NO136252B - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte av den art som

er angitt i kravets ingress. Globuliner som er knyttet til hudvev utviser en cytobiotisk aktivitet.

De cytobiotiske globuliner har ingen aggressiv eller toksisk aktivitet på mennesker.

Isoleringen av disse cytobiotiske globuliner krever en spesiell kombinasjon av tekniske midler, hvilket danner grunnlag for fremgangsmåten ifblge oppfinnelsen. Fremgangsmåten er særpreget ved det som er angitt i kravets karakteriserende del.

Generell bruk av fremgangsmåten

Hudvev kan anvendes fra det oyeblikk hvor det blir uttatt

i slaktehuset, eller etter en frysing gjennomfort med en gang etter at vevet er tatt fra dyret.

Etter finoppdeling utsetter man hudvevet for en fors.te vasking

med en 0,9 %'ig opplosning av natriumklorid for å fjerne mest mulig av det resterende blod. Deretter homogeniserer man vevet ved hjelp av en blander eller annet lignende apparat, og bringer vevet i suspensjon med 10 ganger dets vekt av den samme saltopplosning. Etter omroring og en kontakt i omtrent 1 time, blir den uoppløselige del isolert.

Det ved behandlingen erholdte uopploselige vevresiduum be-handles med 2 til 3 ganger dets vekt, avhengig av organet, av en natriumcitratopplosning med en pH på 3,1 i 0,1 (ion-styrke 0,15 M). pH av blandingen blir kontrollert og innstilt dersom det er nodvendig til 3,1'- 0,1 ved tilsetning av den nodvendige

og tilstrekkelige mengde av saltsyre.

Etter at blandingen har stått i omtrent 1 time ved romtemperatur, blir den sentrifugert og den ovenstående del blir brakt til en pH på omtrent 6 ved tilsetning av den nodvendige og tilstrekkelige mengde av natriumkarbonat. Det dannede bunnfall blir fjernet ved sentrifugering og filtrering. Denne rensning er vesentlig for senere å oppnå utelukkende cytobiotiske globuliner.

Filtratet bringes deretter til en noytral pH (pH-området 7),

og det tilsettes en tilstrekkelig mengde av en ammoniumsulfat-opplosning (NH^^SO^ for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 1,85

M (45% vandig opplosning av salt erholdt ved 25°C).

Etter noen timers henstand blir det dannede bunnfall samlet

opp og opplost i den nettopp nodvendige mengde av renset vann. Opplosningen blir dialysert mot renset vann inntil alle spor

av ammoniumsalt forsvinner. Det danner seg vanligvis et nytt bunnfall som fjernes ved sentrifugering av den dialyserte opplosning.

Den dialyserte og sentrifugerte opplosning blir tilsatt natriummono-.fosfat på en slik måte at man oppnår en.sluttkonsentrasjon.på 0,0175 M (pH 6,3). Denne opplosning ledes deretter gjennom en kolonne av dietylaminometylcellulose og dispergeres i en buf-feropplosning av mononatriumfosfat 0,2 M (pH 6,3), hvoretter den vaskes med monofosfat-bufferopplosningen . 0,0175 M (pH 6,3).

De endelige porsjoner blir eluert ved hjelp av den samme buf-feropplosning. Den utstrømmende opplosning inneholder "rensede" cytobiotiske globuliner bestående vesentlig av globuliner 1 og

G.

Etter ny dialyse og filtrering blir opplosningen lyofilisert

og det torre residuum består av cytobiotiske globuliner med hoy renhetsgrad. Disse globuliner skal opplbses i bruksoye-blikket i et passende bæremiddel. De således erholdte cytobiotiske globuliner har egenskaper som gjor dem egnet til bruk i kosmetikk. De isolerte stoffer av huden av visse dyr eller av hudvevet i fostertilstand har således' en stimulerende innvirk-

ning på menneske-epidermis og på selve huden, og gir huden en ny kraft og en spesiell glans.

De cytobiotiske globuliner kan anbringes på huden enten i form av kremer, pommader osv., eller som opplosning, vaskemiddel, hudmelk osv..-

Eksempel

Hud tatt fra to grise.fostre fra slaktehus blir samtidig hakket opp og vasket med en 0,9 %'ig opplosning av natriumklorid for å fjerne gjenværende blod og knuses deretter i en blandeanordning og sus-penderes i 10 ganger deres vekt av samme saltopplosning. Etter

1 times omroring skiller man fra den uopploste del og fryser ved

en temperatur på -10°C for å bevirke brudd av cellene. Etter

frysingen ble det oppnådde produkt gjensuspendert i 10 ganger dets vekt i saltoppiosningen. og man skiller fra den uopploste del som på ny vaskes inntil vaskevæsken ikke lenger inneholder noe opploselig element.

Den oppnådde uopploste rest blir behandlet med 2 ganger sin vekt av en opplosning av natriumcitrat med en pH på 3,1 0,1 og en ion-styrke på 0,15 M. pH for blandingen ble innstilt til 3,1 ved tilsetning av den nodvendige mengde saltsyre. Etter 1 times henstand sentrifugeres blandingen, den på blandingen ovenstående del separeres, hvilken del man bringer til en pH på 6 ved tilsetning av den nodvendige mengde soda. Den dannede felling fjernes ved sentrifugering og filtrering.. Filtratet innstilles derpå til en noytral pH-verdi og tilsettes en opplosning av ammonium-sulfat for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 1,85 M. Den dannede .felling samles opp, loses opp i rent vann, og den oppnådde opplosning dialyseres i rent vann inntil alle spor av ammoniumsal-ter er forsvunnet. Det danner seg en ny felling som blir fjernet ved sentrifugering. Den dialyserte opplosning sentrifugeres og tilsettes natriummonofosfat inntil en sluttkonsentrasjon på 0,0175 M (pH 6,3). Man forer denne opplosning gjennom en kolonne av dietylaminometylcellulose og dispergerer derpå i en buffer-opplosning av natriummonofosfat 0,2 M (pH 6,3), og deretter vasker man med bufferfosfatet av 0,0175 M (pH 6,3). Den ut-strømmende opplosning inneholder de rensede cytobiotiske globuliner. Etter en ny dialyse og filtrering med rent vann lyo-filiserer man den oppnådde opplosning og får en torr rest be^ stående av cytobiotiske globuliner med hoy renhetsgrad.

