NO135994B

NO135994B -

Info

Publication number: NO135994B
Application number: NO2778/71A
Authority: NO
Inventors: H Yaoi
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1970-10-03
Filing date: 1971-07-21
Publication date: 1977-03-28
Also published as: DE2132911C2; GB1360838A; NL171777B; FR2112249A1; JPS4838843B1; NL7108753A; NO135994C; BE769644A; NL171777C; FR2112249B1; DE2132911A1; SE377279B; DK128789B; CH581195A5

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for svekking av rubellavirus (dvs. røde hunder-virus), som kan opparbeides til en vaksine som ikke bare er ny og effektiv, men også ytterligere svekket, dvs. med langt færre bivirkninger enn de som hittil har vært kjent. The present invention relates to a method for weakening the rubella virus (i.e. rubella virus), which can be processed into a vaccine that is not only new and effective, but also further weakened, i.e. with far fewer side effects than those previously known .

Røde hunder er en mesling-lignende infeksjonssykdom som forårsakes av rubellavirus, og som er karakterisert ved svak feber, utslett og lymfadenopati som opptrer etter en inkuba-sjonsperiode på et par uker. Mens sykdommen er relativt ufarlig for spebarn og barn, er den langt alvorligere for voksne som ofte får arthritis, leddsmerter eller lignende. Spesielt når svangre kvinner har denne sykdom under et tidlig stadium av svangerskapet, trenger infeksjonen forbi morkaken og inn til fosteret, hvorved de nyfødte i mange tilfeller får skader såsom grå stær, hjertesvikt og hørevanskeligheter. Det er videre kjent at røde hunder opptrer periodevis og epidemisk. Det er derfor meget ønskelig å kunne utvikle en metode for å bekjempe og kontrollere røde hunder. Rubella is a measles-like infectious disease caused by the rubella virus, which is characterized by a mild fever, rash and lymphadenopathy that occurs after an incubation period of a couple of weeks. While the disease is relatively harmless for infants and children, it is far more serious for adults who often get arthritis, joint pain or the like. Especially when pregnant women have this disease during an early stage of pregnancy, the infection penetrates past the placenta and into the fetus, whereby the newborns in many cases suffer injuries such as cataracts, heart failure and hearing difficulties. It is also known that rubella occurs periodically and epidemically. It is therefore highly desirable to be able to develop a method to combat and control rubella.

Det er innlysende at det er ønskelig å bekjempe røde hunder på enhver måte, og muligheten for å utvikle en vaksine mot røde hunder har vært meget intensivt undersøkt etter at Weller et al. og Parkman et al. i 1962 oppdaget den virustype It is obvious that it is desirable to combat rubella in every way, and the possibility of developing a vaccine against rubella has been very intensively investigated after Weller et al. and Parkman et al. in 1962 it discovered the virus type

som forårsaker røde hunder. Som et resultat av disse under-søkelser har man funnet at røde hunder-virus kan svekkes gjennom en serie passasjer i en vevskultur inneholdende noen pattedyr-celler eller embryoniske celler av hønsefugler, og at man da oppnår en grad av virulens som gjør at den levende, svekkede vaksine kan inokuleres i mennesker på en slik måte at disse gjøres immune uten alvorlige bivirkninger. which causes rubella. As a result of these investigations, it has been found that rubella virus can be weakened through a series of passages in a tissue culture containing some mammalian cells or embryonic cells of chicken birds, and that a degree of virulence is then achieved which means that the living , weakened vaccine can be inoculated into humans in such a way that they are made immune without serious side effects.

Det har vært klinisk påvist at når en svekket levende rubella-vaksihe inokuleres i spebarn eller barn, så vil man få en antistoffreaksjon som opptrer uten uønskede kliniske reaksjoner, og at de som har oppnådd nevnte antistoffer kan beskyttes mot infeksjon av røde hunder. Fra tid til annen har man isolert rubellavirus fra strupen hos vaksinerte personer, men det er kjent at man aldri har kunnet påvise en kontaktinfeksjon hos utsatte barn og voksne som har vært i kontakt med den vaksinerte . It has been clinically proven that when a weakened live rubella vaccine is inoculated into an infant or child, an antibody reaction occurs without unwanted clinical reactions, and that those who have obtained said antibodies can be protected against rubella infection. From time to time, rubella virus has been isolated from the throats of vaccinated persons, but it is known that contact infection has never been detected in exposed children and adults who have been in contact with the vaccinated person.

Når imidlertid den hittil kjente svekkede levende virusvaksine mot røde hunder har blitt inokulert i voksne pasienter, da spesielt hos kvinner i fødselsdyktig alder, så opptrer det andre reaksjoner enn de man finner hos spebarn og barn, og man kan ofte observere såkalte røde hunder-lignende symptomer som feber, utilpasshet, utslett, arthritis, leddsmerter og lignende. Det er derfor stadig et vanskelig problem å inokulere den hittil kjente svekkede levende virusvaksine mot røde hunder i utsatte voksne pasienter. However, when the previously known weakened live virus vaccine against rubella has been inoculated into adult patients, especially in women of childbearing age, different reactions occur than those found in infants and children, and so-called rubella-like reactions can often be observed symptoms such as fever, malaise, rash, arthritis, joint pain and the like. It is therefore still a difficult problem to inoculate the hitherto known weakened live virus vaccine against rubella in exposed adult patients.

Det er videre ikke kjent hvorvidt de kjente vaksiner er fullstendig fri for toksiske reaksjoner hos fostere, eller har tendenser til misdannelser hos samme, når nevnte vaksiner inokuleres hos de svangre kvinner. It is also not known whether the known vaccines are completely free of toxic reactions in foetuses, or have tendencies towards malformations in the same, when said vaccines are inoculated in pregnant women.

Man har nå funnet at når rubellavirus underkastes dyrkningspassasjer i en vevskultur som inneholder primære nyreceller av marsvin, så kan nevnte rubellavirus raskt svekkes etterhvert som passasjene skrider.frem. Etter at nevnte virus er tilstrekkelig svekket i vevskulturen, kan man av denne vevskultur fremstille en sterkt svekket virusvaksine mot røde hunder som ikke har de uønskede bivirkninger hos voksne pasienter som nevnt ovenfor. It has now been found that when rubella virus is subjected to cultivation passages in a tissue culture containing primary kidney cells of guinea pigs, said rubella virus can quickly weaken as the passages progress. After said virus has been sufficiently weakened in the tissue culture, a highly weakened virus vaccine against rubella can be produced from this tissue culture which does not have the unwanted side effects in adult patients as mentioned above.

