NO122686B

NO122686B -

Info

Publication number: NO122686B
Application number: NO16201866A
Authority: NO
Inventors: S Rasmussen
Original assignee: S Rasmussen
Priority date: 1965-03-10
Filing date: 1966-03-09
Publication date: 1971-07-26
Also published as: CH469207A; DE1992803U; AT274490B; GB1140601A; NL6603127A; DE1525376A1; BE677522A

Description

Fremgangsmåte til utvinning av adrenocorticotropin av blod. Method for extracting adrenocorticotropin from blood.

Den foreliggende oppfinnelse går ut The present invention expires

på en fremgangsmåte til fremstilling av adrenocorticotropt hormon, og mer spesielt en fremgangsmåte til fremstilling av adrenocorticotropin fra blod av pattedyr. on a method for producing adrenocorticotropic hormone, and more particularly a method for producing adrenocorticotropin from mammalian blood.

Det adrenocorticotrope hormon utskilles fra hypofysen hos pattedyr i blodet og føres med dette til binyrene, hvor det stimulerer dannelsen av adrenocorti-kale hormoner fra binyrebarken. I de se-nere år er adrenocorticotropin blitt trukket ut fra hypofysen hos pattedyr, som f. eks. svin, kveg og sauer, og er etter rensning blitt inngitt husdyr og mennesker ved behandling av visse sykdommer. Det er blitt angitt at blodet av pattedyr bare inneholder litt, hvis overhodet noe som helst, aktivt adrenocorticotropin. Ennvidere er der ved forsøk blitt påvist at menneskeblod inneholder mindre enn 0,5 milli-enheter adrenocorticotropin pr. 100 ml under optimale betingelser. Man har derfor ansett blod for å være et lite egnet utgangsmateriale ved fremstilling av adrenocotico-tropin til farmasøytiske formål. The adrenocorticotropic hormone is secreted from the pituitary gland in mammals into the blood and carried with it to the adrenal glands, where it stimulates the formation of adrenocortical hormones from the adrenal cortex. In recent years, adrenocorticotropin has been extracted from the pituitary gland in mammals, such as e.g. pigs, cattle and sheep, and after purification has been administered to domestic animals and humans in the treatment of certain diseases. It has been stated that the blood of mammals contains little, if any, active adrenocorticotropin. Furthermore, experiments have shown that human blood contains less than 0.5 milli-units of adrenocorticotropin per 100 ml under optimal conditions. Blood has therefore been considered to be an unsuitable starting material for the production of adrenocoticotropin for pharmaceutical purposes.

Hensikten med den foreliggende oppfinnelse er å skaffe en fremgangsmåte til fremstilling av adrenocorticotropin fra blod av pattedyr. En annen hensikt er å skaffe en fremgangsmåte til fremstilling av adrenocorticotropin fra forskjellige blodfraksj oner. The purpose of the present invention is to provide a method for producing adrenocorticotropin from the blood of mammals. Another purpose is to provide a method for producing adrenocorticotropin from different blood fractions.

En mer spesiell hensikt med oppfinnelsen er å skaffe en fremgangsmåte til å utvikle adrenocorticotropinaktivitet i blod. Enda en hensikt er å skaffe en fremgangsmåte til å oppspore adrenocorticotropinaktivitet i blod. Andre hensikter og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå av det følgende. A more particular purpose of the invention is to provide a method for developing adrenocorticotropin activity in blood. A further object is to provide a method for detecting adrenocorticotropin activity in blood. Other purposes and advantages of the invention will be apparent from the following.

Den foreliggende fremgangsmåte til fremstilling av preparater av adrenocorticotropin er karakteristisk ved at blodmateriale fra pattedyr, f. eks. blod, plasma eller serum, blandes med pyridoxin eller et pyridoxinsalt som adrenocorticotropinak-tiverende middel, hvoretter blandingen henstår for oppnåelse av maksimal adrenocorticotropinaktivitet, eventuelt under oppvarmning, idet den hertil nødvendige tid er kortere jo høyere temperaturen er. The present method for producing preparations of adrenocorticotropin is characteristic in that blood material from mammals, e.g. blood, plasma or serum, is mixed with pyridoxine or a pyridoxine salt as an adrenocorticotropin-activating agent, after which the mixture is left to achieve maximum adrenocorticotropin activity, possibly during heating, the time required for this being shorter the higher the temperature.

