NO139844B

NO139844B - PROCEDURE FOR REGULATING THE CONTENT OF AN ENZYMATIC TRANSFORMABLE COMPOUND IN A SOLUTION USING A SOLUBLE ENZYME

Info

Publication number: NO139844B
Application number: NO742595A
Authority: NO
Inventors: Ronald Alexander Nixon Edwards; Peter Morris Cantrell; John James Miller
Original assignee: Unisearch Ltd
Priority date: 1974-07-16
Filing date: 1974-07-16
Publication date: 1979-02-12
Also published as: NO742595L; NO139844C

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte The present invention relates to a method

for regulering av innholdet av en enzymatisk omdannbar forbindelse i en opplosning under anvendelse av et opploselig enzym som har en molekylstorrelse som er storre enn den for forbindelsen som skal omdannes. for regulating the content of an enzymatically convertible compound in a solution using a soluble enzyme having a molecular size larger than that of the compound to be converted.

Enzymer blir brukt stadig mer industrielt til kjem-iske reaksjoner. Av Skonomiske grunner, og for å unngå for-urensning av sluttproduktet, er det ofte nodvendig å gjenvinne enzymet som ble anvendt i prosessen fra reaksjonsvæsken. Vanligvis har to fremgangsmåter vært brukt for å gjenvinne enzymene, den forste består i å uopploseliggjore enzymet ved binding til et uoppløselig bærestoff, og den andre består i å holde enzymet tilbake i en membran-diffusjonsreaktor og la væsken strSmme forbi diffusjonssekken. Den forste fremgangsmåten har den ulempe at de uopploseliggjorte enzymer har tendens til å miste aktiviteten temmelig hurtig med tiden, man har også funnet at det kreves store enzymbæreoverflater eller lange oppholdstider, som vil gjore metoden kostbar. Den andre fremgangsmåten som bygger på diffusjon av reaktanter og reak-sjonsprodukter gjennom en halvpermeabel membran er langsom og krever store membranoverflater som gjor metoden uegnet for tek-nisk bruk. Enzymes are increasingly used industrially for chemical reactions. For economic reasons, and to avoid contamination of the final product, it is often necessary to recover the enzyme that was used in the process from the reaction liquid. Generally, two methods have been used to recover the enzymes, the first consists of insolubilizing the enzyme by binding to an insoluble carrier, and the second consists of retaining the enzyme in a membrane diffusion reactor and allowing the liquid to flow past the diffusion bag. The first method has the disadvantage that the insolubilized enzymes tend to lose activity rather quickly over time, it has also been found that large enzyme support surfaces or long residence times are required, which will make the method expensive. The other method, which is based on diffusion of reactants and reaction products through a semi-permeable membrane, is slow and requires large membrane surfaces, which makes the method unsuitable for technical use.

Foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte for regulering av innholdet av en enzymatisk omdannbar forbindelse i en opplosning under anvendelse av et opploselig enzym som har en molekylstorrelse som er storre enn den for forbindelsen som skal omdannes, hvilken fremgangsmåte omfatter et trinn for separering av enzymet fra opplesningen etter den onskede reaksjon, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at alle stoffer som har ,en.molelcylstorr.elsfi storre ann..enzymets molekylstorrelse filtreres fra oppløsningen under anvendelse av et forste filter, ved at enzymet tilsettes til det forste filtrat for å frembringe den onskede enzymatiske omdanning av forbindelsen, at enzymet filtreres fra opplosningen med et andre filter og at det andre filtratet settes til stoffene som ble frafiltrert ved hjelp av det forste filter, og at enzymet som filtreres fra opplosningen ved hjelp av det . ■ andre filter eventue-lt .tilbakeføres for tilsetning til ferskt filtrat fra det forste filter. The present invention thus relates to a method for regulating the content of an enzymatically convertible compound in a solution using a soluble enzyme that has a molecular size larger than that of the compound to be converted, which method comprises a step for separating the enzyme from the readout after the desired reaction, and this method is characterized by the fact that all substances having a molecular size greater than or equal to the enzyme's molecular size are filtered from the solution using a first filter, by the enzyme being added to the first filtrate to produce the desired enzymatic conversion of the compound, that the enzyme is filtered from the solution with a second filter and that the second filtrate is added to the substances that were filtered out using the first filter, and that the enzyme that is filtered from the solution using it. ■ second filter possibly returned for addition to fresh filtrate from the first filter.

