NO137942B

NO137942B - PROCEDURE FOR MAKING A DYE-FREE, WATER-SOLUBLE COLORED SUBSTRATE FOR AMYLASEM} LING

Info

Publication number: NO137942B
Application number: NO312672A
Authority: NO
Inventors: Arthur L Babson; Susan R Babson
Original assignee: Warner Lambert Co
Priority date: 1972-09-01
Filing date: 1972-09-01
Publication date: 1978-02-13
Also published as: NO137942C

Description

Vannløselige farvede substrater hvorfra alt uomsatt farvestoff er blitt fjernet oppnås ved kobling av et reaktivt farvestoff til en stivelse eller stivelsefraksjon i alkalisk løsning, nøytralisering av reaksjonsblandingen og fjerning av alt uomsatt farvestoff ved en flertrinns utfelningsfremgangsmåte som utføres ved kontrollert temperatur, hvorved farvestoffsubstratet utfelles, gjenoppløses og utfelles igjen inntil væsken fra den siste utfeiningen er fri for farve. Skulle overliggende væske inneholde farve av farvestoffet må gjenoppløsningen og gjenutfeiningen fortsettes. Ved å gjennomføre rensningen ved en lav temperatur og ved å utnytte en saltløsning er det mulig å utfelle farvestoffsubstratet med en relativt fortynnet alkoholløsning, som ikke forstyrrer gjen-oppløsningen av farvestoffsubstratet. Flertrinnsutfeiningen utføres ved 4-26°C ved å tilsette til reaksjonsblandingen av Water-soluble colored substrates from which all unreacted dye has been removed are obtained by coupling a reactive dye to a starch or starch fraction in alkaline solution, neutralizing the reaction mixture and removing all unreacted dye by a multi-step precipitation process carried out at controlled temperature, whereby the dye substrate is precipitated, redissolved and is precipitated again until the liquid from the last sweep is free of colour. Should the overlying liquid contain color from the dye, the re-dissolution and re-sweeping must be continued. By carrying out the cleaning at a low temperature and by utilizing a salt solution, it is possible to precipitate the dye substrate with a relatively diluted alcohol solution, which does not interfere with the re-dissolution of the dye substrate. The multi-stage sweep is carried out at 4-26°C by adding to the reaction mixture of

farvet substrat som inneholder en saltkonsentrasjon på fra 0,14 til 4,5%, en vandig alkoholløsning som gir en resulterende konsentrasjon på 10,5% til 34% alkohol i den resulterende blanding; fjerning av overliggende væske som inneholder salt og fritt farvestoff for å colored substrate containing a salt concentration of from 0.14 to 4.5%, an aqueous alcohol solution giving a resulting concentration of 10.5% to 34% alcohol in the resulting mixture; removal of overlying liquid containing salt and free dye to

oppnå en delvis renset farvestoff-substratutfeining; gjenoppløsning av denne utfeining i en av de følgende løsninger: en vandig løsning, achieve a partially purified dye-substrate scavenge; redissolving this slurry in one of the following solutions: an aqueous solution,

en vandig saltløsning som gir opp til 4,5% salt i totalvolumet av farvet substratløsning, en vandig alkoholløsning som gir opp til 34% alkohol i totalvolumet av farvet substratløsning eller en vandig løsning som inneholder mindre enn 0,14% salt og mindre enn 10,5% alkohol; og gjenutfeining av farvet substrat ved å justere konsentrasjonen av salt og alkohol i farvet substratløsning til henholdsvis 0,14% til 4,5% og 10,5% til 34%. Utfelningen/gjen-oppløsning-rensemetoden utføres inntil alt fritt farvestoff er fjernet og det vannløselige, farvede substrat som oppnås er egnet for bruk i en forbedret amylase-fremgangsmåte. an aqueous salt solution giving up to 4.5% salt in the total volume of colored substrate solution, an aqueous alcohol solution giving up to 34% alcohol in the total volume of colored substrate solution or an aqueous solution containing less than 0.14% salt and less than 10 .5% alcohol; and refinishing of colored substrate by adjusting the concentration of salt and alcohol in colored substrate solution to 0.14% to 4.5% and 10.5% to 34%, respectively. The precipitation/redissolution purification method is carried out until all free dye is removed and the water-soluble colored substrate obtained is suitable for use in an improved amylase process.

Stivelse, et polysakkarid, med den empiriske formel ^^lO^n er et P°lvniert materiale som i alt vesentlig består av en amylosefraksjon med den generelle formel: og en amylopektinfraksjon med formelen: Starch, a polysaccharide, with the empirical formula ^^lO^n is a P°lvniated material which essentially consists of an amylose fraction with the general formula: and an amylopectin fraction with the formula:

Amylasene er enzymer som katalyserer hydrolysen av stivelse. The amylases are enzymes that catalyze the hydrolysis of starch.

Amylasene er av to slag, a-amylase som kan hydrolysere både The amylases are of two types, α-amylase which can hydrolyze both

. henholdsvis a- 1, 4 og a- 1, 6 bindinger til amylose og amylopektin, og kan derfor hydrolysere stivelse fullstendig, og /3-amylase som kan hydrolysere bare a- 1,4-bindingen til amylose og således efter-later a-1,6 bindingen i amylopektin uforandret. Virkningen av a-amylase er å hydrolysere både amylose og amylopektin-på tilfeldig måte som gir efterhvert små polysakkaridfragmenter inntil intet annet er tilbake enn maltose og kanskje noe glukose, a-amylase aktiveres av kloridioner og har optimal aktivitet ved en pH på ca. 7. . respectively a- 1, 4 and a- 1, 6 bonds to amylose and amylopectin, and can therefore hydrolyze starch completely, and /3-amylase which can only hydrolyze the a- 1,4 bond to amylose and thus leaves a- 1,6 bond in amylopectin unchanged. The action of α-amylase is to hydrolyze both amylose and amylopectin in a random way which gradually gives small polysaccharide fragments until nothing else is left but maltose and perhaps some glucose, α-amylase is activated by chloride ions and has optimal activity at a pH of approx. 7.

Amylasene av animalsk opprinnelse er av a-amylasetypen. Deres nærvær er blitt påvist i mange vevtyper, men de fremstilles primært i bukspyttkjertelen og spyttkjertlene. Virkningen av amylasen som er tilstede i sekresjonene i disse kjertelvev er å lette fordøyelsen av stivelse ved å hydrolysere og splitte stivelsen i små molekyler som derefter kan absorberes og assimileres. The amylases of animal origin are of the α-amylase type. Their presence has been demonstrated in many tissue types, but they are primarily produced in the pancreas and salivary glands. The action of the amylase present in the secretions of these glandular tissues is to facilitate the digestion of starch by hydrolysing and splitting the starch into small molecules which can then be absorbed and assimilated.

Mens det har vært kjent i over 100 år at amylase er tilstede While it has been known for over 100 years that amylase is present

i blodstrømmen har man ikke funnet kilden for dette enzym i normalt serum. Kilden er øyensynlig ikke i bukspyttkjertelen og spyttkjertlene idet fjernelse av disse kjertlene har en ubetydelig virkning på normal serum amylase nivåer. in the bloodstream, the source of this enzyme has not been found in normal serum. The source is apparently not in the pancreas and salivary glands, as removal of these glands has a negligible effect on normal serum amylase levels.