Skjønt blod ikke oppviser noen særlig Although blood does not show any in particular

adrenocorticotropinaktivitet, har det vist seg at denne behandling medfører en på-viselig adrenocorticotropinaktivitet i blodet på mellom 0,5 og 2,0 enheter pr. ml. Med «pattedyrblod»-materiale skal i denne beskrivelse forstås adrenocorticotropinhol-dige blodmaterialer som f. eks. selve blodet, plasma, serum og defibrinert blod. adrenocorticotropin activity, it has been shown that this treatment causes a detectable adrenocorticotropin activity in the blood of between 0.5 and 2.0 units per ml. In this description, "mammal blood" material is understood to mean adrenocorticotropin-containing blood materials such as e.g. the blood itself, plasma, serum and defibrinated blood.

Ved en foretrukken utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen behandles blod av pattedyr med pyridoxin ved en temperatur av minst 15° C i så lang tid at adrenocorticotropinaktiviteten i blodet utvikles helt. Det har ifølge oppfinnelsen vist seg at den tid som er nød-vendig for å oppnå maksimal adrenocorticotropinaktivitet i blodet, er omvendt proporsjonal med oppvarmningstempera-turen, hvilket vil si at hvis oppvarmnings-temperaturen økes, vil der tilsvarende be-høves mindre tid for å oppnå maksimal adrenocorticotropinaktivitet. Det har f. eks. ifølge oppfinnelsen vist seg at fullstendig aktivitet av blodets adrenocorticotropin kan oppnås på ca. 6 i/2 time ved en temperatur av 100° C, mens der vil kreves 3 måneder for å oppnå fullstendig aktivitet ved en temperatur av 25° C og 2—3 uker ved en temperatur av ca. 37° C. Til-lempningen av denne fremgangsmåte for fabrikasjon av adrenocorticotropin i han-delsmålestokk må antas å kunne foregå best ved en oppvarmningstemperatur av fra 30° C til 150° C, mens bedre resultater kan oppnås ved en temperatur mellom 75° C og 120° C, og en spesielt god adrenocorticotropinaktivering vil oppnås ved en temperatur av mellom 90° C og 100° C. In a preferred embodiment of the method according to the invention, mammalian blood is treated with pyridoxine at a temperature of at least 15° C for such a long time that the adrenocorticotropin activity in the blood is fully developed. According to the invention, it has been shown that the time required to achieve maximum adrenocorticotropin activity in the blood is inversely proportional to the heating temperature, which means that if the heating temperature is increased, correspondingly less time will be required to achieve maximal adrenocorticotropin activity. It has e.g. according to the invention, it has been shown that complete activity of the blood's adrenocorticotropin can be achieved in approx. 6 in/2 hours at a temperature of 100° C, while 3 months will be required to achieve complete activity at a temperature of 25° C and 2-3 weeks at a temperature of approx. 37° C. The adaptation of this method for the manufacture of adrenocorticotropin on a commercial scale must be assumed to be best at a heating temperature of from 30° C to 150° C, while better results can be obtained at a temperature between 75° C and 120° C, and a particularly good adrenocorticotropin activation will be achieved at a temperature of between 90° C and 100° C.

