NL9401270A - Werkwijze voor het lokaliseren van de bron van renale en niet-renale hematurie. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het lokaliseren van de bron van renale en niet-renale hematurie.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze die onderscheid maakt tussen renale en niet-renale bloedingen, door het aantonen van verschil in sedimentatiesnelheid van renale en niet-renale erythrocyten na eventuele agglutinatie met behulp van antistoffen tegen het humane Tamm-Horsfall eiwit, gevolgd door antistoffen tegen deze antistoffen, waarna de al of niet geagglutineerde erythrocyten over een filter, of door een kolom gevuld met glasparels of een gel, worden geleid, waarbij door middel van een kleine (centrifugale) kracht de erythrocyten door het filter of de kolom moeten diffunderen indien geen agglutinatie optreedt, en waarbij de beoordeling van het resultaat visueel of microscopisch kwantitatief plaats kan vinden.

Verhoogde aantallen erythrocyten in urine, genoemd hematurie, kunnen komen vanuit elk deel van het urinair of genitaal systeem en kunnen duiden op slechts verhoogde lichamelijke inspanning of menstruele bloedingen. Ernstige oorzaken van hematurie zijn glomerulonefritis, polycystische nieren, carcinoma, stenen, bloedingsneigingen, infecties of trauma. Hematurie wordt altijd gevonden bij acute glomerulonefritis en subacute bacteriële endocarditis, hypertensie en pyelonefritis. Hematurie kan ook gevonden worden bij een nierinfarct. Daarnaast kan elk ander deel van het urinair en genitaal systeem, zoals urineleiders en blaas, ernstige bloedingen vertonen. In de praktijk is de exacte diagnose moeilijk te stellen en men is al tevreden indien men kan vaststellen of de erythrocyten in urine van renale of niet-renale origine zijn. Men wil dus de locatie van bloedingen in het urinair systeem kunnen karakteriseren, daar deze bijzonder belangrijk is voor het instellen en vervolgen van therapie.

Voor het aantonen van renale en niet-renale erythrocyten gebruikt men verschillende technieken, zoals microscopische beoordeling van de erythrocyten, of immunoperoxidase kleuring van erythrocyten in urine op het Tamm-Horsfall eiwit. Erythrocyten die afkomstig zijn van een bloeding uit de nier (in deze uitvinding renale erythrocyten genoemd) zijn beladen met het zogenaamde Tamm-Horsfall eiwit. Erythrocyten in urine van niet renale afkomst (in deze uitvinding niet-renale erythrocyten genoemd) zijn vrij van dit eiwit. De microscopische beoordeling heeft als nadeel dat de vorm en grootte van de erythrocyten, waarop wordt beoordeeld, sterk afhankelijk zijn van de osmotische druk van de urine, tijdstip van urinelozing, bewaartijd en bewaarcondlties van de urine. De immunoperoxidase kleuring heeft als nadeel dat deze methode zeer bewerkelijk, tijdrovend en derhalve duur is.

Onderstaande werkwijze heeft als voordeel dat zij zeer snel, betrouwbaar, specifiek en onafhankelijk is van de osmotische druk van de urine, tijdstip van lozing, bewaartijd en bewaarcondities van de urine. Hierdoor is de werkwijze bij voorkeur geschikt voor een spoedbepaling, hetgeen uitermate goed aansluit bij het klinisch beeld van de patiënt.

Hiertoe wordt volgens de uitvinding een portie urine met een verhoogde concentratie aan erythrocyten gecentrifugeerd, waarbij de erythrocyten sedimenteren. Vervolgens worden de erythrocyten een drietal malen gewassen met een (gebufferde) fysiologische zout oplossing om overmaat vrij Tamm-Horsfall eiwit, dat in grote hoeveelheden in vrije vorm in de urine voorkomt, weg te wassen. Na de laatste wasbeurt wordt een erythrocytensuspensie gemaakt van een bepaalde sterkte. Van deze erythrocytensuspensie worden enkele microliters géincubeerd met enkele microliters van een oplossing die antistoffen tegen het humaan Tamm-Horsfall eiwit bevat Deze anti humaan Tamm-Horsfall antistoffen hebben een hoge specificiteit en affiniteit voor het humaan Tamm-Horsfall eiwit. In de werkwijze is de titer van de antistoffen tegen humaan Tamm-Horsfall eiwit belangrijk en derhalve moet deze bekend zijn.

