contain other therapeutically valuable substances.

Oppfinnelsen beskrives i de følgende eksempler. Temperaturen er angitt i Cel-siusgrader. The invention is described in the following examples. The temperature is indicated in degrees Celsius.

De i papirkromatografien og tynnlag-kromatografien anvendte systemer er: System 43 = tert.-amylalkohol-isopropa- nol-vann (100:40:55) system 45 = sek.-butanol-3 pst.-vand. ammoniakk (100:44) system 49 = sek.-butanol-trietylamin-di- etylbarbitursyre-vann-iso-propanol (100:0,8:l,8g:60: 10) system 50 = tert.-amylalkohol-isopropa- nol-trietylamin-natrium-5,5 -dietylbarbiturat-vann (100: 40:0,8:l,8g:50) The systems used in paper chromatography and thin-layer chromatography are: System 43 = tert.-amyl alcohol-isopropa- nol-water (100:40:55) system 45 = sec.-butanol-3 percent-water. ammonia (100:44) system 49 = sec.-butanol-triethylamine-di- ethyl barbituric acid-water-iso-propanol (100:0.8:1.8g:60:10) system 50 = tert.-amyl alcohol-isopropa- nol-triethylamine-sodium-5,5-diethylbarbiturate-water (100: 40:0.8:1.8g:50)

system 54 = sek.-butanol-isopropanol-monokloreddiksyre-vann system 54 = sec.-butanol-isopropanol-monochloroacetic acid-water

(70:10:3g:40) (70:10:3g:40)

system 100 = eddiksyre-pyridin-eddiksyre-vann (60:20:6:11) system 100 = acetic acid-pyridine-acetic acid-water (60:20:6:11)

system 101 = n-butanol-pyridin-eddiksyre system 101 = n-butanol-pyridine-acetic acid

-vann (30:20:6:24) -water (30:20:6:24)

system) 110 = eddiksyre-n-butanol-pyridin system) 110 = acetic acid-n-butanol-pyridine

-eddiksyre-vann (80:40:40: 12:19). -acetic acid-water (80:40:40: 12:19).

Eksempel 1. Example 1.

BOC- Ser- Tyr- Ser- Met- Glu( OtBu)- His-Phe- Arg- Try- Gly- Lys( BOC)- Pro- Val-Gly- Lys ( BOC) - Lys ( BOC)- Arg- Arg- Pro-Val- Lys( BOC)- Val- Tyr- Pro- OtBu. BOC- Ser- Tyr- Ser- Met- Glu( OtBu)- His-Phe- Arg- Try- Gly- Lys( BOC)- Pro- Val-Gly- Lys ( BOC) - Lys ( BOC)- Arg- Arg- Pro-Val- Lys( BOC)- Val- Tyr- Pro- OtBu.

210 mg tetradekapeptid-tert.-butyles-ter H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys (BOC) -Arg-Arg-Pro-V.al-Lys (BOC) - Val 210 mg tetradecapeptide-tert.-butyl ester H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys (BOC) -Arg-Arg-Pro-V.al-Lys (BOC) - Val

-Try-Pro-OtBu,3CH3COOH, oppløses raskt ved 0°C i 10 ml 1/10-N. saltsyre og den resulterende oppløsning tørkes lyofilt i høy-vakuum. Den fine, hvite rest tørkes ennå i 2 timer ved 50°C i høyvakuum over fos-forpentoksyd. Samtidig oppløses 160 mg -Try-Pro-OtBu,3CH3COOH, dissolves rapidly at 0°C in 10 ml of 1/10-N. hydrochloric acid and the resulting solution is lyophilized in high vacuum. The fine, white residue is further dried for 2 hours at 50°C in high vacuum over phosphorus pentoxide. At the same time, 160 mg is dissolved

(0,11 mmol) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-(OtBu) -His-Phe-Arg-Try-Gly-OH (Belgisk patent nr. 604 570) i varmen i 1 ml friskt destillert dimetylformamid, avkjøles igjen til romtemperatur og settes til trihydro-kloridet av tetradekapeptidet. Man fortynner med videre 2,5 ml dimetylformamid og får etter 10—15 minutter en klar oppløs-ning. Etter 2 timers henstand i isbad tilsettes 42 mg U ,2 mmol) dicylkloheksyl-karbodiimid i 0,6 ml iskald acetonitril, og lar deretter reagere i 13 timer ved 0°C og 48 timer ved romtemperatur. Det rå reak-sjonsprodukt utfelles deretter med meget eddikester og tørkes i høyvakuum ved 40°C. Råutbytte: 330 mg. (0.11 mmol) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH (Belgian Patent No. 604,570) in the heat in 1 ml of freshly distilled dimethylformamide, cooled again to room temperature and added to the trihydrochloride of the tetradecapeptide. Dilute with a further 2.5 ml of dimethylformamide and obtain a clear solution after 10-15 minutes. After standing for 2 hours in an ice bath, 42 mg (U.2 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide are added in 0.6 ml of ice-cold acetonitrile, and then allowed to react for 13 hours at 0°C and 48 hours at room temperature. The crude reaction product is then precipitated with a lot of vinegar and dried in a high vacuum at 40°C. Raw yield: 330 mg.

100 mg rått beskyttet tetraosapeptid som ennå er forurenset med utgangspep-tider, behandles 1 time ved romtemperatur med 2 ml vannfri trifluoreddiksyre. Overskudd av syre avdampes ved romtemperatur i vakuum og den resulterende rest rives ut med meget abs. eter. Det amorfe spaltningsprodukt underkastes i 4,5 ml 0,5-N. eddiksyre en kontinuerlig høyspen-ningselektroforese (700 volt, 30 m A). På-føringshastighet: 1 ml/time. Totalt oppfanges 23 fraksjoner. Fraksjonene 1—9, 10, 12—13, 14—15, 16 og 17—23 inndampes. Den elektroforetiske analyse viser at i fraksjonene 12—15 inneholdes hovedmengden av det ønskede tetrakosapeptid. For videre rensning helles de sammenslåtte fraksjoner 12—15 oppløst i 2 ml 1/ 100 molar ammoniumacetatpuffer på en karboksymetylcellulosesøyle ($ 1 cm; 1,16 cm; 2,5 g). Karboksymetylcellulosen fylles med 100 ml 1/100 mol. ammoniumacetatpuffer i søylen og gjennomvaskes med videre 50 ml av den samme puffer. Peptidet elueres deretter med ammoniumacetatpuffer (pH=5,4) med stigende mola-ritet (0,1 m=0,7 m) fra søylen. 100 mg of crude protected tetraose peptide which is still contaminated with starting peptides is treated for 1 hour at room temperature with 2 ml of anhydrous trifluoroacetic acid. Excess acid is evaporated at room temperature in a vacuum and the resulting residue is torn out with very abs. ether. The amorphous cleavage product is subjected to 4.5 ml of 0.5-N. acetic acid a continuous high-voltage electrophoresis (700 volts, 30 mA). Application rate: 1 ml/hour. A total of 23 fractions are collected. Fractions 1—9, 10, 12—13, 14—15, 16 and 17—23 are evaporated. The electrophoretic analysis shows that fractions 12-15 contain the main amount of the desired tetracosa peptide. For further purification, the combined fractions 12-15 dissolved in 2 ml of 1/100 molar ammonium acetate buffer are poured onto a carboxymethyl cellulose column ($ 1 cm; 1.16 cm; 2.5 g). The carboxymethyl cellulose is filled with 100 ml of 1/100 mol. ammonium acetate buffer in the column and washed through with a further 50 ml of the same buffer. The peptide is then eluted with ammonium acetate buffer (pH=5.4) with increasing molarity (0.1 m=0.7 m) from the column.

Det oppfanges fraksjoner på 10 ml volum med en automatisk fraksjonssam-ler. Etter 15 fraksjoner er peptidet igjen skilt kvantitativt fra søylen. Man får totalt 15 fraksjoner. Glassene 10—13 inneholder elektroforetisk rent tetrakosapeptid. Den tilbakelagte vei etter en time ved 3000 volt og pH 1,9 utgjør 13—17 cm. Fractions of 10 ml volume are collected with an automatic fraction collector. After 15 fractions, the peptide is again separated quantitatively from the column. You get a total of 15 fractions. The glasses 10-13 contain electrophoretically pure tetracosa peptide. The distance traveled after one hour at 3000 volts and pH 1.9 amounts to 13-17 cm.

