NO121499B

NO121499B -

Info

Publication number: NO121499B
Application number: NO46568A
Authority: NO
Inventors: A Gagneux; C Lehmann; E Renk
Original assignee: Geigy Ag J R
Priority date: 1967-02-07
Filing date: 1968-02-06
Publication date: 1971-03-08
Also published as: AT277220B; IL29422A; IE31940B1; AT280260B; CH480352A; IE31940L; ES350189A1; CH478826A; ES350190A1

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av et fungicid stoff, ayfactin. Process for the production of a fungicidal substance, ayfactin.

Foreliggende oppfinnelse vedrører The present invention relates to

fremgangsmåten for fremstilling av et terapeutisk anvendelig, fungicid stoff betegnet ayfactin, og mere spesielt angår oppfinnelsen fremstillingen av krystallinsk ayfactin. the method for the production of a therapeutically applicable fungicidal substance called ayfactin, and more particularly the invention relates to the production of crystalline ayfactin.

Hos mennesker, dyr og planter forårsakes mange infeksjoner av de organismer som vanligvis går under betegnelsen gjær og fungi, og som også kalles Monilia, Saccharomyceter og Fungi imperfecti. Følgene av slike infeksjoner varierer like fra enkelt ubehag til dødelig utgang og medfører store In humans, animals and plants, many infections are caused by the organisms that usually go by the name of yeast and fungi, and which are also called Monilia, Saccharomyceter and Fungi imperfecti. The consequences of such infections vary equally from simple discomfort to a fatal outcome and entail large

økonomiske tap. Tilfredsstillende stoffer for hindring eller helbredelse av slike infeksjoner er i mange tilfelle ennu ikke funnet. Behandlingen kan utføres med terapeutisk virksomme stoffer av sulfanilamid-gruppen eller med antibiotika som penicillin eller tetracyklin. Andre midler er enten financial losses. Satisfactory substances for preventing or curing such infections have in many cases not yet been found. The treatment can be carried out with therapeutically active substances of the sulfanilamide group or with antibiotics such as penicillin or tetracycline. Other means are either

virkningsløse eller for giftige. Det er således et stort behov for et effektivt terapeutisk anvendelig, fungicid stoff. ineffective or too toxic. There is thus a great need for an effective therapeutically applicable fungicidal substance.

Det er nu ifølge den foreliggende oppfinnelse funnet en krystallinsk forbindelse som er blitt betegnet ayfactin som er terapeutisk verdifull, idet den er i besittelse av en sterkt fungicid virkning, særlig overfor Candida albicans, mens den bare er i besittelse av liten baktericid virkning. Ayfactins egenskaper vil bli beskrevet i det følgende. According to the present invention, a crystalline compound has now been found which has been named ayfactin, which is therapeutically valuable, as it possesses a strong fungicidal effect, particularly against Candida albicans, while it only possesses a small bactericidal effect. Ayfactin's properties will be described below.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen The method according to the invention

for fremstilling av ayfactin kjennetegnes ved at det gjennomføres en submers, aerob gjæring med en Streptomycet slik at det dannes tetracyklin eller klorotetracyklin for the production of ayfactin is characterized by the fact that a submerged, aerobic fermentation is carried out with a Streptomycet so that tetracycline or chlorotetracycline is formed

eller begge deler, hvorpå tetracyklinet eller or both, whereupon the tetracycline or

klorotetracyklinet eller begge deler fjernes ved å behandle det forgjærede substrat med vandig syre og derpå adskille den vandige fase som inneholder antibiotiket, fra myceliet, hvorpå myceliet uttrekkes med et organisk oppløsningsmiddel som i det minste er istand til å oppløse 2,0 g ayfactin pr. liter, hvorpå den væskeformede ekstrakt fraskilles, og det krystallinske ayfactin utvinnes. Ayfactinet inneholder bare grunnstoffene the chlorotetracycline or both are removed by treating the pre-fermented substrate with aqueous acid and then separating the aqueous phase containing the antibiotic from the mycelium, after which the mycelium is extracted with an organic solvent capable of dissolving at least 2.0 g of ayfactin per liter, whereupon the liquid extract is separated, and the crystalline ayfactin is recovered. Ayfactinet contains only the basic ingredients

kullstoff, hydrogen, nitrogen og oksygen og i de følgende tilnærmelsesvise mengder: carbon, hydrogen, nitrogen and oxygen and in the following approximate quantities:

beregnet på vann- og askefri basis. Stoffet har en oppløselighet i vann ved en pH-verdi på ca. 7 på mindre enn 100 mikrogram pr. ml. Det er oppløselig i dimetylformamid, pyridin, morfolin og piperidin. Det utviser de følgende absorpsjonsmaksima og trans-misjoner av ultrafiolett lys oppløst i pyridin i en konsentrasjon på 0,01 mg/ml: calculated on a water- and ash-free basis. The substance has a solubility in water at a pH value of approx. 7 of less than 100 micrograms per ml. It is soluble in dimethylformamide, pyridine, morpholine and piperidine. It exhibits the following absorption maxima and transmissions of ultraviolet light dissolved in pyridine at a concentration of 0.01 mg/ml:

og utviser tablettert i blanding med kalium-bromid karakteristiske absorpsjonsmaksima i det infrarøde område ved de følgende fre-kvenser uttrykt i mikron: 3,1, 3,5, 5,9 6,2 and tableted in a mixture with potassium bromide exhibits characteristic absorption maxima in the infrared range at the following frequencies expressed in microns: 3.1, 3.5, 5.9 6.2

(skulder), 6,3, 7,2—7,3, 8,55, 9,4, 10,0—10,1, 11,85 og 13,0—13,2. (shoulder), 6.3, 7.2—7.3, 8.55, 9.4, 10.0—10.1, 11.85 and 13.0—13.2.