Oppfinnelsen angår også en apparatur for gjennom-føring av den ovenfor angitte fremgangsmåte og denne apparatur karakteriseres ved at den omfatter et forste filter med en porestbrrelse som ikke er storre enn det anvendte enzyms molekylstbrrelse, et reaksjonskar for den forste enzymatiske omdanning av forbindelsen som skal omdannes, et andre filter som har en porestbrrelse som er mindre enn enzymets molekylstorrelse og midler for å kombinere filtratet fra det andre filter med stoffene som ble frafiltrert ved hjelp av det forste filter. The invention also relates to an apparatus for carrying out the above-mentioned method and this apparatus is characterized by the fact that it comprises a first filter with a pore size that is not larger than the molecular size of the enzyme used, a reaction vessel for the first enzymatic conversion of the compound to be converted , a second filter having a pore size smaller than the molecular size of the enzyme and means for combining the filtrate from the second filter with the substances filtered out by means of the first filter.

Oppfinnelsen lar seg særlig anvende på hydrolyse av laktose i melk, men kan også brukes på mange andre områder, f.eks. for innstilling av glukoseinnholdet i eggalbumin med glukoseoksidase eller fjerning av limonin fra sitrussafter ved hjelp av limoninase. The invention can be particularly applied to the hydrolysis of lactose in milk, but can also be used in many other areas, e.g. for setting the glucose content in egg albumin with glucose oxidase or removing limonin from citrus juices using limoninase.

Det foretrekkes at den enzymholdige væske resirkuleres fra det andre filter til reaktoren, for å opprettholde en kontinuerlig strbmning av opplosning fra apparatet. Reaktoren kan være av plugg-strbmningstypen selv om andre reaktor-typer, særlig kontinuerlige reaktorer som tilbakeblandings-reaktorer også kan brukes. It is preferred that the enzyme-containing liquid be recycled from the second filter to the reactor, in order to maintain a continuous flow of solution from the apparatus. The reactor can be of the plug flow type although other reactor types, particularly continuous reactors such as back-mix reactors can also be used.

Man vil innse at hvis porestbrrelsen for de to filtere er den samme, eller hvis porestbrrelsen for det andre filteret er storre enn for det forste filteret, vil væskens sluttsammensetning være den samme som utgangssammensetningens, med unntak av den enzymatiske omdannelse av substratforbindelsen. Denne fremgangsmåte kan således brukes for gjennomfbring av en billig omdannelse av spesielle stoffer i heterogen opplosning eller suspensjon forutsatt at forbindelsen kan .omdannes enzymatisk av et enzym med storre molekylstorrelse enn forbind-elsens molekylstorrelse. Fremgangsmåten er særlig nyttig når man vil fjerne fra opplosningen en annen forbindelse enn sub-stratf orbindelsen og som også ville omdannes av enzymet eller som ville deaktivere enzymet. Man har vist at ved å fjerne de storre partikler eller molekyler fra opplosningen for den enzymatiske omdanning av substratforbindelsen vil enzymets aktivitet oke. It will be realized that if the pore flow for the two filters is the same, or if the pore flow for the second filter is greater than for the first filter, the final composition of the liquid will be the same as the starting composition, with the exception of the enzymatic conversion of the substrate compound. This method can thus be used to carry out an inexpensive conversion of special substances in a heterogeneous solution or suspension, provided that the compound can be enzymatically converted by an enzyme with a larger molecular size than the compound's molecular size. The method is particularly useful when one wants to remove from the solution a compound other than the substrate compound and which would also be converted by the enzyme or which would deactivate the enzyme. It has been shown that by removing the larger particles or molecules from the solution for the enzymatic conversion of the substrate compound, the activity of the enzyme will increase.

Om bnsket kan enzymet podes på et opploselig substrat for å oke dets molekylstorrelse og således den hastighet hvor-med reaksjonsopplbsningen kan filtreres. I foreliggende be-skrivelse vil uttrykket "enzymets molekylstbrrelse" betegne molekylstbrrelsen for enzymet selv sammen med et eventuelt opploselig substrat som det er podet til. If desired, the enzyme can be grafted onto a soluble substrate to increase its molecular size and thus the rate at which the reaction solution can be filtered. In the present description, the expression "molecular size of the enzyme" will denote the molecular size of the enzyme itself together with any soluble substrate to which it is grafted.

I det fblgende gis som eksempler foretrukne utfør-elser av oppfinnelsen under henvisning til den vedlagte skje-matiske tegning av en apparatur i henhold til oppfinnelsen. In the following, preferred embodiments of the invention are given as examples with reference to the attached schematic drawing of an apparatus according to the invention.