Ved in vitro-prøve etter Saffran og Schally viser det erholdte peptid en sterk ACTH-aktivitet. In an in vitro test according to Saffran and Schally, the obtained peptide shows a strong ACTH activity.

Det som utgangsmateriale anvendte tetrakosapeptid-tert.-butylester kan fremstilles som følger: The tetracosapeptide tert-butyl ester used as starting material can be prepared as follows:

1,15 g (15 mmol) PZ-Lys-(BOC)-Pro-Val-Gly-OCH3 (Belgisk patent nr. 594 338) kokes i 15 ml abs. metanol med 0,6 ml hydrazinhydrat i en time med tilbakeløps-kjøler. Oppløsningsmidlet avdampes i vakuum til tørrhet og hydrazidet utfelles med meget eter. Det til å begynne med gelé-aktige produkt blir fast ved skrapning. Man frafiltrerer og vasker etter godt på filteret med eter. Etter tørking over svovelsyre ut-vinner man 1,1 g PZ-tetrapeptidhydrazid, med smeltepunkt 130—131 °C. 1.15 g (15 mmol) of PZ-Lys-(BOC)-Pro-Val-Gly-OCH3 (Belgian patent no. 594,338) is boiled in 15 ml of abs. methanol with 0.6 ml of hydrazine hydrate for one hour with a reflux condenser. The solvent is evaporated in vacuo to dryness and the hydrazide is precipitated with a lot of ether. The initially jelly-like product solidifies when scraped. Filter off and wash the filter thoroughly with ether. After drying over sulfuric acid, 1.1 g of PZ-tetrapeptide hydrazide is recovered, with a melting point of 130-131 °C.

En prøve som er omkrystallisert av varmt vann viser det samme smeltepunkt. Hydrazidet er godt oppløselig i kulden i 25 prosent eddiksyre. A sample recrystallized from hot water shows the same melting point. The hydrazide is well soluble in the cold in 25 per cent acetic acid.

3,06 g (23,7 mmol) prolinmetylester i 20 ml acetonitril settes til oppløsningen av 3.06 g (23.7 mmol) of proline methyl ester in 20 ml of acetonitrile are added to the solution of

7,18 g (20,3 mmol) karbobenzoksy-nitro-L-arginin i 20 ml dimetylformamid, av-kjøler med iskoksalt til co+ 5° til -h10°C og tilsetter deretter en oppløsning av 4,9 g dicykloheksylkarbodiimid i 12 ml dimetylformamid: Acetonitril = 1:1. Reaksjons-oppløsningen fortynnes ennå med 20 ml iskald acetonitril og står i 17 timer ved 0°C. Det dannede urinstoff frafiltreres, vaskes med acetonitril og oppløsningen tilsettes 5 dråper iseddik. Etter 30 minutter avdamper man oppløsningsmidlet til tørrhet, opptar fordampningsresten i eddikester, filtrerer nok en gang gjennom vatt fra det utskilte urinstoff og vasker eddikesteroppløsningen 3 ganger med 10 ml l-n. saltsyre, 2 ganger med vann, så lenge med l-n. natriumbikarbonatoppløs-ning inntil det ikke lenger kan fastslås noen uklarhet ved ansyring av de alkaliske uttrekk og til slutt vaskes nøytralt med vann. 7.18 g (20.3 mmol) of carbobenzoxy-nitro-L-arginine in 20 ml of dimethylformamide, cool with ice-cold brine to co+ 5° to -h10°C and then add a solution of 4.9 g of dicyclohexylcarbodiimide in 12 ml dimethylformamide: acetonitrile = 1:1. The reaction solution is further diluted with 20 ml of ice-cold acetonitrile and left for 17 hours at 0°C. The formed urea is filtered off, washed with acetonitrile and 5 drops of glacial acetic acid are added to the solution. After 30 minutes, the solvent is evaporated to dryness, the evaporation residue is taken up in vinegar, filtered once more through cotton wool from the excreted urea and the vinegar solution is washed 3 times with 10 ml l-n. hydrochloric acid, 2 times with water, as long with l-n. sodium bicarbonate solution until no turbidity can be determined by acidification of the alkaline extracts and finally washed neutrally with water.

Ved inndampning av den tørkede ed-dikesteroppløsning til et lite volum faller karbobenzoksydipeptidesteren nesten kvantitativt ut. Utbytte: 6,16 g (65,5 pst. av det teoretiske), smeltepunkt 155—157°C (sintring 153°C). On evaporation of the dried edic ester solution to a small volume, the carbobenzoxy dipeptide ester precipitates out almost quantitatively. Yield: 6.16 g (65.5 percent of the theoretical), melting point 155-157°C (sintering 153°C).

8,4 g Z-Arg-(N02)-Pro-OCH3 oppløses under oppvarmning i 27 ml iseddik i var- 8.4 g of Z-Arg-(NO2)-Pro-OCH3 are dissolved while heating in 27 ml of glacial acetic acid in var-

men og tilsettes ved romtemperatur 27 ml c\34-n. bromhydrogen-iseddikoppløsning. Etter 1 time inndamper man i vakuum ved 40°C til lite volum og feller ut dikarbo-benzoksyoppløsningsproduktet med meget abs. eter. Det til å begynne med klebrige produkt behandles så lenge med abs. eter inntil det resulterer i et fint pulver. For videre rensing utfelles dihydrobromidet av dipeptidesteren nok en gang fra metanol/eter. Den svakt gulfargede forbindelse opptar man i 4 ml vann, tilsetter 150 ml kloroform og avkjøler blandingen i isbad til 0°C. Under intens omrøring tilsetter man porsjonsvis så lenge fast kaliumkarbonat inntil alt vann er forbrukt og kali-umkarbonatet utskiller seg som fast. Kali-umkarbonatet ekstraheres nok en gang med frisk kloroform og de sammenslåtte kloroformekstrakter tørkes over vann-fritt kaliumkarbonat og filtreres gjennom en G4 glassfilternutsj gjennom litt cellitt. Etter fordampning av kloroformen ved 40° C får man 5,5 g (90 pst. av det teoretiske) nitro-L-arginyl-prolin-metylester. Forbindelsen videre-forarbeides uten videre omsetning. but and add at room temperature 27 ml c\34-n. hydrogen bromide-glacial acetic acid solution. After 1 hour, it is evaporated in vacuo at 40°C to a small volume and the dicarbobenzoxy solution product is precipitated with very abs. ether. The initially sticky product is treated for a long time with abs. ether until a fine powder results. For further purification, the dihydrobromide of the dipeptide ester is precipitated once again from methanol/ether. The slightly yellow compound is taken up in 4 ml of water, 150 ml of chloroform is added and the mixture is cooled in an ice bath to 0°C. During intense stirring, solid potassium carbonate is added in portions until all the water is consumed and the potassium carbonate separates as solid. The potassium carbonate is extracted once more with fresh chloroform and the combined chloroform extracts are dried over anhydrous potassium carbonate and filtered through a G4 glass filter nut through a little cellite. After evaporation of the chloroform at 40° C, 5.5 g (90 per cent of the theoretical) nitro-L-arginyl-proline-methyl ester are obtained. The connection is further processed without further turnover.

