NO125678B

NO125678B -

Info

Publication number: NO125678B
Application number: NO3467/68A
Authority: NO
Inventors: E Crago; K Shepard
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1967-09-07
Filing date: 1968-09-06
Publication date: 1972-10-16
Also published as: DK145892B; YU34082B; YU205268A; IL30634A0; FI50975B; GB1214408A; BE720233A; CH534168A; FR8490M; ES357877A1; DK145892C; NL6812003A; OA02886A; FI50975C; GB1214409A; AT289123B; CA939345A; SE355811B

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av et antibiotisk middel. Method for the preparation of an antibiotic agent.

Det er kjent at antibiotiske midler som først bare ble brukt for terapeutiske formål, nu også brukes for andre formål med tilfredsstillende resultater. It is known that antibiotic agents, which were initially only used for therapeutic purposes, are now also used for other purposes with satisfactory results.

Det er funnet at en actinomycet når It has been found that an actinomycete reaches

den dyrkes i passende flytende, nærende medier er i stand til å gi et antibiotisk stoff som kan ekstraheres fra kulturmediet ved hjelp av passende metoder. it is grown in suitable liquid nutrient media is capable of yielding an antibiotic substance which can be extracted from the culture medium by suitable methods.

Det nye aktive stoff som dannes ved The new active substance that is formed by

dyrking av actinomyceten er gitt navnet «flavensomycin». De fysikalske og kjemiske karakteristika for flavensomycin er forskjellige fra de hittil kjente antibioti-kas. De nye antibiotiske middel er utvun-net av kulturvæsker av en streptomyces som ble isolert fra jordbunnen i et gårds-bruk i Cavour, Piemonte. Denne streptomyces-art tilhører den kromogene gruppe og er gitt navnet Streptomyces Cavouren- cultivation of the actinomycete is given the name "flavensomycin". The physical and chemical characteristics of flavensomycin are different from the previously known antibiotics. The new antibiotics are extracted from culture fluids of a streptomyces that was isolated from the soil on a farm in Cavour, Piedmont. This streptomyces species belongs to the chromogenic group and has been given the name Streptomyces Cavouren-

sis, stamme nr. 829.8.52. Den er deponert i Institute of Microbiology, Rutgers Uni-versity, New Brunswick, New Jersey, USA i desember 1957, og registrert under nr. W. 3758. Dessuten er denne stamme sis, trunk no. 829.8.52. It has been deposited in the Institute of Microbiology, Rutgers University, New Brunswick, New Jersey, USA in December 1957, and registered under No. W. 3758. Moreover, this strain

registrert i Commonwealth Micological Institute, Kew, Surrey under nummer 70852, samt i National Collection of Indu-strial Bacteria, Teddington, Middlesex under nr. 8918. registered in the Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey under number 70852, and in the National Collection of Industrial Bacteria, Teddington, Middlesex under number 8918.

Denne organismes vegetative mycelium dannes av lange, tynne forgrenede eller sammenbuntede hyfer. Luftmyceliet dannes av lange, rette eller bølgeformede hyfer som bærer avrundede konidier (sporer) som ikke er gruppert som busk-vekster. The vegetative mycelium of this organism is formed by long, thin branched or bundled hyphae. The aerial mycelium is formed by long, straight or wavy hyphae bearing rounded conidia (spores) which are not grouped as bushy growths.

Spiraler er ikke observert. Kulturkarakteristika for Streptomyces 829 angis i følgende tabell 1. Spirals are not observed. Culture characteristics of Streptomyces 829 are given in the following Table 1.