Na enkele minuten incuberen bij 37 °C worden enkele microliters van een oplossing, die antistoffen tegen humaan Tamm-Horsfall antistoffen bevatten toegevoegd. Deze antistoffen hebben een hoge specificiteit en affiniteit voor de antistoffen tegen humaan Tamm-Horsfall eiwit en de titer van de oplossing moet bekend zijn. Na enkele minuten incuberen bij 37 °C wordt het mengsel boven op een filter, glasparels of korrels van een gel in een kolom of buisje gebracht. Na het uitoefenen van een kleine centrifugale kracht met behulp van een centrifuge wordt getracht de erythrocyten door de glasparels of gel te laten sedimenteren. Vindt er geen of slechts geringe sedimentatie plaats dan is er agglutinatie opgetreden van de erythrocyten door koppelingen met Tamm-Horsfall antistoffen met het Tamm-Horsfall eiwit aan de erythrocyt en door antistoffen tegen de Tamm-Horsfall antistoffen. De conclusie die dan getrokken kan worden is dat de geagglutineerde erythrocyten het Tamm-Horsfall eiwit bevatten en derhalve van renale origine moeten zijn.

Sedimenteren de erythrocyten door de glasparels of korrels dan bevatten zij niet het Tamm-Horsfall eiwit en zijn zij afkomstig van andere delen van het urinair systeem dan de nieren.

De gehele procedure is schematisch weergegeven in de figuren 1 tot en met 8.

Figuur 1 laat schematisch een erythrocyten suspensie zien, verkregen uit urine nadat de erythrocyten [1] meerdere keren gewassen zijn met een zout oplossing. De erythrocyten zijn van niet renale origine, waardoor zij niet beladen zijn met het Tamm-Horsfall eiwit.

Figuur 2 laat schematisch de toevoeging van antistoffen gericht tegen het Tamm-Horsfall eiwit zien. Deze Tamm-Horsfall antistoffen [2] vinden aan de erythrocyten [1] uit figuur 1 geen epitoop om zich te binden en blijven derhalve vrij in oplossing.

Figuur 3 laat schematisch de toevoeging aan het mengsel uit figuur 2 zien van antistoffen gericht tegen Tamm-Horsfall antistoffen. Deze anti Tamm-Horsfall antistoffen [3] binden met Tamm-Horsfall antistoffen [2]. Dit complex laat de erythrocyten [1] ongemoeid.

Figuur 4 laat schematisch een erythrocyten suspensie zien, verkregen uit urine nadat de erythrocyten [4] meerdere keren gewassen zijn met een zout oplossing. De erythrocyten zijn van renale origine waardoor zij in de nier in de opstijgende lus van Henle beladen zijn met het Tamm-Horsfall eiwit [5],

Figuur 5 laat schematisch de toevoeging van antistoffen gericht tegen het Tamm-Horsfall eiwit zien. Deze Tamm-Horsfall antistoffen [6] vinden aan de erythrocyten [4] uit figuur 4 een epitoop om zich te binden.

Figuur 6 laat schematisch de toevoeging aan het mengsel uit figuur 5 zien van antistoffen gericht tegen Tamm-Horsfall antistoffen. Deze anti Tamm-Horsfall antistoffen [7] binden met Tamm-Horsfall antistoffen [6]. Deze binding koppelt de erythrocyten [4] aan elkaar, waardoor er agglutinatie optreedt.

Figuur 7 laat schematisch de filtratie van het mengsel verkregen bij figuur 3 zien. De niet-renale erythrocyten en de twee soorten antistoffen kunnen de poriën van het filter passeren. De poriegrootte van het filter is daarvoor aangepast aan de grootte van de erythrocyt Figuur 8 laat schematisch de filtratie van het mengsel verkregen bij figuur 6 zien. Omdat er agglutinatie is opgetreden passeren de erythrocyten het filter niet.