Bestemmelsen av amylaseaktiviteten i væskestrømmer er etter-hvert blitt meget viktig. Forhøyede amylasenivåer i blodserum er blitt observert ved- en rekke patologiske tilstander, men det mest iøynefallende økning i serumamylasenivåene har man sett ved akutt pancreatitis hvor det ikke er uvanlig med plutselige økninger på 30-40 ganger det normale nivå. Ved kronisk pancreatitis er økningene moderate og en stor del av pasientene kan ha normale nivåer. The determination of the amylase activity in liquid streams has gradually become very important. Elevated amylase levels in blood serum have been observed in a number of pathological conditions, but the most striking increase in serum amylase levels has been seen in acute pancreatitis where it is not unusual for sudden increases of 30-40 times the normal level. In chronic pancreatitis, the increases are moderate and a large proportion of patients may have normal levels.

Moderate forhøyninger i serumamylase har man også sett ved perforert peptisk ulcerpasienter og ved blokkeringsforstyrrelser i tarmsystemet, hvor forhøyet amylase sannsynligvis er forårsaket av lekkasje av enzymer fra tarmsystemet inn i det peritoneale hulrom og reabsorbering -fra dette hulrom i det generelle sirkulasjons-systemet. Moderate.forhøyninger ser man også ved kusma, nyre— insuffisens og kreft i pancreas. Hepatobiliær sykdom er karakterisert ved lave nivåer av serumamylase. Moderate elevations in serum amylase have also been seen in perforated peptic ulcer patients and in blockage disorders in the intestinal system, where elevated amylase is probably caused by leakage of enzymes from the intestinal system into the peritoneal cavity and reabsorption from this cavity into the general circulatory system. Moderate elevations are also seen in mumps, kidney insufficiency and pancreatic cancer. Hepatobiliary disease is characterized by low levels of serum amylase.

Klassiske metoder for bestemmelse av amylaseaktivitet omfatter den amyloclastiske metode, hvor minskningen i viskositet eller turbiditet av en stivelsesuspensjon som er gjort flytende av en analyseprøve som inneholder amylase avleses som amylaseaktivitet; og en modifisert versjon av den sakkarogene metoden hvor en prøve som inneholder amylase inkuberes med stivelse og de dannede reduserende sukkerarter bestemmes og angis som Somogyienheter. Classic methods for determining amylase activity include the amyloclastic method, where the reduction in viscosity or turbidity of a starch suspension that has been liquefied by an analytical sample containing amylase is read as amylase activity; and a modified version of the saccharogenic method where a sample containing amylase is incubated with starch and the reducing sugars formed are determined and given as Somogyi units.

Selv om den modifiserte sakkarogene metode for amylasebestemmelse Although the modified saccharogenic method for amylase determination

er ansett som mer nøyaktig enn den amyloclastiske metode, er den sakkarogene metode meget tidkrevende, kompleks og krever at man må bestemme omfattende og variable blindprøver av på forhånd redusert sukker. Ikke hydrdlysert stivelse gir i tillegg ofte uklarhet og forstyrrer bestemmelsen av reduserende sukkerarter. is considered more accurate than the amyloclastic method, the saccharogenic method is very time-consuming, complex and requires extensive and variable blank samples of previously reduced sugar to be determined. In addition, non-hydrolysed starch often causes turbidity and interferes with the determination of reducing sugars.

Det eksisterer således et stort behov for en enkel , There is thus a great need for a simple,

hurtig og nøyaktig metode for bestemmelse av amylaseaktivitet. En fast and accurate method for determining amylase activity. One

slik forbedret metode for måling av amylaseaktivitet er nylig funnet og er beskrevet i U.S. patent nr. 3.597.322. such an improved method for measuring amylase activity has recently been found and is described in U.S. Pat. patent No. 3,597,322.

Ved denne amylasémålinq inkuberes et At this amylase measurement, a

vannløselig, farvet substrat med en relativt liten prøve av væske som inneholder en ukjent konsentrasjon' av amylase under kontrollerte tids- og temperaturbetingelser; efter en viss tid utfelles ikke omsatt farvet substrat og eventuelt proteinstoffer som er tilstede i den flytende prøven ved tilsetning av et alkoholisk garvesyreutfelningsmiddel ved kontrollert pH og temperatur; og den optiske tetthet av den gjenværende klare, men ikke farvede overliggende væske måles for bestemmelse av amylaseaktivitet. Den forbedrede følsomhet av denne nye metode for bestemmelse av amylaseaktivitet skyldes hovedsakelig anvendelsen av et vannløselig, farvet substrat som er lett hydrolyserbart ved hjelp av små mengder amylase. water-soluble, colored substrate with a relatively small sample of liquid containing an unknown concentration of amylase under controlled time and temperature conditions; after a certain time, unreacted colored substrate and any protein substances present in the liquid sample are precipitated by the addition of an alcoholic tannic acid precipitant at controlled pH and temperature; and the optical density of the remaining clear but unstained supernatant is measured to determine amylase activity. The improved sensitivity of this new method for determining amylase activity is mainly due to the use of a water-soluble, colored substrate which is easily hydrolysable by small amounts of amylase.

Det vannløselige, farvede substrat som anvendes ved målingen fremstilles ved kobling i en vandig alkalisk løsning av et egnet reaktivt farvestoff med en egnet stivelse eller stivelsefraksjon for å oppnå et vannløselig farvet stivelseprodukt. Det oppnådde produkt underkastes derefter gelfiltrering og dialyse-behandling for å fjerne alt uomsatt farvestoff; tilstedeværelsen av fritt farvestoff i substratet forstyrrer sterkt forsøksresultatet, siden målingen av amylaseaktiviteten ved denne måling er ved hjelp av optisk tetthet. For å være sikker på at alt fritt farvestoff er fullstendig fjernet fra det farvede substratet under rensningen tilsettes det et selektivt utfelningsmiddel for det farvede substrat til prøver av påfølgende fraksjoner av rensede løsninger. Et alkoholisk garvesyreutfelningsmiddel som anvendes ved en kontrollert pH og temperatur har vist seg å felle ut alt vannløselig farvet substrat: tilstedeværelsen av farve fra farvestoffet i gjenværende overliggende væske indikerer at det er noe fritt farvestoff tilbake og at rensningen er ufullstendig. The water-soluble, colored substrate used in the measurement is prepared by coupling in an aqueous alkaline solution a suitable reactive dye with a suitable starch or starch fraction to obtain a water-soluble colored starch product. The product obtained is then subjected to gel filtration and dialysis treatment to remove all unreacted dye; the presence of free dye in the substrate strongly interferes with the test result, since the measurement of the amylase activity in this measurement is by means of optical density. To ensure that all free dye is completely removed from the dyed substrate during purification, a selective precipitant for the dyed substrate is added to samples of successive fractions of purified solutions. An alcoholic tannic acid precipitant used at a controlled pH and temperature has been shown to precipitate all water-soluble colored substrate: the presence of color from the dye in the remaining supernatant indicates that some free dye remains and that the purification is incomplete.

Egenskapene av dette alkoholiske garvesyreutfelningsmiddel The properties of this alcoholic tannic acid precipitant

er kritisk: løsninger som inneholder fra 0,5% til 2% garvesyre i 50% alkohol, bufret til en pH på 5,0 til 5,5, og som bringes til en temperatur på 20°C til 30°C er effektive. Det er foretrukket å anvende en alkoholisk garvesyreløsning med 50% metanol som inneholder 1% garvesyre som er bufret til en pH på 5,35 med en 0,1N benzoesyre/natriumbenzoatbuffer og som bringes til en temperatur på 25°C. is critical: solutions containing from 0.5% to 2% tannic acid in 50% alcohol, buffered to a pH of 5.0 to 5.5, and brought to a temperature of 20°C to 30°C are effective. It is preferred to use an alcoholic tannic acid solution with 50% methanol containing 1% tannic acid which is buffered to a pH of 5.35 with a 0.1N benzoic acid/sodium benzoate buffer and which is brought to a temperature of 25°C.