Denne streptomyces-art kan dyrkes ved hjelp av vanlige metoder, deriblant med stasjonære og neddykkede kulturer. Sistnevnte gir de beste kulturer. Kultur-mediene må inneholde kullhydrater, en passende kilde for nitrogen samt mineralsalter. Dyrkingen kan utføres ved temperaturer mellom 24 og 32° C og er avhengig av luftningen, omrøringen og det nærende mediums sammensetning. I praksis oppnåes i alminnelighet det maksimale ut-bytte fra det fjerde til det syvende dyrk-ningsdøgn. This Streptomyces species can be cultivated using standard methods, including stationary and submerged cultures. The latter gives the best cultures. The culture media must contain carbohydrates, a suitable source of nitrogen and mineral salts. Cultivation can be carried out at temperatures between 24 and 32° C and depends on the aeration, stirring and the composition of the nutrient medium. In practice, the maximum yield is generally achieved from the fourth to the seventh day of cultivation.

Under dyrkningen stiger pH verdien til 7,8—8, og den bør ikke overstige disse verdier. During cultivation, the pH value rises to 7.8-8, and it should not exceed these values.

Den kulturvæske man får tilbake efter dyrkningen av streptomyces-arten som gir flavensomycinet, inneholder forskjellige stoffer som rester av nærende elementer, «lysated» mycelium, foruten det aktive stoff som kan nå en konsentrasjon på 1600 enheter pr. ml eller høyere, avhengig av kulturmediet og dyrknings-betingelsene. The culture liquid that you get back after the cultivation of the streptomyces species that produces the flavensomycin contains various substances such as remnants of nutritious elements, "lysated" mycelium, in addition to the active substance which can reach a concentration of 1,600 units per ml or higher, depending on the culture medium and the cultivation conditions.

Flavensomycin kan ekstraheres fra kulturvæsken ved hjelp av forskjellige Flavensomycin can be extracted from the culture fluid using various

oppløsningsmidler som ikke. er blandbare med vann, som eter, kloroform, butanol, etylacetat, bensin, benzen, osv., ved en pH verdi mellom 7,5 og 8,5. , solvents that do not. are miscible with water, such as ether, chloroform, butanol, ethyl acetate, petrol, benzene, etc., at a pH value between 7.5 and 8.5. ,

Det erholdte ekstrakt inneholdende det antibiotiske middel som råprodukt inndampes i vakuum ved temperaturer mellom og inklusive 20 og 30° C. The obtained extract containing the antibiotic agent as raw product is evaporated in vacuum at temperatures between and including 20 and 30°C.

Rensningen av råproduktet utføres ved kromatografi av den inndampede væs-ke gjennom en aluminiumoksydkolonne som er tilført en av de foran nevnte opp-løsningsmidler, fortrinsvis benzen. The purification of the crude product is carried out by chromatography of the evaporated liquid through an alumina column which has been supplied with one of the above-mentioned solvents, preferably benzene.

Rensning av det antibiotiske middel oppløst i benzen (rå-ekstrakt) kan utføres på to forskjellige måter: 1) Ved kromatografi av rå-ekstraktet i en aluminiumoksydkolonne. Man tilfører denne kolonne en benzenoppløsning, vasker den omhyggelig med benzen for å fjerne fett og fraksjoner som er inaktive og har gul til rød farve. Man vasker derpå med etylacetat, hvorved en annen inaktiv gulfarvet fraksjon elueres. Sluttelig vasker man med absolutt metanol, hvorved det antibiotiske middel elueres. 2) Rå-esktraktet felles med petroleter, bunnfallet oppløses i aceton, felles på-ny med petroleter, oppløses i benzen og kromatograferes i aluminiumoksyd. Kolonnen vaskes med benzen og etylacetat, hvorpå det antibiotiske middel elueres med absolutt metanol. Purification of the antibiotic agent dissolved in benzene (crude extract) can be carried out in two different ways: 1) By chromatography of the crude extract in an aluminum oxide column. A benzene solution is added to this column, it is washed carefully with benzene to remove fat and fractions that are inactive and have a yellow to red color. It is then washed with ethyl acetate, whereby another inactive yellow-coloured fraction is eluted. Finally, wash with absolute methanol, whereby the antibiotic is eluted. 2) The crude extract is combined with petroleum ether, the precipitate is dissolved in acetone, combined again with petroleum ether, dissolved in benzene and chromatographed in aluminum oxide. The column is washed with benzene and ethyl acetate, after which the antibiotic is eluted with absolute methanol.

