NL9401153A

NL9401153A - Method for breeding and propagating male sterile plants

Info

Publication number: NL9401153A
Application number: NL9401153A
Authority: NL
Original assignee: Sakata Seed Corp
Priority date: 1993-07-14
Filing date: 1994-07-12
Publication date: 1995-02-01
Also published as: NL194904B; NL194904C

Abstract

Method for breeding and propagating a male sterile plant, comprising the backcrossing of a plant which has male sterility obtained by protoplast vision techniques based on a somatic hybrid plant cell which carries a cytoplasm which transmits male sterility and a nucleus of a plant belonging to Brassica oleracea or a nucleus of a hybrid plant between a plant belonging to Brassica oleracea and a plant belonging to Brassica campestris with a plant belonging to Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica Napus or Brassica Juncea to breed a male sterile plant belonging to Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica Napus or Brassica juncea which carries the abovementioned cytoplasm transmitting male sterility, and to a highly pure nucleus of a plant belonging to said Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica Napus or Brassica juncea. <IMAGE>

Description

Titel: Werkwijzen voor het kweken en het zich doen voortplanten van mannelijke steriele plantenTitle: Methods of Growing and Reproducing Male Sterile Plants

ACHTERGROND VAN DE UITVINDINGBACKGROUND OF THE INVENTION

Deze uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een plant waarvan de mannelijke voortplantingsorganen niet functioneel aanwezig zijn. Deze planten worden hierin verder mannelijke steriele planten genoemd.This invention relates to a method of preparing a plant in which the male reproductive organs are not functionally present. These plants are further referred to herein as male sterile plants.

Met niet functioneel aanwezig zijn wordt bedoeld dat op het moment dat de vrouwelijke geslachtsorganen van een plant rijp zijn, er geen mannelijke functionele geslachtsorganen of stuifmeelkorrels van dezelfde plant aanwezig zijn. Hoe dit berekt kan worden, wordt hier onder uitgelegd.By not being functionally present is meant that when the female genital organs of a plant are ripe, no male functional genital organs or pollen grains of the same plant are present. How this can be calculated is explained below.

Deze planten worden bereid met het doel om het met zichzelf kruisen van tweeslachtige planten te voorkomen. Het niet met zichzelf kunnen kruisen van planten wordt wel in zichzelf onverenigbaarheid genoemd. De onderhavige uitvinding voorziet dus in een manier om in dergelijke planten, speciaal van de familie cruciferae (brassicaceae), met name van het geslacht Brassica, te voorzien.These plants are prepared for the purpose of preventing the crossing of androgynous plants by themselves. The inability to cross plants with themselves is called in itself incompatibility. Thus, the present invention provides a way to provide such plants, especially of the cruciferae (brassicaceae) family, especially of the genus Brassica.

Het nut van in zichzelf onverenigbare planten moge duidelijk zijn. Deze planten kunnen namelijk veel gerichte gekruist worden met andere raszuivere lijnen zonder dat er zelfbestuiving en dus planten (of zaad) zonder de gewenste gekruiste eigenschappen worden geproduceerd.The utility of incompatible plants may be clear. Namely, these plants can be crossed in a targeted manner with other purebred lines without self-pollination and thus plants (or seed) without the desired crossed properties being produced.

Volgens de uitvinding wordt dit bereikt door een werkwijze voor het bereiden van een plant waarvan de mannelijke voortplantingsorganen niet functioneel zijn, waarbij men een celfusie uitvoert tussen een cytoplasma dat zorg draagt voor de steriliteit van de mannelijke voortplantingsorganen en een raszuivere kern van een met dat cytoplasma verenigbare soort, of een hybride kern van twee raszuivere verenigbare soorten. Eventueel kunnen deze planten dan weer worden teruggekruist met andere raszuivere lijnen waarbij de mannelijke steriliteit behouden blijft.According to the invention, this is achieved by a method of preparing a plant whose male reproductive organs are not functional, in which a cell fusion is performed between a cytoplasm that ensures the sterility of the male reproductive organs and a pure-bred nucleus of one containing that cytoplasm compatible species, or a hybrid core of two purebred compatible species. Optionally, these plants can then be backcrossed with other purebred lines, while maintaining male sterility.