Detaljene ved fremstillingen og rensningen åv det vannløsexige farvede substrat som anvendes ved amylasebestemmelsen er dekket av U.S. patent nr. 3.679.6.61. The details of the preparation and purification of the water-soluble colored substrate used in the amylase assay are covered by U.S. Pat. patent No. 3,679.6.61.

Skjønt metoden for rensning av det farvede substrat Although the method of cleaning the colored substrate

og utførelsen av rensningen som er beskrevet i den tidligere søknad har vist seg å være effektiv, er det visse ulemper. Dialyse-rensningen tar f.eks, ca. 1 uke før man får en renset løsning av det farvede substrat. Ved gelfiltreringen må eluanten samles opp i en rekke fraksjoner og en prøve av hver fraksjon må analyseres for å være sikker på at det ikke er noe fritt farvestoff tilbake. Denne fremgangsmåte krever øyensynlig meget tid og er kostbar. and the performance of the purification described in the previous application has been shown to be effective, there are certain disadvantages. The dialysis cleaning takes, for example, approx. 1 week before you get a purified solution of the colored substrate. During the gel filtration, the eluent must be collected in a number of fractions and a sample of each fraction must be analyzed to be sure that no free dye remains. This method apparently requires a lot of time and is expensive.

Ved foreliggende oppfinnelse fjernes uomsatt farvestoff fullstendig fra vannløselige farvede substrater ved en flertrinns utfelningsfremgangsmåte som utføres ved en kontrollert temperatur, hvorved det tilsettes til reaksjonsblandingen et vannløselig farvet substrat som inneholder 0,14-4,5% salt fra nøytralisasjonen, en vandig alkoholløsning som gir en resulterende konsentrasjon på 10,5% til 34% alkohol i den totale reaksjonsblandingen for å utfelle det farvede substrat, fjerning av overliggende væske som inneholder salt og fritt farvestoff for å oppnå den delvis rensede, farvede substratutfeining; gjenoppløsning av denne utfeining i en av de følgende løsninger: en vandig løsning, en vandig saltløsning som gir opp til 4,5% salt i totalvolumet av farvet substratløsning, en vandig alkoholløsning som gir opptil 34% alkohol i totalvolumet av farvet substratløsning eller en vandig løsning som inneholder mindre enn 0,14% salt og mindre enn 10,5% alkohol; gjenutfelling av det farvede stivelsesubstrat ved å justere den resulterende konsentrasjon av salt til 0,14% til 4,5%, og den resulterende konsentrasjon av alkohol til 10,5% til 34%. Rensemetoden ved utfelning/gjenoppløsning som fortrinnsvis utføres ved 4°C fortsettes inntil alt fritt farvestoff er blitt fjernet fra det vannløselige farvede substrat. In the present invention, unreacted dye is completely removed from water-soluble colored substrates by a multi-stage precipitation process carried out at a controlled temperature, whereby a water-soluble colored substrate containing 0.14-4.5% salt from the neutralization is added to the reaction mixture, an aqueous alcohol solution which gives a resulting concentration of 10.5% to 34% alcohol in the total reaction mixture to precipitate the dyed substrate, removal of supernatant containing salt and free dye to obtain the partially purified dyed substrate precipitate; redissolving this smear in one of the following solutions: an aqueous solution, an aqueous salt solution that provides up to 4.5% salt in the total volume of colored substrate solution, an aqueous alcohol solution that provides up to 34% alcohol in the total volume of colored substrate solution or an aqueous solution containing less than 0.14% salt and less than 10.5% alcohol; reprecipitation of the colored starch substrate by adjusting the resulting concentration of salt to 0.14% to 4.5%, and the resulting concentration of alcohol to 10.5% to 34%. The purification method by precipitation/redissolution which is preferably carried out at 4°C is continued until all free dye has been removed from the water-soluble colored substrate.

Det har nå vist seg at vannløselige farvede substrater som er fullstendig frie for uomsatt farvestoff kan oppnås ved en fremgangsmåte hvorved uomsatt farvestoff fjernes ved en flertrinns utfelningsmetode: det farvede substrat utfelles, gjenoppløses og utfelles igjen inntil den overliggende væske fra den siste utfeining ikke inneholder farve av farvestoffet. Produktene som oppnås ved denne fremgangsmåte er egnet for anvendelse ved amylasebestemmelse slik som beskrevet i U.S. patent nr. 3.597.322. It has now been found that water-soluble colored substrates which are completely free of unreacted dye can be obtained by a process whereby unreacted dye is removed by a multi-stage precipitation method: the colored substrate is precipitated, redissolved and precipitated again until the overlying liquid from the last sweep contains no dye of the dye. The products obtained by this method are suitable for use in amylase determination as described in U.S. Pat. patent No. 3,597,322.

Stivelsen som er egnet for anvendelse i foreliggende oppfinnelse kan oppnås fra potet, tapioka, mais, hvete, ris, potet, voksaktig mais eller hvilken som helst annen kilde som kan farves efter fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse for å gi det ønskede løselige farvede substrat. Løselighet-karakteristika av stivelseutgangsmateriale kan variere over et stort område, men det farvede sluttprodukt må være vannløselig når det skal anvendes for måling ifølge foreliggende oppfinnelse. Amylose og amylopektin er kommersielt tilgjengelig som omhyggelig standardiserte fraksjoner og oppnås fra stivelse på følgende måte: fortynnet stivelsepasta som inneholder 2-3% stivelse behandles i autoklav. Varm stivelse- The starch suitable for use in the present invention can be obtained from potato, tapioca, maize, wheat, rice, potato, waxy maize or any other source which can be dyed according to the method of the present invention to give the desired soluble colored substrate. Solubility characteristics of starch starting material can vary over a wide range, but the colored end product must be water soluble when it is to be used for measurement according to the present invention. Amylose and amylopectin are commercially available as carefully standardized fractions and are obtained from starch as follows: dilute starch paste containing 2-3% starch is autoclaved. hot starch-

løsning mettes med en alkohol slik som butanol eller pentanol for å utfelle i alt vesentlig amylose, den rettkjedede fraksjon av stivelse, som gir en intens blåfarve med jod. Hovedmengden av stivelsen som ikke adskilles ved denne butanolbehandling er amylopektin eller den forgrenede fraksjon av stivelse som gir en rød farve med jod. Ved den foretrukne utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes amylopektinfraksjonen. solution is saturated with an alcohol such as butanol or pentanol to precipitate essentially amylose, the straight-chain fraction of starch, which gives an intense blue color with iodine. The main amount of the starch that is not separated by this butanol treatment is amylopectin or the branched fraction of starch that gives a red color with iodine. In the preferred embodiment according to the present invention, the amylopectin fraction is used.