Farmakologisk undersokelse av hud- globuliner.

Undersøkelsen som danner gjenstand for foreliggende rapport er blitt utfort for å vise aktiviteten av en krem som ble spesielt fremstilt for å forårsake en foryngelse av huden, og som inneholdt som aktivt stoff spesifikke hud-globuliner fremstilt som angitt ovenfor.

Da denne foryngelse er et resultat av en intens fornyelse av derma- og epidermis-lagene, vil dette fremgå av en histologisk undersokelse.

Undersøkelser ble utfort på følgende måte:

Marsvin ble klippet i ryggområdet, 2 områder ble således avgren-set for hvert dyr: - ett (blindprove) blir behandlet med bare fyllstoffet

(eksipienten)

- det annet (behandlet) blir behandlet med den aktive krem som inneholder det sanme fyllstoff tilsatt cytobiotiske globuliner, brukt en gang pr. dag i 15 dager.

Etter denne tid utforer man en biopsi og hudfragmentene blir underkastet en histologisk undersokelse.

Snittene ble farvet ved hjelp av to forskjellige metoder og de mikroskopiske observasjoner er kommentert i det følgende.

Dyr 1250

Venstre side ( Blindprove)

Epidermis inneholdt bare 3 eller 4 lag av malpighi-celler. Basis-membran lite buktet - ingen forlengelse av papil-

laer.

Derma - et lite antall av cellekjerner

Hbvre side ( Behandlet)

Epidermis - tre ganger storre tykkelse enn normalt langs.hele den uttatte overflat. - Nærvær av forlengelser mellom papil-laer - Meget klar basis-membran.

Derma - okning av kjernetallet - Flere collagene fibrer.

Dyr 1252

Blindprove

Epidermis - vanlig struktur, antall av lag varierer med 4/8 av det som gir derma-epidermis-beroringsflaten et buktet utseende., meget klart vedheftende keratin-lag.

Derma - tilstrekkelig tetthet.

Behandlet

Epidermis - tykt keratin-lag som losner seg fra epidermis. An-ordning i meget regelmessige buer av malpighi-celler forsynt med mange elementer. Man kan folge dem helt til den ytterst ut-viklede neo-vaskulari sasj onsoverflate.

Derma - elet ble observert gunstige karrdiametere, samt noen få arterioler som er innsatt i epidermis.

Fysiologisk, er det alltid vanskelig å forbedre tilstanden av et vev som befinner seg i godt utviklet tilstand. Man kan se at man her, til tross for den til å begynne med allerede eutrofiske tilstand, kan oppnå en betydelig forbedring ved slutten av behandlingen.

Man kan konkludere av disse forsok at bruken av den aktive krem bevirker: 1) en betydelig eliminering av utvendige + keratiniserte epidermis-lag, 2) en intensiv forandring av derma med tallrike vaskulære mikroformasjoner, på grunn av den okede tilfoyelse av

næringselementer,

3) en regenererende vekst av derma synlig på fotografiene, som forårsaker dannelsen av nye epidermis-lag.

En sammenligning av den behandlete del med blindproven viser forandringer som tillater å hevde at huden er blitt forynget. Av disse resultater fremgår det således at cytobiotiske globuliner, fremstilt ifolge foreliggende oppfinnelse, har egenskaper som gjor dem skikket også for kosmetisk bruk. Således har stoffer som er isolert fra huden av visse dyr eller hudvev fra dyr i fosterstadium en stimulerende virkning på menneske-epidermis og til og med på derma som viser seg ved en ny fasthet og en særlig glans av huden.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av cytobiotiske globuliner for anvendelse i hud-behandlingsmidler karakterisert ved at den omfatter folgende trinn:

   Macerasjon av hudvev fra sunde slaktedyr eller fostre med en vandig opplosning som inneholder 0,9 vekt-% NaCl for å danne et vevhomogenisat som inneholder cytobiotiske globuliner, eluering av vevhomogenisåtet med en citratopplosning som har en pH på 3,1 0,01 (ionstyrke 0,15 M) for å danne en protein-opplosning, utfelling av urenheter fra proteinopplosningen ved tilsetning av natriumkarbonat til en pH i nærheten av 6 for å fraskille en forste utfelling som fjernes ved filtrering, filtratet innstilles på en pH-verdi på 7 og det tilsettes am-moniumsulfat for å danne en sekundær utfelling, denne utfelling opploses i den nettopp tilstrekkelige vannmengde for fullstendig opplosning for å danne en globulin-inneholdende opplosning, om onskes dialyseres opplosning mot destillert vann for fullstendig å fjerne ammoniumsalt hvorved dannes en ytterligere utfelling som fjernes ved sentrifugering og den dialyserte og sentrifugerte opplosning innstilles på en pH-verdi på 6,3 med natriummonofosfat og passerer gjennom en dietylaminometylcellulose-^kolonne og den utstrømmende opplosning dialyseres og filtreres eventuelt for den lyofiliseres.