Den optimale pH-verdi for aktivering av blodadrenocorticotropin med pyridoxin har ifølge oppfinnelsen vist seg å ligge mellom en pH-verdi på 3,5 og 5,5, selv om noen aktivering kan oppnås med en pH-verdi som ligger litt på den sure eller basiske side av dette område. Aktiverin-gen av adrenocorticotropin med pyridoxin utføres bedre ved pH-verdier mellom 4,0 og 5,0, og et spesielt godt resultat kan oppnås ved en pH-verdi på omkring 4,7— 4,8. Innstillingen av pH ved denne fremgangsmåte kan foretas med en hvilken som helst egnet syre, base eller puffer, som f. eks. saltsyre, natriumhydroxyd og eddiksyre-natriumacetatpufferoppløsning. According to the invention, the optimal pH value for activation of blood adrenocorticotropin with pyridoxine has been shown to lie between a pH value of 3.5 and 5.5, although some activation can be achieved with a pH value that is slightly on the acidic or basic side of this area. The activation of adrenocorticotropin with pyridoxine is carried out better at pH values between 4.0 and 5.0, and a particularly good result can be achieved at a pH value of around 4.7-4.8. The setting of the pH in this method can be done with any suitable acid, base or buffer, such as e.g. hydrochloric acid, sodium hydroxide and acetic acid-sodium acetate buffer solution.

Mens ethvert blodmateriale av pattedyr kan anvendes som utgangsmateriale ved denne fremgangsmåte, har det ifølge oppfinnelsen vist seg at bedre resultater oppnås med plasma eller serum, og at særlig gode resultater oppnås med okseplas-ma eller -serum. Adrenocorticotropinakti-veringsmekanismen ved denne fremgangsmåte er ikke klart opplyst, men det antas at adrenocorticotropin utskilles fra hypofysen i inaktiv form, eller at aktivt adrenocorticotropin som føres inn i blodet, in-aktiveres av en eller annen mekanisme i blodet. Det er muligens en mekanisme i forbindelse med binyrene som er istand til å omdanne proadrenocorticotropin til adrenocorticotropin for å stimulere dannelsen av adrenocorticale hormoner i binyrebarken. Dette inaktive adrenocorticotropin eller forløper for adrenocorticotropin som finnes i blod kalles pro-adrenocorticotropin. Utgangsmaterialet for denne fremgangsmåte kan således være ethvert pro-adrenocorticotropinholdig blodmateriale av pattedyr. While any mammalian blood material can be used as starting material in this method, according to the invention it has been shown that better results are obtained with plasma or serum, and that particularly good results are obtained with bovine plasma or serum. The adrenocorticotropin activation mechanism by this method is not clearly explained, but it is assumed that adrenocorticotropin is secreted from the pituitary gland in an inactive form, or that active adrenocorticotropin introduced into the blood is inactivated by some mechanism in the blood. There is possibly a mechanism associated with the adrenal glands that is able to convert proadrenocorticotropin to adrenocorticotropin to stimulate the formation of adrenocortical hormones in the adrenal cortex. This inactive adrenocorticotropin or precursor of adrenocorticotropin found in blood is called pro-adrenocorticotropin. The starting material for this method can thus be any mammalian pro-adrenocorticotropin-containing blood material.

Rekkefølgen ved denne fremgangsmåte kan være først å regenerere adrenocorticotropinaktiviteten i blod, plasma, serum osv., og deretter å utvinne adrenocorticotropin i den aktive form. På den annen side kan adrenocorticotropin trekkes ut av blodutgangsmaterialet for å oppnå et pro-adrenocorticotropinkonsentrat som deretter kan behandles med pyridoxin, slik at pro-adrenocorticotropin omdannes til adrenocorticotropin. Utvinningen eller konsentreringen av enten pro-adrenocorticotropin eller adrenocorticotropin fra blodutgangsmaterialet kan skje ved kjemisk fraksjonering med nøytrale salter, f. eks. ammoniumsulfat, natriumklorid og natriumsulfat, tunge metalljoner som sink og aluminium eller et oxygenholdig alifa-tisk oppløsningsmiddel som en alkohol eller en keton, f. eks. ethanol, methanol eller aceton. Ved denne kjemiske frak-sjoneringsmetode bundf elles proteinmn-holdet i blodet med andre adrenocortico-tropinforurensninger, hvoretter bundfallet skilles fra adrenocorticotropinoppløsnin-gen. The order of this method may be first to regenerate adrenocorticotropin activity in blood, plasma, serum, etc., and then to recover adrenocorticotropin in the active form. On the other hand, adrenocorticotropin can be extracted from the blood source material to obtain a pro-adrenocorticotropin concentrate which can then be treated with pyridoxine, so that pro-adrenocorticotropin is converted to adrenocorticotropin. The recovery or concentration of either pro-adrenocorticotropin or adrenocorticotropin from the blood starting material can be done by chemical fractionation with neutral salts, e.g. ammonium sulfate, sodium chloride and sodium sulfate, heavy metal ions such as zinc and aluminum or an oxygen-containing aliphatic solvent such as an alcohol or a ketone, e.g. ethanol, methanol or acetone. With this chemical fractionation method, the protein level in the blood is precipitated with other adrenocorticotropin contaminants, after which the precipitate is separated from the adrenocorticotropin solution.