Apparaturen for regulering av laktoseinnholdet i skummet melk ved hjelp av P-galaktosidase består av en for-rådsbeholder 10, ultrafiltreringsanlegg 11 og 12 og en enzym-reaktor 13. The apparatus for regulating the lactose content in skimmed milk by means of β-galactosidase consists of a storage container 10, ultrafiltration facilities 11 and 12 and an enzyme reactor 13.

Skummet melk tilfores periodevis til forrådsbeholder-en 10 gjennom ledning 14 og går derfra kontinuerlig gjennom ledning 15 og pumpen 16 til forste ultrafiltreringsanlegg 11. Skimmed milk is fed periodically to the storage container 10 through line 14 and from there goes continuously through line 15 and the pump 16 to the first ultrafiltration system 11.

Melken som går gjennom ultrafiltreringsanlegget 11 separeres i et filtrat som består av en opplosning av molekyler med molekylstbrrelse mindre enn enzymets molekylstbrrelse og et konsentrat som inneholder molekyler med storre mol-stbrrelse. I praksis fant man det hensiktsmessig å drive ul-traf iltreringsanlegget under slike forhold at 90% av skummet-melken gikk gjennom som filtrat og 10% ble separert som konsentrat. The milk that passes through the ultrafiltration facility 11 is separated into a filtrate consisting of a solution of molecules with a molecular size smaller than the enzyme's molecular size and a concentrate containing molecules with a larger molecular size. In practice, it was found appropriate to operate the ultrasonic filtration plant under such conditions that 90% of the skimmed milk passed through as filtrate and 10% was separated as concentrate.

Filtratet går gjennom ledning 17 til enzymreaktoren 13 mens konsentratet fores direkte gjennom ledning 18 til en blander 19 hvor konsentratet kombineres med det enzymbehand-lede filtrat. The filtrate goes through line 17 to the enzyme reactor 13, while the concentrate is fed directly through line 18 to a mixer 19 where the concentrate is combined with the enzyme-treated filtrate.

For å lette oppstartingen av apparatet er det in-stallert en resirkulasjonslinje 21 og pumpe 22 som resirkulerer melkekonsentrat gjennom ultrafiltreringsanlegget 11. To facilitate the start-up of the device, a recirculation line 21 and pump 22 have been installed which recycles milk concentrate through the ultrafiltration system 11.

Ledningen 17 forer filtratet fra ultrafiltreringsanlegget 11 til enzymreaktoren 13 som er forsynt med en rbrer 23. Enzymet (3-galaktosidase settes til filtratet og omdanner laktosen i melkefiltratet til glukose og galaktose. Man har kunnet oppnå en omsetning på 90% under samtidig kort oppholds-tid i reaktoren. The line 17 leads the filtrate from the ultrafiltration plant 11 to the enzyme reactor 13, which is equipped with a reactor 23. The enzyme (3-galactosidase is added to the filtrate and converts the lactose in the milk filtrate to glucose and galactose. It has been possible to achieve a conversion of 90% during a short residence time time in the reactor.

Den omsatte melken fores gjennom ledning 24 og pumpen 25 samt varmeveksler 26 til et andre ultrafiltreringsan-. legg 12. Varmeveksleren 26 brukes for å holde temperaturen i enzymreaktoren 13 på den temperatur som gir maksimal aktivitet for det aktuelle enzym i reaktoren. The converted milk is fed through line 24 and pump 25 as well as heat exchanger 26 to a second ultrafiltration unit. add 12. The heat exchanger 26 is used to keep the temperature in the enzyme reactor 13 at the temperature that gives maximum activity for the relevant enzyme in the reactor.

Ultrafiltreringsanlegget 12 separerer den omsatte melken til et filtrat som inneholder reagerte melkebestand-deler og et konsentrat som inneholder enzymet. Filtratet går gjennom ledning 27 til blanderen 19 for kombinasjon med melke-konsentratet som er produsert i forste ultrafilter 11. Enzym-konsentratet fra det andre ultrafilter 12 resirkuleres til enzymreaktoren 13 gjennom ledning 28. En- resirkulasjonsled-ning 29 og pumpe 30 er også innkoplet. The ultrafiltration unit 12 separates the reacted milk into a filtrate containing reacted milk component parts and a concentrate containing the enzyme. The filtrate goes through line 27 to the mixer 19 for combination with the milk concentrate produced in the first ultrafilter 11. The enzyme concentrate from the second ultrafilter 12 is recycled to the enzyme reactor 13 through line 28. A recirculation line 29 and pump 30 are also connected .