Flavensomycin utvinnes fra metanol-oppløsningen ved å fordampe metanolet. Det er et krystallinsk sitrongult pulver. Flavensomycin is recovered from the methanol solution by evaporating the methanol. It is a crystalline lemon yellow powder.

I det følgende beskrives som eksempel en utførelsesform for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. In the following, an embodiment of the method according to the invention is described as an example.

Eksempel: Streptomyces-stammen dyrkes i et agar-asparaginglycerolmedium ved 27° C. På dette medium oppnåes en meget god vekst av sporer. Produksjonsmediet kan podes direkte med sporer eller med et pod-ningsmedium bestående av en 24 timer gammel streptomyces-kultur som.er dyr-ket på et medium av samme sammensetning som produksjonsmediet, ved 27° C og under neddykkede betingelser. Example: The Streptomyces strain is cultivated in an agar-asparagine glycerol medium at 27° C. A very good growth of spores is achieved on this medium. The production medium can be inoculated directly with spores or with an inoculation medium consisting of a 24-hour-old streptomyces culture which has been grown on a medium of the same composition as the production medium, at 27° C. and under submerged conditions.

Til hver kolbe eller hvert dyrknings-apparat ble brukt følgende medium: -maltose 20 . g -pepton ................ 5 » -kornstøpvæske ........ 2.5 » -ledningsvann .......... 1 liter The following medium was used for each flask or culture apparatus: - maltose 20 . g -peptone ................ 5 » -grain pouring liquid ........ 2.5 » -tap water .......... 1 liter

Kolbens eller dyrkningsapparatenes innhold podes med sporer eller podnings-medium og dets pH verdi innstilles på 7 med natriumhydroksyd. The contents of the flask or culture apparatus are inoculated with spores or inoculation medium and its pH value is adjusted to 7 with sodium hydroxide.

Når dyrkningen er avsluttet, heves pH verdien til 7,5—8,5 og man arbeider ved en temperatur på 27—28° C. Myceliet tas ut og det antibiotiske middel ekstraheres fra dyrkningsmediet med tre porsjo-ner benzen i forholdet benzen og dyrk-ningsmedium på 3 : 1. Herunder passer man omhyggelig at pH verdien ligger mellom 7,5 og 7,8. Under disse betingelser oppløses flavensomycin i benzen. When cultivation is finished, the pH value is raised to 7.5-8.5 and one works at a temperature of 27-28° C. The mycelium is taken out and the antibiotic agent is extracted from the cultivation medium with three portions of benzene in the ratio of benzene to culture -ning medium of 3 : 1. Here you carefully ensure that the pH value is between 7.5 and 7.8. Under these conditions, flavensomycin dissolves in benzene.

Ekstraktets volum minskes ved inn-dampning i vakuum innen et temperatur-område mellom 20 og 40° C. Selv de siste spor av vann fjernes ved denne operasjon. The volume of the extract is reduced by evaporation in a vacuum within a temperature range between 20 and 40° C. Even the last traces of water are removed by this operation.

Produktet renses ved kromatografi av det inndampede ekstrakt i en aluminiumoksydkolonne som er tilført benzen. The product is purified by chromatography of the evaporated extract in an alumina column to which benzene has been added.

1) Det antibiotiske middel absorberes sammen med noen fraksjoner med gul til rød farve mens aktive fraksjoner og røde til fiolette pigmenter ikke absorberes. Kolonnen vaskes flere ganger med benzen og derpå med etylacetat, hvorved der elueres en gul, inaktiv fraksjon. Sluttelig vaskes der med absolutt metanol hvorved den aktive 1) The antibiotic agent is absorbed together with some fractions with a yellow to red color, while active fractions and red to violet pigments are not absorbed. The column is washed several times with benzene and then with ethyl acetate, whereby a yellow, inactive fraction is eluted. Finally, it is washed with absolute methanol, whereby the active

fraksjon (flavensomycin) tas ut. Noen rødfarvede inaktive fraksjoner som kan elueres med aceton og vann blir tilbake i kolonnen. fraction (flavensomycin) is taken out. Some red-colored inactive fractions that can be eluted with acetone and water remain in the column.