De Tamm-Horsfall antistoffen schematisch weergegeven in de figuren 2,3 en 5 t/m 8 met de nummers 2 en 6 komen uit dezelfde stock oplossing en zijn derhalve precies hetzelfde qua karakter, aviditeit, affiniteit, specificiteit, titer en sterkte.

De anti Tamm-Horsfall antistoffen schematisch weergegeven in de figuren 3 en 6 t/m 8 met de nummers 3 en 7 komen uit dezelfde stock oplossing en zijn derhalve precies hetzelfde qua karakter, aviditeit, affiniteit, specificiteit, titer en sterkte.

Thans zijn er twee systemen op de markt die gebruik maken van het verschil in sedimentatiesnelheid van geagglutineerde en niet geagglutineerde erythrocyten door kolommen, te weten Diamed-ID van de firma Dialab, die gebruik maakt van een gel en de BioVeu van de firma Ortho, die gebruik maakt van glasparels.

De bovenstaande werkwijze kan bij voorkeur uitgevoerd worden met beide systemen, waarbij de incubaties van de erythrocytensuspensie met de desbetreffende antistoffen direkt bovenop de glasparels of gel van beide systemen kan worden uitgevoerd, alwaar ook de eventuele agglutinatie plaats kan vinden.

Bij mengpopulaties van renale en niet-renale erythrocyten kan het percentage van de afzonderlijke fracties worden bepaald door de geagglutineerde fractie en de fractie die sedimenteert tot op de bodem, afzonderlijk over te brengen in verschillende buizen. Vervolgens wordt het hemoglobine gehalte van elke buis bepaald. Deze gehalte meting kan op verschillende manieren worden uitgevoerd.

Een variatie op bovenstaande tweestappenmethode is de eenstapsmethode, waarbij aan de gewassen erythrocyten-suspensie kleine bolletjes worden toegevoegd, waaraan de Tamm-Horsfall antistoffen zijn gekoppeld met behulp van bekende koppelingstechnieken. Bij toevoeging van de bolletjes met Tamm-Horsfall antistoffen aan renale erythrocyten vindt dan in één stap agglutinatie plaats, doordat meerdere erythrocyten aan meerdere bolletjes koppelen, door middel van bindingen van het Tamm-Horsfall eiwit met Tamm-Horsfall antistoffen).

Claims (6)

1. Werkwijze voor het maken van onderscheid tussen renale en niet-renale bloedingen met behulp van cytochemische agglutinatie, door een erythrocytensuspensie, verkregen uit urine, na sedimentatie, wassen, en resuspenderen, achtereenvolgens te laten incuberen met antistoffen gericht tegen het Tamm-Horsfal! eiwit en antistoffen tegen deze antistoffen bij een zekere temperatuur, gedurende een bepaalde tijd, waarbij agglutinatie optreedt indien de erythrocyten in de opstijgende lus van Henle in aanraking zijn gekomen met het Tamm-Horsfall eiwit en derhalve van renale oorsprong zijn, en geen agglutinatie optreedt indien de bloeding zijn oorsprong heeft in andere delen van het urinair systeem.

2. Werkwijze volgens conclusie 1 met het kenmerk dat met behulp van filtratie geagglutineerde erythrocyten gescheiden kunnen worden van niet geagglutineerde erythrocyten.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 met het kenmerk dat met behulp van glasparels geagglutineerde erythrocyten gescheiden kunnen worden van niet geagglutineerde erythrocyten.

4. Werkwijze volgens conclusie 1 met het kenmerk dat met behulp van een gel geagglutineerde erythrocyten gescheiden kunnen worden van niet geagglutineerde erythrocyten.

5. Werkwijze volgens voorgaande conclusies met het kenmerk dat het resultaat visueel of microscopisch kwantitatief kan worden beoordeeld.

6. Werkwijze volgens voorgaande conclusies met het verschil dat agglutinatie van renale erythrocyten door middel van Tamm-Horsfall antistoffen gekoppeld aan kleine bolletjes wordt teweeggebracht, zonder toevoeging van antistoffen tegen Tamm-Horsfall antistoffen, waardoor een éénstapsmethode in plaats van een twees tappenmethode ontstaat.