Den laktose-regulerte melken inneholdt 19% av det opprinnelige laktoseinnhold. Rest-laktoseinnholdet kan regu-leres ved å variere separasjonsforholdet som oppnås gjennom forste filter eller ved å innstille hydrolysegraden for filtratet i enzymreaktoren. The lactose-regulated milk contained 19% of the original lactose content. The residual lactose content can be regulated by varying the separation ratio achieved through the first filter or by adjusting the degree of hydrolysis for the filtrate in the enzyme reactor.

Om onsket kan resirkulasjonsledningen 21 omfatte en lagringsbeholder slik at substratet kan behandles satsvis med storre volumer. Denne fremgangsmåten har den fordel sammenlignet med en kontinuerlig metode at filteret vil operere mer effektivt ved lavere proteininnhold. Hvis filteret kjbres som kontinuerlig filter for melken fra tanken 10, vil det alltid arbeide ved maksimale proteininnhold etter en kort opp-kjbringsperiode. Hvis filteret drives satsvis, vil det bare virke en kort periode ved maksimalt proteininnhold etter en forlenget, og mer effektiv, oppbygningsperiode. If desired, the recirculation line 21 can comprise a storage container so that the substrate can be processed in batches with larger volumes. This method has the advantage compared to a continuous method that the filter will operate more efficiently at a lower protein content. If the filter is bought as a continuous filter for the milk from the tank 10, it will always work at maximum protein content after a short collection period. If the filter is operated in batches, it will only work for a short period at maximum protein content after an extended, and more efficient, build-up period.

I henhold til en alternativ fremgangsmåte kan filtratet fra lédning 27, eller vann, resirkuleres til lagringsbeholder 10 og hele apparaturen drives satsvis for å oppnå lav- According to an alternative method, the filtrate from line 27, or water, can be recycled to storage container 10 and the entire apparatus operated in batches to achieve low

ere laktoseinnhold i sluttproduktet. are lactose content in the final product.

Apparatet kan omfatte flere mikrofiltere i serie for gjennomførelse av forste og/eller andre filtreringstrinn. The apparatus can comprise several microfilters in series for carrying out the first and/or second filtration stage.

Melk med regulert laktoseinnhold kan gis til person- Milk with regulated lactose content can be given to persons

er som ikke er istand til å metabolisere laktose, en sykdom som er vanlig i store områder av Asia og Midtosten. Den regu- are unable to metabolize lactose, a disease common in large areas of Asia and the Middle East. The regu-

lerte melken finner betraktelig anvendelse for fremstilling av matvarer idet f.eks. laktose har tendens til å skille seg ut fra frosne melkeprodukter som iskrem mens bruk av melk behand- lerte milk finds considerable use for the production of foodstuffs, as e.g. lactose tends to separate from frozen milk products such as ice cream, while the use of milk treats

let ifolge oppfinnelsen avhjelper dette problem og reduserer den mengden sukrose som må tilsettes produktet på grunn av den hoyere sotningseffekt for glukose og galaktose sammenlignet med den opprinnelige laktose. Bakte matvarer som kaker etc. according to the invention, this problem is remedied and the amount of sucrose that must be added to the product is reduced due to the higher sooting effect for glucose and galactose compared to the original lactose. Baked foods such as cakes etc.

har bedre bruningsegenskaper når de lages med laktose-regulert melk. have better browning properties when made with lactose-regulated milk.

Apparaturen som er beskrevet kan brukes for utforelse The apparatus described can be used for carrying out

av andre fremgangsmåter i henhold til oppfinnelsen. Eksempler er: of other methods according to the invention. Examples are:

Eksempel 1 - Regulering av glukoseinnholdet i eggalbumin Example 1 - Regulation of the glucose content in egg albumin

Eggalbumin inneholder vanligvis ca. 0, 5% glukose. Egg albumin usually contains approx. 0.5% glucose.

Når eggalbumin tbrkes til lavt fuktighetsinnhold, vil glukosen reagere med aminogrupper som leveres av albuminets hovedbestand-del, proteinene, under dannelse av mbrkfargede polymerer som er uheldig for utseendet, opplbselighet og funksjonelle egen-skaper for albumin når det brukes til koking for matlaging. When egg albumin is used for low moisture content, the glucose will react with amino groups supplied by the albumin's main component, the proteins, forming dark colored polymers that are detrimental to the appearance, solubility and functional properties of albumin when it is used for cooking.