Mens det ikke er nødvendig at stivelseutgangsmaterialet er løselig i vann i noen særlig grad har det vist seg at det er kritisk at det farvede substratproduktet som oppnås for anvendelse ved målemetoden, er løselig i vann. Anvendelsen av et farvet, vann-løselig substrat gir en teknisk overlegen måling som er enkel og hurtig, og enda tilstrekkelig følsom for å sikre nøyaktighet og troverdighet. Av denne grunn, skjønt ikke løselig og relativt uløselig stivelse kan omsettes med det reaktive farvestoff for å gi et løselig produkt anvendes amylopektin, den løselige stivelsefraksjonen, som utgangsmateriale ved den foretrukne utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse. Det foretrukne amylopektin ,selges kommersielt av National Starch and Chemical Corporation som "Amioca" 51-6002. Det reaktive farvestoff som anvendes i henhold til oppfinnelsen selges kommersielt av Geigy under varemerket "REACTONE RED 2 B". Dette farvestoff er angitt i litteraturen (Ackermann og Dussy i Melliand's Textilber. vol. 42, side 1167 (1961) å ha følgende struktur: While it is not necessary that the starch starting material be soluble in water to any particular extent, it has been found that it is critical that the colored substrate product obtained for use in the measurement method is soluble in water. The use of a colored, water-soluble substrate provides a technically superior measurement that is simple and fast, and yet sufficiently sensitive to ensure accuracy and reliability. For this reason, although not soluble and relatively insoluble starch can react with the reactive dye to give a soluble product, amylopectin, the soluble starch fraction, is used as starting material in the preferred embodiment according to the present invention. The preferred amylopectin is sold commercially by the National Starch and Chemical Corporation as "Amioca" 51-6002. The reactive dye used according to the invention is sold commercially by Geigy under the trademark "REACTONE RED 2 B". This dye is stated in the literature (Ackermann and Dussy in Melliand's Textilber. vol. 42, page 1167 (1961)) to have the following structure:

Det vannløselige farvestoffsubstrat oppnås ifølge foreliggende oppfinnelse ved kobling av stivelseutgangsmateriale i en alkalisk løsning med det reaktive farvestoff og fjerning av alt uomsatt farvestoff fra det oppnådde produkt. Temperaturen og reaksjonstiden, såvel som forholdet stivelse til farvestoff og alkalikonsentrasjonen er alle avhengige variable som kan forandres i utstrakt grad og enda gi det ønskede løselige substrat ifølge foreliggende oppfinnelse. Det har imidlertid vist seg at det er praktisk og derfor foretrukket å utføre reaksjonen ved værelsestemperatur (fra ca. 20°C til ca. 30°C) i ca. 18 timer ved å anvende et forhold stivelse til farvestoff på fra ca. 2,5:1 til ca. 100:1, fortrinnsvis ca. 4:1, og alkalikonsentrasjon på fra 0,1 til ca. 1,5N. Alkaliet i den resulterende blanding nøytraliseres derefter med en vandig løsning av en syre, f.eks. vandig saltsyre. The water-soluble dye substrate is obtained according to the present invention by coupling starch starting material in an alkaline solution with the reactive dye and removing all unreacted dye from the obtained product. The temperature and the reaction time, as well as the ratio of starch to dye and the alkali concentration are all dependent variables that can be changed to an extensive extent and still provide the desired soluble substrate according to the present invention. However, it has been found to be practical and therefore preferred to carry out the reaction at room temperature (from about 20°C to about 30°C) for about 18 hours by using a ratio of starch to dye of from approx. 2.5:1 to approx. 100:1, preferably approx. 4:1, and alkali concentration of from 0.1 to approx. 1.5N. The alkali in the resulting mixture is then neutralized with an aqueous solution of an acid, e.g. aqueous hydrochloric acid.

Den nøyaktige kjemiske struktur av det løselige farvede substrat ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke kjent, men det antas at på lignende måte som reaktive farvestoffer kobles til alkali-behandlet cellulose, bindes farvestoffet til frie hydroksylgrupper i stivelse, amylose eller amylopektin. Se f.eks. U.S. patentene nr. 1.886.480, 3.044.843 og 3.029.123. En empirisk formel (Cg<H>^Q<0g>)<n->D er oppstillet for disse nye substrater, hvor n er et stort helt tall, (0,11, _.0C) representerer naturlig fore-6 10 5 n The exact chemical structure of the soluble colored substrate according to the present invention is not known, but it is believed that in a similar way as reactive dyes are attached to alkali-treated cellulose, the dye is attached to free hydroxyl groups in starch, amylose or amylopectin. See e.g. U.S. patents Nos. 1,886,480, 3,044,843 and 3,029,123. An empirical formula (Cg<H>^Q<0g>)<n->D is established for these new substrates, where n is a large whole number, (0.11, _.0C) represents natural fore-6 10 5 n

kommende stivelse, amylose eller amylopektin og forthcoming starch, amylose or amylopectin and

D er resten av det reaktive farvestoff. D is the rest of the reactive dye.

Det er vesentlig at alt uomsatt farvestoff fjernes fra ovennevnte reaksjonsblanding for at det resulterende farvede substrat kan være egnet for anvendelse ved bestemmelse av amylaseaktivitet: tilstedeværelsen av fritt farvestoff i substratet vil alvorlig forstyrre analyseresultatene, siden målingen av amylaseaktiviteten ved denne måling er ved hjelp av optisk tetthet. Konvensjonelle fremgangsmåter som anvendes på tekstilområdet for fjernelse av uomsatt farvestoff fra farvestoffmaterialer, slik som beskrevet i U.S. patent nr. 3.304.297 (Wegmann et al.), omfatter anvendelsen It is essential that all unreacted dye be removed from the above reaction mixture in order for the resulting colored substrate to be suitable for use in the determination of amylase activity: the presence of free dye in the substrate will seriously interfere with the assay results, since the measurement of amylase activity in this measurement is by means of optical density. Conventional methods used in the textile field for removing unreacted dye from dye materials, such as described in U.S. Pat. patent no. 3,304,297 (Wegmann et al.), includes the application

av absolutt alkohol. Disse fremgangsmåter har imidlertid vist seg å ha en ugunstig virkning på vannløseligheten av det rensede farvede substrat som oppnås og er derfor betraktet som ikke aksepterbare. of absolute alcohol. However, these methods have been shown to have an adverse effect on the water solubility of the cleaned colored substrate that is obtained and are therefore considered unacceptable.

Det har nå overraskende vist seg at uomsatt farvestoff kan fjernes fra et vannløselig farvet substrat ved en flertrinns utfelningsfremgangsmåte hvor temperaturen og konsentrasjonen av alkohol og salt kontrolleres omhyggelig; løseligheten i vann av de rensede, farvede substratprodukt får bli upåvirket. Fremgangsmåten omfatter regulering av temperaturen ved alle reaksjoner når man tilsetter en fortynnet alkoholløsning til urenset farvet substratreaksjonsblanding som inneholder en viss konsentrasjon av salt som et resultat av nøytralisasjonen for å gi en spesifikk konsentrasjon av alkohol i den totale reaksjonsblanding, hvorved utfeiningen av farvet substrat oppnås. Overliggende væske som inneholder salt og fritt farvestoff fjernes, og den delvis rensede farvede substratutfeining gjenoppløses i vann eller en vandig løsning som inneholder salt og/eller alkohol. Avhengig av hvilket løsningsmiddel som er blitt anvendt for å gjenoppløse utfeiningen tilsettes ytterligere mengder av salt og alkohol til løsningen for å gi de konsentrasjoner hvorved det farvede substrat gjenutfelles. Disse gjenoppløsnings/gjenutfelningstrinn fortsettes ved regulert temperatur inntil overliggende væske fra den siste utfelning er hovedsakelig fritt for farve av farvestoff. Egnede alkoholer som kan anvendes ved ovennevnte fremgangsmåte omfatter alkoholer med 1-3 karboner; metanol er foretrukket. Blant egnede salter kan nevnes uorganiske salter slik som natriumklorid, kaliumklorid, natrium-sulfat, kaliumsulfat o.l. Av disse er natriumklorid foretrukket. It has now surprisingly been found that unreacted dye can be removed from a water-soluble colored substrate by a multi-stage precipitation process where the temperature and concentration of alcohol and salt are carefully controlled; the solubility in water of the cleaned, colored substrate product may be unaffected. The method includes regulation of the temperature in all reactions when adding a dilute alcohol solution to impure colored substrate reaction mixture containing a certain concentration of salt as a result of the neutralization to give a specific concentration of alcohol in the total reaction mixture, whereby the removal of colored substrate is achieved. The overlying liquid containing salt and free dye is removed, and the partially cleaned colored substrate smear is redissolved in water or an aqueous solution containing salt and/or alcohol. Depending on which solvent has been used to redissolve the smear, additional amounts of salt and alcohol are added to the solution to give the concentrations at which the colored substrate is reprecipitated. These redissolution/reprecipitation steps are continued at a controlled temperature until the supernatant liquid from the last precipitation is substantially free of color dye. Suitable alcohols which can be used in the above method include alcohols with 1-3 carbons; methanol is preferred. Suitable salts include inorganic salts such as sodium chloride, potassium chloride, sodium sulphate, potassium sulphate etc. Of these, sodium chloride is preferred.

