NO142226B - Fremgangsmaate til utvinning av streptokinase - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til utvinning

av streptokinase som etter ytterligere behandling kan finne an-

vendelse som terapeutikum.

Den fibrinolytiske virkning av kulturfiltrater av

mange streptokokkstammer er kjent. Som stoff som er ansvarlig for dette ble det oppdaget streptokinase. Det dannes ved siden av mange andre stoffer som f.eks. streptodornase, streptolysin eller hyaluronidase under bestemte kulturbetingelser. For en terapeutisk anvendelse er det derfor ubetinget nødvendig en ad-

skillelse fra næringsbestanddelene og de andre bakteriestoffveks-lingsprodukter.

En av de herved opptredende hovedvanskeligheter ligger

i håndteringen av de derved dannede relativt store væskemengder,

forbundet med relativt små streptokinasemengder. De tidligere metoder anvender til konsentrering utfellingsreaksjoner med etanol, metanol, ammoniumsulfat eller andre oppløsningsmidler. Ulempen ved disse metoder består på den ene side i ofte ikke meget høye utbytter, i forbruk av store mengder tilsetningsstoffer, forbundet med en primær volumøkning og i relativt liten rensefaktor.

Videre er det kjent en fremgangsmåte til rensing av streptokinase, idet denne fremgangsmåte er karakterisert ved at man adsorberer en fra streptokokkfiltratet utvunnet streptokinase-

holdig vandig pufferoppløsning med molaritet på 0,01 med en pH-

verdi på 5,0 på karboksymetylpolysakkarid, utvasker med puffer-oppløsning av samme molaritet og eluerer hovedfraksjonen av streptokinase med 0,2 molar pufferoppløsning av pH-verdi 5,5.

Fra norsk patent 113.095 er det på den annen side

kjent en fremgangsmåte til rensing av rå streptokinase, idet denne

fremgangsmåte er karakterisert ved at streptokinase adsorberes ved molare fosfatpufferkonsentrasjoner fra 0,005 til 0,015 på celluloseioneutvekslerharpiks og deretter eluerer forurensninger ved gradienteluering ved hjelp av fosfatpuffere i første rekke ved en molarkonsentrasjon fra 0,02 til 0,06 og deretter elueres streptokinase ved molare konsentrasjoner fra 0,06 til 0,15.

Denne fremgangsmåte gjennomføres hele tiden ved pH 7,5.

En tilsvarende fremgangsmåte er også kjent fra US-patent 344404-5, idet det likeledes er omtalt en finrensing av rå streptokinase ved behandling med DEAE-cellulose. Streptokinase elueres deretter fra cellulosen med 0,1 til 0,15 molar fosfat-puf f er .

Den foreliggende oppfinnelse har til formål å tilveie-bringe en fremgangsmåte til utvinning av streptokinase fra kulturfiltrater av streptokokker, som forbinder høye utbytter, lite materialforbruk og en høy rensningseffekt.

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til utvinning av streptokinase fra kulturfiltrater av streptokokker, hvor streptokinasen utfelles på et adsorberende materiale ved pH-verdier under 3,5 og etter fjerning av forurensninger ved vask elueres med en pufferoppløsning med alkalisk pH-verdi, hvoretter streptokinasen utvinnes fra eluatet, idet fremgangsmåten er karakterisert ved at det som adsorberende materiale anvendes karboksymetylcellulose og forurensninger fjernes ved vask med fortynnet iseddik.

Ved dekantering, filtrering eller sentrifugering

lar CM-cellulosen seg adskille lett med den bundne streptokinase. Ved utvasking av CM-cellulosen med 0,01 N eddiksyre lar de fleste medrevne næringsbestanddeler seg fjerne. Streptokinasen gjen-vinnes ved eluering med 0,05 molar fosfatpuffer, som er 0,1 molar med hensyn på natriumklorid, ved pH=8,0. I eluatet kan streptolysinet etter kjente fremgangsmåter ved tilsetning av CaC^ fjernes på det kalsiumfosfat som danner seg, idet samtidig den største del av forurensninger fjernes. Det således dannede produkt utfelles enten med etanol eller ammoniumsulfat på kjent måte, dialyseres mot vann og lyofiliseres. Det inneholder ca. 30.000 _Christensen-enh.eter pr. mg protein og er fritt for streptolysin.

Som næringssubstrat for dyrking av streptokokkene tjener tryptisk kaseinpepton med glukose, salt- og vitamintil-setninger. Andre næringsbunner gir dårligere utbytter.

Det kreves fortrinnsvis ingen dyre tilsetningsstoffer,

den praktiske utførelse er enkel, den anvendte CM-cellulose er regenererbar, utbyttene svinger mellom 60 og 90% og det ekstra-

herte kulturfiltrat er praktisk talt sterilt og kan kasseres uten ytterligere behandling. Ved felling av streptokinase på en ione-utveksler kan det videre ved bestemte ekstraheringsbetingelser fjernes hovedmengden av forurensninger uten ekstra arbeids<p>rosess.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av et

eksempel:

10 g CM-cellulose ekvilibreres med 500 ml 0,2 N

eddiksyre i 30 minutter og vaskes deretter med 500 ml 0,01 N

eddiksyre. Den således forberedte karboksymetylcellulose setter man til 5 liter streptokokk-kulturfiltrat, hvis pH-verdi på for-

hånd ble innstilt til 3,0. Etter to timers omrøring filtrerer man over en grov glassfritte (G2) og kasserer filtratet. CM-cellulo-

sen vaskes med 0,5 1 0,01 N eddiksyre. Deretter eluerer man streptokinasen med 1 liter fosfatpuffer (0,05 molar fosfat, 0,1

molar NaCl, pH=8,0). pH-verdien i eluatet ble innstilt til 7,0

og streptolysinet utfelt med 10 ml 1 molar CaCl2 ved konstant holdt pH-verdi. Utfellingen ble bortsentrifugert etter 30 minutter og kassert. Streptokinasen felles ved pH 5,5 med 350 g ammonium-

sulfat (pr. liter). Den dannede utfelling oppløser man i ca.

60 ml vann, innstiller suspensjonens pH-verdi til 9,0, dialyserer sulfatfri og lyofiliserer.

Man får 450 mg streptokinase med en titer på 2,5x10<4 >Christensen-enheter pr. mg. Det tilsvarer 80% av utgangsaktivi-teten. For terapeutiske formål kan det dannede produkt videre-

renses etter en av de kjente fremgangsmåter.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til utvinning av streptokinase fra kulturfiltrater av streptokokker, hvor streptokinasen utfelles på et adsorberende materiale ved pH-verdier under 3,5 og etter fjerning av forurensninger ved vask elueres med en pufferopp-løsning med alkalisk pH-verdi, hvoretter streptokinasen utvinnes fra eluatet, karakterisert ved at det som adsorberende materiale anvendes karboksymetylcellulose og forurensninger fjernes ved vask med fortynnet iseddik.