Ayfactinet ifølge oppfinnelsen utvinnes ved uttrekning av mycelium av tetracyklin-og klorotetracyklinproduserende slag av Streptomyces slik som Streptomyces aureofaciens f. eks. stammene NRRL-2209, B-1286, B-1287 og B-1288) og Streptomyces viridifaciens (f. eks. stammen ATCC-11989). Denne uttrekning av mycelium som er dan-net under en aerob, submers gjæring, lettes ved at man først fjerner tetracyklinet og klorotetracyklinet ved surning av hele substratet f. eks. til en pH-verdi på 2 for å oppløse disse antibiotika, hvorpå man isolerer myceliet ved filtrering. Tetracyklinet og klorotetracyklinet kan også utfelles på myceliet ved tilnærmelsesvis nøy-tral eller alkalisk pH-verdi og fraskilles sammen med myceliet. Tetracyklinet og klorotetracyklinet skilles derpå, fra myceliet ved oppløsning i syre (f. eks. med vandig saltsyre ved en pH-verdi på 2), og myceliet isoleres ved filtrering og videre-bearbeides for utvinning av ayfactinet. Det våte, sure mycelium innstilles til en pH-verdi på ca. 9,0—10,0 f. eks. ved hjelp av ammoniumhydroksyd, og hvert kilogram vått mycelium (inkl. eventuelt filterhjelpe-middel, f. eks. diatoméjord) uttrekkes med ca. 0,5—2,5 1 n-butanol. Butanolet isoleres ved filtrering, idet myceliet kastes bort, innstilles til en pH-verdi i nærheten av nøy-tralpunktet (f. eks. til en pH-verdi på 7 ved hjelp av svovelsyre) og konsentreres i det minste 20 ganger ved azeotropisk destillasjon fortrinnsvis i vakuum, hvorved vannet fjernes og temperaturen kan holdes på en lav verdi. Ayfactinet utfelles etter avkjøling og henstand og isoleres ved filtrering. The ayfactin according to the invention is extracted by extracting the mycelium of tetracycline- and chlorotetracycline-producing species of Streptomyces such as Streptomyces aureofaciens e.g. strains NRRL-2209, B-1286, B-1287 and B-1288) and Streptomyces viridifaciens (e.g. strain ATCC-11989). This extraction of mycelium, which is formed during an aerobic, submerged fermentation, is facilitated by first removing the tetracycline and chlorotetracycline by acidifying the entire substrate, e.g. to a pH value of 2 to dissolve these antibiotics, after which the mycelium is isolated by filtration. The tetracycline and chlorotetracycline can also be precipitated on the mycelium at an approximately neutral or alkaline pH value and separated together with the mycelium. The tetracycline and chlorotetracycline are then separated from the mycelium by dissolving in acid (e.g. with aqueous hydrochloric acid at a pH value of 2), and the mycelium is isolated by filtration and further processed to extract the ayfactin. The wet, acidic mycelium is adjusted to a pH value of approx. 9.0—10.0 f. e.g. with the help of ammonium hydroxide, and each kilogram of wet mycelium (including any filter aid, e.g. diatomaceous earth) is extracted with approx. 0.5—2.5 1 n-butanol. The butanol is isolated by filtration, discarding the mycelium, adjusted to a pH value close to the neutral point (e.g. to a pH value of 7 using sulfuric acid) and concentrated at least 20 times by azeotropic distillation preferably in a vacuum, whereby the water is removed and the temperature can be kept at a low value. The ayfactin precipitates after cooling and standing and is isolated by filtration.

I mange tilfelle fremkommer ayfactinet på denne måte som en oljeaktig blanding sammen med det svinefett eller eventuelt annet skumdempningsmiddel som er an-vendt ved gjæringen. Utrøring med et ikke-basisk, organisk oppløsningsmiddel som metylisobutylketon, oppløser fettet uten å oppløse ayfactinet. Etter isolering ved filtrering vaskes det faste ayfactin med vann for å fjerne tilstedeværende mengder av nøytrale salter. In many cases, the ayfactin appears in this way as an oily mixture together with the lard or any other defoamer used during the fermentation. Agitation with a non-basic organic solvent such as methyl isobutyl ketone dissolves the fat without dissolving the ayfactin. After isolation by filtration, the solid ayfactin is washed with water to remove the amounts of neutral salts present.

Til blandingen av fett, nøytrale salter og ayfactin kan det også tilsettes vann og metylisobutylketon hvorved det dannes tre lag: a) fett oppløst i metylisobutylketon, b) nøytrale salter oppløst i vann og c) fast ayfactin. Det tilsettes derpå et filterhjelpe-middel, og blandingen filtreres, hvorpå filterkaken uttrekkes med pyridin. Pyridin-oppløsningen av ayfactin konsentreres og tørres ved destillasjon fortrinnsvis i vakuum, og fast ayfactin utfelles, deretter ved tilsetning av et flytende fellingsmiddel for ayfactin som toluol. Water and methyl isobutyl ketone can also be added to the mixture of fat, neutral salts and ayfactin, whereby three layers are formed: a) fat dissolved in methyl isobutyl ketone, b) neutral salts dissolved in water and c) solid ayfactin. A filter aid is then added, and the mixture is filtered, after which the filter cake is extracted with pyridine. The pyridine solution of ayfactin is concentrated and dried by distillation, preferably in vacuum, and solid ayfactin is precipitated, then by the addition of a liquid precipitant for ayfactin such as toluene.

Ayfactinet kan eventuelt ytterligere renses ved oppløsning i dimetylformamid, pyridin, morfolin eller piperidin, filtrering for å fjerne inaktive, uoppløselige urenheter og felling av det rensede ayfactin ved at det til filtratet tilsettes andre alminnelige or-ganiske oppløsningsmidler, f. eks. toluol, alifatiske kullvannstoffer (eventuelt i form av.hanuelsproduktene skellysolve) eller iso-propanol. The ayfactin can optionally be further purified by dissolution in dimethylformamide, pyridine, morpholine or piperidine, filtration to remove inactive, insoluble impurities and precipitation of the purified ayfactin by adding other common organic solvents to the filtrate, e.g. toluene, aliphatic hydrocarbons (possibly in the form of the Hanuel products skellysolve) or iso-propanol.

Ifølge en annen fremgangsmåte for rensning utrøres ayfactinet utvunnet som ovenfor beskrevet fra n-butanol med vandig syre, f. eks. eddiksyre eller saltsyre, ved en pH-verdi på 1,5 for å fjerne i syre og vann oppløselige urenheter. Det faste ayfactin kan også utrøres med formamid, metanol, aceton eller blandinger av disse, hvorved ytterligere urenheter oppløses mens meget lite ayfactin går i oppløsning. According to another method for purification, the ayfactin extracted as described above from n-butanol is stirred with aqueous acid, e.g. acetic acid or hydrochloric acid, at a pH value of 1.5 to remove impurities soluble in acid and water. The solid ayfactin can also be stirred with formamide, methanol, acetone or mixtures of these, whereby further impurities are dissolved while very little ayfactin dissolves.

Krystallinsk ayfactin svarer til de ovenfor nevnte egenskaper. Crystalline ayfactin corresponds to the above-mentioned properties.

På tegningen er vist ayfactins absorpsjonsspektrum i det infrarøde område. The drawing shows ayfactin's absorption spectrum in the infrared range.