Hensikten ved foreliggende oppfinnelse er å til-veiebringe en fremgangsmåte for å svekke rubellavirus, hvorved en virulent rubella-virusstamme kan svekkes langt raskere enn det som hittil har vært mulig med kjente fremgangsmåter for å svekke rubellavirus. En slik svekket rubellavirus vil kunne opparbeides til en vaksine mot røde hunder som er ny og effektiv, og som etter vaksinasjon ikke frembringer røde hunder-lignende symptomer eller misdannelser eller toksiske reaksjoner hos fostere, noe som hittil har vært meget vanskelig fullstendig The purpose of the present invention is to provide a method for weakening rubella virus, whereby a virulent rubella virus strain can be weakened far more quickly than has hitherto been possible with known methods for weakening rubella virus. Such a weakened rubella virus will be able to be processed into a vaccine against rubella which is new and effective, and which after vaccination does not produce rubella-like symptoms or malformations or toxic reactions in fetuses, which has so far been very difficult completely

å eliminere fra de kjente virusvaksiner mot røde hunder. to eliminate from the known virus vaccines against rubella.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en fremgangsmåte for svekking av rubella-virus hvorved virus underkastes dyrkningspassasjer i en vevskultur og passasjene avsluttes når tilstrekkelig svekkelse er oppnådd, og denne fremgangsmåte er kjennetegnet ved at passasjene utføres minst 10 ganger i en vevskultur inneholdende primære nyreceller av marsvin, og ved temperaturer i området 28-36°C. According to the present invention, a method for weakening rubella virus is thus provided whereby the virus is subjected to cultivation passages in a tissue culture and the passages are terminated when sufficient weakening has been achieved, and this method is characterized by the passages being carried out at least 10 times in a tissue culture containing primary kidney cells of guinea pigs, and at temperatures in the range 28-36°C.

Man kan benytte enhver stamme av rubella-virus og som eksempler på rubella-virusstammer kan nevnes To-336, Yo-25, M-33, Ko-1, Brown, No-1. Blant de mange anvendte rubella-virusstammer er virusstamme To-336, dvs. ATCC-VR-553, spesielt fordelaktig. Denne stamme er blitt isolert ved en utpensling av svelget hos en pike som hadde røde hunder i Japan, og dens underkultur er blitt tilsendt American Type Culture Collection, Maryland, USA, under nevnte tilvekstnummer ATCC-VR-553. Any strain of rubella virus can be used and examples of rubella virus strains include To-336, Yo-25, M-33, Ko-1, Brown, No-1. Among the many rubella virus strains used, virus strain To-336, i.e. ATCC-VR-553, is particularly advantageous. This strain has been isolated from a throat swab of a girl who had rubella in Japan, and its subculture has been sent to the American Type Culture Collection, Maryland, USA, under the aforementioned accession number ATCC-VR-553.

De primære nyreceller fra marsvin kan fremstilles på kjent måte. The primary kidney cells from guinea pigs can be produced in a known manner.

Rubella-virus inokuleres i en vevskultur som inneholder nevnte celler sammen med et egnet vevskulturmedium, og inkuberes stasjonært eller i bevegelse i et tidsrom fra 5-10 dager (vanligvis ca. en uke). Inkuberingen utføres i praksis ved en temperatur fra 28 - 36°C, mest fordelaktig ved temperaturer fra 29 - 32°C. Den således oppformerte virus inokuleres så i en fersk vevskultur som inneholder nevnte celler for den etterfølgende dyrkningspassasje som sådan, eller etter en egnet fortynning. Etterhvert som slike passasjer gjentas suksessivt, får man en rask svekkelse av nevnte virus. Rubella virus is inoculated into a tissue culture containing said cells together with a suitable tissue culture medium, and incubated stationary or in motion for a period of 5-10 days (usually about a week). The incubation is carried out in practice at a temperature of 28 - 36°C, most advantageously at temperatures of 29 - 32°C. The thus propagated virus is then inoculated into a fresh tissue culture containing said cells for the subsequent cultivation passage as such, or after a suitable dilution. As such passages are repeated successively, one gets a rapid weakening of the said virus.

Som det anvendte vevsmedium kan man f.eks. benytte Hanks oppløsning, Earle's oppløsning, Gey's oppløsning, TC medium 199, Eagle's medium og lignende. Disse media kan til-føres, alt etter ønske, egnede bestanddeler slik som laktalbuminhydrolysat, inaktivert kalveserum, etc. Videre kan nevnte media tilsettes antibiotika slik som penicilliner, streptomycin, dihydrostreptomycin, neomycin eller kanamycin, slik at kulturen kan beskyttes mot mikroorganismer som måtte opptre på grunn av en tilfeldig forurensning. As the tissue medium used, one can e.g. use Hank's solution, Earle's solution, Gey's solution, TC medium 199, Eagle's medium and the like. These media can be supplemented, as desired, with suitable ingredients such as lactalbumin hydrolyzate, inactivated calf serum, etc. Furthermore, antibiotics such as penicillins, streptomycin, dihydrostreptomycin, neomycin or kanamycin can be added to said media, so that the culture can be protected against microorganisms that may occur due to an accidental contamination.

På denne måte blir nevnte rubella-virus utsatt for dyrkningspassasjer inntil det kan bekreftes at viruset er tilstrekkelig svekket/ noe som kan skje ved en inokulering i et serumnegativt dyr eller i en pasient som er følsom for rubella virus. Skjønt antall dyrkningspassasjer som er nødvendige for å oppnå en tilstrekkelig svekkelse vil variere med virulensgra-den på den anvendte virus, inkuberingsperioden for en dyrkningspassasje og lignende, så er det nødvendig å utføre minst 10 passasjer. Således kan rubella-virus svekkes langt raskere ved passasjer i vevskulturer som inneholder primære nyreceller av marsvin sammenlignet med de hittil kjente fremgangsmåter for svekkelse av rubella-virus (sammenlign forsøk 2, In this way, said rubella virus is subjected to cultivation passages until it can be confirmed that the virus is sufficiently weakened/ which can happen by inoculation in a serum-negative animal or in a patient who is sensitive to rubella virus. Although the number of culture passages necessary to achieve a sufficient attenuation will vary with the degree of virulence of the virus used, the incubation period for a culture passage and the like, it is necessary to carry out at least 10 passages. Thus, rubella virus can be attenuated much faster by passages in tissue cultures containing primary guinea pig kidney cells compared to the hitherto known methods for attenuation of rubella virus (compare experiment 2,

side 12). page 12).

Nevnte svekkelse av rubella-virus kan ytterligere lettes ved å anvende den såkalte begrensede fortynningsmetode under passasjene med nevnte vevskultur som inneholder primære nyreceller av marsvin (sammenlign forsøk 3, mer detaljert beskrevet i det etterfølgende). Når man anvender den begrensende fortynningsmetode, blir vevsvæsken fra den foregående passasje fortynnet i serie ved en fortynningsfaktor varierende fra 2 - 10. Hver av de fortynnede væsker inokuleres i en vevskultur inneholdende nevnte primære nyreceller, og de inkuberes for å bestemme den høyeste fortynningsgrad som er mulig for å oppnå en oppformering av virusen under nevnte passasje. Den kulturvæske' som oppnås fra den største fortynning anvendes så som utgangskultur for neste passasje. Den begrensende fortynningsmetode kan anvendes i enhver passasje eller serie av passasjer med vevskultur inneholdende nevnte primære nyreceller. Said attenuation of rubella virus can be further facilitated by using the so-called limited dilution method during the passages with said tissue culture containing primary guinea pig kidney cells (compare experiment 3, described in more detail below). When using the limiting dilution method, the tissue fluid from the previous passage is serially diluted at a dilution factor varying from 2 - 10. Each of the diluted fluids is inoculated into a tissue culture containing said primary kidney cells and incubated to determine the highest dilution that is possible to achieve a multiplication of the virus during said passage. The culture liquid obtained from the largest dilution is then used as the starting culture for the next passage. The limiting dilution method can be used in any passage or series of passages with tissue culture containing said primary kidney cells.