8,34 g (25,2 mmol) H-Arg(N02)-Pro-OCH., i 25 ml frisk destillert dimetylformamid slås sammen med oppløsningen av 8,92 g (25,2 mmol) Z-Arg(N02)-OH, fortynnes med 50 ml acetonitril og avkjøles i kuldebad til h-10°C. Etter 30 minutters henstand ved denne temperatur tilsetter man under omrøring 5,71 g (27,7 mmol) dicykloheksyl-karbodiimid, oppløst i 12,5 ml iskald acetonitril, og lar den reagere i 22 timer ved 0°C. Urinstoffet frafiltreres 8.34 g (25.2 mmol) of H-Arg(NO2)-Pro-OCH., in 25 ml of freshly distilled dimethylformamide are combined with the solution of 8.92 g (25.2 mmol) of Z-Arg(NO2)- OH, diluted with 50 ml of acetonitrile and cooled in a cold bath to h-10°C. After standing for 30 minutes at this temperature, 5.71 g (27.7 mmol) of dicyclohexyl carbodiimide, dissolved in 12.5 ml of ice-cold acetonitrile, are added with stirring and allowed to react for 22 hours at 0°C. The urea is filtered out

og oppløsningsmidlet inndampes i vakuum til lite volum. Den sirupøse rest opptar man i kloroform, vasker 3 ganger med 10 ml l-n. saltsyre, 2 ganger med 10 ml vann og så lenge med l-n. natriumbikarbonat og l-n. sodaoppløsning inntil det ikke lenger kan påvises noen utfelling henholdsvis uklarhet ved ansyring av de alkaliske uttrekk. Til slutt vaskes kloroformuttrekkene nøytrale med vann og tørkes over natriumsulfat. Etter fordampning av oppløs-ningsmidlet får man 10,4 g (62 pst.) rå karbobenzoksy-tripeptidester. and the solvent is evaporated in vacuo to a small volume. The syrupy residue is taken up in chloroform, washed 3 times with 10 ml l-n. hydrochloric acid, 2 times with 10 ml of water and as long with l-n. sodium bicarbonate and l-n. soda solution until no precipitation or turbidity can be detected when the alkaline extracts are acidified. Finally, the chloroform extracts are washed neutral with water and dried over sodium sulfate. After evaporation of the solvent, 10.4 g (62 per cent) of crude carbobenzoxy tripeptide ester are obtained.

En prøve av råproduktet med 2/n. bromhydrogeniseddikoppløsning, spaltet i 1 time ved romtemperatur, viser ved papirkromatogram i systemene 54 og 49 ved siden av tripeptidet også videre mengder nitroarginin og et annet biprodukt. For rensning krystalliseres 4,6 g råprodukt fra 140 ml n-butanol. Utbytte: 2,2 g ren karbobenzoksy-tripeptidester, smeltepunkt = A sample of the raw product with 2/n. Bromohydrogenase acetic acid solution, digested for 1 hour at room temperature, shows in paper chromatograms in systems 54 and 49 next to the tripeptide also further amounts of nitroarginine and another by-product. For purification, 4.6 g of crude product is crystallized from 140 ml of n-butanol. Yield: 2.2 g of pure carbobenzoxy-tripeptide ester, melting point =

120°C (dekomponering) [a] ^ =43,9°C 120°C (decomposition) [a] ^ =43.9°C

±1°C (c = 1,032 i metanol). ±1°C (c = 1.032 in methanol).

I ultrafiolett spektrum viser karbo-benzoksytripeptidesteren ved 271 m^ det maksimum (e = 32.200) som er karakteristisk for nitroarginin. In the ultraviolet spectrum, the carbo-benzoxytripeptide ester shows at 271 m^ the maximum (e = 32,200) which is characteristic of nitroarginine.

2,19 g (3,3 mmol) Z-Arg(N02)-Arg-(N02)-Pro-OCH3 dekarbobenzoksyleres i 13,2 ml 2-n. bromhydrogensyre-iseddik-oppløsning i 1 time ved romtemperatur. Etter fordampning av overskudd av syre utfeller man dekarbobenzoksyleringspro-duktet med meget absolutt eter. Råproduktet opptas i 2 ml vann, ekstraheres 2 ganger med frisk eddikester, eddikesterfasene vaskes nok en gang med vann og de sammenslåtte vandige oppløsninger tilsettes i en ioneutvekslersøyle Merck II. Den fri tripeptidester elueres med 200 ml vann og vannet avdampes i vakuum ved 40°C. Utbytte 1,3 g (74 pst. av det teoretiske). 2.19 g (3.3 mmol) of Z-Arg(NO 2 )-Arg-(NO 2 )-Pro-OCH 3 are decarbobenzoxylated in 13.2 ml of 2-n. hydrobromic acid-glacial acetic acid solution for 1 hour at room temperature. After evaporation of excess acid, the decarbobenzoxylation product is precipitated with very absolute ether. The crude product is taken up in 2 ml of water, extracted twice with fresh ethyl acetate, the ethyl acetate phases are washed once more with water and the combined aqueous solutions are added to an ion exchange column Merck II. The free tripeptide ester is eluted with 200 ml of water and the water is evaporated in vacuo at 40°C. Yield 1.3 g (74 per cent of the theoretical).

Ved papirkromatogram i systemene 43, 49 og 54 gir den frie tripeptidester med ninhydrin bare hver en positiv flekk. Rf. 43/0,42; 49/0,67 og 54/0,49. In the case of paper chromatograms in systems 43, 49 and 54, the free tripeptide ester with ninhydrin gives only one positive spot each. Rf. 43/0.42; 49/0.67 and 54/0.49.

1,07 g (2,01 mmol) H-Arg(N02)-Arg-(N02)-Pro-OCH3 i 16,5 ml dimetylformamid/acetonitril 1:1 avkjøles til ^-10°C. Under intens omrøring innfører man hurtig 1,44 g T-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OH (Belgisk patent nr. 594 338) i oppløsningen, fortynner med 10 ml på forhånd avkjølt acetonitril og tilsetter etter 10 minutter 456 mg (2,2 mmol) dicykloheksylkarbodiimid i 5 ml iskald acetonitril. Etter 20 timers reaksjonstid ved 0°C frafiltreres urinstoffet og oppløsningsmidlet avdampes i vakuum ved 40°C. Den ikke omsatte tripeptidester utfelles med meget eddikester, deretter inndampes eddikesteropp-løsningen til tørrhet og fordampningsresten opptas i litt aceton. Etter filtrering gjennom vatt utfelles N-trityl-pentapeptidesteren med meget eter. 1.07 g (2.01 mmol) of H-Arg(NO2)-Arg-(NO2)-Pro-OCH3 in 16.5 ml of dimethylformamide/acetonitrile 1:1 is cooled to ^-10°C. With intense stirring, 1.44 g of T-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OH (Belgian patent no. 594 338) are quickly introduced into the solution, diluted with 10 ml of previously cooled acetonitrile and after 10 minutes, 456 mg ( 2.2 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide in 5 ml of ice-cold acetonitrile. After 20 hours of reaction time at 0°C, the urea is filtered off and the solvent is evaporated in vacuum at 40°C. The unreacted tripeptide ester is precipitated with a lot of acetic ester, then the acetic ester solution is evaporated to dryness and the evaporation residue is taken up in a little acetone. After filtering through water, the N-trityl pentapeptide ester is precipitated with a lot of ether.

En med vannfri trifluoreddiksyre spaltet prøve av trityl-pentapeptidesteren viser ved papirkromatografi i systemet 49 ved siden av pentapeptid-metylesteren Rf 0,29 også meget lite av de to utgangsmate-rialer. (Dipeptid-H-Lys-Lys-OH [Rf = 0,12] og tripeptidester nitro-arginyl-nitro-arginyl-prolinmetylester [Rf = 0,53]). A sample of the trityl pentapeptide ester cleaved with anhydrous trifluoroacetic acid shows by paper chromatography in the system 49 next to the pentapeptide methyl ester Rf 0.29 also very little of the two starting materials. (Dipeptide-H-Lys-Lys-OH [Rf = 0.12] and tripeptide ester nitro-arginyl-nitro-arginyl-proline methyl ester [Rf = 0.53]).

For analyse fordeles 200 mg ifølge Graig mellom 80 pst. metanol og kloroform: tetraklorkarbon 1:1 over 100 trinn multiplikativt. Hovedmengden av stoffet (180 mg) befinner seg i elementene 16— 28. Disse slås sammen og utfelles på ny fra aceton/eter. Smeltepunkt 134—136°C For analysis, according to Graig, 200 mg is distributed between 80 percent methanol and chloroform: carbon tetrachloride 1:1 over 100 steps multiplicatively. The main amount of the substance (180 mg) is found in elements 16-28. These are combined and re-precipitated from acetone/ether. Melting point 134-136°C

[a] ^ = 41,2°C ± 0,4°C (c = 2,709 i metanol). Ultrafiolett-spektrum: l maks. 271 mj.1, 6 = 32.500 i finsprit. [a] ^ = 41.2°C ± 0.4°C (c = 2.709 in methanol). Ultraviolet spectrum: l max. 271 mj.1, 6 = 32,500 in fine spirits.