(1) Als gevolg van de snelle ontwikkeling van plantbiotechnologie in recente jaren zijn er verscheidene middelen voor het verbeteren van plantvariëteiten ontwikkeld. Bij deze middelen voor het verbeteren van plantvariëteiten neemt een mannelijke steriele voorraad een zeer belangrijke plaats in. Bijvoorbeeld het verzamelen van zaad van een F^- hybride van een groente die tot de familie van de Cruciferae behoort wordt over het algemeen uitgevoerd door gebruik te maken van een "in zichzelf onverenigbaar" inteeltlijn waarin bevruchting niet normaal wordt uitgevoerd als gevolg van het feit dat stuifmeel niet kiemt, de stuifmeelbuis niet kan uitgroeien in de stamper, de groeisnelheid van de stuifmeelbuis verlaagd of onderbroken wordt, enz. ondanks bestuiving, omdat een dergelijke lijn hoewel zij monoklineus is en de reproductieve organen van beide sexen zich gelijktijdig ontwikkelen, onverenigbaar is. Niettemin is het bekend dat er sommige inteeltlijnen zijn waarvan het moeilijk is om de gewenste F^-hybrides op efficiënte wijze te verkrijgen, omdat zij zwak zijn in die "met zichzelf onverenigbaarheid" hoewel zij in hun praktische eigenschappen persé uitstekend zijn. Wanneer de produktie van een F^-hybride onder gebruikmaking van een mannelijke steriele voorraad als vrouwelijke ouder gewenst wordt in dergelijke gevallen, wordt er geen stuifmeel geproduceerd door gezegde vrouwelijke ouder en kan dientengevolge de efficiënte produktie van een F^“ hybride as bovenbeschreven worden bereikt.(1) As a result of the rapid development of plant biotechnology in recent years, various means of improving plant varieties have been developed. A male sterile stock occupies a very important place in these means for improving plant varieties. For example, seed collection of an F ^ hybrid from a vegetable belonging to the Cruciferae family is generally performed using an "incompatible" inbreeding line in which fertilization is not normally performed due to the fact that pollen does not germinate, the pollen tube cannot grow out in the pistil, the growth rate of the pollen tube is reduced or interrupted, etc. despite pollination, because such a line, although monoclinic and the reproductive organs of both sexes developing simultaneously, is incompatible . Nevertheless, it is known that there are some inbreeding lines which are difficult to efficiently obtain the desired F 2 hybrids because they are weak in that "self-incompatible" although they are per se excellent in their practical properties. When the production of an F1 hybrid is desired using a male sterile stock as a female parent in such cases, no pollen is produced by said female parent and consequently the efficient production of an F1 hybrid axis can be achieved as described above. .

(2) Met betrekking tot gezegde produktie van een mannelijke steriele voorraad worden tegenwoordig de volgende nadelen aangewezen.(2) With regard to said production of a male sterile supply, the following disadvantages are presently identified.

Als één van de middelen voor het produceren van een mannelijke steriele plant kan de kernsubstitutietehcniek worden genoemd waarbij een kern van een reeds gevestigde mannelijke steriele plant wordt vervangen door een kern van een gewenste plant.As one of the means of producing a male sterile plant, the core substitution technique may be mentioned in which a core of an already established male sterile plant is replaced with a core of a desired plant.

Volgens deze "kernsubtitutietechniek", wordt een mitochondriaal DNA bekend als een genetische bron van mannelijke steriliteit in het cytoplasma bewaard, waardoor de mannelijke steriliteit persé bewaard blijft.According to this "nuclear substitution technique", a mitochondrial DNA known as a genetic source of male sterility is preserved in the cytoplasm, thereby necessarily preserving male sterility.

Niettemin met betrekking ook tot een chloroplast waarvan bekend is dat die z'n eigen genen bevat die een serieuze invloed uitoefenen op de expressie van de kenmerken van een plant, blijft ook de chloroplast van gezegde mannelijke steriele voorraad als een oudervoorraad gelijktijdig bewaard. Dientengevolge in het geval dat een mannelijke steriele voorraad als een oudervoorraad niet verwant is aan een voorraad die een kern biedt, dan zijn er gevallen waarin een onvoordelig fenomeen voor de produktie van een plant wordt opgewekt door de interactie tussen gezegde chloroplast en gezegde celkern.Nevertheless, also with regard to a chloroplast known to contain its own genes which seriously affect the expression of the characteristics of a plant, the chloroplast of said male sterile stock is also preserved simultaneously as a parent stock. Accordingly, in the case where a male sterile stock as a parent stock is unrelated to a stock that provides a core, there are instances when an unfavorable phenomenon for plant production is generated by the interaction between said chloroplast and said cell nucleus.