Ayfactin utviser liten eller ingen aktivitet overfor de fleste Gram-positive og Gram-negative bakterier, men er sterkt aktivt overfor visse fungi, som dermatophyten M. audouini, som forekommer ved klinisk tinea capitis, den ikke-patogene plantefungus A. Solani, dermatophyten E. floccosum og særlig overfor Candida albicans, den gjæringsorganisme som trives i menneskets fordøyelseskanal under be-handlinger med antibiotika, særlig når det anvendes antibiotika med bredt spektrum, som kloramphenicol, tetracyklin, klorotetracyklin og oksytetracyklin. I foregående beskrivelse og i store deler av den alminnelige medisinske litteratur kalles gjærarter (Saccharomyceter) og Fungi imperfecti rent generisk Monilia, og de infeksjoner som forårsakes av dem betegner moniliasis eller fungusinfeksjoner. De øvrige organismer som har interesse i denne sammenheng om-tales simpelthen som «andre patogene fungi». Ayfactin har vist seg å være effektivt in vivo overfor den patogene Candida albicans hos mus, når den injiseres intra-peritonealt i nøytral, vandig suspensjon samtidig med inngift av en intraperitoneal injeksjon av klorotetracyklin (for å be-skytte mot bakteriell infeksjon) og tilstrekkelig med Candida albicans til å drepe alle kontrollmusene innen 48 timer. På denne måte ble det funnet at den minimale dosis ayfactin (CD50) tilstrekkelig til å sikre at i det minste halvparten av musene overlevde i det minste 12 dager, var 0,04 mg/kg. Dette viser den overordentlig sterke, fungicide virkning av ayfactin i det levende dyr. Ved et lignende eksperiment hvor ayfactinet ble inngitt oralt, var CD50 over 300 mg/kg, hvilket viser at ayfactin ikke absorberes i blodbanen gjennom fordøy-elseskanalens vegger. Ayfactin har et høyt terapeutisk index (forholdet mellom toksisk og effektiv dosis), hvilket sees av den bestemmelse at dets LD50 (den minimale dosis som er nødvendig for å drepe halvdelen av dyrene) hos mus ved intraperitoneal injeksjon er ca. 0,8 mg pr. kg, dvs. 20 ganger til tilsvarende CD50. Ayfactin shows little or no activity against most Gram-positive and Gram-negative bacteria, but is highly active against certain fungi, such as the dermatophyte M. audouini, which occurs in clinical tinea capitis, the non-pathogenic plant fungus A. solani, the dermatophyte E floccosum and especially against Candida albicans, the yeast that thrives in the human digestive tract during treatment with antibiotics, especially when broad-spectrum antibiotics such as chloramphenicol, tetracycline, chlorotetracycline and oxytetracycline are used. In the preceding description and in large parts of the general medical literature, yeast species (Saccharomycetes) and Fungi imperfecti are called generically Monilia, and the infections caused by them denote moniliasis or fungal infections. The other organisms that are of interest in this context are simply referred to as "other pathogenic fungi". Ayfactin has been shown to be effective in vivo against the pathogenic Candida albicans in mice, when injected intraperitoneally in a neutral, aqueous suspension at the same time as an intraperitoneal injection of chlorotetracycline (to protect against bacterial infection) and sufficient Candida albicans to kill all the control mice within 48 hours. Thus, the minimal dose of ayfactin (CD50) sufficient to ensure that at least half of the mice survived at least 12 days was found to be 0.04 mg/kg. This shows the extremely strong, fungicidal effect of ayfactin in the living animal. In a similar experiment where ayfactin was administered orally, the CD50 was over 300 mg/kg, which shows that ayfactin is not absorbed into the bloodstream through the walls of the digestive tract. Ayfactin has a high therapeutic index (the ratio between toxic and effective dose), which is seen by the determination that its LD50 (the minimum dose necessary to kill half of the animals) in mice by intraperitoneal injection is approx. 0.8 mg per kg, i.e. 20 times the corresponding CD50.

Ayfactinet ifølge oppfinnelsen er anvendelig ved bekjempelse av mange syk-dommer, som forårsakes ved fungusinfeksjoner hos mennesker, dyr og planter. Ved anvendelsen tilsettes ayfactinet en vesent-lig mengde av et farmasøytisk anvendelig bærestoff som kan enten være et fast stoff eller en væske. Preparatene kan anvendes i form av tabletter, f. eks. utflytende tabletter, pulvere, granuler, kapsler (både hårde og bløte), suspensjoner i spesielle oljer eller annen doseringsform som er særlig anvendelig ved oral inngift. Flytende fortyn-nelsesmidler anvendes sterile ved parenteral bruk, dvs. ved injeksjon. Et slikt preparat kan f. eks. være en steril oppløsning, inne-holdende 1—125 mg/ml dimetylacetamid, eller det kan være en suspensjon i vann eller en injiserbar olje, f. eks. 0,5 % i vann som inneholder 0,5 % karboksymetylcellu-lose. Preparatene kan også fremstilles på den måte at det aktive stoff ayfactin blandes med faste f ortynningsmidler eller tabletteringshjelpemidler eller begge deler, som maisstivelse, lactose, talk, stearin-syre magnesiumstearat eller gummiarter. Et hvilket som helst kapselmateriale eller tabletteringsmateriale som anvendes innen farmacien kan anvendes, forutsatt at det ikke reagerer med ayfactin, og materialet kan tabletteres med eller uten hjelpestoffer. Ayfactinet kan også anbringes i de alminnelige kapsler av resorberbare materialer, som gelatin, og inngis i denne form med et inn-hold av f. eks. 1—500 og fortrinnsvis 10—20 mg pg kapsel eller tablett. Ayfactinet ifølge oppfinnelsen er særlig anvendelig for lokal anvendelse, f. eks. i form av badevann eller salver, ved fungus-inf eks joner i huden hos mennesker eller dyr eller som sprøyte væsker eller tilsatt gjød-ninger ved plantesykdommer. På grunn av den lave absorpsjon, den lave giftighet og den høye aktivitet overfor Candida albicans er ayfactin spesielt anvendelig ved behand- Ayfactinet according to the invention is useful in combating many illnesses caused by fungal infections in humans, animals and plants. During use, a substantial amount of a pharmaceutically usable carrier is added to ayfactin, which can either be a solid or a liquid. The preparations can be used in the form of tablets, e.g. liquid tablets, powders, granules, capsules (both hard and soft), suspensions in special oils or other dosage forms that are particularly suitable for oral administration. Liquid diluents are used sterile for parenteral use, i.e. by injection. Such a preparation can e.g. be a sterile solution, containing 1-125 mg/ml dimethylacetamide, or it can be a suspension in water or an injectable oil, e.g. 0.5% in water containing 0.5% carboxymethyl cellulose. The preparations can also be prepared in such a way that the active substance ayfactin is mixed with solid diluents or tableting aids or both, such as corn starch, lactose, talc, stearic acid magnesium stearate or gums. Any capsule material or tableting material used in pharmacy may be used, provided it does not react with ayfactin, and the material may be tableted with or without excipients. Ayfactinet can also be placed in the usual capsules of resorbable materials, such as gelatin, and administered in this form with a content of e.g. 1-500 and preferably 10-20 mg per capsule or tablet. Ayfactinet according to the invention is particularly useful for local application, e.g. in the form of bath water or ointments, in the case of fungus infections in the skin of humans or animals or as spray liquids or added fertilizers in case of plant diseases. Due to the low absorption, the low toxicity and the high activity against Candida albicans, ayfactin is particularly useful in treating

lingen av infeksjoner av denne organisme eller andre fungi som ofte følger behandlingen med antibiotika, slik som det er beskrevet i J. Amer. Med. Assoc. 152:206, 1953 eller A.M.A. Arch. Int. Med. 95:74—82 og 112—117, 1955 eller The Practitioner 174: ling of infections by this organism or other fungi that often follow treatment with antibiotics, as described in J. Amer. With. Assoc. 152:206, 1953 or A.M.A. Arch. Int. Med. 95:74-82 and 112-117, 1955 or The Practitioner 174:

29—38, 1955. En slik oppformering av gjærarter og særlig Candida albicans er alminnelig i fordøyelseskanalen som en følge av behandling med antibiotika og fører leilighetsvis til fatale systemiske infeksjoner. 29—38, 1955. Such a proliferation of yeast species and particularly Candida albicans is common in the digestive tract as a result of treatment with antibiotics and occasionally leads to fatal systemic infections.

En særlig fordelaktig form for ayfactin til klinisk anvendelse er en kombinasjon med et eller flere av de antibiotika med bredt spektrum som er så anvendelige ved behandlingen av bakterielle infeksjoner, men som har den ulempe at de leilighetsvis forårsaker fungusinfeksjoner, særlig i for-døyelseskanalen ved den vanlige orale inngift. For dette formål settes en alminnelig dosis av tetracyklin, klorotetracyklin, oksytetracyklin eller kloramfenicol (f. eks. 50— 250 mg pr. kapsel) til en enhetsdosis av ayfactin som er beskrevet ovenfor (f. eks. 1—500 mg og fortrinnsvis 5—50 mg pr. kapsel). Ifølge en spesiell utformning av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremstilles en kapsel som inneholder 250 mg tetracyklin og 20 mg ayfactin. Et slikt produkt tilveiebringer en antibakteriell terapi med bredt spektrum og en effektiv fungicid A particularly advantageous form of ayfactin for clinical use is a combination with one or more of the broad-spectrum antibiotics which are so useful in the treatment of bacterial infections, but which have the disadvantage that they occasionally cause fungal infections, particularly in the digestive tract at the usual oral administration. For this purpose, a common dose of tetracycline, chlorotetracycline, oxytetracycline or chloramphenicol (e.g. 50-250 mg per capsule) is added to a unit dose of ayfactin described above (e.g. 1-500 mg and preferably 5- 50 mg per capsule). According to a special design of the method according to the invention, a capsule containing 250 mg of tetracycline and 20 mg of ayfactin is produced. Such a product provides a broad-spectrum antibacterial therapy and an effective fungicide

profylax. Den kjensgjerning at ayfactinet prophylaxis. The fact that ayfactinet

ikke absorberes gjennom fordøyelseskana-lens vegger medvirker til å øke effekten av dets fungicide virkning med oral inngift av dette produkt og tillater ayfactinet å utøve not absorbed through the walls of the alimentary canal helps to increase the effect of its fungicidal action with oral administration of this product and allows ayfactin to exert

sin virkning fortrinnsvis innenfor for-døyelseskanalens hulrom. Den normale dosis for en voksen av dette produkt vil være 4—8 kapsler pr. dag. Utover anvendelsen av en slik kombinasjon i en kapsel for å hindre moniliasis eller pruritis ani er anvendelsen av trocher av verdi for å hindre trøske, og anvendelse av supposi-torier er av verdi for å hindre vaginatis eller vulvitis, likesom anvendelse av salver eller badevann er av verdi for å hindre tilsvarende symptomer på fungusvekst. its effect preferably within the cavity of the digestive tract. The normal dose for an adult of this product will be 4-8 capsules per day. day. In addition to the use of such a combination in a capsule to prevent moniliasis or pruritis ani, the use of troches is of value in preventing thrush, and the use of suppositories is of value in preventing vaginatis or vulvitis, just as the use of ointments or bath water is of value in preventing similar symptoms of fungus growth.

Ayfactin kan lett identifiseres ved sitt absorpsjonsspektrum i det ultrafiolette område og sin manglende baktericide virkning hvorved det adskiller seg fra andre fungicide stoffer fremstilt ved gjæring, unntatt stof-fene av trichomycin-ascosin-candicidin-candinin-gruppen (se Oroschnik et al, Science, 121, 147—149, 1955, Utahara et al. J Antibiotics Japan, ser. A 7(4), 120, 124, Ayfactin can be easily identified by its absorption spectrum in the ultraviolet region and its lack of bactericidal action, whereby it differs from other fungicidal substances produced by fermentation, except for the substances of the trichomycin-ascosin-candicidin-candinin group (see Oroschnik et al, Science, 121, 147-149, 1955, Utahara et al J Antibiotics Japan, Ser A 7(4), 120, 124,

1954 og Vining et al, Antibiotics Annual 1954—1955, pages 980—987). Ayfactin adskiller seg fra candinin ved det sistnevnte stoffs oppløselighet i vann (Vining, ibid. 1954 and Vining et al, Antibiotics Annual 1954—1955, pages 980—987). Ayfactin differs from candinin by the solubility of the latter substance in water (Vining, ibid.

p. 982), ved undersøkelse ved hjelp av papir-kromatografi og ved det siste stoffs langt større aktivitet overfor Sporotrichum schenkii (se Taber et Al, Antibiotics and Cehmotherapy 4(4), 455—461, 1954). Ayfactin kan skjelnes fra candicidin ved det siste stoffs høyere nitrogeninnhold, (funnet på vann-og askefri basis: S, 64,7%, H, 8,34%' N, 4,24 %, O, 22,72 %, funnet ved differens: ayfactin synes således å inneholde ytterligere en C7H702 eller C7H802-gruppe. Ayfactin er også langt mindre oppløselig i vann enn candicidin og er i det minste flere ganger mer virksomt enn candicidin ved fortynningsforsøk overfor Candida albicans. Ayfactin kan skjelnes fra ascosin ved det siste stoffs større oppløselighet i vann (se Hickey et al. Antibiotics and Chemo-therapy, 2(9), 472—483, 1952). Ayfactin kan skjelnes fra trichomycin ved at det siste stoff ikke inneholder nitrogen og ved dette stoffs store oppløselighet i vann (se Hosoya et al. J. Antibiotics Japan 5, 564—566, 1955, og 7, 5—8, 1955). Ayfactin kan ennvidere skjelnes fra trichomycin, ascosin, candicidin og candidin ved forskjell i deres ab-sorpsjonsspektra i det infrarøde område. p. 982), by examination by means of paper chromatography and by the far greater activity of the latter substance against Sporotrichum schenkii (see Taber et Al, Antibiotics and Cehmotherapy 4(4), 455-461, 1954). Ayfactin can be distinguished from candicidin by the latter substance's higher nitrogen content, (found on a water- and ash-free basis: S, 64.7%, H, 8.34%' N, 4.24%, O, 22.72%, found by difference: ayfactin thus appears to contain an additional C7H702 or C7H802 group. Ayfactin is also far less soluble in water than candicidin and is at least several times more effective than candicidin in dilution tests against Candida albicans. Ayfactin can be distinguished from ascosin by the the latter substance's greater solubility in water (see Hickey et al. Antibiotics and Chemo-therapy, 2(9), 472—483, 1952). Ayfactin can be distinguished from trichomycin by the fact that the latter substance does not contain nitrogen and by the greater solubility of this substance in water (see Hosoya et al. J. Antibiotics Japan 5, 564-566, 1955, and 7, 5-8, 1955). Ayfactin can further be distinguished from trichomycin, ascosin, candicidin and candidin by differences in their absorption spectra in the infrared range.