For å være sikker på at alt fritt farvestoff er blitt To be sure that all free dye has become

fjernet ved denne flertrinns-utfelningsfremgangsmåte har det vist removed by this multi-step precipitation procedure has shown

seg at det er spesielt verdifullt å anvende utførelsesmetoden som angitt i U.S. patent nr. 3.679.661. said that it is particularly valuable to use the method of execution as set forth in U.S. Pat. Patent No. 3,679,661.

En prøve av renset farvet substrat oppløses i A sample of cleaned colored substrate is dissolved in

vann og det alkoholiske garvesyreutfelningsmiddel tilsettes, slik som beskrevet i U.S. patent nr. 3.679.661. water and the alcoholic tannic acid precipitant are added, as described in U.S. Pat. Patent No. 3,679,661.

Det anvendes fortrinnsvis en alkoholisk garve- An alcoholic tanning agent is preferably used

syreløsning med 50% metanol som inneholder 1% garvesyre, bufret til en pH på 5,35 med 0,lN benzoesyre/natriumbenzoatbuffer og som bringes til en temperatur på 25°C, som utfelningsmiddel. Tilstedeværelsen av farve fra farvestoffet i overliggende væske ved denne analysen indikerer at det er igjen noe fritt farvestoff og gjen-oppløsning/gjenutfelningstrinnene må utføres enda en gang efterfulgt av behandlingen av prøven. I praksis er det i almindelighet mulig ved nøyaktig observasjon av overliggende væske, å gjenta utfelnings-trinnene et tilstrekkelig antall ganger slik at behandling av prøvene utføres som det endelige trinn og sikrer en fullstendig farvestoff-fj ernels e. acid solution with 50% methanol containing 1% tannic acid, buffered to a pH of 5.35 with 0.1N benzoic acid/sodium benzoate buffer and which is brought to a temperature of 25°C, as precipitant. The presence of color from the dye in the supernatant by this analysis indicates that some free dye remains and the redissolution/reprecipitation steps must be performed once more followed by the processing of the sample. In practice, it is generally possible, by accurate observation of the overlying liquid, to repeat the precipitation steps a sufficient number of times so that treatment of the samples is carried out as the final step and ensures complete dye removal.

Det er tidligere angitt at flertrinns utfelningsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er temperaturavhengig, og som et resultat er det nødvendig med spesielle konsentrasjoner av salt og alkohol for utfeiningen og gjenoppløsningen ved forskjellige temperaturer. Konsentrasjoner og temperaturer som anvendes er kritiske og må overholdes omhyggelig. Det har f.eks. vist seg at ved værelsestemperatur (vanligvis mellom 23-26°C) vil utfelningen av det farvede substrat fra en reaksjonsblanding som inneholder fra 0,14% til 1,7% salt, fortrinnsvis 0,17% til 0,56%, og spesielt foretrukket 0,21% salt, som et resultat av nøytralisasjonen oppnås ved tilsetning av en tilstrekkelig mengde alkohol for å gi 25% til 34% alkohol, fortrinnsvis 27% til 32%, og spesielt foretrukket 30% alkohol, basert på totalvolumet av den farvede substratløsning. Overliggende væske som inneholder fritt farvestoff, alkohol og salt fjernes, men den resulterende, delvis rensede farvede substratutfeining kan ha opptatt små mengder alkohol og salt sammen med gjenværende fritt farvestoff. It has previously been stated that the multi-stage precipitation method of the present invention is temperature dependent, and as a result special concentrations of salt and alcohol are required for the precipitation and redissolution at different temperatures. Concentrations and temperatures used are critical and must be carefully observed. It has e.g. It has been found that at room temperature (usually between 23-26°C) the precipitation of the colored substrate from a reaction mixture containing from 0.14% to 1.7% salt, preferably 0.17% to 0.56%, and especially preferably 0.21% salt, as a result of which the neutralization is achieved by adding a sufficient amount of alcohol to give 25% to 34% alcohol, preferably 27% to 32%, and especially preferred 30% alcohol, based on the total volume of the dyed substrate solution. Supernatants containing free dye, alcohol, and salt are removed, but the resulting partially cleaned dyed substrate washout may have absorbed small amounts of alcohol and salt along with residual free dye.

De delvis rensede farvede substrat kan derefter gjenopp- The partially cleaned colored substrates can then be re-

løses i en av de følgende Løsninger: vann, en vandig saltløsning som gir ikke mer enn 1,7% salt i totalvolumet av farvet substrat, dissolve in one of the following solutions: water, an aqueous salt solution that gives no more than 1.7% salt in the total volume of colored substrate,

en vandig alkoholløsning som gir ikke mer enn 34% alkohol i den totale farvede substratløsning eller en vandig løsning som inneholder salt og alkohol i konsentrasjoner under det minimum som er nødvendig for utfeining, dvs. under 0,14% salt og under 25% alkohol i den totale farvede substratløsning. Det farvede stivelsesubstrat kan nå gjenutfelles ved justering av konsentrasjonen av salt og alkohol i den farvede substratløsning til prosenttall over den initielle utfelningsreaksjon, dvs. 0,14% til 1,7%, fortrinnsvis 0,17% til 0,56%, og spesielt foretrukket 0,21% salt, og 25% til 34%, fortrinnsvis an aqueous alcohol solution yielding not more than 34% alcohol in the total dyed substrate solution or an aqueous solution containing salt and alcohol in concentrations below the minimum required for spotting, i.e. below 0.14% salt and below 25% alcohol in the total colored substrate solution. The colored starch substrate can now be reprecipitated by adjusting the concentration of salt and alcohol in the colored substrate solution to percentages above the initial precipitation reaction, i.e. 0.14% to 1.7%, preferably 0.17% to 0.56%, and especially preferably 0.21% salt, and 25% to 34%, preferably

27% til 32%, og spesielt foretrukket 30% alkohol basert på totalvolumet av løsningen. Gjenoppløsnings/gjenutfelnings-fremgangsmåten kan derefter gjentas inntil den overliggende væske er fri for farvestoff. Det er også kritisk for rensningen utført ved værelsestemperatur at tilsatt alkoholløsning er 80% eller lavere, og at denne løsning tilsettes meget langsomt til den farvede stivelsereaksjons-blandingen. Hurtig tilsetning av absolutt alkohol eller høy konsentrert løsning for å gi den krevede angitte konsentrasjon har vist seg å gi en ball-lignende utfeining som ikke kan gjenoppløses for ytterligere rensning. 27% to 32%, and particularly preferred 30% alcohol based on the total volume of the solution. The redissolution/reprecipitation procedure can then be repeated until the supernatant is free of dye. It is also critical for the cleaning carried out at room temperature that the added alcohol solution is 80% or lower, and that this solution is added very slowly to the colored starch reaction mixture. Rapid addition of absolute alcohol or highly concentrated solution to give the required specified concentration has been shown to produce a ball-like smear which cannot be redissolved for further purification.