Bijvoorbeeld in het geval dat een "kern gesubstitueerd type (Ogura) Brassica campestris" wordt geproduceerd onder gebruikmaking van het Ogura cytoplasma van een Japanse radijs [Ogura, H; Mem. Pac. Agri., Kagoshima Univ., vol. 6, pp. 39-78 (1968)] als het cytoplasma dat voorziet in mannelijke steriliteit en een kern van een plant behoren tot Brassica campestris vertegenwoordigt door een Chinese kool als een kern, dan leedt gezegde plant aan chlorosis bij lage temperaturen. Daarenboven wordt de groei van necatariën in gezegde plant niet gezien, zodat het moeilijk wordt om een insect zoals een honingbij of dergelijke aan te trekken die een rol hebben bij het transporteren van stuifmeel. Dientengevolge lijkt het moeilijk om te zeggen dat gezegde plant een gunstige voorraad is om te worden ontwikkeld.For example, in the case where a "core substituted type (Ogura) Brassica campestris" is produced using the Ogura cytoplasm of a Japanese radish [Ogura, H; Mem. Pac. Agri., Kagoshima Univ., Vol. 6, pp. 39-78 (1968)] If the cytoplasm that provides male sterility and a plant core belong to Brassica campestris represented by a Chinese cabbage as a core, then said plant suffers from low temperature chlorosis. In addition, the growth of necatia in said plant is not seen, so that it becomes difficult to attract an insect such as a honey bee or the like which have a role in transporting pollen. As a result, it seems difficult to say that said plant is a favorable stock to develop.

(3) Vervolgens tussen de bovengenoemde Ogura radijscel en een plant behorend tot Brassica Napus (koolzaad, is het bestudeerd om een somatische hybride te gebruiken die geproduceerd kan worden door het fuseren van protoplast van gezegde planten als een mannelijke steriele voorraad [Pelletier et al., Mol. Gen. Genet., vol. 191, blz. 244-250 (1983)].(3) Then, between the above-mentioned Ogura radish cell and a plant belonging to Brassica Napus (rapeseed, it has been studied to use a somatic hybrid that can be produced by fusing protoplast from said plants as a male sterile stock [Pelletier et al. , Mol Gen Genet, vol. 191, pp. 244-250 (1983)].

In een dergelijke somatisch hybride, waarbij de mannelijke steriliteit van de Ogura radijscel behouden blijft, tegelijkertijd waarmee een chloroplast afgeleid van de Ogura radijscel afvalt en alleen een chloroplast van een plant behorend tot het bovengenoemde genus Brassica behouden blijft. Als een resultaat hiervan, heeft gezegde somatische hybride voordelen doordat de bovengenoemde chlorosis en onbevredigende groei van nectariën onherkenbaar worden.In such a somatic hybrid, whereby the male sterility of the Ogura radish cell is maintained, at the same time with which a chloroplast derived from the Ogura radish cell falls off and only a chloroplast of a plant belonging to the aforementioned genus Brassica is retained. As a result, said somatic hybrid has advantages in that the aforementioned chlorosis and unsatisfactory nectarine growth become unrecognizable.

Niettemin is er een grens aan het soort plant behorend tot het genus Brassica dat toegepast kan worden in bovengenoemde protoplastfusie uit technisch oogpunt. Daarom is het op dit moment moeilijk om een mannelijke steriele somatische hybride vrijelijk te produceren, hetgeen een kweker wil, direct middels de bovengenoemde protoplastfusietechnieken.Nevertheless, there is a limit to the type of plant belonging to the genus Brassica that can be used in the above protoplast fusion from a technical point of view. Therefore, it is currently difficult to freely produce a male sterile somatic hybrid, which is what a breeder wants, directly using the above protoplast fusion techniques.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDINGSUMMARY OF THE INVENTION

Dientengevolge ligt het probleem dat op te lossen is met de onderhavige uitvinding in het voorzien in een nieuwe methode voor het kweken van een plant welke methode gebruik maakt van een mannelijke steriele voorraad die de bovengenoemde uitstekende karakteristieken bezit en die het mogelijk maakt om een dergelijke somatische hybride die mannelijke steriliteit bezit vrijelijk te produceren zoals een kweker wil.As a result, the problem to be solved with the present invention is to provide a new method of growing a plant which utilizes a male sterile stock which has the above excellent characteristics and which allows such somatic hybrid that has male sterility to freely produce as a grower wants.

De onderhavige uitvinders hebben een intensieve bredere en diepere studie gemaakt om het bovenstaande probleem op te lossen. Als een resultaat daarvan, hebben zij gevonden dat het mogelijk is om een plant te produceren behorend tot het genus Brassica die de gezegde gewenste karakteristieke behoud en die tegelijkertijd de mannelijke steriliteit bruikbaar voor de produktie van een -hybride bij het terugkruisen van gezegd somatisch hybride met een gewenste plant van het genus Brassica behoud.The present inventors have made an intensive broader and deeper study to solve the above problem. As a result of this, they have found that it is possible to produce a plant belonging to the genus Brassica which retains the saying desired characteristic and at the same time manly sterility useful for the production of a hybrid when backcrossing said aromatic hybrid with preserving a desired plant of the genus Brassica.