En fortynningsprøve med ayfactin kan utføres på følgende måte: Fast ayfactin i en mengde på 1 mg/ml oppløses i metanol som inneholder 10 % saltsyre, og der tilsettes en vandig støtputeoppløsning med en pH-verdi på 8, slik at der fremkommer en endelig pH-verdi på 7,3^7,4. Oppløsningen fortynnes til en konsentrasjon på 200 mikrogram pr. ml. I 10 prøveglass, hvert inne-holdende 1 ml. myco-philsubstrat (modi-fisert Sabouraud-substrat, f. eks. et han-delsprodukt fra Baltimore Biological Labo-ratorium), podes med en fortynning 1:10.000 av en gjærkultur (f. eks. Sac-charomyces nr. 32). Til det første av prøve-glassene tilsettes 1 ml av ayfactinoppløsnin-gen, hvorpå det blandes. 1 ml fra det første glass overføres deretter til det annet glass, og den samme fremgangsmåte fortsettes gjennom hele serien. Glassene settes deretter i termostat og iakttas i vekst eller hemning på vanlig måte. Ayfactin har vist seg å ha hemning ved en minimal konsentrasjon på mindre enn 0,4 mikrogram pr. ml ved denne fremgangsmåte og på mindre enn 1,0 mikrogram pr. ml overfor Candida albicans. A dilution test with ayfactin can be carried out as follows: Solid ayfactin in an amount of 1 mg/ml is dissolved in methanol containing 10% hydrochloric acid, and an aqueous buffer solution with a pH value of 8 is added, so that a final pH is obtained -value of 7.3^7.4. The solution is diluted to a concentration of 200 micrograms per ml. In 10 test tubes, each containing 1 ml. myco-phil substrate (modified Sabouraud substrate, e.g. a commercial product from the Baltimore Biological Laboratory), inoculated with a 1:10,000 dilution of a yeast culture (e.g. Saccharomyces No. 32). To the first of the test tubes, 1 ml of the ayfactin solution is added, after which it is mixed. 1 ml from the first glass is then transferred to the second glass, and the same procedure is continued throughout the series. The glasses are then placed in a thermostat and observed for growth or inhibition in the usual way. Ayfactin has been shown to have inhibition at a minimal concentration of less than 0.4 micrograms per ml by this method and of less than 1.0 micrograms per ml against Candida albicans.

En typisk handelsoppløsning som inneholder ca. 2500 mikrogram tetracyklin pr. ml, inneholder for hvert 10 g tetracyklin ca. 1 g ayfactin som vil gi et resultat på 1,0 mokrogram pr. ml ved det ovenfor nevnte fortynningsforsøk i prøveglass. A typical trading solution containing approx. 2500 micrograms of tetracycline per ml, contains for every 10 g of tetracycline approx. 1 g of ayfactin which will give a result of 1.0 micrograms per ml in the aforementioned dilution experiment in test tubes.

Oppfinnelsen er i det følgende forklart ved hjelp av eksempler. The invention is explained in the following with the help of examples.

Eksempel 1: Example 1:

1 kg mycelium fra en submers, aerob gjæring av Streptomyces aureaofaciens fremkom ved surning av hele substratet til en pH-verdi på 2 og isolering ved filtrering. Myceliet ble uttrukket med 3 1 n-butanol ved en pH-verdi på 9,5, og butanolet isoler-tes og ble uttukket med 1,5 1 vann ved en pH-verdi på 1,5, hvoretter den vandige væskeoppløsning ble kastet vekk. Oppløs-ningen i n-butanol ble konsentrert ved destillasjon i vakuum til 200 ml, hvorved det ble utfeldt 6,2 g fast ayfactin som ble isolert ved filtrering, vasket med en alifatisk kull-vannstoff (handelsproduktet skellysolve C). Ved fortynningsprøve viste produktet seg å hemme gjær ved en konsentrasjon på 1,6 mikrogram pr. ml. 1 kg of mycelium from a submerged, aerobic fermentation of Streptomyces aureofaciens was obtained by acidifying the entire substrate to a pH value of 2 and isolation by filtration. The mycelium was extracted with 3 L of n-butanol at a pH value of 9.5, and the butanol was isolated and extracted with 1.5 L of water at a pH value of 1.5, after which the aqueous liquid solution was discarded . The solution in n-butanol was concentrated by distillation in vacuum to 200 ml, whereby 6.2 g of solid ayfactin was precipitated, which was isolated by filtration, washed with an aliphatic carbon-hydrogen (the commercial product skellysolve C). In a dilution test, the product proved to inhibit yeast at a concentration of 1.6 micrograms per ml.

Eksempel 2: Example 2:

16 kg mycelium fra en submers, areob gjæring med Streptomyces aureaofaciens ble fremstilt ved surning av hele substratet til en pH-verdi på 2 og isolering ved filtrering. Myceliet ble uttrukket med 75 1 aceton, og myceliet fjernet ved filtrering og kastet vekk. Til acetonoppløsningen ble det tilsatt saltsyre i en slik mengde at pH-verdien ble 6,0, hvorved det ble utfelt 140 g urent ayfactin som ble isolert ved filtrering, vasket med aceton og tørret i vakuum over P205. Ved fortynningsprøve viste produktet seg å være aktivt overfor gjær ved en fortynning på 6,3 mikrogram pr. ml. Det rå ayfactin ble utrørt i 2,8 1 vann ved en pH-verdi på 2,0 og det uoppløste, rensede ayfactin ble isolert ved filtrering, vasket med vann og tørret, hvorved det fremkom et utbytte på 9,0 g, som ved fortynningsprøve viste seg å hemme ved en konsentrasjon på 1,6 mikrogram pr. ml. Utrøring av en por-sjon av dette ayfactin med en blanding av like romfang varm formamid og metanol fjernet urenheter som ble isolert ved utfelling med eter, og som ved prøve viste seg å inneholde meget lite ayfactin, mens ca. 7 g renset ayfactin forble uoppløst. 16 kg of mycelium from a submerged, areobic fermentation with Streptomyces aureofaciens was produced by acidifying the entire substrate to a pH value of 2 and isolation by filtration. The mycelium was extracted with 75 l of acetone, and the mycelium was removed by filtration and discarded. Hydrochloric acid was added to the acetone solution in such an amount that the pH value became 6.0, whereby 140 g of impure ayfactin was precipitated, which was isolated by filtration, washed with acetone and dried in vacuum over P2O5. In a dilution test, the product proved to be active against yeast at a dilution of 6.3 micrograms per ml. The crude ayfactin was stirred in 2.8 L of water at a pH of 2.0 and the undissolved, purified ayfactin was isolated by filtration, washed with water and dried to give a yield of 9.0 g, as dilution test proved to inhibit at a concentration of 1.6 micrograms per ml. Stirring a portion of this ayfactin with a mixture of equal volumes of warm formamide and methanol removed impurities which were isolated by precipitation with ether, and which, when tested, proved to contain very little ayfactin, while approx. 7 g of purified ayfactin remained undissolved.

Eksempel 3: Example 3:

8 kg mycelium fra en submers, aerob gjæring av Streptomyces aureofaciens fremkom ved surning av hele substratet til en pH-verdi omkring 2 og isolering ved filtrering. Myceliet ble uttrukket med 20 1 n-butanol ved en pH-verdi på 9,5 og filtrert, og butanolet ble uttrukket med et likt romfang vann ved en pH-verdi på 9,5. Butanolet ble isolert, konsentrert ved destillasjon i vakuum og heldt i 5 romfang alkaner (skellysolve C) for utfelling av ayfactinet, hvorav det fremkom 18,4 g som viste seg aktivt ved en konsentrasjon på 0,5 mikrogram pr. ml. 8 kg of mycelium from a submerged, aerobic fermentation of Streptomyces aureofaciens was obtained by acidifying the entire substrate to a pH value of around 2 and isolation by filtration. The mycelium was extracted with 20 1 n-butanol at a pH value of 9.5 and filtered, and the butanol was extracted with an equal volume of water at a pH value of 9.5. The butanol was isolated, concentrated by distillation in vacuum and held in 5 volumes of alkanes (skellysolve C) to precipitate the ayfactin, from which 18.4 g emerged which proved active at a concentration of 0.5 micrograms per ml.

Eksempel 4: Example 4:

6,9 g ayfactin fremstilt som beskrevet i eksempel 2 ble utrørt 15 minutter med en blanding av 600 ml vann og 600 ml n-butanol innstilt på en pH-verdi av 10,0 med ammoniumhydroksyd. Butanollaget 6.9 g of ayfactin prepared as described in example 2 was stirred for 15 minutes with a mixture of 600 ml of water and 600 ml of n-butanol adjusted to a pH value of 10.0 with ammonium hydroxide. The butanol layer

ble isolert og konsentrert ved destillasjon i vakuum til et romfang på 30 ml. Ved av-kjøling ble det utfeldt 1,8 g krystallinsk ayfactin som ble oppsamlet ved filtrering og ved forsøk viste seg å hemme gjær ved for-tynningsprøve i en konsentrasjon på 0,2— 0,4 mikrogram pr. ml. was isolated and concentrated by distillation in vacuo to a volume of 30 ml. Upon cooling, 1.8 g of crystalline ayfactin was precipitated, which was collected by filtration and was shown to inhibit yeast in a dilution test at a concentration of 0.2-0.4 micrograms per ml.

Det krystallinske ayfactin hadde føl-gende egenskaper: Elementæranalyse: C 63,7 %, H 7,54 %, N 2,96 %, aske 1,78 %, H20 8,26 %. På vann- og askefri basis ga dette: C 64,85 %, H 7,68 %, N 3,01 %. Dette tyder på en mulig empirisk formel svasende til <C>25<H>35-3(.N07. Ayfactin er nesten uopp-løselig i vann og lett oppløselig i dimetylformamid, pyridin, morfolin og piperidin. The crystalline ayfactin had the following properties: Elemental analysis: C 63.7%, H 7.54%, N 2.96%, ash 1.78%, H 2 O 8.26%. On a water- and ash-free basis, this gave: C 64.85%, H 7.68%, N 3.01%. This suggests a possible empirical formula similar to <C>25<H>35-3(.NO7. Ayfactin is almost insoluble in water and easily soluble in dimethylformamide, pyridine, morpholine and piperidine.

Eksempel 5: Example 5:

200 g mycelium fremkommet ved submers, aerob gjæring av Streptomyces 200 g of mycelium produced by submerged, aerobic fermentation of Streptomyces

aureaofaciens ved surning av hele substratet til en pH-verdi på 2 og isolert ved filtrering ble uttrukket med 1 1 n-butanol. Butanolet ble isolert og konsentrert ved destillasjon i vakuum til 50 ml. Av denne oppløs-ning ble 45 ml satt til 500 ml alkaner (skellysolve C), hvorved det ble utfelt 50C mg fast ayfactin, som ble isolert ved filtrering og viste seg å hemme veksten av Candida albicans ved plateforsøk. aureofaciens by acidifying the entire substrate to a pH value of 2 and isolated by filtration was extracted with 1 1 n-butanol. The butanol was isolated and concentrated by distillation in vacuo to 50 ml. 45 ml of this solution was added to 500 ml of alkanes (skellysolve C), whereby 50C mg of solid ayfactin was precipitated, which was isolated by filtration and proved to inhibit the growth of Candida albicans in plate tests.

Eksempel 6: Example 6:

Til 10 1 substrat fremkommet ved submers, aerob gjæring av Streptomyces viridifaciens ble der tilsatt diatoméjord. Ettei filtrering ble myceliet vasket med vann og deretter uttrukket med 4 1 aceton innstill til en pH-verdi på 8,0 ved tilsetning a\ ammoniumhydroksyd. Den våte aceton-oppløsning som således fremkom, ble konsentrert ved destillasjon i vakuum, idet del ble tilsatt ytterligere vann, slik at det ble etterlatt 800 ml vandig rest, hvorfra det ble utfeldt 5,4 g fast ayfactin som hadde en fungicid aktivitet som bestemt ved fortynningsmetoden svarte til 1,8—3,7 mikrogram pr. ml. Diatomaceous earth was added to 10 1 of substrate produced by submerged, aerobic fermentation of Streptomyces viridifaciens. After filtration, the mycelium was washed with water and then extracted with 4 l of acetone adjusted to a pH value of 8.0 by the addition of ammonium hydroxide. The wet acetone solution thus obtained was concentrated by distillation in vacuo, part of which was added with further water, so that 800 ml of aqueous residue was left, from which precipitated 5.4 g of solid ayfactin which had a fungicidal activity as determined by the dilution method corresponding to 1.8-3.7 micrograms per ml.