2) Det konsentrerte benzenekstrakt av det antibiotiske middel felles med petroleter. Bunnfallet som utgjør den aktive bestanddel oppløses i aceton og felles påny med petroleter. De fettaktige pig-menterte fraksjoner med gul til rød farve som ikke adsorberes i alumini-umsoksydkolonnen og således krever 2) The concentrated benzene extract of the antibiotic agent is combined with petroleum ether. The precipitate which constitutes the active ingredient is dissolved in acetone and redissolved with petroleum ether. The fatty pigmented fractions with a yellow to red color which are not adsorbed in the alumina column and thus require

en meget langvarig vaskning av kolonnen med benzen, fjernes nesten full-stendig ved hjelp av denne metode. Bunnfallet oppløses i benzen og kromatograferes i en aluminiumoksydkolonne. Efter vasking med benzen og etylacetat elueres den aktive fraksjon med absolutt metanol. a very long washing of the column with benzene, is almost completely removed by means of this method. The precipitate is dissolved in benzene and chromatographed in an alumina column. After washing with benzene and ethyl acetate, the active fraction is eluted with absolute methanol.

Flavensomycin utvinnes fra metanol-oppløsningen ved å fordampe metanolen. Man får et sitrongult, krystallinsk pulver uten lukt og ikke hygroskopisk. Flavensomycin is recovered from the methanol solution by evaporating the methanol. You get a lemon-yellow, crystalline powder that is odorless and not hygroscopic.

Det nye antibiotiske middel viser føl-gende kjemiske og fysikalske egenskaper: Flavensomycinets klare, citrongule farve forandres ikke i alkaliske eller i sure media. Produktet inneholder 2,11 % nitrogen, og inneholder ikke svovel eller halo-gen. The new antibiotic shows the following chemical and physical properties: Flavensomycin's clear, lemon-yellow color does not change in alkaline or acidic media. The product contains 2.11% nitrogen, and does not contain sulfur or halogen.

Stoffets absorpsjonsspektrum i det ul-trafiolette område viser bare ett maksi-mum, nemlig ved 251. The substance's absorption spectrum in the ultraviolet region shows only one maximum, namely at 251.

Dets absorpsjonsspektrum i det infra-røde område viser hovedmaksima ved 2,90 3,26 — 3,45 — 5,86 — 5,94 — 6,17 — 6,51 — 6,92 — 8,02 — 9,05 — 10,04 — 10,32 — 10,91 — 13,02 — 13,13 mikroner ( se vedføyede tegning). Its absorption spectrum in the infrared region shows the main maxima at 2.90 3.26 — 3.45 — 5.86 — 5.94 — 6.17 — 6.51 — 6.92 — 8.02 — 9.05 — 10.04 — 10.32 — 10.91 — 13.02 — 13.13 microns (see attached drawing).

De angitte første seks maksima tilsva-rer følgende funksjonelle grupper: OH; CH, CO, konjugert CO, konjugert dobbeltbinding, fenyl. Nærværet av sistnevnte gruppe og av konjugert CO er ikke sikker. The indicated first six maxima correspond to the following functional groups: OH; CH, CO, conjugated CO, conjugated double bond, phenyl. The presence of the latter group and of conjugated CO is not certain.

Absorpsjonsspektret i infrarødt for flavensomycin i kaliumbromid ved konsentrasjon på 3 % (nederste kurve B) er i vedføyede tegning vist i sammenligning med dette absorpsjonsspektrum for en ka-liumbromidskive (øverste kurve A) bestemt med et Beckmann IR/2 spektrofoto-meter. The infrared absorption spectrum for flavensomycin in potassium bromide at a concentration of 3% (bottom curve B) is shown in the attached drawing in comparison with this absorption spectrum for a potassium bromide disk (top curve A) determined with a Beckmann IR/2 spectrophotometer.