Dat wil zeggen de strekking van de onderhavige uitvinding ligt in de volgende zaken.That is, the scope of the present invention lies in the following matters.

(1) Een methode voor het kweken van een mannelijke steriele plant, omvattende het terugkruisen van een plant die mannelijke steriliteit bezit verkregen door protoplastfusietechnieken gebaseerd op een somatische hybride plantcel die het cytoplasma draagt dat mannelijke steriliteit veroorzaakt alsmede een kern van een plant behorend tot Brassica oleracea of een kern van een hybrideplant tussen een plant behorend tot Brassica oleracea en een plant behorend tot(1) A method of growing a male sterile plant comprising backcrossing a plant possessing male sterility obtained by protoplast fusion techniques based on a somatic hybrid plant cell carrying the cytoplasm causing male sterility as well as a plant core belonging to Brassica oleracea or a core of a hybrid plant between a plant belonging to Brassica oleracea and a plant belonging to

Brassica campestris met een plant behorend tot Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica Napus of Brassica iuncea om een mannelijke steriele plant te kweken behorend tot Brassica oleracea , Brassica campestris, Brassica Napus of Brassica iuncea die het bovenstaande cytoplasma dat mannelijke steriliteit overbrengt draagt tezamen met een hoog zuivere kern van een plant behorend tot gezegde Brassica oleracea. Brassica campestris, Brassica Napus of Brassica juncea.Brassica campestris with a plant belonging to Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica Napus or Brassica iuncea to cultivate a male sterile plant belonging to Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica Napus or Brassica iuncea carrying the above cytoplasm that transmits male sterility together with a highly pure core of a plant belonging to the saying Brassica oleracea. Brassica campestris, Brassica Napus or Brassica juncea.

(2) Een werkwijze voor het kweken van een mannelijke steriele plant volgens het bovenstaande (1), waarin het cytoplasma dat mannelijke steriliteit overbrengt een cytoplasma is verkregen door het recombineren van het Ogura cytoplasma.(2) A method of cultivating a male sterile plant according to the above (1), wherein the cytoplasm that transfers male sterility to a cytoplasm is obtained by recombining the Ogura cytoplasm.

(3) Een methode voor het zich doen voortplanten van een mannelijke steriele plant, omvattende het terugkruisen van een plant die mannelijke steriliteit verkregen door protuplastfusietechnieken gebaseerd op een somatische hybrideplantcel die een cytoplasma dat mannelijke steriliteit overdraagt bezit, tezamen met een kern van een plant behoren tot Brassica oleracea of een kern van een hybrideplant tussen een plant behorend tot Brassica oleracea en een plant behorend tot Brassica campestris met een plant behorend tot Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica Napus of Brassica Λuncea om een mannelijke steriele plant te kweken behorend tot Brassica oleracea. Brassica campestris, Brassica Napus of Brassica iuncea die het bovenstaande cytoplsma dat mannelijke steriliteit overbrengt draagt tezamen met een hoog zuivere kern van een plant behorend tot gezegde Brassica olearacea, Brassica campestris, Brassica Napus of Brassica juncea.(3) A method of propagating a male sterile plant, comprising backcrossing a plant that possesses male sterility obtained by protuplast fusion techniques based on a somatic hybrid plant cell that has a cytoplasm that transmits male sterility, together with a core of a plant to Brassica oleracea or a core of a hybrid plant between a plant belonging to Brassica oleracea and a plant belonging to Brassica campestris with a plant belonging to Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica Napus or Brassica Λuncea to cultivate a male sterile plant belonging to Brassica oleracea . Brassica campestris, Brassica Napus or Brassica iuncea bearing the above cytoplsma that conveys male sterility together with a high purity core of a plant belonging to say Brassica olearacea, Brassica campestris, Brassica Napus or Brassica juncea.

(4) Een werkwijze voor het zich doen voortplanten van een mannelijke steriele plant als in het bovenstaande (3) beschreven, waarin het cytoplasma dat mannelijke steriliteit overbrengt een cytoplasma is verkregen door het recombineren van het Ogura cytoplasma.(4) A method of reproducing a male sterile plant as described above (3), wherein the cytoplasm transmitting male sterility is a cytoplasm obtained by recombining the Ogura cytoplasm.