Skjønt flertrinnsutfeiningen kan utføres ved værelsestemperatur er det spesielt foretrukket å utføre fremgangsmåten ved en lavere temperatur, dvs. ved 4°C siden det ved denne temperatur kan anvendes lavere konsentrasjon av alkohol. For å utfelle farvet substrat ved 4°C er de nødvendige konsentrasjoner av alkohol basert på totalvolumet av farvet substratblanding som inneholder 0,14 til 4,5% salt, fortrinnsvis 0,34 til 1,04%, og spesielt foretrukket 0,61% salt, 10,5% til 21%, fortrinnsvis 11,5% til 18% og spesielt foretrukket 14%. Det delvis rensede utfelte farvestoffsubstrat kan derefter gjenoppløses i en av de følgende løsninger: vann, en vandig saltløsning som ikke gir mer enn 4,5% salt i totalvolumet av farvet substratløsning, en vandig alkoholløsning som ikke gir mer enn 21% alkohol i totalvolumet av farvet substratløsning eller en vandig løsning som inneholder salt og alkohol i en konsentrasjon under minimum krevet for utfeining, dvs. under 0,14% salt og under 10,5% alkohol i den totale farvede.substratløsning. Gjenutfeining av det farvede substrat oppnås ved å justere salt og alkohol-konsentrasjonene til de prosentene som tidligere angitt for initiell utfelning, dvs. 0,14% til 4,5%, fortrinnsvis 0,34% til 1,04%, og spesielt foretrukket 0,61% salt og 10,5% til 21%, fortrinnsvis 11,5% til 18%, og spesielt foretrukket 14% alkohol basert på totalvolumet av løsningen. Ved 4 C er det kritisk at alkoholløsningen som tilsettes er av en relativt fortynnet konsentrasjon, f.eks. 40% eller lavere, og at denne løsning tilsettes meget langsomt til den farvede stivelse eller løsning for å bibeholde løselighetskarakteristika av det farvede substrat. Although the multi-stage refinement can be carried out at room temperature, it is particularly preferred to carry out the method at a lower temperature, i.e. at 4°C since a lower concentration of alcohol can be used at this temperature. To precipitate colored substrate at 4°C, the required concentrations of alcohol are based on the total volume of colored substrate mixture containing 0.14 to 4.5% salt, preferably 0.34 to 1.04%, and particularly preferably 0.61% salt, 10.5% to 21%, preferably 11.5% to 18% and particularly preferred 14%. The partially cleaned precipitated dye substrate can then be redissolved in one of the following solutions: water, an aqueous salt solution that does not give more than 4.5% salt in the total volume of dyed substrate solution, an aqueous alcohol solution that doesn't give more than 21% alcohol in the total volume of colored substrate solution or an aqueous solution containing salt and alcohol in a concentration below the minimum required for removal, i.e. below 0.14% salt and below 10.5% alcohol in the total colored substrate solution. Refining of the colored substrate is achieved by adjusting the salt and alcohol concentrations to the percentages previously stated for initial precipitation, i.e. 0.14% to 4.5%, preferably 0.34% to 1.04%, and particularly preferred 0.61% salt and 10.5% to 21%, preferably 11.5% to 18%, and especially preferred 14% alcohol based on the total volume of the solution. At 4 C, it is critical that the alcohol solution that is added is of a relatively diluted concentration, e.g. 40% or lower, and that this solution is added very slowly to the colored starch or solution in order to maintain the solubility characteristics of the colored substrate.

Ved anvendelse av temperaturer som er forskjellig fra de som er gitt ovenfor, kan det bestemmes andre effektive konsentrasjoner av salt og alkohol fra de gitte parametre. By using temperatures different from those given above, other effective concentrations of salt and alcohol can be determined from the given parameters.

Det rensede vannløselige farvestoffsubstrat som er fremstilt eftec fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er egnet for anvendelse ved amylasebestemmelse som angitt i U.S. patent nr. 3.59 7.::2. Efter dette patent The purified water-soluble dye substrate produced by the method according to the present invention is suitable for use in amylase determination as stated in U.S. Pat. patent no. 3.59 7.::2. According to this patent

må en vandig løsning av renset farvet substrat bufres til en pH på an aqueous solution of purified colored substrate must be buffered to a pH of

fra ca. 6,5 til ca. 7,8 med et egnet buffermiddel for anvendelse ved amylasemålingen. Det er foretrukket å anvende en 0,lM vannfri toverdig kaliumfosfat og 0,1M enverdig kaliumfosfatbuffersystem som gir en pH på ca. 7. Små mengder av et middel som vil gi kloridioner er også nødvendig for å aktivere amylasen under målingen: en vandig fortynnet løsning av natriumklorid gir en konsentrasjon på fra ca. 0,005 mol til ca. 0,05 mol i det resulterende målemedia har vist seg å være effektiv. from approx. 6.5 to approx. 7.8 with a suitable buffer for use in the amylase measurement. It is preferred to use a 0.1M anhydrous divalent potassium phosphate and 0.1M monovalent potassium phosphate buffer system which gives a pH of approx. 7. Small amounts of an agent that will give chloride ions are also necessary to activate the amylase during the measurement: an aqueous dilute solution of sodium chloride gives a concentration of from approx. 0.005 mol to approx. 0.05 mol in the resulting measurement media has been shown to be effective.

Målemedia som angitt ovenfor kan lagres som slike, fortrinnsvis ved kjøleskapstemperaturer eller lyofiliseres (frysetørres) The measuring media as stated above can be stored as such, preferably at refrigerator temperatures or lyophilized (freeze-dried)

for preservering og opparbeides med vann når målingen skal utføres. Alternativt kan farvestoffsubstratet lyofiliseres slik som det er fremstilt og buffermidlet og materialet som gir kloridioner kan tilsettes like før målingen. for preservation and made up with water when the measurement is to be carried out. Alternatively, the dye substrate can be lyophilized as it is prepared and the buffering agent and the material that gives chloride ions can be added just before the measurement.

Ved utførelsen av målingen for amylaseaktivitet inkuberes When carrying out the measurement for amylase activity is incubated

fra ca. 0,5 til ca. 2 ml av en vannløsning som inneholder ca. 1% from approx. 0.5 to approx. 2 ml of a water solution containing approx. 1%

av det farvede løselige substrat, puffret til en pH på fra ca. 6,5 of the colored soluble substrate, buffered to a pH of from approx. 6.5

til ca. 7,8 og som inneholder tilstrekkelig kloridioner for aktivering av amylasen, med en liten mengde (fra ca. 0,1 til ca. to approx. 7.8 and which contain sufficient chloride ions to activate the amylase, with a small amount (from about 0.1 to about

0,2 ml) av en flytende prøve hvis aktivitet skal bestemmes. Inkuberingen utføres i ca. 10 minutter ved temperaturer på ca. 37°C. 0.2 ml) of a liquid sample whose activity is to be determined. The incubation is carried out for approx. 10 minutes at temperatures of approx. 37°C.

Ved slutten av inkuberingsperioden fjernes alt uomsatt farvet At the end of the incubation period, all unreacted dye is removed

substrat og eventuelt proteinmateriale i prøven som skal måles ved å anvende som utfelningsmiddel 1% garvesyreløsning i ca. 50% metanol, puffret til en pH på ca. 5.,35, og bragt til en temperatur på ca. 25°C. Den dannede utfeining fjernes ved sentrifugering. Adskilt bunnfall kastes og optisk tetthet av den klare overliggende væske bestemmes ved absorbsjonsmaksimum for det spesielt anvendte farvestoff. Den optiske tetthet (absorbsjon) er en lineær funksjon av konsentrasjonen av amylase i den flytende prøven som undersøkes, og ved egnet kalibrering kan amylasekonsentrasjonen avleses direkte. substrate and any protein material in the sample to be measured by using a 1% tannic acid solution in approx. 50% methanol, buffered to a pH of approx. 5.35, and brought to a temperature of approx. 25°C. The resulting slurry is removed by centrifugation. Separated precipitate is discarded and optical density of the clear overlying liquid is determined at the absorption maximum of the particular dye used. The optical density (absorbance) is a linear function of the concentration of amylase in the liquid sample being examined, and with suitable calibration the amylase concentration can be read directly.