Alt etter behov kan dyrkningspassasjene av rubella-virus med vevskulturen av nevnte celler utføres ved å innskyte flere kultiveringer med en vevskultur av andre dyreceller. Av andre slike dyreceller som kan anvendes, kan nevnes embryoceller av vaktel, and og kylling. Blant disse celler er det spesielt fordelaktig å innskyte fra 1-5 gangers passasjer med embryoceller av vaktel i hovedpassasjene med primære nyreceller av marsvin. Depending on the need, the cultivation passages of rubella virus with the tissue culture of said cells can be carried out by interposing several cultivations with a tissue culture of other animal cells. Of other such animal cells that can be used, mention may be made of quail, duck and chicken embryo cells. Among these cells, it is particularly advantageous to insert from 1-5 passages with embryo cells of quail in the main passages with primary kidney cells of guinea pigs.

Den således sterkt svekkede rubella-virus brukes som utgangspunkt for fremstilling av en sterkt svekket virusvaksine mot røde hunder. Nevnte utgangsvirus inokuleres og inkuberes i en vevskultur for vajcsine-f remstilling , f . eks . en kultur inneholdende primære nyreceller av marsvin eller kanin, og denne fremstilling av vaksine kan skje på en i seg selv kjent måte. Det anbefales at virusen oppformeres i et kulturmedium som ikke inneholder noen slike stoffer som kan virke som et antigen når den resulterende vaksine inokuleres i mennesker. The rubella virus thus greatly weakened is used as a starting point for the production of a greatly weakened virus vaccine against rubella. Said starting virus is inoculated and incubated in a tissue culture for vaccine production, e.g. e.g. a culture containing primary kidney cells of a guinea pig or rabbit, and this production of vaccine can take place in a manner known per se. It is recommended that the virus be propagated in a culture medium which does not contain any such substances which may act as an antigen when the resulting vaccine is inoculated into humans.

Fra den således oppnådde kulturvæske kan man fjerne faste stoffer slik som celler, cellefragmenter eller lignende, noe som kan skje ved en filtrering eller sentrifugering hvorved filtratet eller væsken kan brukes som sådan eller fortynnes med et egnet fortynningsmiddel som f.eks. en fysiologisk saltopp-løsning eller destillert vann, alt avhengig av filtratets eller væskens virustiter. Solid substances such as cells, cell fragments or the like can be removed from the culture liquid thus obtained, which can be done by filtration or centrifugation whereby the filtrate or liquid can be used as such or diluted with a suitable diluent such as e.g. a physiological saline solution or distilled water, all depending on the virus titer of the filtrate or liquid.

Mens den sterkt svekkede virusvaksine mot røde hunder kan brukes som sådan, kan den også konserveres eller preserveres i frosset form med eller uten tilsetning av ett eller flere stabiliseringsmidler som sukrose, laktose, glutama-ter, fosfater og lignende. Alternativt kan den lyofiliseres med eller uten tilsetning av ett eller flere stabiliseringsmidler slik som menneskeserumalbumin, gelatin og lignende for videre lagring, og det lyofiliserte produkt kan så oppløses når det skal brukes med et egnet fortynningsmiddel, f.eks. en fysiologisk saltoppløsning eller sterilt destillert vann. While the highly attenuated rubella virus vaccine can be used as such, it can also be preserved or preserved in frozen form with or without the addition of one or more stabilizers such as sucrose, lactose, glutamates, phosphates and the like. Alternatively, it can be lyophilized with or without the addition of one or more stabilizing agents such as human serum albumin, gelatin and the like for further storage, and the lyophilized product can then be dissolved when it is to be used with a suitable diluent, e.g. a physiological saline solution or sterile distilled water.

For å oppnå en tilfredsstillende vaksinasjon, vil det vanligvis være nødvendig å inokulere minst 10 2 ' 0 InD5QTo obtain a satisfactory vaccination, it will usually be necessary to inoculate at least 10 2 ' 0 InD5Q

(50 % interfererende dose) virustiter pr. person, fortrinnsvis subkutant og alt på en gang. Spesielt foretrukne doser er fra IO<2>'<5> til IO<3>'<5> InD5Q.(50% interfering dose) virus titer per person, preferably subcutaneously and all at once. Particularly preferred doses are from IO<2>'<5> to IO<3>'<5> InD5Q.

For den subkutane inokulering kan man anvende en dose med den nødvendige virustiter i en vandig sammensetning med et volum fra 0,1 til 1,0 ml, fortrinnsvis 0,25 til 0,5 ml. Vaksinen kan således justeres at den ved anvendelse omfatter en sterkt svekket rubella-virus i en røde hunder virustiter pa o minst 10 2 ' 0 InD,-n/nil, fortrinnsvis og ønskelig - 10 2 ' 5 til 10 4 ' 5 InD50/ml, og et fysiologisk akseptabelt bære-stoff for nevnte virus. For the subcutaneous inoculation, one can use a dose with the required virus titer in an aqueous composition with a volume of 0.1 to 1.0 ml, preferably 0.25 to 0.5 ml. The vaccine can thus be adjusted so that when used it comprises a highly weakened rubella virus in a rubella virus titer of at least 10 2 '0 InD,-n/nil, preferably and desirably - 10 2 '5 to 10 4 '5 InD50/ml , and a physiologically acceptable carrier for said virus.

Når den således fremstilte sterkt svekkede virusvaksine mot røde hunder inokuleres i spebarn og barn, kan man observere en bemerkelsesverdig stigning i antistoffnivået i serumet, noe som vil hindre dem i å få en infeksjon av rubella-virus. Når vaksinen anvendes på voksne, inkludert kvinner i befruktningsdyktig alder, kan man også observere en økning av antistoffer i blodserumet, og det er bemerkelsesverdig at man ikke har kunnet observere noen røde hunder-lignende symptomer som vanligvis anses for å være uønskede bivirkninger, og som ofte opptrer ved en vaksinasjon med hittil kjente virusvaksiner mot røde hunder. Den nye og sterkt svekkede virusvaksine mot røde hunder kan således brukes trygt selv for voksne pasienter som effektivt skal immuniseres mot en infeksjon av rubella-virus . When the highly attenuated virus vaccine against rubella thus prepared is inoculated into infants and children, a remarkable rise in the level of antibodies in the serum can be observed, which will prevent them from getting a rubella virus infection. When the vaccine is used in adults, including women of childbearing age, an increase in antibodies in the blood serum can also be observed, and it is noteworthy that no rubella-like symptoms have been observed, which are usually considered to be unwanted side effects, and which often occurs with a vaccination with previously known virus vaccines against rubella. The new and greatly weakened virus vaccine against rubella can thus be used safely even for adult patients who are to be effectively immunized against an infection by the rubella virus.