Det nye antibiotiske middel som frem-stilles ved hjelp av foreliggende oppfin-nelse er meget lett oppløselig i noen opp-løsningsmidler som metanol, etanol propylenglykol og pyridin. Det er lett opp-løselig i noen alkoholer som normalt pro-panol, normal butanol og amylalkohol. Det er også oppløselig i iseddik og i eddiksy-rens metyl-, etyl-, propyl- og butylestere. Det er også oppløselig i aceton, kloroform, dioksan og benzen, samt vann. The new antibiotic agent produced by means of the present invention is very easily soluble in some solvents such as methanol, ethanol, propylene glycol and pyridine. It is easily soluble in some alcohols such as normal propanol, normal butanol and amyl alcohol. It is also soluble in glacial acetic acid and in acetic acid's methyl, ethyl, propyl and butyl esters. It is also soluble in acetone, chloroform, dioxane and benzene, as well as water.

Det nye antibiotiske middel er uopp-løselig i glycerol, kullstofftetraklorid, kullstoffdisulfid, eter, heksan, benzen og vaselinolje. The new antibiotic agent is insoluble in glycerol, carbon tetrachloride, carbon disulphide, ether, hexane, benzene and petroleum jelly.

Vandige oppløsninger av flavensomycin kan fåes ved å blande oppløsninger av stoffet i et oppløsningsmiddel med vann, f. eks. oppløsninger på opp til 0,2 g pr. ml i etanol. Oppløsningene skummer. Aqueous solutions of flavensomycin can be obtained by mixing solutions of the substance in a solvent with water, e.g. solutions of up to 0.2 g per ml in ethanol. The solutions foam.

Flavensomycin gir farvereaksjoner med Milisch's, Fehling's og Ehrlich's reagenser. Det gir ikke farvereaksjoner med Seliwanoffs, Tollens', Millon's, Lieber-mann's, Sakaguchi's reagenser og heller ikke med biuret. Med FeCl3 gir det et bunnfall uten farvereaksjon. Flavensomycin gives color reactions with Milisch's, Fehling's and Ehrlich's reagents. It does not give color reactions with Seliwanoff's, Tollens', Millon's, Liebermann's, Sakaguchi's reagents nor with biuret. With FeCl3 it gives a precipitate without a color reaction.

Flavensomycin er temmelig stabilt når det oppbevares i vakuum som et tørt pulver eller som oppløsninger i organiske oppløsningsmidler. Flavensomycin is fairly stable when stored in vacuum as a dry powder or as solutions in organic solvents.

I vanlige oppløsninger, særlig med lave konsentrasjoner er det tilbøyelig til delvis å tape sin aktivitet. Det er observert at det antibiotiske middel blir raskere inaktivt ved en pH verdi på 8—10 enn ved en pH verdi på 6—4. In ordinary solutions, especially at low concentrations, it tends to partially lose its activity. It has been observed that the antibiotic becomes inactive faster at a pH value of 8-10 than at a pH value of 6-4.

En vandig oppløsning av flavensomycin med en konsentrasjon på 100 mikrogram pr. ml, pH verdi 7, taper ved 18° C omkring 40 °/o av sin aktivitet efter tre døgn. En vandig oppløsning på 1 mg pr. ml med pH verdi likeledes på 7, er efter oppbevaring ved 4° C uforandret efter syv døgn. Samme oppløsnings aktivitet minskes hundrede ganger efter seks timers oppbevaring ved 70° C og efter tredve mi-nutters oppbevaring ved 100° C. An aqueous solution of flavensomycin with a concentration of 100 micrograms per ml, pH value 7, loses at 18° C around 40 °/o of its activity after three days. An aqueous solution of 1 mg per ml with a pH value likewise of 7, after storage at 4° C is unchanged after seven days. The activity of the same solution is reduced a hundredfold after six hours of storage at 70°C and after thirty minutes of storage at 100°C.