Til bestemmelse av aktiviteten av preparater av adrenocorticotropin foreligger der en internasjonalt anerkjent metode, hvor preparatets virkning bestemmes ved intravenøs injeksjon på rotter, hvoretter styrken uttrykkes i internasjonale enheter. There is an internationally recognized method for determining the activity of preparations of adrenocorticotropin, where the effect of the preparation is determined by intravenous injection into rats, after which the strength is expressed in international units.

Foruten denne metode anvendes imid-lertid også en annen metode, hvor der også anvendes rotter, men hvor injeksjonen blir foretatt subcutant, idet preparatet dess-uten tilsettes gelatin før injeksjonen. Den styrke som blir funnet på denne måte, kan betegnes som «styrke ved subcutan injeksjon» til forskjell fra den ovenfor nevnte styrke, som er bestemt ved intravenøs injeksjon. In addition to this method, however, another method is also used, where rats are also used, but where the injection is made subcutaneously, as gelatin is also added to the preparation before the injection. The strength found in this way can be termed "strength by subcutaneous injection" in contrast to the above-mentioned strength, which is determined by intravenous injection.

Adrenocorticotropin eller pro-adrenocorticotropin kan også skilles fra blodutgangsmaterialet ved at man på kjent måte, slik som det skjer i den såkalte Bunding-prosess, adsorberer det på et cellulosede-rivat. Bunding-prosessen går ut på å utvinne adrenocorticotropin fra oppløsnin-ger ved adsorbsjon på oxycellulose ved en pH-verdi på omkring 4,5. Adsorbatet vas-kes ut slik at der fremkommer et inaktivt materiale, hvoretter adrenocorticotropin elueres fra det utvaskede adsorbat med en vandig, saltsur oppløsning med en pH-verdi på fra 1,0 til 1,5. En annen metode til kjemisk fraksjonering av blodsubstans for å få konsentrert en pyridoxinaktivert adrenocorticotropinoppløsning er en var-me-sjokk-prosess, hvor den foretrukne ut-førelsesform av fremgangsmåten består i at blodserum forenes med natriumcapry-lat som har en konsentrasjon på mellom 0,11 og 0,13 M, hvoretter den fremkomne oppløsning innstilles på en pH-verdi mellom 5,0 og 5,2, oppvarmes til en temperatur mellom 65° C og 71° C i minst 20 mi-nutter for selektivt å koagulere en del av proteinet i væsken og endelig å skille det koagulerte protein fra den tiloversblevne væske. Adrenocorticotropin or pro-adrenocorticotropin can also be separated from the blood output material by adsorbing it onto a cellulose derivative in a known manner, as occurs in the so-called Bunding process. The Bunding process involves extracting adrenocorticotropin from solutions by adsorption on oxycellulose at a pH value of around 4.5. The adsorbate is washed out so that an inactive material appears, after which the adrenocorticotropin is eluted from the washed out adsorbate with an aqueous, hydrochloric acid solution with a pH value of from 1.0 to 1.5. Another method for chemical fractionation of blood substance to concentrate a pyridoxine-activated adrenocorticotropin solution is a heat-shock process, where the preferred embodiment of the method consists in combining blood serum with sodium caprylate which has a concentration of between 0, 11 and 0.13 M, after which the resulting solution is adjusted to a pH value between 5.0 and 5.2, heated to a temperature between 65° C and 71° C for at least 20 minutes to selectively coagulate a portion of the protein in the liquid and finally to separate the coagulated protein from the remaining liquid.