Foreliggende oppfinnelse vil nå mere detaljert bli beskrevet ved hjelp av de følgende eksempler. Således vil sikkerheten ved den fremstilte sterkt svekkede virusvaksine mot røde hunder bli forklart ved hjelp av forsøk. The present invention will now be described in more detail with the help of the following examples. Thus, the safety of the highly weakened virus vaccine against rubella will be explained by means of experiments.

Eksempel 1 Example 1

Nyrer ble fjernet aseptisk fra friske marsvin. Nevnte nyrer (i det etterfølgende betegnet "GPK") ble vasket med Hanks' avveide saltoppløsning"^ og ble så oppmalt. Det oppmalte vev ble suspendert i 50 ganger større volum av en 0,2 5 %'s trypsin-tilsatt Hank's oppløsning, og ble så suspendert under omrøring. De resulterende frie celler ble oppsamlet ved sentrifugering ved 1000 r.p.m. i 5 min. og fortynnet med en slik mengde av en laktalbumin Hanks<1> oppløsning 2) som var tilsatt 5 ..% inaktivert kalveserum, at den resulterende cellesuspensjon inneholdt ca. 5 x 10 celler pr. ml. Suspensjonen ble inkubert stasjonært i 50 ml kolber ved 36°C. Etter 7 døgn da cellene var sterkt oppformert på innersiden av kolbene, ble de vasket tre ganger med et TC-medium 199 , hvorved man fikk fremstilt en primær cellekultur av GPK. Kidneys were removed aseptically from healthy guinea pigs. Said kidneys (hereinafter referred to as "GPK") were washed with Hanks' balanced salt solution"^ and then ground. The ground tissue was suspended in a 50-fold volume of 0.25% trypsin-supplemented Hank's solution, and was then suspended with stirring. The resulting free cells were collected by centrifugation at 1000 rpm for 5 min and diluted with such an amount of a lactalbumin Hanks<1> solution 2) to which 5..% inactivated calf serum had been added, that the resulting cell suspension contained approximately 5 x 10 cells per ml. The suspension was incubated stationary in 50 ml flasks at 36° C. After 7 days when the cells had greatly proliferated on the inside of the flasks, they were washed three times with a TC medium 199 , whereby a primary cell culture of GPK was produced.

0,2 ml av en 10 ganger fortynnet væske av en rubella-virusstamme som var blitt isolert fra en pasient med røde hunder og passasjedyrket 13 ganger med primære nyreceller fra afrikansk grønnape, i det etterfølgende betegnet "AGMK", ble så inokulert 0.2 ml of a 10-fold dilution of a rubella virus strain that had been isolated from a patient with rubella and passaged 13 times with primary African green monkey kidney cells, hereinafter referred to as "AGMK", was then inoculated

i GPK-cellekulturen og holdt ved 37°C i 90 min. Deretter ble kulturvæsken kastet og cellene vasket 5 ganger med TC-medium 199. Til slutt ble 5 ml TC-medium 199, som var tilsatt 2% inaktivert kalveserum tilsatt kolben og inkuberingen ble utført ved 32°C i 7 døgn. Kulturvæsken ble sentrifugert ved 3000 omdr./ minutt i 5 min. for å utskille én væske som så kan brukes som utgangskultur i neste passasje etter en fortynning 10 ganger ved in the GPK cell culture and kept at 37°C for 90 min. The culture liquid was then discarded and the cells washed 5 times with TC medium 199. Finally, 5 ml of TC medium 199, which had been supplemented with 2% inactivated calf serum, was added to the flask and the incubation was carried out at 32°C for 7 days. The culture fluid was centrifuged at 3000 rpm for 5 min. to separate one liquid which can then be used as the starting culture in the next passage after a 10-fold dilution by

hjelp av et TC-medium 199. using a TC medium 199.

På denne måten ble passasjen med GPK-vevskulturen gjentatt 45 ganger og kulturvæsken fra siste gangs passasje ble sentrifugert, hvorved man oppnådde en sterkt svekket virus som kan anvendes for fremstilling av en virusvaksine mot røde hunder. 10 ml av den 10 ganger fortynnede viruskultur ble inokulert i en primær cellekultur av kaninnyrer (i det etter-følgende betegnet "RK") i Roux-kolber på 500 ml, og hvor kulturen var fremstilt på samme måte som angitt ovenfor, og deretter ble kolbene hensatt ved 37°C i 90 min. Væsken ble kastet og cellene vasket 5 ganger med TC-medium 199. Deretter ble 4 0 ml av et serumfritt TC-medium 19 9 tilsatt kolbene, og inkuberingen ble utført ved 3 2°C i 7 dager. Den resulterende kulturvæske ble sentrifugert ved 3000 omdr./min. i 5 min., hvorved man fikk en overliggende væske som er en sterkt svekket virusvaksine mot røde hunder. Denne væske viser en virustiter mot røde hunder på IO<3>'<5> InD5Q/ml bedømt ved hjelp av ECHO-11<4>^-systernet og AGMK. In this way, the passage with the GPK tissue culture was repeated 45 times and the culture fluid from the last passage was centrifuged, whereby a greatly weakened virus was obtained which can be used for the production of a virus vaccine against rubella. 10 ml of the 10-fold diluted virus culture was inoculated into a primary cell culture of rabbit kidneys (hereinafter referred to as "RK") in 500 ml Roux flasks, and where the culture was prepared in the same manner as above, and then flasks set aside at 37°C for 90 min. The liquid was discarded and the cells were washed 5 times with TC medium 199. Then 40 ml of a serum-free TC medium 199 was added to the flasks, and the incubation was carried out at 32°C for 7 days. The resulting culture fluid was centrifuged at 3000 rpm. for 5 min., whereby an overlying liquid was obtained which is a highly weakened virus vaccine against rubella. This fluid shows an anti-rubella virus titer of 10<3>'<5> InD5Q/ml as assessed by the ECHO-11<4>^ system and AGMK.

Produktet ble frosset for lagring ved -7 0°C. The product was frozen for storage at -70°C.

Etter 10 0 døgns lagring ble produktet opptint og fortynnet 3 ganger pr. volum med en fysiologisk saltoppløsning. Den fortynnede vaksine ble subkutant inokulert i en arm og viste den ønskede immuniseringseffekt både hos voksne pasienter og hos barn og spebarn. After 100 days of storage, the product was thawed and diluted 3 times per volume with a physiological saline solution. The diluted vaccine was subcutaneously inoculated into one arm and showed the desired immunization effect both in adult patients and in children and infants.