Den vandige moderlut ble konsentrert til 150 ml, innstilt til en pH-verdi på 1,5 med saltsyre, hvorpå den ble uttrukket med 150 ml n-butanol. Butanolet ble isolert, konsentrert og tørret ved destillasjon i vakuum til et romfang på 50 ml, hvorpå det ble tilsatt 500 ml alkaner (Skellysolve C). Herved ble det utfeldt 3,5 g fast ayfactin med en fungicid aktivitet bestemt ved fortynningsmetoden på 1,8—3,7 mikrogram pr. ml. The aqueous mother liquor was concentrated to 150 ml, adjusted to a pH of 1.5 with hydrochloric acid, after which it was extracted with 150 ml of n-butanol. The butanol was isolated, concentrated and dried by distillation in vacuum to a volume of 50 ml, after which 500 ml of alkanes (Skellysolve C) were added. This precipitated 3.5 g of solid ayfactin with a fungicidal activity determined by the dilution method of 1.8-3.7 micrograms per ml.

Myceliet ble etter den alkaliske uttrekning med aceton atter uttrukket med 4 1 aceton innstilt til en pH-verdi på 2,0 ved tilsetning av saltsyre. Det sure aceton-uttrykk ble nøytralisert til en pH-verdi på 7,0 med ammoniumhydroksyd, hvorved det ble utfeldt 27 g fast stoff med liten fungicid aktivitet. Moderluten av aceton ble inn-dampet under tilsetning av ca. 200 ml vann, hvorved det ble utfeldt ca. 2,0 g oljeaktig ayfactin med en fungicid aktivitet bestemt ved fortynningsmetoden på 0,39 mikrogram pr. ml. Lyofilisering av det etterlatte, vandige filtrat ga 8,0 g fast stoff som ikke utviste fungicid aktivitet ved en konsentrasjon på 100 mikrogram pr. ml. After the alkaline extraction with acetone, the mycelium was extracted again with 4 1 acetone adjusted to a pH value of 2.0 by the addition of hydrochloric acid. The acidic acetone extract was neutralized to a pH value of 7.0 with ammonium hydroxide, whereby 27 g of solid material with little fungicidal activity was precipitated. The mother liquor of acetone was evaporated while adding approx. 200 ml of water, whereby approx. 2.0 g of oily ayfactin with a fungicidal activity determined by the dilution method of 0.39 micrograms per ml. Lyophilization of the aqueous filtrate left behind gave 8.0 g of a solid substance which did not exhibit fungicidal activity at a concentration of 100 micrograms per ml.

Eksempel 7: Example 7:

A. Ayfactin med en fungicid aktivitet på 1,5 mikrogram pr. ml bestemt ved fortynningsmetoden ble uttrukket med aceton, A. Ayfactin with a fungicidal activity of 1.5 micrograms per ml determined by the dilution method was extracted with acetone,

hvorved det ble etterlatt en fast, uoppløselig rest med en aktivitet på 0,39 mikrogram pr. ml og ennvidere et fast stoff som fremkom ved fordampning av acetonen som var inaktivt ved en konsentrasjon på 50 mikrogram pr. ml. whereby a solid, insoluble residue was left with an activity of 0.39 micrograms per ml and further a solid that appeared by evaporation of the acetone which was inactive at a concentration of 50 micrograms per ml.

B. 200 mg ayfactin med en aktivitet svarende til 3,7 mikrogram pr. ml ble uttrukket med 20 ml metanol, hvorved det til rest ble 60 mg fast, uoppløselig ayfactin med en aktivitet svarende til 3,1 mikrogram pr. ml og ennvidere 2 mg fast stoff som fremkom ved å sette metanoluttrekket til 200 ml eter. Det sistnevnte stoff var inaktivt ved en konsentrasjon på 10 mikrogram pr. ml. C. 200 mg ayfactin med en aktivitet svarende til 3,7 mikrogram pr. ml ble uttrukket med 20 ml n-butanol, hvorved det til rest ble 70 mg fast, uoppløselig ayfactin med en aktivitet svarende til 6,3 mikrogram pr. ml. Ved tilsetning av butanol-uttrekket til 10 romfang alkaner (skelly-soive C) fremkom det ingen utfelling. C. 500 mg ayfactin med en aktivitet i svarende til 3,7 mikrogram pr. ml ble uttrukket med 10 ml saltsyre ved en pH-verdi på 1,0 i 10 minutter, hvorved det til rest ble 400 mg fast, uoppløselig ayfactin med en aktivitet svarende til 0,78 mikrogram pr. ml. Det sure uttrekk lyofilisertes, hvor- B. 200 mg ayfactin with an activity corresponding to 3.7 micrograms per ml was extracted with 20 ml of methanol, whereby the residue was 60 mg of solid, insoluble ayfactin with an activity corresponding to 3.1 micrograms per ml and further 2 mg of solid which was obtained by putting the methanol extract into 200 ml of ether. The latter substance was inactive at a concentration of 10 micrograms per ml. C. 200 mg ayfactin with an activity corresponding to 3.7 micrograms per ml was extracted with 20 ml of n-butanol, whereby the residue was 70 mg of solid, insoluble ayfactin with an activity corresponding to 6.3 micrograms per ml. When the butanol extract was added to 10-volume alkanes (skelly-soive C), no precipitation appeared. C. 500 mg ayfactin with an activity corresponding to 3.7 micrograms per ml was extracted with 10 ml of hydrochloric acid at a pH value of 1.0 for 10 minutes, whereby the residue was 400 mg of solid, insoluble ayfactin with an activity corresponding to 0.78 micrograms per ml. The acidic extract was lyophilized, where

ved det fremkom 80 mg fast stoff som var inaktivt i en konsentrasjon på 50 mikro- by this, 80 mg of solid material appeared which was inactive at a concentration of 50 micro-

gram pr. ml. grams per ml.

Eksempel 8: Example 8:

1 g ayfactin som'var aktivt i en kon- 1 g ayfactin which was active in a con-

sentrasjon på 0,4 mikrogram pr. ml, ble suspendert i en blanding av 100 ml. vann og 100 ml n-butanol. Blandingen ble; innstilt på en pH-verdi på 1,5 med saltsyre. Etter omrøring i 10 minutter ble det fra skille- concentration of 0.4 micrograms per ml, was suspended in a mixture of 100 ml. water and 100 ml of n-butanol. The mixture became; adjusted to a pH value of 1.5 with hydrochloric acid. After stirring for 10 minutes, from the separation

flaten utvunnet 30 mg brunt, fast stoff med en aktivitet svarende til 4 mikrogram pr. ml. Etter adskillelse av de to faser ble den vandige fase innstilt til en pH-verdi på 7,0, hvorved det fremkom 80 mg fast stoff som var inaktivt ved en konsentrasjon på 60 mikrogram pr. ml. Lyofilisering av det vandige konsentrat ga 170 mg stoff som var inaktivt med en konsentrasjon på 20 mikro- surface extracted 30 mg of brown, solid substance with an activity corresponding to 4 micrograms per ml. After separation of the two phases, the aqueous phase was adjusted to a pH value of 7.0, whereby 80 mg of solid material emerged which was inactive at a concentration of 60 micrograms per ml. Lyophilization of the aqueous concentrate gave 170 mg of substance which was inactive with a concentration of 20 micro-

gram pr. ml. grams per ml.