Det er vanlig å fjerne glukose fra albumin for tork-ingen. Dette kan oppnås i henhold til foreliggende metode ved å bruke glukose-oksidase som enzym i forbindelse med filtere som har slik porestorrelse at glukose-oksidase holdes tilbake. I dette tilfelle må man fortynnet albuminet med vann for det tilfores forste filter idet albuminets viskositet er hoy og vanskelig strommer gjennom systemet. Om onsket kan filtratet fra det andre filteret resirkuleres og settes til eggalbuminet istedenfor vann for å redusere viskositeten, denne resirkula- It is common to remove glucose from albumin for drying. This can be achieved according to the present method by using glucose oxidase as an enzyme in connection with filters that have such a pore size that glucose oxidase is retained. In this case, the albumin must be diluted with water before it is fed to the first filter, as the albumin's viscosity is high and it is difficult to flow through the system. If desired, the filtrate from the second filter can be recycled and added to the egg albumin instead of water to reduce the viscosity, this recycle

sjon har den fordel at stoffmengden som går gjennom systemet reduseres og konsentrasjonen av andre bestanddeler enn glukose holdes konstant. tion has the advantage that the amount of substance passing through the system is reduced and the concentration of components other than glucose is kept constant.

Eksempel 2 - Fjerning av glukose fra blodplasma for torking Blodplasma fores til forste filter hvor molekyler storre enn glukose-oksidase fjernes.. Det gjenværende serum passerer filteret og glukosen i filtratet omdannes til glukon-syre ved glukose-oksidase-enzymet. Example 2 - Removal of glucose from blood plasma for drying Blood plasma is fed to the first filter where molecules larger than glucose oxidase are removed. The remaining serum passes the filter and the glucose in the filtrate is converted to gluconic acid by the glucose oxidase enzyme.

Grunnene til at man fjerner glukose fra blodplasma er de samme som anfort i eksempel 1, dvs. hvis tbrket blodplasma brukes som et for eller et mikrobiologisk medium, vil det gjennomgå en "bruningsreaksjon" hvis glukose og aminogrupper reagerer under dannelse av fargede polymerer. The reasons for removing glucose from blood plasma are the same as stated in example 1, i.e. if used blood plasma is used as a lining or a microbiological medium, it will undergo a "browning reaction" where glucose and amino groups react to form colored polymers.

Eksempel 5 - Fjerning av bitterstoffer fra appelsinsaft Example 5 - Removal of bitter substances from orange juice

Appelsinsaft som er bitter inneholder forbindelsen limonin som kan nedbrytes og avbitres av enzymet limoninase. Orange juice that is bitter contains the compound limonin, which can be broken down and made bitter by the enzyme limoninase.

Appelsinsaft innmates til forste filter hvor uopp-løselige stoffer og opplbselige forbindelser med storre mol-stbrrelse enn limoninase fjernes. Enzymet limoninase bringes til innvirkning på limoninet mellom de to filtere. Det er ikke helt klart hva som danner limoninets nedbrytningsproduk-ter, men man har funnet at disse er mindre enn limonin og ikke bitre. Orange juice is fed to the first filter where insoluble substances and soluble compounds with a larger molar mass than limoninase are removed. The enzyme limoninase is brought to bear on the limonin between the two filters. It is not entirely clear what forms limonin's breakdown products, but it has been found that these are smaller than limonin and not bitter.

Claims

1. Method for regulating the content of an enzymatically convertible compound in a solution using a soluble enzyme having a molecular size greater than that of the compound to be converted, which method comprises a step of separating the enzyme from the solution after the desired reaction, characterized in that all substances having a molecular size greater than the molecular size of the enzyme are filtered from the solution using a first filter, in that the enzyme is added to the first filtrate to produce the desired enzymatic conversion of the compound, that the enzyme is filtered from the solution with a second filter and that the second filtrate is added to the substances that were filtered out using the first filter, and that the enzyme that is filtered from the solution using the second filter is possibly returned for addition to fresh filtrate from the first filter.

2. Apparatus for carrying out the method according to claim 1, for regulating the quantity ratio for a compound in solution or suspension by means of a soluble enzyme with a larger molecular size than that of said compound, characterized by a first filter (11) with a pore size smaller than the enzyme's molecular size, a reaction container (13) for enzymatic conversion of the compound, a second filter (12) with a pore size smaller than the enzyme's molecular size and devices (19) which combine the filtrate from the second filter (12) with filtered substances from the first filter (11).