Det har vist seg at det adrenocorticotropin som frembringes fra blodmaterialet av pattedyr ved denne fremgangsmåte, har en tendens til å bli ustabilt, dvs. miste sin styrke, og at slikt adrenocorticotropin kan stabiliseres ved å forenes med et organisk reduserende stoff som inneholder minst en sulfhydrylgruppe, som cy-stein, thioglycolsyre og beta-mecaptoetha-nol. Dette reduserende stoff kan settes til adrenocortricotropinpreparatet i en konsentrasjon mellom 0,05 og 0,2 g pr. 100 ml. Stabiliseringen av blod-adrenocorticotropin ved hjelp av dette reduserende stoff kan økes ved en pH-verdi på mellom 6,5 og 7,0. Dette adrenocorticotropin-prepa-rat kan også inneholde gelatin i en konsentrasjon på omkring 8 — 40 pst. for å oppnå ytterligere økning av adrenocortico-tropinstyrken ved subcutan eller intra-muskulær injeksjon ifølge en kjent fremgangsmåte. It has been found that the adrenocorticotropin produced from the blood material of mammals by this method tends to become unstable, i.e. lose its potency, and that such adrenocorticotropin can be stabilized by combining with an organic reducing agent containing at least one sulfhydryl group , such as cystein, thioglycolic acid and beta-mecaptoethanol. This reducing substance can be added to the adrenocortricotropin preparation in a concentration between 0.05 and 0.2 g per 100 ml. The stabilization of blood adrenocorticotropin by means of this reducing substance can be increased at a pH value of between 6.5 and 7.0. This adrenocorticotropin preparation can also contain gelatin in a concentration of about 8 to 40 percent to achieve a further increase in adrenocorticotropin strength by subcutaneous or intramuscular injection according to a known method.

Bestanddelene i dette adrenocortico-tropinpreparat må være tilstrekkelig rene, dvs. være egnet til injeksjon på mennesker, når preparatet er beregnet til bruk på mennesker, og at det skal være egnet til injeksjon på dyr, når preparatet er beregnet til veterinære formål. Adrenocorticotropinaktiviteten av preparater fremstilt ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse kan bestemmes ved en metode hvor ascorbinsyre-utskillelsen fra hypofysen- hos rotter bestemmes ved subcutan injeksjon. The components in this adrenocorticotropin preparation must be sufficiently pure, i.e. be suitable for injection into humans, when the preparation is intended for use in humans, and that it must be suitable for injection into animals, when the preparation is intended for veterinary purposes. The adrenocorticotropin activity of preparations produced by the method according to the present invention can be determined by a method in which the ascorbic acid secretion from the pituitary gland in rats is determined by subcutaneous injection.

Den foreliggende oppfinnelse er i det følgende forklart nærmere ved et eksempel. The present invention is explained in more detail in the following by means of an example.

Eksempel. 25 ml okseserum ble blandet med 0,62 g pyridoxinhydroklorid. 2,5 ml av den fremkomne blanding ble forenet med 2,5 ml av en 32 pst.'s vandig gelatinoppløsning som inneholdt 1 pst. fenol. Det herved fremkomne produkt ble betraktet som et kontrollprodukt. Example. 25 ml of bovine serum was mixed with 0.62 g of pyridoxine hydrochloride. 2.5 ml of the resulting mixture was combined with 2.5 ml of a 32% aqueous gelatin solution containing 1% phenol. The resulting product was considered a control product.