Butanolfasen ble uttrukket med likt The butanol phase was extracted with equal

romfang vann, idet pH-verdien ble innstilt på 7,0 med ammoniumhydroksyd. Det vandige lag ble isolert og lyofilisert, hvor- volume of water, the pH value being adjusted to 7.0 with ammonium hydroxide. The aqueous layer was isolated and lyophilized, where

ved det fremkom 125 mg fast ayfactin som var aktivt ved en konsentrasjon på 1,2 mikrogram pr. ml. Butanolet ble konsentrert og tørret ved destillasjon til et romfang på 50 ml, hvorpå det ble tilsatt 500 ml alkaner (skellysolve C), hvorved det fremkom 200 this resulted in 125 mg of solid ayfactin which was active at a concentration of 1.2 micrograms per ml. The butanol was concentrated and dried by distillation to a volume of 50 ml, after which 500 ml of alkanes (Skellysolve C) were added, whereby 200

mg fast ayfactin med en aktivitet svarende til 4 mikrogram pr. ml. mg fast ayfactin with an activity corresponding to 4 micrograms per ml.

Eksempel 9: Example 9:

1 g ayfactin som var aktivt ved en kon- 1 g ayfactin which was active at a con-

sentrasjon på 3,7 mikrogram pr. ml, ble suspendert i en blanding av 100 ml vann og 100 ml metylisobutylketon. Blandingen ble innstilt til en pH-verdi på 2,0 med saltsyre. concentration of 3.7 micrograms per ml, was suspended in a mixture of 100 ml of water and 100 ml of methyl isobutyl ketone. The mixture was adjusted to a pH value of 2.0 with hydrochloric acid.

Etter omrøring ble det fra skilleflaten ut- After stirring, from the separation surface,

vunnet 150 mg fast ayfactin som var aktivt ved en konsentrasjon på 0,45 mikrogram pr. ml. Hele mengden av fast stoff som ble utvunnet fra væskefasene, ialt 415 mg, var inaktivt ved fortynningsprøven i konsentra- won 150 mg of solid ayfactin which was active at a concentration of 0.45 micrograms per ml. The entire amount of solid recovered from the liquid phases, a total of 415 mg, was inactive in the dilution test in concen-

sjoner så høyt som 50 mikrogram pr. ml. tions as high as 50 micrograms per ml.

Eksempel 10: Example 10:

Ayfactin sublimerte ikke i høyt vakuum Ayfactin did not sublime in high vacuum

ved temperaturer opptil 200° C. Oppløselig- at temperatures up to 200° C. Soluble-

heten i store mengder av kloroform eller etylacetat var ubetydelig. Ayfactin var full- the heat in large amounts of chloroform or ethyl acetate was negligible. Ayfactin was full-

stendig oppløselig i pyridin og ble utfeldt permanently soluble in pyridine and was precipitated

herav med eter, aceton eller metanol. Ay- of which with ether, acetone or methanol. Ay-

factin var fullstendig oppløselig i piperidin og ble utfeldt ved tilsetning av eter. factin was completely soluble in piperidine and was precipitated by the addition of ether.

Eksempel 11: Example 11:

6 g ayfactin som var aktivt i en kon- 6 g ayfactin which was active in a con-

sentrasjon på 3,2 mikrogram pr. ml, ble uttrukket med 100 ml ammoniumhydrok- concentration of 3.2 micrograms per ml, was extracted with 100 ml of ammonium hydroxide

syd ved en pH-verdi på 10,5 i 15 minutter, south at a pH value of 10.5 for 15 minutes,

hvorved det fremkom en sort, oljeaktig oppløsning. Oljen ble fjernet ved uttrek- whereby a black, oily solution appeared. The oil was removed by extracting

ning med alkaner (skellysolve C), den van- ation with alkanes (Skellysolve C), the water-

dige fase ble innstilt til en pH-verdi på dige phase was set to a pH value of

1,5 med saltsyre, hvorved det ble utfeldt 1 g av et fast, sort produkt som var aktivt 1.5 with hydrochloric acid, whereby 1 g of a solid, black product which was active was precipitated

i en konsentrasjon på 1,6 mikrogram pr. in a concentration of 1.6 micrograms per

ml. ml.

Eksempel 12: Example 12:

Undersøkelse av oppløsninger av han-delsprodukter av tetracyklin og klorotetra- Examination of solutions of commercial products of tetracycline and chlorotetra-

cyklin i en konsentrasjon på 500 mikro- cyclin at a concentration of 500 micro-

gram pr. ml ved fortynningsprøven viste at disse stoffer ikke hadde noen fungicid aktivitet. grams per ml in the dilution test showed that these substances had no fungicidal activity.

Claims

1. Process for the production of fungicidal substance, called ayfactin, karak-

characterized in that a submerged, aerobic fermentation of a Streptomyces, which is capable of producing tetracycline or chlortetracycline or both, is carried out in a known manner, after which the tetracycline or chlortetracycline or both are removed from the substrate in the usual way, after which the mycelium is extracted with an organic solvent, which is capable of dissolving at least 2 g of ayfactin per 1, whereupon the ayfactin in crystalline form is recovered from the extract and further purified, which ayfactin dissolved in, among other things, pyridine in a concentration of 0.01 mg/ml exhibits the following absorption maxima and minima: 2. Method as stated in claim 1, characterized by treating the substrate with aqueous acid, after which the aqueous antibiotic-containing phase is removed from the mycelium and the ayfactin is recovered from the mycelium. 3. Procedure as stated in the in condition 1, characterized in that the substrate is treated with alkali, whereby the tetracycline or chlortetracycline or both parts are precipitated, after which the aqueous phase is separated from the mycelium, and the precipitated solid substance and the tetracycline or chlortetracycline or both parts are removed by treatment with aqueous acid, after which the mycelium is isolated from the aqueous phase and adjusted to a pH value of approx. 9.0—10.0 after which the ayfactin is extracted from the mycelium. 4. Method as stated in claims 1-3, characterized in that the mycelium is extracted with n-butanol, dimethylformamide, pyridine, piperidine and morpholine.