1,46 g (1,19 mmol) Na-trityl-penta-peptidmetylester spaltes i 50 ml 75 pst.-ig eddiksyre i 45 minutter ved 30°C, deretter avdampes ved 30 °C eddiksyren i høy vakuum, og fordampningsresten fordeles mellom 1-prosentig eddiksyre og eter. Etter fordampning av eteroppløsningen utvin-nes i kvantitativt utbytte trifenylkarbino-let. Eddiksyreoppløsningen fordampes like-ledes i høyvakuum ved 40°C og resten fordeles i skilletrakt mellom n-butanol og N-sodaoppløsning. pH-verdien i den vandige fase må være 8,5. Butanoluttrekkene vaskes nøytralt med vann og tørkes over natriumsulfat. Utbytte: 1,03 g (88 pst.-ig). 1.46 g (1.19 mmol) Na-trityl-penta-peptide methyl ester is decomposed in 50 ml of 75% acetic acid for 45 minutes at 30°C, then the acetic acid is evaporated at 30°C in high vacuum, and the evaporation residue is distributed between 1 percent acetic acid and ether. After evaporation of the ether solution, the triphenylcarbinol is recovered in quantitative yield. The acetic acid solution is similarly evaporated in high vacuum at 40°C and the residue is distributed in a separatory funnel between n-butanol and N-soda solution. The pH value in the aqueous phase must be 8.5. The butanol extracts are washed neutrally with water and dried over sodium sulfate. Yield: 1.03 g (88 percent).

Forbindelsen forarbeides direkte videre uten videre rensning. The compound is directly processed further without further purification.

900 mg^ (1,2 mmol) PZ-Lys(BOC)Pro-Val-Gly-hydrazid avkjøles i 10 ml dimetylformamid til -4-10°C, deretter setter man langsomt til 4 ml l-n. saltsyre og tildryp-per deretter ved -hl0°C under god omrø-ring 1,4 ml iskald 1-N.natriumnitrittopp-løsning. Etter 30 sekunder begynner acidet å utskilles som klebrig forbindelse. Man lar det reagere ennå i 3 minutter ved -=-10° C og tilsetter deretter reaksjonsblandingen 150 ml isvann. Det klebrige dårlig filter-bare acid ekstraheres med iskald eddikester og eddikesterfasene vaskes nøytralt med vann (3 ganger), deretter tørkes i kulden over magnesiumsulfat og filtreres gjennom en kald G4-glassnutsj inn i is-avkjølt oppløsning av 1,03 g (cndI mmol) H-Lys (BOC) -Lys (BOC) - Arg (N02) -Arg-(N02)-Pro-OCH;J>. Man lar det deretter reagere i 22 timer ved 0°C og 3 timer ved 30°C. Reaksjonsoppløsningen vaskes med vann (40 ml), 4 ganger med 10 ml 1 pst.-ig eddiksyreoppløsning, 5 ganger med 10 ml 1-N. natriumbikarbonatoppløsning og til 900 mg^ (1.2 mmol) PZ-Lys(BOC)Pro-Val-Gly-hydrazide is cooled in 10 ml of dimethylformamide to -4-10°C, then slowly added to 4 ml of l-n. hydrochloric acid and then add dropwise at -10°C with good stirring 1.4 ml of ice-cold 1-N sodium nitrite solution. After 30 seconds, the acid begins to separate as a sticky compound. It is allowed to react for a further 3 minutes at -=-10° C and then 150 ml of ice water is added to the reaction mixture. The sticky poorly filterable acid is extracted with ice-cold acetic acid and the acetic acid phases are washed neutrally with water (3 times), then dried in the cold over magnesium sulfate and filtered through a cold G4 glass funnel into an ice-cooled solution of 1.03 g (cnd1 mmol ) H-Lys (BOC) -Lys (BOC) - Arg (NO 2 ) -Arg-(N0 2 )-Pro-OCH;J>. It is then allowed to react for 22 hours at 0°C and 3 hours at 30°C. The reaction solution is washed with water (40 ml), 4 times with 10 ml of 1% acetic acid solution, 5 times with 10 ml of 1-N. sodium bicarbonate solution and to

slutt med vann og mettet koksaltoppløs-ning. Ved inndampning av den tørkede oppløsning faller nonapeptidderivatet ut. Utbytte: 1,70 g råprodukt. finish with water and saturated saline solution. When the dried solution is evaporated, the nonapeptide derivative precipitates. Yield: 1.70 g crude product.

For videre rensning opptar man 1,52 g av råproduktet i litt kloroform og filtrerer gjennom en søyle av 45 g silikagel. En gangs utfelling på ny av eluatet av 10 ml kloroform med eter gir 1,06 g PZ-nona-peptid-metylester. Smeltepunkt 134—140° C (dekomponering). For further purification, 1.52 g of the crude product is taken up in a little chloroform and filtered through a column of 45 g of silica gel. A single reprecipitation of the eluate from 10 ml of chloroform with ether yields 1.06 g of PZ-nona-peptide methyl ester. Melting point 134-140° C (decomposition).

I tyntlagskromatogram (kiselgel G; In thin-layer chromatogram (silica gel G;

Merck) i systemet dioksan:vann = 9,1 er bare ett stoff med Rf-verdien 0,75 påvis-bar. I systemene kloroform:aceton 7:3 og benzol: aceton 1:1 forblir forbindelsen ved starten. Stoffet smelter, krystallisert fra acetonitril, ved 136—138°C, og i ultrafiolett spektrum i etanol oppviser det maksima ved 272 mu. (e = 26 600) og = 320 Merck) in the system dioxane:water = 9.1, only one substance with an Rf value of 0.75 is detectable. In the systems chloroform:acetone 7:3 and benzene:acetone 1:1, the compound remains at the start. The substance, crystallized from acetonitrile, melts at 136-138°C, and in the ultraviolet spectrum in ethanol it shows a maximum at 272 mu. (e = 26,600) and = 320

m|x (e = 22 400). m|x (e = 22,400).

1,06 g (0,62 mmol) PZ-nonapeptidester i 6 ml 75 prosents dioksan forsåpes med 1,24 ml 1,95-N. natronlut i 15 minutter ved romtemperatur. Deretter heller man reaksj onsoppløsningen i 110 ml isvann, som inneholder 2,5 ml 1-N. saltsyre, og filtrerer den fnokkaktige utfelling gjennom et G3 glassfritte. Bunnfallet vaskes godt med vann og tørkes over fosforpent-oksyd i høyvakuum. Utbytte: 970 mg amorft produkt. Rf = 0,52 i tyntlagskromatogram for dioksan:vann = 9:1. 1.06 g (0.62 mmol) of PZ nonapeptide ester in 6 ml of 75 percent dioxane is saponified with 1.24 ml of 1.95-N. lye for 15 minutes at room temperature. The reaction solution is then poured into 110 ml of ice water, which contains 2.5 ml of 1-N. hydrochloric acid, and filter the fleck-like precipitate through a G3 glass frit. The precipitate is washed well with water and dried over phosphorus pentoxide in a high vacuum. Yield: 970 mg of amorphous product. Rf = 0.52 in thin layer chromatogram for dioxane:water = 9:1.

200 mg i systemet metanol: vann kloroform: tetraklorkarbon = 8:2:5:5 fordelt over 121 trinn gir 162 mg rent peptidderi-vat K = 0,65. 200 mg in the system methanol: water chloroform: carbon tetrachloride = 8:2:5:5 distributed over 121 steps gives 162 mg of pure peptide derivative K = 0.65.