Bemerkninger: Remarks:

1) Hank's avveide saltoppløsning består av følgende: 1) Hank's weighed salt solution consists of the following:

destillert vann (trippeldestillert), til en distilled water (triple distilled), to a

total mengde på 1 liter. total amount of 1 liter.

2) Laktalbumin Hanks' oppløsning fremtilles ved å oppløse 5 g laktalbuminhydrolysat i Hanks avveide saltoppløsning slik at man totalt får et volum på 1000 ml. 3) TC-medium 199 er en steril vandig oppløsning justert til pH 7,2, og som inneholder aminosyrer, purinbaser pyrimidinbaser, vitaminer, sukkere, nukleotider, uorganiske salter, etc. Den detaljerte-sammensetning er bl.a. beskrevet i: Morgan, J.F. et al.: 2) Lactalbumin Hanks' solution is prepared by dissolving 5 g of lactalbumin hydrolyzate in Hanks' weighed salt solution so that a total volume of 1000 ml is obtained. 3) TC medium 199 is a sterile aqueous solution adjusted to pH 7.2, and which contains amino acids, purine bases, pyrimidine bases, vitamins, sugars, nucleotides, inorganic salts, etc. The detailed composition is, among other things, described in: Morgan, J.F. et al.:

Proe. Soc. Exp. Biol. Med., 73,side 1-8 (1950). Pro. Soc. Exp. Biol. Med., 73, pages 1-8 (1950).

4) ECHO-11 betyr ECHO virus type 11 (Gregory-stamme), dvs. den stamme som vanligvis anvendes for en infek-s jonsbedømmelse av riibella-virus. Nevnte type virus er mer detaljert beskrevet i f.eks. "New Eng. J. Med" 275, 569-574, 1966. 4) ECHO-11 means ECHO virus type 11 (Gregory strain), i.e. the strain that is usually used for an infection assessment of riibella virus. Said type of virus is described in more detail in e.g. "New Eng. J. Med" 275, 569-574, 1966.

Eksempel 2 Example 2

I dette eksempel anvendte man samme virusstamme som i eksempel 1 og underkastet 10 gangers passasjer ved anvendelse av den begrensede fortynningsmetode. In this example, the same virus strain as in example 1 was used and subjected to 10-fold passages using the limited dilution method.

Således ble utgangsviruset fortynnet med TC-medium 199 ved en serie 5 gangers fortynning fra 1:5 2 til 1:5 9, og 0,2 ml av hver av de fortynnede væsker ble inokulert i en GPK-cellekultur i 10 kolber på 50 ml som var fremstilt på samme måte som angitt i eksempel 1, og deretter inkubert i 7 døgn under samme betingelser som angitt i eksempel 1. De respektive kul-turvæsker ble sentrifugert ved 3000 omdr./min. i 5 min, hvorved man oppnådde væske som så ble frosset for lagring ved -70°C. Thus, the starting virus was diluted with TC medium 199 by a series of 5-fold dilutions from 1:5 2 to 1:5 9, and 0.2 ml of each of the diluted liquids was inoculated into a GPK cell culture in 10 50 ml flasks which was prepared in the same way as stated in example 1, and then incubated for 7 days under the same conditions as stated in example 1. The respective culture fluids were centrifuged at 3000 rpm. for 5 min, whereby liquid was obtained which was then frozen for storage at -70°C.

Den begrensende fortynning for virusformeringen ved nevnte dyrkningspassasje ble bestemt ved hjelp av følgende metode, hvor man anvendte en vesikulær stomatitis-virus: Cellene som ble utskilt fra ovennevnte væsker ble etter to gangers vasking med Hanks avveide saltoppløsning inokulert med 100 TCID^q (50 % vevskultur-infiserende dose) av en vesikulær stomatitis-virus og inkubert ved 36 C i 2 dager i 5 ml TC-medium 199 tilsatt 2 % inaktivert kalveserum. Deretter ble de respektive celler observert mikroskopisk for tegn til cytopatiske effekter forårsaket av den vesikulære stomatitis-virus, hvorved man kunne bestemme den høyeste fortynning for oppformeringen av virusen. The limiting dilution for the virus propagation at said culture passage was determined by the following method, using a vesicular stomatitis virus: The cells secreted from the above fluids were after washing twice with Hank's weighed saline solution inoculated with 100 TCID^q (50% tissue culture infective dose) of a vesicular stomatitis virus and incubated at 36 C for 2 days in 5 ml of TC medium 199 supplemented with 2% inactivated calf serum. Then the respective cells were observed microscopically for signs of cytopathic effects caused by the vesicular stomatitis virus, whereby the highest dilution for the propagation of the virus could be determined.

Blant de væsker som ble frosset, opptinte man bare Among the liquids that were frozen, only thawed

de som ble oppnådd fra utgangsviruset mfid høyeste fortynning. those obtained from the starting virus mfid highest dilution.

De opptinte væsker ble fortynnet med TC-medium 199 ved en The thawed liquids were diluted with TC medium 199 at a

2 9 2 9

5-gangers seriefortynning fra 1:5 til 1:5 . 0,2 ml av hver av de fortynnede væsker ble inokulert i en frisk GPK-cellekultur i 10 kolber på 50 ml og inkubert under samme betingelser som angitt ovenfor. Den høyeste fortynning for virusoppformering ble igjen bestemt på ovennevnte måte, og de oppnådde kultur-væsker fra utgangsvirus-væsken med høyeste fortynning ble så anvendt som utgangskultur for neste dyrkningspassasje etter en fortynning ved hjelp av nevnte 5-gangers fortynningsserie. 5-fold serial dilution from 1:5 to 1:5. 0.2 ml of each of the diluted liquids was inoculated into a fresh GPK cell culture in 10 50 ml flasks and incubated under the same conditions as stated above. The highest dilution for virus propagation was again determined in the above-mentioned manner, and the obtained culture liquids from the starting virus liquid with the highest dilution were then used as starting culture for the next cultivation passage after a dilution using the aforementioned 5-fold dilution series.

På denne måten ble passasjen med GPK-cellekulturen utført 10 ganger med anvendelse av den begrensende fortynningsmetode, og kulturvæsken fra den tiende kultur ble så sentrifugert, hvorved man oppnådde en sterkt svekket utgangsvirus for fremstilling av en virusvaksine mot røde hunder. In this way, the passage with the GPK cell culture was carried out 10 times using the limiting dilution method, and the culture liquid from the tenth culture was then centrifuged, whereby a highly attenuated starting virus was obtained for the preparation of a virus vaccine against rubella.

Nevnte utgangsvirus ble inokulert i RK-cellekulturen i Roux-kolber og opparbeidet på samme måte som angitt i eksempel 1 ved hjelp av et serumfritt TC-medium 199, hvorved man fikk fremstilt en sterkt svekket virusvaksine mot røde hunder. Vaksinen viser en rubella-virustiter på 10 4 ' 0 InD5Q/ml, bedømt på samme måte som angitt i eksempel 1. Said starting virus was inoculated into the RK cell culture in Roux flasks and worked up in the same way as stated in example 1 using a serum-free TC medium 199, whereby a highly weakened viral vaccine against rubella was produced. The vaccine shows a rubella virus titer of 10 4 ' 0 InD5Q/ml, assessed in the same manner as indicated in Example 1.