Volgens de onderhavige uitvinding wordt voorzien in een nieuwe methode voor het kweken van planten onder gebruikmaking van een mannelijke steriele plantvoorraad die uitstekende eigenschappen bezit, die het mogelijk maakt om een dergelijke somatische hybride die mannelijke steriliteit bezit te produceren als de kweker wenst.According to the present invention, there is provided a new method of growing plants using a male sterile plant stock that has excellent properties, which makes it possible to produce such a somatic hybrid that has male sterility if the grower desires.

KORTE BESCHRIJVING VAN DE FIGURENBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

Fig. 1 laat de oorsprong van elke PCR primer (sonde) zien.Fig. 1 shows the origin of each PCR primer (probe).

Fig. 2 is een elektroforesepatroon (1) die de resultaten van RFLP in mitochondriale DNA's van mannelijke steriele lijnen verkregen door protoplastfusie laat zien (zonder ATPA).Fig. 2 is an electrophoresis pattern (1) showing the results of RFLP in mitochondrial DNAs from male sterile lines obtained by protoplast fusion (without ATPA).

Fig. 3 is een elektroforesepatroon (2) dat de resultaten van RFLP in mitochondriale DNA's van mannelijke steriele lijnen verkregen door protoplastfusie laat zien (zonder, atp 6).Fig. 3 is an electrophoresis pattern (2) showing the results of RFLP in mitochondrial DNAs from male sterile lines obtained by protoplast fusion (without, atp 6).

Fig. 4 is een elektroforesepatroon dat de resultaten van RFLP in chloroplast DNA's van mannelijke steriele lijnen verkregen door protoplastfusie laat zien (sonde, EcoRI fragment van een chloroplast DNA).Fig. 4 is an electrophoresis pattern showing the results of RFLP in chloroplast DNAs from male sterile lines obtained by protoplast fusion (probe, EcoRI fragment from a chloroplast DNA).

Fig. 5 is een elektroforesepatroon (3) dat de resultaten vai RFLP in mitochondriale DNA's van mannelijke steriele lijnen verkregen door protoplastfusie laat zien [sonde, cox I (+ atp A)' Fig. 6 is een elektroforesepatroon (4) dat de resultaten vai RFLP in mitochondriale DNA's van mannelijke steriele lijnen verkregen door protoplastfusie laat zien (sonde, cox I (+ atp A) Fig. 7 is een elektroforesepatroon (5) dat de resultaten vai RFLP in mitochondriale DNA's van mannelijke steriele lijnen verkregen door protoplastfusie laat zien (sonde, atp A).Fig. 5 is an electrophoresis pattern (3) showing the results of RFLP in mitochondrial DNAs from male sterile lines obtained by protoplast fusion [probe, cox I (+ atp A)]. 6 is an electrophoresis pattern (4) showing the results of RFLP in mitochondrial DNAs from male sterile lines obtained by protoplast fusion (probe, cox I (+ atp A). Fig. 7 is an electrophoresis pattern (5) showing the results of RFLP in mitochondrial Shows DNAs from male sterile lines obtained by protoplast fusion (probe, atp A).

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDINGDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Hieronder wordt de onderhavige uitvinding in detail beschreven.The present invention is described in detail below.

A. Produktie van een plant die mannelijke steriliteit bezit gebaseerd op een somatisch hybride verkregen door protoplastfusietechnieken die een cytoplasma dat mannelijke steriliteit draagt overbrengt alsmede een kern van een plant behorend tot Brassica oleracea of een kern van een hybrideplant tussen een plant behorend tot Brassica oleracea en een plant behorend tot Brassica campestris.A. Production of a plant that has male sterility based on a somatic hybrid obtained by protoplast fusion techniques that transfers a cytoplasm that carries male sterility as well as a core of a plant belonging to Brassica oleracea or a core of a hybrid plant between a plant belonging to Brassica oleracea and a plant belonging to Brassica campestris.

Als voorbeelden van "een plant behorend tot Brasslca oleracea" waaruit een somatische hybridecel kan worden bereid door volledig gebruik te maken van protoplast fusietechnieken worden hier als bijzonder geschikte planten genoemd, een kool, een broccoli, een bloemkool, een decoratieve boerenkool, spruitjes, een koolrabi, spinazi, een kairan (de albograbragroep van Brassica oleracea L.), een boerenkool, waaronder "Kinkei 210", een Fl hybridevariëteit en de oude lijr. "F" (welke allebei zijn geproduceerd door SAKATA SEED CORPORATION) omdat cellen van gezegde planten makkelijk geïsoleerd worden als protoplasten om gefuseerd te worden met andere protoplasten.As examples of "a plant belonging to Brasslca oleracea" from which a somatic hybrid cell can be prepared by making full use of protoplast fusion techniques are mentioned here as particularly suitable plants, a cabbage, a broccoli, a cauliflower, a decorative kale, Brussels sprouts, a kohlrabi, spinazi, a kairan (the albograbra group of Brassica oleracea L.), a kale including "Kinkei 210", an Fl hybrid variety and the old lijr. "F" (both of which are produced by SAKATA SEED CORPORATION) because cells from said plants are easily isolated as protoplasts to be fused with other protoplasts.