Ultrafiolett spektrum: Xmaks. 320 m^i e = 21 700 og 271 m.\ i, e = 37 200 i finsprit. Ultraviolet spectrum: Xmax. 320 m^i e = 21,700 and 271 m.\ i, e = 37,200 in spirits.

Stoffet smelter, krystallisert fra acetonitril, ved 140—145°C (dekomponering). The substance melts, crystallized from acetonitrile, at 140-145°C (decomposition).

4,75 g ( 13,4 mmol) PZ-valin i 65 ml absolutt dioksan avkjøles således i isvann, at en del av dioksanet er fast. Deretter tilsettes 3,45 ml (14,4 mmol) N-tributylamin og etter videre 5 minutter 1,38 ml (13,4 mmol) klormaursyreetylester og det reageres deretter i 15 minutter under avkjøling. 4.75 g (13.4 mmol) of PZ-valine in 65 ml of absolute dioxane are cooled in ice water so that part of the dioxane is solid. 3.45 ml (14.4 mmol) of N-tributylamine are then added and, after a further 5 minutes, 1.38 ml (13.4 mmol) of ethyl chloroformate and the reaction is then continued for 15 minutes under cooling.

På forhånd innføres 4 g (17,2 mmol) Ns-BOC-lysin under omrøring langsomt i 32 ml vann, som inneholder 2,45 ml (17,2 mmol) N-trietylamin. De siste porsjoner av Ne-BOC-lysinet oppløses ikke lenger godt. Ved avkjøling med is utskilles igjen litt fast stoff fra den vandige oppløsning. Denne oppløsning setter man hurtig under intens omrøring og avkjøling til den friskt tilberedte oppløsning av det blandede an-hydrid og lar deretter reagere i 30 minutter ved romtemperatur. Reaksj onsoppløs-ningen inndampes i vakuum ved 40°C til lite volum, tilsettes under isavkjøling 100 ml vann og 40 ml 10 pst.-ig sitronsyreopp-løsning. Den deigaktige utfelling blir fast ved skrapning med eter. Det rå PZ-valyl-Ne-BOC-lysin frafiltreres, vaskes med meget vann og eter og tørkes ved 50 °C i høy-vakuum. Utbytte: 4,41 g, smeltepunkt 167 In advance, 4 g (17.2 mmol) of Ns-BOC-lysine are slowly introduced while stirring into 32 ml of water, which contains 2.45 ml (17.2 mmol) of N-triethylamine. The last portions of the Ne-BOC lysine no longer dissolve well. When cooling with ice, a little solid material separates from the aqueous solution. This solution is quickly added under intense stirring and cooling to the freshly prepared solution of the mixed anhydride and then allowed to react for 30 minutes at room temperature. The reaction solution is evaporated in vacuo at 40°C to a small volume, 100 ml of water and 40 ml of a 10% citric acid solution are added under ice-cooling. The pasty precipitate solidifies when scraped with ether. The crude PZ-valyl-Ne-BOC-lysine is filtered off, washed with plenty of water and ether and dried at 50 °C in high vacuum. Yield: 4.41 g, melting point 167

—169°C (sintring 165°C). —169°C (sintering 165°C).

Eterfasen fraskilles og tørkes over natriumsulfat. Ved avdampning av eteren utskilles ennå videre 1,07 g PZ-dipeptid. Smeltepunkt 167—169° C. The ether phase is separated and dried over sodium sulfate. When the ether is evaporated, a further 1.07 g of PZ dipeptide is separated. Melting point 167-169° C.

Totalutbyttet utgjør 5,48 g (70 pst. av det teoretiske). Analysefraksjonen smelter etter en gangs omkrystallisering fra eddikester ved 167—169° C. The total yield amounts to 5.48 g (70 per cent of the theoretical). The analysis fraction melts after a single recrystallization from acetic acid at 167-169° C.

Det ultrafiolette spektrum i finsprit viser ved Xmaks. 230 m^ e = 13.400 og Xmaks. 322 m^i e = 23.000. The ultraviolet spectrum in distilled spirits shows at Xmax. 230 m^ e = 13,400 and Xmax. 322 m^i e = 23,000.

11,25 g (27,4 mmol) karbobenzoksy-valyl-tyrosin (patent nr. 93 699) i 100 ml friskt destillert acetonitril tilsettes opp-løsningen av 4,65 g (27,4 mmol) prolin-tert.-butylester i 25 ml acetonitril og av-kjøler i isbad til 0° C. Deretter tilsettes oppløsningen av 6,21 g dicykloheksylkar-bo-diimid i 10 ml kald acetonitril og det reageres i 15 timer ved 0° C. Det utkry-stalliserte urinstoff frafiltreres (90 pst. av det teoretiske) og reaksj onsoppløsningen tilsettes 1 ml iseddik. Etter 15 minutter avdampes acetonitrilet i vakuum, fordampningsresten opptas i eddikester og filtreres nok en gang fra utskilt urinstoff. Eddikesteroppløsningen ekstraheres 2 ganger med 10 ml iskald 2-N. saltsyre, deretter så lenge med 2-N. sodaoppløsning, inntil ansyrede prøver ikke lenger viser noen utfelling, og til slutt vaskes nøytralt med vann. Eddikesterekstraktene tørker man over natriumsulfat og avdamper opp-løsningsmidlet under forminsket trykk. Utbytte: 14,1 g (88 pst. av det teoretiske) amorf karbobenzoksytripeptidester. 11.25 g (27.4 mmol) of carbobenzoxy-valyl-tyrosine (patent no. 93 699) in 100 ml of freshly distilled acetonitrile is added to the solution of 4.65 g (27.4 mmol) of proline tert-butyl ester in 25 ml of acetonitrile and cools in an ice bath to 0° C. Then the solution of 6.21 g of dicyclohexylcarbodiimide in 10 ml of cold acetonitrile is added and the reaction is carried out for 15 hours at 0° C. The crystallized urea is filtered off ( 90 per cent of the theoretical) and 1 ml of glacial acetic acid is added to the reaction solution. After 15 minutes, the acetonitrile is evaporated in vacuo, the evaporation residue is taken up in vinegar and filtered once more from excreted urea. The acetic ester solution is extracted twice with 10 ml of ice-cold 2-N. hydrochloric acid, then as long with 2-N. soda solution, until acidified samples no longer show any precipitation, and finally washed neutrally with water. The acetic ester extracts are dried over sodium sulphate and the solvent is evaporated under reduced pressure. Yield: 14.1 g (88 percent of theory) amorphous carbobenzoxytripeptide ester.

Karbobenzoksy-tripeptidesteren er godt oppløselig i de fleste organiske opp-løsningsmidler, foruten eter, petroleter og benzol. Det forarbeides videre direkte uten videre rensning. The carbobenzoxy tripeptide ester is well soluble in most organic solvents, apart from ether, petroleum ether and benzene. It is further processed directly without further purification.

14,13 g (24,9 mmol) Z-Val-Tyr-Pro-OtBu spaltes i 250 ml 90 pst.-ig metanol, som inneholder 4,5 ml iseddik, i nærvær av 2 g 10 pst.-ig Pd-karbonkatalysator hy-drogenolytisk. Det dannede karbondioksyd absorberes med kalilut i en annen, deri-mellom sjaltet hydrerente. Etter 2 timer er hydrogenopptaket avsluttet. Oppløsningen, som er befridd for katalysator, inndampes i vakuum ved 40° C til tørrhet og fordampningsresten fordeles mellom 200 ml eddikester og 2 ganger 20 ml iskald 2-N. sodaoppløsning. Sodaoppløsningene ekstraheres nok en gang med frisk eddikester, eddikesterfasene vaskes nøytralt med vann og tørkes over natriumsulfat. Etter fordampning av oppløsningsmidlet i vakuum gjenvinner man 7,69 g (71 pst. av det teoretiske) av fri tripeptidester. 14.13 g (24.9 mmol) of Z-Val-Tyr-Pro-OtBu is cleaved in 250 ml of 90% methanol, containing 4.5 ml of glacial acetic acid, in the presence of 2 g of 10% Pd- carbon catalyst hydrogenolytic. The carbon dioxide formed is absorbed with potassium hydroxide in another, in between salted hydrene. After 2 hours, the hydrogen absorption has ended. The solution, which has been freed of catalyst, is evaporated in vacuo at 40° C to dryness and the evaporation residue is distributed between 200 ml of acetic acid and 2 times 20 ml of ice-cold 2-N. soda solution. The soda solutions are extracted once more with fresh acetic acid, the acetic acid phases are washed neutrally with water and dried over sodium sulphate. After evaporation of the solvent in vacuo, 7.69 g (71 per cent of the theoretical) of free tripeptide ester are recovered.