På samme måte som angitt i eksempel 1 ble produktet frosset for lagring og deretter opptint og brukt for vaksinasjon, hvorved man fikk en tilfredsstillende immunisering såvel hos voksne pasienter som hos barn og spebarn. In the same way as stated in example 1, the product was frozen for storage and then thawed and used for vaccination, whereby a satisfactory immunization was obtained both in adult patients and in children and infants.

Eksempel 3 Example 3

Embryoer fra vaktel (i det etterfølgende betegnet "QE") ble aseptisk fjernet fra eggene etter 5 døgns ruging, og etter avkutting av fosterhodene ble nevnte embryoer opparbeidet på samme måte som angitt i eksempel 1, hvorved man fikk fremstilt en QE-cellekultur. Embryos from quail (hereinafter referred to as "QE") were aseptically removed from the eggs after 5 days of incubation, and after cutting off the fetal heads, said embryos were processed in the same way as stated in example 1, whereby a QE cell culture was produced.

Denne cellekultur ble inokulert med samme rubella-virusstamme som i eksempel 1 og inkubert under samme betingelser som nevnt i dette eksempel. Passasjen med QE-cellekulturen ble gjentatt to ganger. Kulturvæsken fra annen gangs passasje ble sentrifugert, hvorved man oppnådde en væske. Denne væsken ble inokulert i en GPK-cellekultur i kolber, og hvor cellekulturen var fremstilt på samme måte som angitt i eksempel 1. Nevnte inokulum ble inkubert under samme betingelser som angitt i eksempel 1. Væsken som ble oppnådd ved sentrifugering av den resulterende kultur ble fortynnet 10 ganger pr. volum og inokulert i en frisk GPK-cellekultur. Passasjen med GPK-cellekulturen ble således gjentatt 20 ganger. Deretter ble dyrkningspassasjen med QE-cellekulturen gjentatt to ganger, hvoretter man igjen utførte 10 passasjer med GPK-cellekulturen. This cell culture was inoculated with the same rubella virus strain as in Example 1 and incubated under the same conditions as mentioned in this Example. The passage with the QE cell culture was repeated twice. The culture liquid from the second passage was centrifuged, whereby a liquid was obtained. This liquid was inoculated into a GPK cell culture in flasks, and where the cell culture was prepared in the same manner as stated in Example 1. Said inoculum was incubated under the same conditions as stated in Example 1. The liquid obtained by centrifugation of the resulting culture was diluted 10 times per volume and inoculated into a fresh GPK cell culture. The passage with the GPK cell culture was thus repeated 20 times. Then the cultivation passage with the QE cell culture was repeated twice, after which 10 passages were again performed with the GPK cell culture.

Den således oppnådde utgangsvirus ble inokulert i en RK-cellekultur i Roux-kolber på 500 ml og opparbeidet på samme måte som angitt i eksempel 1 ved hjelp av et serumfritt TC-medium 199. Man fikk på denne måten fremstilt en sterkt svekket virusvaksine mot røde hunder. Den således oppnådde vaksine viser en rubella-virustiter på 10<3>'^ InD^0/ml, bedømt ved hjelp av samme system som angitt i eksempel 1. The starting virus thus obtained was inoculated into an RK cell culture in 500 ml Roux flasks and worked up in the same way as stated in example 1 with the help of a serum-free TC medium 199. In this way, a highly attenuated virus vaccine against red dogs. The vaccine thus obtained shows a rubella virus titer of 10<3>'^ InD^0/ml, assessed using the same system as indicated in Example 1.

På samme måte som i eksempel 1 ble produktet frosset for lagring og deretter opptint og brukt for vaksinasjon. In the same way as in Example 1, the product was frozen for storage and then thawed and used for vaccination.

De QE-celler som ble brukt i dette eksempel er negative i den såkalte COFAL-prøve (referanse Sarma, P.S. et. al, Virology, 23, 313 og følgende (1964)). The QE cells used in this example are negative in the so-called COFAL test (reference Sarma, P.S. et. al, Virology, 23, 313 et seq. (1964)).

Eksempel 4 Example 4

0,2 ml av en 100 gangers fortynnet væske av rubella virus, stamme To-336, passasjedyrket 7 ganger med AGMK-celler, ble inokulert i en GPK-cellekultur i kolber på 50 ml, fremstilt på. samme måte som angitt i eksempel 1. Inokulumet ble inkubert under samme betingelser som angitt i eksempel 1. Således ble passasjen med GPK-cellekulturen gjentatt 19 ganger, og kulturvæsken etter den nittende passasjé ble sentrifugert, hvorved man oppnådde en sterkt svekket utgangsvirus for fremstilling av en rubella-virusvaksine. 0.2 ml of a 100-fold dilution of rubella virus, strain To-336, passaged 7 times with AGMK cells, was inoculated into a GPK cell culture in 50 ml flasks, prepared on. the same way as stated in Example 1. The inoculum was incubated under the same conditions as stated in Example 1. Thus, the passage with the GPK cell culture was repeated 19 times, and the culture liquid after the nineteenth passage was centrifuged, whereby a highly attenuated starting virus was obtained for the production of a rubella virus vaccine.

Utgangsviruset ble inokulert i RK-celler i Roux-kolber på 500 ml og bearbeidet på samme måte som angitt i eksempel 1 ved hjelp av et serumfritt TC-medium 199, hvorved man fikk en sterkt svekket virusvaksine mot røde hunder. Den. således fremstilte vaksine viser en rubella-virustiter på 10 4 '3 InD^/ml, bedømt på samme måte som angitt i eksempel 1. The starting virus was inoculated into RK cells in 500 ml Roux flasks and processed in the same way as indicated in example 1 using a serum-free TC medium 199, whereby a highly attenuated virus vaccine against rubella was obtained. It. thus prepared vaccine shows a rubella virus titer of 10 4 '3 InD^/ml, assessed in the same way as indicated in example 1.

På samme måte som angitt i eksempel 1, ble produktet frosset for lagring og deretter opptint og brukt for vaksinasjon. Similarly to Example 1, the product was frozen for storage and then thawed and used for vaccination.

Eksempel 5 Example 5

0,2 ml av en 100 gangers fortynnet væske av rubella 0.2 ml of a 100-fold diluted liquid of rubella

virus, stamme Yo-25, passasjedyrket 5 ganger med AGMK-celler, ble inokulert i en GPK-cellekultur i kolber på 50 ml fremstilt på samme måte som angitt i eksempel 1. Inokulumet ble inkubert under samme betingelser som angitt i nevnte eksempel. Passasjen med GPK-cellekulturen ble således gjentatt 24 ganger, og kulturvæsken fra den 24. kultur ble sentrifugert, hvorved man oppnådde en sterkt svekket utgangsvirus for fremstilling av en virusvaksine mot røde hunder. virus, strain Yo-25, passaged 5 times with AGMK cells, was inoculated into a GPK cell culture in 50 ml flasks prepared in the same manner as stated in Example 1. The inoculum was incubated under the same conditions as stated in said example. The passage with the GPK cell culture was thus repeated 24 times, and the culture fluid from the 24th culture was centrifuged, whereby a highly weakened starting virus was obtained for the production of a virus vaccine against rubella.