Als voorbeelden van "een somatische hybrideplant tussenplanten behorend tot het genus Brassica" waaruit gezegde somatische hybridecel kan worden bereid door volledig gebruik te maken van protoplast fusietechnieken, kunnen worden genoemd een hakuran (kunstmatig gesynthetiseerde Brassica Napus.). die bekend is als een interspecies hybride van een hybride van een kool en een Chinese kool en dergelijke. Het is bekend geweest dat het van oorsprong moeilijk is om de protoplastfusietechnieken volledig toe te passen op hun Chinese kool behorend tot Brassica campestris [Jourdan, P. & E. D. Earle; J. Amer. Hort. Sci., vol. 114, blz. 343-349 (1989)]. Het verdient daarom de voorkeur om een Hakuran te gebruiken als "een somatische hybrideplant tussen planten behorend tot het genus Brassica" waarop protoplast fusietechnieken volledig kunnen worden toegepast volgens de onderhavige kweekmethoden omdat het een overbruggingsplant kan zijn voor het produceren van een mannelijke steriele Chinese kool.As examples of "a somatic hybrid plant interplants belonging to the genus Brassica" from which said somatic hybrid cell can be prepared by making full use of protoplast fusion techniques, mention can be made of a hakuran (artificially synthesized Brassica Napus.). which is known as an interspecies hybrid of a hybrid of a cabbage and a Chinese cabbage and the like. It has been known that it is originally difficult to fully apply the protoplast fusion techniques to their Chinese cabbage belonging to Brassica campestris [Jourdan, P. & E. D. Earle; J. Amer. Hort. Sci., Vol. 114, 343-349 (1989)]. It is therefore preferable to use a Hakuran as "a plant somatic hybrid plant belonging to the genus Brassica" to which protoplast fusion techniques can be fully applied according to the present cultivation methods because it can be a bridging plant to produce a male sterile Chinese cabbage.

Als voorbeelden van een cytoplasma dat mitochondria draagt die mannelijke steriliteit overbrengen, kunnen worden genoemd het Ogura cytoplasma bekend als gezegd cytoplasma afgeleid van een Japanse radijs, het SHIGA-THOMPSON cytoplasma en POLIMA cytoplasma bekend als gezegd cytoplasma afgeleid van een koolzaad, het ANANO cytoplasma bekend als gezegd cytoplasma afgeleid van een mosterdzaad, het MURALIS cytoplasma bekend als gezegd cytoplasma afgeleid vanAs examples of a cytoplasm carrying mitochondria that transmit male sterility, the Ogura cytoplasm known as said cytoplasm derived from a Japanese radish can be mentioned, the SHIGA-THOMPSON cytoplasm and POLIMA cytoplasm known as said rapeseed cytoplasm known as the ANANO cytoplasm as said cytoplasm derived from a mustard seed, the MURALIS cytoplasm known as said cytoplasm derived from

Diplotasis muralis enz. Onder deze mannelijke steriliteit overbrengende cellen, kan het Ogura cytoplasma genoemd worden als bijzonder voordelig omdat een zogenaamd restoratiegen, dat de fertiliteit van een plant herstelt, zeer zeldzaam tot expressie wordt gebracht zelfs als gezegd cytoplasma wordt overgebracht in een plant van het genus Brassica zodat de mannelijke steriliteit persé stabiel behouden kan blijven. Als protoplast fusietechnieken hetgeen technieken zijn voor het bereiden van een somatische hybridecel tussen aen plantcel behorend tot het bovengenoemde genus Brassica en een cel die een cytoplasma bezit dat mannelijke steriliteit overbrengt in de onderhavige uitvinding, kunnen gebruikelijke technieken die nu worden toegepast op plantencellen worden geadopteerd [Kao N.K. en M.R. Michayluk; Planta, vol. 115, blz. 355-367 (1974)] .Diplotasis muralis etc. Among these male sterility-transmitting cells, the Ogura cytoplasm can be termed as particularly advantageous because a so-called restoration gene, which restores the fertility of a plant, is very rarely expressed even if said cytoplasm is transferred into a plant of the genus Brassica so that male sterility per se can be stable. As protoplast fusion techniques, which are techniques for preparing a somatic hybrid cell between a plant cell belonging to the aforementioned genus Brassica and a cell possessing a cytoplasm that transfers male sterility in the present invention, conventional techniques now applied to plant cells can be adopted [ Kao NK and M.R. Michayluk; Planta, vol. 115, 355-367 (1974)].