Det kjøres en blindprøve hvor utfeiningsmidlet tilsettes før enzym-prøven. Den optiske tetthet av blindprøven trekkes fra den optiske tetthet av prøven for å eliminere virkningen av reagensene på de oppnådde verdier for de enzymatiske hydrolyseprodukter. A blank test is run where the cleaning agent is added before the enzyme test. The optical density of the blank is subtracted from the optical density of the sample to eliminate the effect of the reagents on the obtained values for the enzymatic hydrolysis products.

De følgende eksempler er gitt for å illustrere oppfinnelsen:The following examples are given to illustrate the invention:

Eksempel 1 Example 1

Fremstilling av farvet amylopektin - flertrinns utfelninqsmetode ved ' 4°C - oppløsning av utfelningen i metanol 40 g amylopektin (AMIOCA STARCH 51-6002) oppløses i lOOOml destillert vann og omrøres. 100 ml av en 10% vandig løsning av Geigy 'REACTON RED 2B"tilsettes, efterfulgt av 100 ml 2,5N NaOH-løsning, og satsen omrøres inntil den blir for viskøs for omrøring. Satsen dekkes derefter til og får lov til å stå ved værelsestemperatur (23 til 26°C) i 18 timer. Tilsettes IN saltsyre (ca. Production of colored amylopectin - multi-stage precipitation method at 4°C - dissolution of the precipitation in methanol 40 g of amylopectin (AMIOCA STARCH 51-6002) is dissolved in 1000 ml of distilled water and stirred. 100 ml of a 10% aqueous solution of Geigy 'REACTON RED 2B" is added, followed by 100 ml of 2.5N NaOH solution, and the batch is stirred until it becomes too viscous for stirring. The batch is then covered and allowed to stand room temperature (23 to 26°C) for 18 hours Add IN hydrochloric acid (approx.

250 ml) under røring for å nøytralisere reaksjonsblandingen, 250 ml) while stirring to neutralize the reaction mixture,

(pH lik 7), og fortynnes derefter med destillert vann til et volum på 1500 ml og blandes godt. Fjerner alt uomsatt farvestoff fra denne reaksjonsblandingen ved å avkjøle alle løsningene til 4°C og utføre alle reaksjonene ved denne temperatur: til 1000 ml farvet stivelse tilsettes langsomt under kraftig omrøring 1000 ml 28%ig metanol; (pH equal to 7), and then diluted with distilled water to a volume of 1500 ml and mixed well. Remove all unreacted dye from this reaction mixture by cooling all solutions to 4°C and carrying out all reactions at this temperature: to 1000 ml of colored starch add slowly with vigorous stirring 1000 ml of 28% methanol;

lar sedimentere (5 minutter) og dekanterer overliggende løsning; allow to settle (5 minutes) and decant supernatant;

til den resulterende utfelning tilsettes under røring 1000 ml 14%ig metanol; efter at all utfelning er blitt oppløst gjenutfelles substratet med 35 ml av en 3,OM natriumklorid; gjentar gjenutfeiningen og gjenoppløsningstrinnene minst to ganger. Undersøker på nærvær av fritt farvestoff ved å tilsette et spesielt fremstilt utfelningsmiddel av alkoholisk garvesyre til en vandig løsning av det rensede, farvede substrat og bestemmer absorbsjonen av overliggende væske efter at farvet substrat er blitt utfelt. Utfelningsmidlet fremstilles fra en l%ig garvesyreløsning i 50% metanol som er puffret 1000 ml of 14% methanol is added to the resulting precipitate while stirring; after all the precipitate has been dissolved, the substrate is reprecipitated with 35 ml of a 3.OM sodium chloride; repeating the resweeping and redissolving steps at least twice. Examines the presence of free dye by adding a specially prepared precipitant of alcoholic tannic acid to an aqueous solution of the cleaned, colored substrate and determines the absorption of the overlying liquid after the colored substrate has been precipitated. The precipitant is prepared from a 1% tannic acid solution in 50% methanol which has been buffered

ned en 0,1M benzoesyre/natriumbenzoatpuffer til en pH på 5,35 og bringes til en temperatur på 25°C. Det rensede, farvede substrat fra den siste utfelningen oppløses i 1000 ml destillert vann. Relativ-konsentrasjon av farvet substrat i en 1 ml prøve av denne løsning beregnes for å bestemme mengden av løsning som skal omsettes med 5 ml av det ovenfor fremstilte utfelningsmiddel. Dette gjøres ved å fortynne 1 ml prøven til 100 ml med destillert vann, idet man anvender en avlesning i optisk tetthet mot vann ved 540 nanometer, down a 0.1M benzoic acid/sodium benzoate buffer to a pH of 5.35 and brought to a temperature of 25°C. The cleaned, colored substrate from the last precipitation is dissolved in 1000 ml of distilled water. Relative concentration of colored substrate in a 1 ml sample of this solution is calculated to determine the amount of solution to be reacted with 5 ml of the precipitant prepared above. This is done by diluting 1 ml of the sample to 100 ml with distilled water, using a reading in optical density against water at 540 nanometers,

sammenligner med en kjent standardløsning og beregner for å oppnå compares with a known standard solution and calculates to achieve

den nødvendige mengde utfelningsmiddel for reaksjonen. Den beregnede mengde, som vanligvis ligger mellom 2 og 3 ml, tas fra den vandige farvede substratløsning og fortynnes med destillert vann til et volum på 10 ml. 5 ml utfelningsmiddel av alkoholisk garvesyre tilsettes til 1 ml av den siste løsning i et sentrifugeglass ;g blandes; 0,2 ml av en proteinløsning (ca. 7%) tilsettes derefter til the required amount of precipitant for the reaction. The calculated amount, which is usually between 2 and 3 ml, is taken from the aqueous colored substrate solution and diluted with distilled water to a volume of 10 ml. 5 ml of precipitant of alcoholic tannic acid is added to 1 ml of the last solution in a centrifuge tube; g is mixed; 0.2 ml of a protein solution (about 7%) is then added

j^ntrifugen i 10 minutter og absorbsjonen av overliggende væske avleies ven 540 nanometer. Dersom absorbsjonen er større enn iC rt:° .....sningen av farvet substrat for å fjerne fritt farvestoff fortsette ved gjenutfeining og gjenoppløsning som tidligere beskrevet inntil man får en absorbsjon på 0,020. Når det farvede substrat er fullstendig renset justeres konsentrasjonen av farvet substrat slik at absorbsjonen av 1 ml vandig løsning fortynnet til 100 ml med destillert vann gir en absorbsjon på 0,140 ved 540 nanometer. pH av farvet substratløsning justeres til 7,0 med en 0,1M fosfatpuffer. Konsentrasjonen av natriumklorid i den resulterende løsning (minst 0.005M) er tilstrekkelig for amylasemåling. Den resulterende løsning kan anvendes som sådan ved målingen som beskrevet i eksempel 4 eller den kan bli lyofilisert og gjenfortynnet når den skal anvendes. The mixture is centrifuged for 10 minutes and the absorbance of the overlying liquid is determined at 540 nanometers. If the absorbance is greater than iC rt:° .....sanding of colored substrate to remove free dye continue by re-finishing and redissolving as previously described until an absorbance of 0.020 is obtained. When the colored substrate is completely cleaned, the concentration of colored substrate is adjusted so that the absorbance of 1 ml of aqueous solution diluted to 100 ml with distilled water gives an absorbance of 0.140 at 540 nanometers. The pH of the colored substrate solution is adjusted to 7.0 with a 0.1M phosphate buffer. The concentration of sodium chloride in the resulting solution (at least 0.005M) is sufficient for amylase measurement. The resulting solution can be used as such in the measurement as described in example 4 or it can be lyophilized and re-diluted when it is to be used.