I papirkromatogrammet i systemene 43, 45 og 54 vandrer tripeptidesteren med oppløsningsmiddelfronten og gir med ninhydrin og Pauly-reagens hver 1 flekk. In the paper chromatogram in systems 43, 45 and 54, the tripeptide ester migrates with the solvent front and gives 1 spot each with ninhydrin and Pauly's reagent.

Oppløsningen av 10,36 g (17,7 mmol) PZ-Val-Lys(BOC)-OH og 7,69 g (17,7 mmol) H-Val-Tyr-Pro-OtBu i 140 ml friskt destillert dimetylformamid tilsettes ved 0° C 4,2 g dicykloheksyl-karbodiimid (15-prosents overskudd) i 12 ml dimetylformamid og det står i 2 dager ved 0° C. Opp-løsningen som er befridd for urinstoff lar man stå videre i 30 minutter med 0,5 ml iseddik, avdamper oppløsningsmidlet i vakuum inntil lite volum og opptar den si-rupøse rest i meget eddikester. Eddikester-fasen vaskes fire ganger med 25 ml 0,2-N. The solution of 10.36 g (17.7 mmol) PZ-Val-Lys(BOC)-OH and 7.69 g (17.7 mmol) H-Val-Tyr-Pro-OtBu in 140 ml of freshly distilled dimethylformamide is added at 0° C. 4.2 g of dicyclohexylcarbodiimide (15 percent excess) in 12 ml of dimethylformamide and it stands for 2 days at 0° C. The solution, which has been freed from urea, is allowed to stand for 30 minutes with 0.5 ml of glacial acetic acid, evaporates the solvent in a vacuum to a small volume and takes up the syrupy residue in a lot of vinegar. The acetic ester phase is washed four times with 25 ml of 0.2-N.

ammoniumhydroksydoppløsning, 2 ganger ammonium hydroxide solution, 2 times

med 30 ml vann, 2 ganger med 30 ml iskald 10-prosentig sitronsyreoppløsning og with 30 ml of water, 2 times with 30 ml of ice-cold 10 percent citric acid solution and

til slutt nøytralt med vann. Etter tørking med natriumsulfat og fordampning av oppløsningsmidlet får man 17 g rått amorft reaksj onsprodukt. For videre rensning tilsetter man råproduktet, oppløst i 100 ml kloroform, i en med 10 prosents vann des-aktivert silikagelsøyle (570 g; <I> 5,6 cm.h = 41 cm). Eluert med kloroform vandrer den orangerøde sone bare langsomt, mens med kloroform .eddikester 2:1 kan det ut-vaskes to fraksjoner. finally neutral with water. After drying with sodium sulphate and evaporation of the solvent, 17 g of crude amorphous reaction product are obtained. For further purification, the crude product, dissolved in 100 ml of chloroform, is added to a silica gel column deactivated with 10 percent water (570 g; <I> 5.6 cm.h = 41 cm). Eluted with chloroform, the orange-red zone migrates only slowly, while with chloroform.acetic ester 2:1 two fractions can be washed out.

Den første fraksjon 4,8 g er ennå sterkt forurenset med dicykloheksylurinstoff og PZ-dipeptid og lar seg krystallisere fra acetonitril bare i dårlig utbytte, mens den annen fraksjon (7,2 g) igjen utfelles fra 200 ml acetonitril som geleaktig produkt. Utbytte: 5,1 g PZ-pentapeptidester, smeltepunkt 154—158° C. The first fraction 4.8 g is still heavily contaminated with dicyclohexylurea and PZ dipeptide and can be crystallized from acetonitrile only in poor yield, while the second fraction (7.2 g) is again precipitated from 200 ml of acetonitrile as a gel-like product. Yield: 5.1 g PZ-pentapeptide ester, melting point 154-158° C.

Analysefraksj onen smelter etter en videre krystallisasjon ved 157—159° C. The analysis fraction melts after further crystallization at 157-159° C.

I ultrafiolett spektrum (opptatt i finsprit) viser forbindelsen 2 maksima ved 227 m\ i og 322 mjx med e-verdiene 20.700 og 21.100. In the ultraviolet spectrum (recorded in alcohol), compound 2 shows maxima at 227 m\i and 322 mjx with e values of 20,700 and 21,100.

I tyntlagskromatogram (kiselgel G; Merck) er Rf-verdiene: 0,23 (kloroform : aceton = 95:5), og 0,60 (benzol : aceton = 1:1). In the thin-layer chromatogram (silica gel G; Merck), the Rf values are: 0.23 (chloroform : acetone = 95:5), and 0.60 (benzene : acetone = 1:1).

1,4 g PZ-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu rystes i 100 ml metanol i nærvær av 400 mg 10 pst.-ig palladium-karbonkatalysator i 6 timer ved 5 atm. med hydrogen i autoklav. Man frafiltrerer katalysatoren, vasker denne gjentatt med metanol og avdamper oppløsningsmidlet i vakuum. Fordampningsresten rives ut med meget eter og tørkes i høyvakuum. Det resulterer i et fint amorft pulver. Utbytte: 980 mg. 1.4 g of PZ-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu are shaken in 100 ml of methanol in the presence of 400 mg of 10% palladium-carbon catalyst for 6 hours at 5 atm. with hydrogen in an autoclave. The catalyst is filtered off, washed repeatedly with methanol and the solvent is evaporated in vacuo. The evaporation residue is removed with a lot of ether and dried in a high vacuum. This results in a fine amorphous powder. Yield: 980 mg.

I systemene 54 og 49 vandrer forbindelsen med oppløsningsmiddelfronten. In systems 54 and 49, the compound migrates with the solvent front.

I tyntlagskromatogram (kiselgel G) i system dioksan : vann = 9,1 er Rf-verdien 0,65. In the thin-layer chromatogram (silica gel G) in the system dioxane : water = 9.1, the Rf value is 0.65.

276 mg (0,16 mmol) PZ-Lys-Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC) - Arg (N02) - Arg(N02)-Pro-OCH3 (tørket over fosfor-pentoksyd i høyvakuum ved 80° C) opp-løses i en blanding av 1 ml absolutt dimetylformamid, 2 ml absolutt tetrahydrofuran og kjøles i iskoksalt-kuldebad til —10° C. Deretter tilsetter man 0,16 mmol trietylamin i 1,6 ml tetrahydrofuran og etter videre 5 minutter 0,16 mmol klor-maursyreisobutylester i 1,6 ml abs. tetrahydrofuran. Man lar det reagere 15 minutter i kuldebad og tilsetter deretter 140 mg H-Val-Lys (BOC) -Val-Tyr-Pro-OtBu oppløst i 2 ml abs. tetrahydrofuran. Man rører ennå 15 minutter i isbad og deretter 1 time ved romtemperatur, deretter avdamper man oppløsningsmidlet i vakuum ved 40° C og utfeller reaksj onsproduktet med meget eter. Det tørkede råprodukt (395 mg) settes i 4 ml alkoholfri kloroform til en aluminiumoksydsøyle (aktivitet III, 40 g) og gjennomvaskes med 100 ml kloroform. Den gule sone med peptidderivatet vandrer derved bare langsomt. Deretter gj ennomvaskes med 80 ml kloroform metanol = 95:5. Derved kan det kromatogra-fisk elueres et ensartet produkt på 290 mg. Rf = 0,75, dioksan:vann = 9:1 i tyntlagskromatogram. . Stoffet smelter, krystallisert fra acetonitril, ved 160—165° C. Det ultrafiolette spektrum i etanol viser maksima ved l = 272 mu. (e = 36.800) og 319 mu (e = 20.400). 276 mg (0.16 mmol) PZ-Lys-Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC) - Arg (N02) - Arg(N02)-Pro-OCH3 (dried over phosphorus pentoxide in high vacuum at 80° C) is dissolved in a mixture of 1 ml of absolute dimethylformamide, 2 ml of absolute tetrahydrofuran and cooled in an ice-cold salt bath to -10° C. Then 0.16 mmol of triethylamine is added in 1.6 ml of tetrahydrofuran and then 5 minutes 0.16 mmol chloroformic acid isobutyl ester in 1.6 ml abs. tetrahydrofuran. It is allowed to react for 15 minutes in a cold bath and then 140 mg of H-Val-Lys (BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu dissolved in 2 ml of abs. tetrahydrofuran. The mixture is stirred for a further 15 minutes in an ice bath and then for 1 hour at room temperature, then the solvent is evaporated in vacuo at 40° C and the reaction product is precipitated with a lot of ether. The dried crude product (395 mg) is added to an aluminum oxide column (activity III, 40 g) in 4 ml of alcohol-free chloroform and washed through with 100 ml of chloroform. The yellow zone with the peptide derivative therefore moves only slowly. Then wash again with 80 ml of chloroform methanol = 95:5. Thereby, a uniform product of 290 mg can be chromatographically eluted. Rf = 0.75, dioxane:water = 9:1 in thin layer chromatogram. . The substance melts, crystallized from acetonitrile, at 160-165° C. The ultraviolet spectrum in ethanol shows maxima at l = 272 mu. (e = 36,800) and 319 mu (e = 20,400).