In het bijzonder, worden celwanden verwijderd van plantencellen bedoeld om te worden gefuseerd om protoplasten te isoleren en dan worden gezegde protoplasten met elkaar gefuseerd. Als voorbeelden van fusiemethode in dit geval, kunnen worden genoemde de traditionele techniek gebruik makend van polyethyleenglycol als een fusogeen; de elektrofusietechniek omvattende het zich tot een parelketting laten vormen van protoplasten door elektriciteit en hierop direct stroom toe te passen. Wanneer de fusieefficiëntie in acht genomen wordt, dan kan de later genoemde elektrofusietechniek als de voordelige fusietechniek genoemd worden.In particular, cell walls of plant cells are intended to be fused to isolate protoplasts and then said protoplasts are fused together. As examples of fusion method in this case, mention can be made of the traditional technique using polyethylene glycol as a fusogen; the electrofusion technique comprising making protoplasts into a pearl chain by applying electricity and applying current directly to it. When the fusion efficiency is taken into account, the electrofusion technique mentioned later can be mentioned as the advantageous fusion technique.

Na het uitvoeren van protoplastfusie, kan gezegde fuseerde protoplast verder worden geïnduceerd tot een gewenste plant door het kweken van die gefuseerde protoplast volgens een op zich bekende methode. Bijvoorbeeld wordt de gefuseerde protoplast gekweekt in een callus kwekend medium bijvoorbeeld het Yamashita & Shimamoto's medium (Jpn. J. Breeding; vol. 34, supplement volume no. 2, blz. 30-3 (1984)] om kleine callus te bereiden, waarna gezegde kleine callus op regeneratiemedia worden geplaatst die worden bereid door het toevoegen van planthormonen zoals cytokinine en dergelijke aan verschillende basale media om de kleine callus te kweken en de gewenste planten te induceren.After performing protoplast fusion, said fused protoplast can be further induced into a desired plant by culturing said fused protoplast by a method known per se. For example, the fused protoplast is grown in a callus growing medium, for example the Yamashita & Shimamoto's medium (Jpn. J. Breeding; vol. 34, supplement volume no. 2, pp. 30-3 (1984)] to prepare small callus, after which said small callus are placed on regeneration media prepared by adding plant hormones such as cytokinin and the like to various basal media to grow the small callus and induce the desired plants.

Overigens, van welke hybridecellen de gefuseerde mytochondriale DNA's en chloroplast DNA's afkomstig zijn kan worden bevestigd door gezegde DNA's te extraheren en de enzymrestrictiepatronen daarvan te analyseren met de RFLP methode onder gebruikmaking van een bekende probe, of een vergelijkbare methode.Incidentally, from which hybrid cells the fused mytochondrial DNAs and chloroplast DNAs originate can be confirmed by extracting said DNAs and analyzing their enzyme restriction patterns by the RFLP method using a known probe, or a similar method.

B. Terugkruisen van een somatische hybrideplant voorzien van mannelijke steriliteit verkregen als eerder genoemd met een gewenste plant behorend tot Brassica oleracear Brassica campestris, Brassica Napus of Brassica iuncea om een mannelijke steriele plant te kweken behorend tot Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica Naous of Brassica iuncea die het bovengenoemde cytoplasma dat mannelijke steriliteit overbrengt draagt alsmede een hoog zuivere kern van een plant behorend tot gezegde Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica Napus of Brassica iuncea.B. Backcrossing a somatic hybrid plant with male sterility obtained as previously mentioned with a desired plant belonging to Brassica oleracear Brassica campestris, Brassica Napus or Brassica iuncea to cultivate a male sterile plant belonging to Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica Naous or Brassica iuncea bearing the above-mentioned cytoplasm that conveys male sterility as well as a high-purity core of a plant belonging to say Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica Napus or Brassica iuncea.