Nevnte utgangsvirus ble inokulert i RK-celler i Roux-kolber på 500 ml og opparbeidet på samme måte som angitt i eksempel 1, hvorved man fikk en sterkt svekket rubella-virusvaksine. Den således fremstilte vaksine viste en rubella-virustiter på 10 4 ' 2 InD^/ml, bedømt på samme måte som angitt i eksempel 1. Said starting virus was inoculated into RK cells in 500 ml Roux flasks and worked up in the same manner as stated in example 1, whereby a highly attenuated rubella virus vaccine was obtained. The vaccine thus prepared showed a rubella virus titer of 10 4 - 2 InD^/ml, assessed in the same manner as stated in Example 1.

På samme måte som angitt i eksempel 1 ble produktet frosset for lagring og deretter opptint og brukt for vaksinasjon . In the same way as stated in example 1, the product was frozen for storage and then thawed and used for vaccination.

Eksempel 6 Example 6

0,2 ml av en 100 gangers fortynnet væske av rubella virus, stamme To-336 passasjedyrket 7 ganger med AGMK-celler, ble inokulert i en GPK-cellekultur i kolber på 50 ml, fremstilt på samme måte som angitt i eksempel 1. Nevnte inokulum ble inkubert under samme betingelser som angitt i eksempel 1. Passasjen med GPK-cellekulturen ble således gjentatt 20 ganger med anvendelse av den begrensende fortynningsmetode slik denne er beskrevet i eksempel 2, fra den femte passasje til den attende passasje. 0.2 ml of a 100-fold dilution of rubella virus strain To-336 passaged 7 times with AGMK cells was inoculated into a GPK cell culture in 50 ml flasks, prepared in the same manner as indicated in Example 1. Said inoculum was incubated under the same conditions as stated in example 1. The passage with the GPK cell culture was thus repeated 20 times using the limiting dilution method as described in example 2, from the fifth passage to the eighteenth passage.

Den eåledes oppnådde sterkt svekkede utgangsvirus ble så videre tilpasset RK-cellekulturen ved 2 passasjer med dette kulturmedium, og ble så inokulert i RK-celler i Roux-kolber på 500 ml og bearbeidet på samme måte som angitt i eksempel 1, hvorved man fikk en sterkt svekket virusvaksine mot røde hunder. Den således oppnådde vaksine viser en rubella-virustiter på IO<4>'"<*>" InD^g/ml, bedømt på samme måte som angitt i eksempel 1. The highly attenuated starting virus thus obtained was then adapted to the RK cell culture by 2 passages with this culture medium, and was then inoculated into RK cells in 500 ml Roux flasks and processed in the same way as stated in example 1, whereby a highly attenuated virus vaccine against rubella. The vaccine thus obtained shows a rubella virus titer of 10<4>'"<*>" InD^g/ml, judged in the same manner as indicated in Example 1.

På samme måte som angitt i eksempel 1 ble produktet frosset for lagring og deretter opptint og brukt for vaksinasjon. In the same manner as stated in Example 1, the product was frozen for storage and then thawed and used for vaccination.

Forsøk 1 Attempt 1

De sterkt svekkede virusvaksiner mot røde hunder, fremstilt som angitt i eksempel 1-6, ble underkastet prøver på den'måte som er beskrevet i avsnitt 73.114 i Public Health • Servlce> Regulations, Title 42, del 73, USA, for sikkerhetsprøv.er for "poliomyelitis vaccine, live, oral", og på den måte som er beskrévét<r>i avsnitt 73.73 i samme bestemmelser for sterilitets-prøver. The highly attenuated rubella virus vaccines prepared as set forth in Examples 1-6 were tested in the manner described in Section 73.114 of the Public Health Service Regulations, Title 42, Part 73, United States, for safety testing. for "poliomyelitis vaccine, live, oral", and in the manner described<r>in section 73.73 of the same provisions for sterility tests.

Som et resultat av inokuleringsprøver i forskjellige dyr (f.eks. i kaniner, voksne mus, musunger og marsvin), vevs-kulturprøver méd forskjellige typer primære celler (f.eks. med apenyrer, menneskeamnion, menneskenyrer og kaninnyrer) og negative prøver på fordelaktige midler, ble det bekreftet at de prøvede vaksiner tilfredsstilte ethvert krav i ovennevnte bestemmelser. As a result of inoculation tests in different animals (e.g. in rabbits, adult mice, mice and guinea pigs), tissue culture samples with different types of primary cells (e.g. with monkey kidney, human amnion, human kidney and rabbit kidney) and negative samples of advantageous means, it was confirmed that the tested vaccines satisfied every requirement in the above provisions.

Forsøk 2 Attempt 2

I denne prøve ble svekkingen av rubella-virus oppnådd ved passasjen med GPK-cellekulturen sammenlignet med den man oppnådde ved dyrkningspassasjer med RK-cellekulturen, idet den sistnevnte ble anvendt som representativ for de hittil kjente celler som har vært anvendt for svekking av rubella-virus. In this test, the attenuation of rubella virus achieved by passage with the GPK cell culture was compared to that achieved by passage with the RK cell culture, the latter being used as representative of the previously known cells that have been used for the attenuation of rubella virus .

Rubella-virus stamme To-336 passasjedyrket 7 ganger med AGMK-celler og stamme Yo-25 passasjedyrket 5 ganger med AGMK-celler, ble begge underkastet 30 passasjer med GPK-celler under samme betingelser som angitt i eksempel 1, respektivt. Rubella virus strain To-336 passaged 7 times with AGMK cells and strain Yo-25 passaged 5 times with AGMK cells were both subjected to 30 passages with GPK cells under the same conditions as stated in Example 1, respectively.

Som kontrollforsøk ble nevnte to stammer underkastet 30 passasjer med RK-celler under samme betingelser som angitt ovenfor. As a control experiment, the aforementioned two strains were subjected to 30 passages with RK cells under the same conditions as stated above.

Reduksjonen av virusvirulensen med antall passasjer ble bestemt med hensyn til de respektive passasjesystemer på, følgende måte: De respektive virusvasker fra 1., 5., 10., 15., 20., 25. og 30. kultur ble inokulert subkutant i rhesus-aper, kaniner og marsvin i en dose på 5 x 10 3TCID^q pr. dyr.. Klinisk; . reaksjon, rubella-virus antistofftiter i dyreserum og isolering av rubella-virus ved utstrykning fra svelget ble bestemt med hensyn tii de respektive inokulerte dyr. The reduction of the virus virulence with the number of passages was determined with respect to the respective passage systems in the following way: The respective virus washes from the 1st, 5th, 10th, 15th, 20th, 25th and 30th cultures were inoculated subcutaneously into rhesus monkeys, rabbits and guinea pigs in a dose of 5 x 10 3TCID^q per animal.. Clinical; . reaction, rubella virus antibody titer in animal serum and isolation of rubella virus by smear from the pharynx were determined with respect to the respective inoculated animals.