320 mg PZ-tetradekapeptid-tert.-bu-tylester rystes med hydrogen i 6 ml 90 pst.-ig eddiksyre og i nærvær av 100 mg 320 mg of PZ-tetradecapeptide-tert.-butyl ester are shaken with hydrogen in 6 ml of 90% acetic acid and in the presence of 100 mg

10 pst.-ig palladiumkarbonkatalysator i 5 10% palladium carbon catalyst in 5

timer ved 5 atm. Deretter fylles reaksj ons-oppløsningen i en hydrerente, og det rystes videre i 17 timer med 100 mg frisk Pd-katalysator under normalbetingelser. For adsorpsjon av det dannede karbondioksyd mellomsjåltes ennå en 2. hydrerente med kalilut. Den frafiltrerte katalysator vaskes grundig med 90 pst.-ig eddiksyre og metanol, og oppløsningsmidlet inndampes i vakuum til tørrhet. Etter tørking får man 220 mg av et hvitt amorft pulver. hours at 5 atm. The reaction solution is then filled into a hydrant, and it is further shaken for 17 hours with 100 mg of fresh Pd catalyst under normal conditions. For adsorption of the carbon dioxide formed, a 2nd hydrogen bath with potassium hydroxide was also intersalted. The filtered-off catalyst is washed thoroughly with 90% acetic acid and methanol, and the solvent is evaporated in vacuo to dryness. After drying, 220 mg of a white amorphous powder is obtained.

Det ultrafiolette spektrum viser i finsprit ved 278 myi det maksima (e = 1500) som er karakteristisk for tyrosin. The ultraviolet spectrum shows in distilled spirits at 278 myi the maxima (e = 1500) which are characteristic of tyrosine.

I papirkromatogrammet i systemene 49, 50 og 54 vandrer forbindelsen med opp-løsningsmiddelveggen og gir positive reak-sjoner med ninhydrin, Pauly- og Sakagu-chi-reagens. In the paper chromatogram in systems 49, 50 and 54, the compound migrates with the solvent wall and gives positive reactions with ninhydrin, Pauly and Sakagu-chi reagent.

Eksempel 2: Example 2:

120 mg (0,2 mmol) tert.-butyloksykar-bonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metio-nin-hydrazid oppløses i 1,5 ml dimetylformamid. Under omrøring tilsettes ved 120 mg (0.2 mmol) of tert.-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionine hydrazide is dissolved in 1.5 ml of dimethylformamide. Add wood while stirring

—10° C 0,6 ml kald l-n. saltsyre, og deretter 0,22 ml l-n. natriumnitritt-oppløs-ning. Etter 3 minutter fortynnes oppløs-ningen med 10 ml kaldt vann, og innstil-les på en pH-verdi 7—8 med l-n. natri-umhydrogenkarbonat-oppløsning. Det utskilte krystallinske tertiære butyloksykar-bonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metio-ninazid frafiltreres etter 15 minutter ved 0° C, vaskes med isvann og oppløses i f uk- -10° C 0.6 ml cold l-n. hydrochloric acid, and then 0.22 ml l-n. sodium nitrite solution. After 3 minutes, the solution is diluted with 10 ml of cold water, and adjusted to a pH value of 7-8 with l-n. sodium bicarbonate solution. The separated crystalline tertiary butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methioninazide is filtered off after 15 minutes at 0° C, washed with ice water and dissolved in

tig tilstand i 3 ml kald dimetylformamid. Etter tilsetning av 0,02 ml (0,15 mmol) trietylamin og 298 mg (0,1 mmol) Glu-(OtBu) -His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys (BOC) - Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys (BOC) - Val-Tyr-Pro-OtBu-tetraacetat står oppløsningen i 20 timer ved 0° C og deretter tilsettes meget eddikester. Det rå tetrakosapeptidderivat renses ifølge den i eksempel i 1 beskrevne fremgangsmåte, ved hjelp av motstrøms-fordeling, og de fraksjoner som fåes i tynnlagskromatogram, som enhetlig produkt, slås sammen. Det erholdte stoff er identisk med det ifølge eksempel 1 fremstilte be-skyttede tetrakosapeptid. tig state in 3 ml of cold dimethylformamide. After addition of 0.02 ml (0.15 mmol) triethylamine and 298 mg (0.1 mmol) Glu-(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys (BOC) - Pro-Val-Gly- Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys (BOC) - Val-Tyr-Pro-OtBu-tetraacetate, the solution stands for 20 hours at 0° C and then a lot of acetic acid is added. The crude tetracosa peptide derivative is purified according to the method described in example 1, using countercurrent distribution, and the fractions obtained in the thin-layer chromatogram, as a uniform product, are combined. The substance obtained is identical to the protected tetracosa peptide prepared according to example 1.

Det som utgangsmaterial anvendte eikosapeptidderivat kan fremstilles som følger: The eicosa peptide derivative used as starting material can be prepared as follows:

6,25 mg (0,273 mmol) Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys- (BOC) -Lys (BOC) -Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu-3 CHgCOOH, fremstilt som i eksempel 1, oppløses i 10 ml tørr pyridin. Man tilsetter oppløsningen 0,17 g para-toluol-sulfonsyre, inndamper til tørrhet, tørker i 18 timer ved 35° C og 0,01 mm Hg, river ut det erholdte pulver for å fjerne pyridintosylat med aceton og filtrerer. Utbytte: 726 mg fargeløst tetradekapeptidtritosylat med smeltepunkt 155—162° C. 525 mg» (0,2 mmol) av tritosylat og 245 mg (0,24 mmol) Z-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH (erholdt ved kondensering av ka.rbobenzoksy-L-arginin med L-tryptofylglycin-metylester, eliminering av karbobenzoksygruppen, kondensering av den frie tripeptidester med karbobenzoksy--L-fenylalanin, eliminering av karbobenzoksygruppen, kondensering av den frie te-trapeptidester med karbobenzoksy-(y-tert,-butyl) -L-glutamyl-L-histidin-azid og forsåpning av metylestergruppen med n.-natronlut i 75 pst.-ig dioksan), oppløses i 4 ml 80 pst.-ig pyridin under omrøring ved 50° C. Oppløsningen tilsettes 52 mg 0,25 mmol) dicykloheksylkarbodiimid, omrøres ved 50° C og det tilsettes 52 mg dicykloheksylkarbodiimid etter 3 og etter 6 timer. Etter 20 timer avkjøler man den svakt uklare oppløsning til 10° C, frafiltrerer utskilt dicykloheksylurinstoff og tilsetter eter under omrøring. Derved utfelles amorft eikosapeptidtritosylat. Dette skil- les fra, oppløses i 10 ml 60 pst.-ig metanol og kromatograferes gjennom en søyle av 4 ml Amberlit-IRA-400 (acetatform). Eluatet gir etter inndampning i vakuum og utrivning av resten med eter 650 mg rå eikosapeptidtriacetat. Dette viser i tynn--lagkromatogram følgende hovedf lekker: Rf1))0 = 0,34 (på aluminiumoksyd); Rf10! = 0,76 (på silikagel); Rfn0<=><0,>45 (på silikagel); utvikling med Reindel-Hoppe-, Pauly- og Ehrlich-reagens. 6.25 mg (0.273 mmol) Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys-(BOC)-Lys (BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu -3 CHgCOOH, prepared as in example 1, is dissolved in 10 ml of dry pyridine. 0.17 g of para-toluene-sulfonic acid is added to the solution, evaporated to dryness, dried for 18 hours at 35° C. and 0.01 mm Hg, the powder obtained is ground to remove pyridine tosylate with acetone and filtered. Yield: 726 mg of colorless tetradecapeptide tritosylate with melting point 155-162° C. 525 mg» (0.2 mmol) of tritosylate and 245 mg (0.24 mmol) of Z-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly -OH (obtained by condensation of carbobenzoxy-L-arginine with L-tryptophyllglycine methyl ester, elimination of the carbobenzoxy group, condensation of the free tripeptide ester with carbobenzoxy-L-phenylalanine, elimination of the carbobenzoxy group, condensation of the free tetrapeptide ester with carbobenzoxy-(γ-tert,-butyl)-L-glutamyl-L-histidine-azide and saponification of the methyl ester group with sodium hydroxide solution in 75% dioxane), dissolve in 4 ml of 80% pyridine with stirring at 50° C. 52 mg (0.25 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide is added to the solution, stirred at 50° C and 52 mg of dicyclohexylcarbodiimide is added after 3 and after 6 hours. After 20 hours, the slightly cloudy solution is cooled to 10° C, separated dicyclohexylurea is filtered off and ether is added while stirring. Amorphous eicosapeptide tritosylate is thereby precipitated. This separation read off, dissolve in 10 ml of 60% methanol and chromatograph through a column of 4 ml Amberlit-IRA-400 (acetate form). The eluate gives, after evaporation in vacuo and trituration of the residue with ether, 650 mg of crude eicosapeptide triacetate. This shows in the thin-layer chromatogram the following main spots: Rf1))0 = 0.34 (on aluminum oxide); RF10! = 0.76 (on silica gel); Rfn0<=><0.>45 (on silica gel); development with Reindel-Hoppe, Pauly and Ehrlich reagents.

600 mg (0,18 mmol) av det oven-nevnte karbobenzoksyeikosapeptidderivat 600 mg (0.18 mmol) of the above-mentioned carbobenzoxy eicosa peptide derivative

oppløses i 10 ml metanol og hydreres i nærvær av 0,5 ml iseddik og 1 g palladium-kull (10 pst. Pd) natten over. Deretter filtreres katalysatoren fra og filtratet inndampes i vakuum. Det erholdte råprodukt oppløses i 10 ml tert.-butanol-vann (1:1) og kromatograferes gjennom en søyle av 6 g karboksymetylcellulose under anvendelse av en lineær gradient mellom 100 ml 50 pst.-ig tert.-butanol og 100 ml 50 pst.-ig tert.-butanol-iseddik (9:1). De etter tynnlagskromatogram på silikagel ensartede eikosapeptidderivat erholdte fraksjoner slås sammen og inndampes i vakuum. dissolve in 10 ml of methanol and hydrate in the presence of 0.5 ml of glacial acetic acid and 1 g of palladium charcoal (10 per cent Pd) overnight. The catalyst is then filtered off and the filtrate is evaporated in a vacuum. The crude product obtained is dissolved in 10 ml of tert-butanol-water (1:1) and chromatographed through a column of 6 g of carboxymethyl cellulose using a linear gradient between 100 ml of 50% tert-butanol and 100 ml of 50% .-ig tert.-butanol glacial acetic acid (9:1). The fractions obtained after thin-layer chromatogram on silica gel uniform eicosa peptide derivative are combined and evaporated in vacuum.

Rf-verdier: Rf54 = 0,50, Rf10I<=> 0,68, Rfll() = 0,12. Etter avspaltning av samt-lige beskyttelsesgrupper viser eikosapeptidet følgende Rf-verdier: R<f>101<=> 0,25 Rf values: Rf54 = 0.50, Rf10I<=> 0.68, Rfll() = 0.12. After removal of all protective groups, the eicosa peptide shows the following Rf values: R<f>101<=> 0.25

(på silikagel), RfltM — 0,30 (på aluminiumoksyd). (on silica gel), RfltM — 0.30 (on alumina).

Eksempel 3: Example 3:

En oppløsning av 5,1 mg ( col, 5 x 10-g mol) av det ovenstående tetrakosapeptid i 2,0 ml 0,1-n. kaliumkloridoppløsning tilsettes 0,020 ml 0,1-n. saltsyre og 0,020 ml 0,1-n. sinksulfatoppløsning. Den inneholder altså: HC1: 2 x 10—« mol; Zn<+>2 2 x 10-(i mol; tetrakosapeptid cv3l,5 x 10— <> mol. A solution of 5.1 mg (col, 5 x 10-g mol) of the above tetracosa peptide in 2.0 ml of 0.1-n. potassium chloride solution, add 0.020 ml of 0.1-n. hydrochloric acid and 0.020 ml of 0.1-n. zinc sulfate solution. It therefore contains: HC1: 2 x 10-« mol; Zn<+>2 2 x 10-(i mol; tetracosa peptide cv3l.5 x 10— <> mol.

Oppløsningen titreres med 0,1-n. natronlut. Titrasjonskurven viser et sink-kompleks med pH = 8,35. Ved og over pH-verdien 8,35 begynner det tungtoppløselige kompleks å falle ut i meget finfordelt, gel-aktig form. Det frasentrifugeres ved pH 9,5 og vaskes med vann. Komplekset har en sterk ACTH-aktivitet. The solution is titrated with 0.1-n. baking soda. The titration curve shows a zinc complex with pH = 8.35. At and above the pH value 8.35, the poorly soluble complex begins to fall out in a very finely divided, gel-like form. It is centrifuged at pH 9.5 and washed with water. The complex has a strong ACTH activity.

Claims

1. Process for the production of new tetracosa peptides with adrenocorticotropic action and with the formula L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-(or glutaminyl)-L-histidyl-L-phenylalan-yl-L -arginyl-L-tryptophyll-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lys -yl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline, its acid addition salts and heavy metal complexes, characterized by a) condensing the decapeptide tertiary butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl - (or glutaminyl)-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyll-glycine, in which an optionally present ycarboxy group P6 in the ghi-tamyl residue is protected, with the tetradeca heptidester L-lysyl-L-prolyl-L-valyl -gly-cyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline ester, in which the g-amino group in the lysyl residue is protected, or b) condenses the tetrapeptide tertiary butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionine or the ts azide with the oak-ose peptide ester L-glutamyl-(or glutaminyl)-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyll-glycyl-L-lysyl-L-pro-lyl-L-valyl-glycyl-L- lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proline ester, wherein e- the amino group in the lysyl residue and a possibly present Y-carboxyl group * the glutamyl residue is protected, leaving the amino and carboxyl groups free, and, if desired, transfer the obtained compounds to their acid addition salts or metal complexes.

2. Method according to claim 1, characterized in that a compound is used as starting material in which the ε-amino group in the lysine is protected with a tert-butyloxycarbonyl residue.

3. Process according to claims 1 and 2, characterized in that a compound is used as starting material in which the γ-carboxyl group in the glutamyl residue is protected with the tert-butyl ester group.

4. Process according to claim 3, characterized in that the condensation is carried out in the presence of a carbodiimide.

5. Method according to claims 1-4, characterized in that the tetracosa peptide L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyll is transferred -glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-propyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L -tyrosyl-L-proline to the zinc complex.