De 22,5 ml av okseserumsblandingen som ble tilbake ble anbragt i en glassbe-holder. Denne beholder ble lukket tett til og deretter oppvarmet i vannbad ved en temperatur av 85—90° C. Etter 30 minut-ters forløp ble der tilsatt 15 ml pyrogen-fritt, destillert vann til innholdet av beholderen. Etter en tid på 2, 4 og 6 timer ble prøver av okseserumblandingen tatt ut av beholderen. Hver av disse prøver ble fortynnet i forholdet 1:1 med en 32 pst.'s vandig gelatinoppløsning som inneholdt 1 pst. fenol. The 22.5 ml of the bovine serum mixture that remained was placed in a glass container. This container was closed tightly and then heated in a water bath at a temperature of 85-90° C. After 30 minutes, 15 ml of pyrogen-free, distilled water was added to the contents of the container. After a time of 2, 4 and 6 hours, samples of the bovine serum mixture were taken out of the container. Each of these samples was diluted 1:1 with a 32% aqueous gelatin solution containing 1% phenol.

De forskjellige preparater fikk føl-gende betegnelser: Kontrollpreparatet A, 2-timers-preparatet B, 4-timers-preparatet C og 6-timers-preparatet D. 8 rotter ble injisert subcutant med 0,5 ml av hvert av disse preparater pr. rotte. Adrenocorticotropinaktiviteten av preparatene ble bestemt ifølge den ovenfor nevnte subcutane metode. Resultatene er ført opp i den føl-gende tabell, hvor den adrenale ascorbin-syreutskillelse er uttrykt i microgram ascorbinsyre pr. mg. binyrevekt. The different preparations were given the following designations: Control preparation A, 2-hour preparation B, 4-hour preparation C and 6-hour preparation D. 8 rats were injected subcutaneously with 0.5 ml of each of these preparations per rat. The adrenocorticotropin activity of the preparations was determined according to the above-mentioned subcutaneous method. The results are listed in the following table, where the adrenal ascorbic acid excretion is expressed in micrograms of ascorbic acid per mg. adrenal weight.

Standardutslagene som er anført i den ovenstående tabell ville svare til henholds-vis 0,0236, 0,0590 og 0,1475 enheter pr. 0,5 ml. Kontrollprøven (A) utviste ikke noen aktivitet. Forsøksresultatet for prøve C viser en styrke på 0,39—0,40 enheter pr. ml okseserum, mens forsøksresultatet for prøve B viser en styrke på 2 enheter pr. ml okseserum, og forsøksresultatet for prøve D viser en styrke på 1,5 enheter pr. ml okseserum. The standard outputs listed in the above table would correspond to respectively 0.0236, 0.0590 and 0.1475 units per 0.5 ml. The control sample (A) did not show any activity. The test result for sample C shows a strength of 0.39-0.40 units per ml of bovine serum, while the test result for sample B shows a strength of 2 units per ml of bovine serum, and the test result for sample D shows a strength of 1.5 units per ml of bovine serum.

Claims

1. Method for extracting adrenocorticotropin from blood, characterized in that blood material from mammals, preferably bovine blood material, such as blood, plasma or serum, is mixed with pyridoxine or a pyridoxine salt as an adrenocorticotropin-activating agent, after which the mixture is left to achieve maximum adrenocorticotropin- activity, possibly during heating, as the time required for this is shorter the higher the temperature.

2. Method as stated in claim 1, characterized in that the mixture is allowed to stand at a temperature between 30 and 150° C and a pH value between 3.5 and 5.5.

3. Procedure as stated in claim 1 and. 2, where ox blood plasma is used as the starting material, characterized in that the mixture settles at a pH value between 4.0 and 5.0 and a temperature between 75 and 120°C.

4. Procedure as stated in the stand 1 and 2, where there as output feed riale, ox blood serum is used, characterized by the mixture remaining for approx. four hours at a pH value between 4.7 and 4.8 and a temperature between 90 and 100° C.