Klinisk reaksjon: Utslett og andre symptomer som Clinical reaction: Rash and other symptoms such as

kan tilskrives inokuleringen blé observert ca. 3 uker etter inokuleringen. can be attributed to the inoculation blé observed approx. 3 weeks after inoculation.

Rubella-virus antistofftiter: Serumprøver på dyrene ble tatt på den 21. dag etter inokuleringen^ og hemaglut-inering-inhiberingstiter '(<H>ÅI) ble bestemt med hensyn til de respektive prøver ved hjelp av den metode som er beskrevet av Stewart et j al. i "New Eng. J. Med.", 276, 554-557, 1967. Rubella virus antibody titers: Serum samples of the animals were taken on the 21st day after inoculation^ and hemagglutination inhibition titers' (<H>ÅI) were determined with respect to the respective samples using the method described by Stewart et al. j al. in "New Eng. J. Med.", 276, 554-557, 1967.

Isolering av rubella- virus fra svelg^ utstrykninger: I 17 dager, idet man startet 5 dager etter onokuleringen, ble i utstrykninger fra svelg hos alle dyrene oppsamlet og undersøkt, ved hjelp av den metode som er beskrevet av Parkman!et al. i • "New Eng. J. Med.", 275, 569-574 ; 1966., Isolation of rubella virus from pharyngeal smears: For 17 days, starting 5 days after inoculation, smears from the pharynx of all animals were collected and examined, using the method described by Parkman et al. in • "New Eng. J. Med.", 275, 569-574 ; 1966.,

De oppnådde resultater er angitt i tabellene! og2. The obtained results are indicated in the tables! and2.

Forsøk 3 Attempt 3

Rubella-virusstamme To 336 passasjedyrket 7 ganger med AGMK-celler ble underkastet 20 passasjer i en GPK-cellekultur under anvendelse av den begrensende fortynningsmetode til 3. passasje, 6. passasje og 9. passasje på den måte som er beskrevet i eksempel 6. Rubella virus strain Two 336 passage cultured 7 times with AGMK cells were subjected to 20 passages in a GPK cell culture using the limiting dilution method to 3rd passage, 6th passage and 9th passage in the manner described in Example 6.

Reduksjonen av virusvirulensen med antall passasjer ble bestemt på den måte som er beskrevet i forsøk 2. The reduction of virus virulence with the number of passages was determined in the manner described in experiment 2.

Resultatene er angitt i tabell. 3. The results are shown in the table. 3.

Sammenligningsdata Comparative data

Test I Test I

Attenueringen av rubellavirus oppnådd ved passasjer med primære nyreceller fra marsvin (betegnet GPK) ble sammenlignet med den som ble oppnådd ved passasjer med primærceller av marsvin-lunge (betegnet GPL), primærceller av kaninnyre (betegnet RK), lungeceller WI-38 fra menneskeembryo (diploid celle betegnet "WI" 38), nyreceller av afrikansk grønnape (betegnet AGMK) og primærceller av oksenyre (betegnet BK). The attenuation of rubella virus obtained in passages with primary guinea pig kidney cells (designated GPK) was compared with that obtained in passages with primary cells of guinea pig lung (designated GPL), primary cells of rabbit kidney (designated RK), human embryonic lung cells WI-38 ( diploid cell designated "WI" 38), African green monkey kidney cells (designated AGMK) and bull kidney primary cells (designated BK).

Rubellavirus av stammen To-336, som var underkastet passasjer 7 ganger med AGMK, og rubellavirus av stammen Yo-25, som var underkastet passasjer 5 ganger med AGMK, ble begge underkastet passasjer 30 ganger med GPK under de samme betingelser som angitt i eksempel 1. Som kontroll ble de to stammene underkastet passasjer 30 ganger med GPL, PK, WI-38 og BK under de samme betingelser som ovenfor. Rubella virus strain To-336, which had been passaged 7 times with AGMK, and rubella virus strain Yo-25, which had been passaged 5 times with AGMK, were both passaged 30 times with GPK under the same conditions as stated in Example 1 As a control, the two strains were passaged 30 times with GPL, PK, WI-38 and BK under the same conditions as above.

Minskingen av rubellavirus-virulensen med antall passasjer ble bestemt med hensyn til respektive passasjesystemer på følgende måte: Respektive virusvæsker av kulturene 1, 5, 10, 15, 20, 25 og 3 0 ble dyrket subkutant på rhesus-aper, kaniner og marsvin i en dose på 5 . 10 3 TCI D^q pr. dyr. Rubellavirus-antilegemetiteren for dyresera og rubella virusisolering fra svelget ble bestemt hos de respektive inokulerte dyr. The reduction of rubella virus virulence with the number of passages was determined with respect to respective passage systems as follows: Respective virus fluids of cultures 1, 5, 10, 15, 20, 25 and 30 were cultured subcutaneously on rhesus monkeys, rabbits and guinea pigs in a dose of 5 . 10 3 TCI D^q per animals. The rubella virus antibody titer for animal sera and rubella virus isolation from the pharynx was determined in the respective inoculated animals.

Rubella-virus-antilegemetiter: serumprøver fra dyr ble oppsamlet på den 21. dagen etter inokuleringen og hemaglu-tinering-inhiberingstiteren (HAI) ble bestemt for hver prøve ved hjelp av Stewart et al.'s metode beskrevet i "New Eng. J. Med." 276, 554-557 (1967). Rubella virus antibody titers: serum samples from animals were collected on the 21st day after inoculation and the hemagglutinating inhibition (HAI) titer was determined for each sample using the method of Stewart et al. described in "New Eng. J. With." 276, 554-557 (1967).

Rubellavirus-isolering fra svelget: I 17 dager regnet fra 5. dagen etter inokuleringen ble det oppsamlet svelgprøver fra samtlige dyr og disse ble undersøkt ved hjelp av Parkman et al.'s metode som beskrevet i "New Eng. J. Med.", Rubella virus isolation from the pharynx: For 17 days counting from the 5th day after inoculation, pharyngeal samples were collected from all animals and these were examined using Parkman et al.'s method as described in "New Eng. J. Med.",

275, 569-574 (1966) . 275, 569-574 (1966).

Resultatene er sammenfattet i de nedenstående tabeller I og II. The results are summarized in the tables I and II below.

Claims

1. Method for attenuation of rubella virus, whereby rubella virus is subjected to cultivation passages in a tissue culture and the passages are terminated when sufficient attenuation has been achieved, characterized in that the passages are performed at least 10 times in a tissue culture containing primary kidney cells of guinea pigs, and at temperatures in the range 28-36°C.

2. Method according to claim 1, characterized in that strain ATCC-VR-553 (To-336) is used as rubella virus.