Eksempel II Example II

Flertrinns utfelningsmetode ved 4°C - oppløsning av utfelningen i vann. Multi-stage precipitation method at 4°C - dissolving the precipitate in water.

Fremstill farvet amylopektin som beskrevet i eksempel 1. Prepare colored amylopectin as described in Example 1.

Fjern alt uomsatt farvestoff fra reaksjonsblandingen ved å avkjøle alle løsninger til 4°C og utfør alle fremgangsmåtene ved denne temperatur; til 1000 ml farvet stivelse tilsettes langsomt under kraftig røring 1000 ml 28% metanol; la bunnfelle (5 minutter) og dekanter overliggende væske; til den resulterende utfelning tilsettes under omrøring 1000 ml vann; efter at utfelningen er blitt oppløst gjenutfelles substratet med 1000 ml 28%ig metanol som inneholder 0,61% NaCl; gjenta gjenoppløsningen og gjenutfeiningen minst to ganger; behandle den rensede, farvede substratløsning som i eksempel I for å forsikre seg om at alt fritt farvestoff er blitt fjernet. Fremstill den resulterende løsning av farvet substrat som i eksempel I. Remove all unreacted dye from the reaction mixture by cooling all solutions to 4°C and perform all procedures at this temperature; to 1000 ml of colored starch slowly add, with vigorous stirring, 1000 ml of 28% methanol; allow to settle (5 minutes) and decant supernatant; to the resulting precipitate add, with stirring, 1000 ml of water; after the precipitate has been dissolved, the substrate is reprecipitated with 1000 ml of 28% methanol containing 0.61% NaCl; repeat the redissolution and resweeping at least twice; process the purified dyed substrate solution as in Example I to ensure that all free dye has been removed. Prepare the resulting solution of colored substrate as in Example I.

Eksempel III Example III

Flertrinns utfelningsmetode ved værelsestemperatur - oppløsning av utfelningen i vann Multi-stage precipitation method at room temperature - dissolution of the precipitation in water

Fremstill farvet amylopektin som beskrevet i eksempel I. Prepare colored amylopectin as described in Example I.

Fjern alt ikke omsatt farvestoff fra reaksjonsblandingen ved å ut-føre alle fremgangsmåter ved værelsestemperatur: til lOOO ml farvet stivelse tilsettes langsomt under kraftig røring 1000 ml 60% metanol; la bunnfalle i 5 minutter og dekanter overliggende væske; til den resulterende utfelning tilsettes under omrøring 1000 ml vann; efter at utfelningen er blitt oppløst, gjenutfelles substratet med 1000 ml 60% metanol som inneholder 0,21% natriumklorid; gjenta gjenoppløsni-ngen og gjenutfelningen minst to ganger; behandle den rensede farvede substratløsning som i eksempel I for å være sikker på at alt fritt farvestoff er blitt fjernet. Fremstill den resulterende løsning av farvet substrat som i eksempel I. Remove all unreacted dye from the reaction mixture by carrying out all procedures at room temperature: to 1000 ml of colored starch add slowly with vigorous stirring 1000 ml of 60% methanol; allow to settle for 5 minutes and decant supernatant; to the resulting precipitate add, with stirring, 1000 ml of water; after the precipitate has been dissolved, the substrate is reprecipitated with 1000 ml of 60% methanol containing 0.21% sodium chloride; repeat the redissolution and reprecipitation at least twice; process the purified colored substrate solution as in Example I to ensure that all free dye has been removed. Prepare the resulting solution of colored substrate as in Example I.

Eksempel IV Example IV

0,2 ml av en prøve av blodserum inkuberes med 1 ml bufret løselig farvet substrat som oppnådd ifølge eksempel I i 10 minutter ved 37°C. Ved slutten av inkuberingsperioden bringes 5 ml av en l%ig garvesyreoppløsning i 50% metanol, bufret med 0,1M benzoesyre og natriumbenzoatbuf f er ti"l en pH på 5,35, til en temperatur på 25°C, 0.2 ml of a sample of blood serum is incubated with 1 ml of buffered soluble colored substrate as obtained according to Example I for 10 minutes at 37°C. At the end of the incubation period, 5 ml of a 1% tannic acid solution in 50% methanol, buffered with 0.1M benzoic acid and sodium benzoate buffer is brought to a pH of 5.35, to a temperature of 25°C,

og tilsettes til målemediet. Den resulterende utfelning fjernes ved sentrifugering. Den optiske tetthet av overliggende væske bestemmes derefter ved en bølgelengde på 540 nanometer og blir funnet å være 0,360. Som en referansestandard underkastes serum inneholdende 117 Somogyi enheter (en kjent konsentrasjon) and added to the measuring medium. The resulting precipitate is removed by centrifugation. The optical density of the overlying liquid is then determined at a wavelength of 540 nanometers and is found to be 0.360. As a reference standard, serum containing 117 Somogyi units (a known concentration) is subjected to

amylase den samme undersøkelse. Den optiske tetthet for referanse-standarden bestemmes ved 540 nanometer og blir funnet å være 0,180. Eftersom mengden av farvestoff som er dannet ved enzym- amylase the same examination. The optical density of the reference standard is determined at 540 nanometers and is found to be 0.180. Since the amount of dye formed by enzyme

hydrolysen av substratet, er proporsjonal med amylasekonsentrasjonen, the hydrolysis of the substrate, is proportional to the amylase concentration,

er den optiske tetthet av farvestoff-oppløsningen også direkte proporsjonal med amylase-konsentrasjonen. Mengden av amylase i den ukjente prøve er således 234 Somogyi-enheter, beregnet i henhold til den følgende formel: the optical density of the dye solution is also directly proportional to the amylase concentration. The amount of amylase in the unknown sample is thus 234 Somogyi units, calculated according to the following formula:

Claims

Method for producing a water-soluble colored substrate with the formula (<C>6<H>10°5,n ' D where n is a large whole number, (C,Hn^0,-) is one of the polysaccharides starch, amylose or amylopectin and D is the residue of a reactive dye of the formula;

characterized by (1) incubating an alkaline solution of the polysaccharide with the reactive dye, (2) neutralizing the reaction mixture of colored substrate from (1) to give a salt concentration of from 0.14% to 4.5%, based on the total volume of the reaction mixture, (3) transfers the reaction mixture (2) to a temperature in the range from 4°C to 26°C, and maintains this temperature in all subsequent purification steps, (4) adds to the reaction mixture from (3) an aqueous alcohol solution yielding from 10.5% to 34% alcohol based on the total volume of the reaction mixture to precipitate the dyed substrate, (5) separating partially purified dyed substrate slurry from (4) from overlying liquid containing salt, alcohol and free dye, (6 ) redissolves partially purified colored substrate from (5) in a solution selected from the group consisting of: (a) water, (b) an aqueous salt solution providing up to 4.5% salt in the total volume of colored substrate solution, (c ) an aqueous alcohol solution that gives innti l 34% alcohol in the total volume of colored substrate solution, and (d) an aqueous solution containing less than 0.14% salt and less than 10.5% alcohol in the total volume of colored substrate solution, (7) adjusting the salt concentration in the colored substrate solution from (6) to 0.14 - 4.5% and the alcohol concentration to 10.5-34%, based on the total volume of colored substrate solution, to re-precipitate colored substrate and (8) repeating steps (6) and (7) if necessary until the resulting supernatant from the reprecipitation step is free of all color from the dye.