Den beste stabilitet i vandige oppløs-ninger har man ved pH verdi på 6,3—7. The best stability in aqueous solutions is achieved at a pH value of 6.3-7.

Lyset synes å ha liten innflytelse på The light seems to have little influence on

inaktivering av flavensomycin. inactivation of flavensomycin.

Flavensomycin har en vesentlig virkning mot fungusarter og er særlig aktivt overfor gjærarter av saccaromyces-typen samt på trådformede fungi av peni-cillium-familien. Det er ikke aktivt overfor Schizomycetes ved konsentrasjoner som er mindre enn 100 mikrogram pr. ml. Flavensomycin has a significant effect against fungal species and is particularly active against yeast species of the saccaromyces type as well as filamentous fungi of the penicillium family. It is not active against Schizomycetes at concentrations less than 100 micrograms per ml.

I nedenstående tabell angis det antibiotiske spektrum for flavensomycin på basis av følgende bestemmelser: fortyn-ning i agar, vandige oppløsninger av det antibiotiske middel fremstillet av 10 %'s etanoloppløsninger: The table below shows the antibiotic spectrum for flavensomycin on the basis of the following determinations: dilution in agar, aqueous solutions of the antibiotic prepared from 10% ethanol solutions:

Foruten sin sterke fungiside virkning viser flavensomycin også en bemerkelses-verdig insektisid virkning. I nedenstående tabell III vises denne insektiside virkning basert på lokal påføring på husfluer: In addition to its strong fungicidal effect, flavensomycin also shows a remarkable insecticidal effect. Table III below shows this insecticidal effect based on local application to houseflies:

Flavensomycinets giftighet er bestemt ved forsøk på hvite mus under anvendelse av intraperitonal injeksjon. Man fikk føl-gende resultater: LD50 = 1 mg/kg, LDo = 350 mikrogram/kg. Ved subkutan injeksjon ble funnet LD50 = 2 mg/kg, LDo = 1 mg/kg. Flavensomycin's toxicity has been determined by experiments on white mice using intraperitoneal injection. The following results were obtained: LD50 = 1 mg/kg, LDo = 350 micrograms/kg. By subcutaneous injection, LD50 = 2 mg/kg, LDo = 1 mg/kg was found.

Kronisk giftighet ved intraperitonal injeksjon: LDo = 250 mikrogram/kg pr. dag i IO dager. Giftighet ved oral innfør-ing: LD50 = 25 mg/kg, akutt (i metanol og vann); i propylenglykol-vann: LD50 = 19 mg/kg. Chronic toxicity by intraperitoneal injection: LDo = 250 micrograms/kg per day for IO days. Toxicity by oral administration: LD50 = 25 mg/kg, acute (in methanol and water); in propylene glycol water: LD50 = 19 mg/kg.

Claims

1. Process for the production of an antibiotic agent, here called flavensomycin, which has a significant effect against fungal species and which is effective as an insecticide, characterized by cultivating the organism Streptomyces Cavourensis (strain no. 829.8.52 deposited, among other things, in The Institute of Microbiology , Rutgers University, New Brunswick, New Jersey, U.S.A. in December 1957 under No. W. 3758) in a liquid medium containing sources of assimilable carbon and nitrogen as well as mineral salts, after cultivation the mycelium is removed from the culture liquid and then flavensomycin is extracted in form of crude product from the same with an organic solvent and purify the extract obtained.

2. Method according to claim 1, characterized in that the purification of the flavensomycin extract is carried out by evaporating it in a vacuum, adsorbing the concentrate thus obtained in aluminum oxide, removing the inactive fractions, eluting the active fraction with methanol and evaporating the methanol so that the flavensomycin is obtained in a dry state.

3. Method according to claim 1, characterized in that the pH value of the culture liquid is adjusted to 7.5-8.5 with an alkaline substance before the extraction of the flavensomycin therefrom.