Gezegde terugkruising wordt uitgevoerd door het direct terug te kruisen van een somatische hybrideplant voorzien van mannelijke steriliteit verkregen als bovengenoemd met een plant behorend tot Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica Napus of Brassica iuncea waarvan de produktie gewenst is. Over de frequentie van zulke terugkruisingen valt het volgende te zeggen, de somatische hybrideplant komt dichter bij de pure lijn van een plant behorend tot het genus Brassica als een doel van het terugkruisen wanneer het terugkruisen meer frequent wordt herhaald. En met betrekking tot eigenschappen van het cytoplasma gedurende deze perioder die van moederplant blijven bewaard. Dat wil zeggen, de bovengenoemde mannelijke steriliteit blijft bewaard zoals hij is in nakomelingen planten ongeacht de frequentie van gezegde terugkruising. In een specifieke procedure voor de terugkruising, wordt de ovulecultuur gezamenlijk geadopteerd gedurende de eerste twee keren en daarna wordt gebruikelijke terugkruising uitgevoerd. Hoewel de frequentie van gezegde terugkruising afhangt van de mate van verwantschap tussen een somatische hybrideplant die mannelijke steriliteit bezit en een plant behorend tot gezegd genus Brassica die waarvan de produktie gewenst is en hoe zuiver de mannelijke steriele plant die geproduceerd moet worden bedoeld is, is het over het algemeen tenminste 5 keer, bij voorkeur ongeveer 7 keer.Said backcrossing is performed by directly backcrossing a somatic hybrid plant provided with male sterility obtained as mentioned above with a plant belonging to Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica Napus or Brassica iuncea the production of which is desired. As to the frequency of such backcrosses, the following can be said, the somatic hybrid plant comes closer to the pure line of a plant belonging to the genus Brassica as a target of backcrossing as the backcrossing is repeated more frequently. And with regard to properties of the cytoplasm during this period that of mother plant are preserved. That is, the aforementioned male sterility is preserved as it is in progeny plants regardless of the frequency of said back-crossing. In a specific backcrossing procedure, the ovule culture is co-adopted during the first two times and then conventional backcrossing is performed. Although the frequency of said backcrossing depends on the degree of relationship between a somatic hybrid plant that has male sterility and a plant belonging to said genus Brassica, the one whose production is desired and how pure the male sterile plant to be produced is intended to be. generally at least 5 times, preferably about 7 times.

Daarenboven kan de ovule cultuurmethode [Nishi et al.;In addition, the ovule culture method [Nishi et al .;

Jpn. J. Breed., vol. 8, blz. 215-222 (1959)] gezamenlijk worden geadopteerd in de bovenstaande terugkruising om efficiënt generaties nakomelingen te verkrijgen. In het geval in het bijzonder van het uitvoeren van een afgelegen hybridisatie van een plant tussen planten die niet congeen maar xenogeen zijn, dan is de bovenstaande gezamenlijke adoptie bevoorkeurt.Jpn. J. Breed., Vol. 8, pp. 215-222 (1959)] are co-adopted in the above backcross to efficiently generate generations of offspring. In particular, in case of performing a remote hybridization of a plant between plants that are not congenic but xenogenic, the above joint adoption is preferred.

Overigens is er geen restrictie voor een plant behorend tot Brassica,, Pleracea, Brassica campestris, Brassica Napus of Brassica iuncea als onderwerp van deze terugkruising voor zover het een plant is behorend tot gezegd genus Brassica. Als specifieke voorbeelden van de plant behorend tot Brassica oleracea, kunnen worden genoemd een kool, een broccola, een bloemkool, een decoratieve boerenkool, spruitjes, koolrabi, spinazi, een kairan (de albograbra groep van Brassica oleracea L.), een boerenkool, enz. Als specifieke voorbeelden van de plant behorend tot Brassica campestris kunnen worden genoemd een Chinese kool, een knol, een chingensai (Brassica rapa L. var. chinenis), een komatsuna (Brassica rapa L. var. pervidis), Nabana (Brassica rapa L. var. amplexicaulis), een Nozawana (Brassica rapa L. var. rapa), een geselecteerd nakomelingenschap van (een Chugokusaishin x een kunstmatig gesynthetiseerd koolzaad) enz. Als specifieke voorbeelden van de plant behorend tot Brassica Napus kunnen worden genoemd een koolzaad, een kunstmatig gesynthetiseerd koolzaad als een hybridisatie nakomelingenschap van (herfstgedicht x brocoli), enz. Als specifieke voorbeelden van de plant behorend tot Brassica iuncea kunnen worden genoemd een bladmosterd, een gekraagd bladmosterd, een oliebladmosterd, een takana (Brassica ~ïuncea Czern en Coss var. ineglifolia Kitamura), een zaasai (Brassica iuncea var. bulbifera Mas.), enz. Hieronder, een combinatie in een mannelijke steriele somatische hybrideplant als een ouderplant is kool-radijs-MS-2 en een plant als onderwerp van terugkruisen is diegene behorend tot Brassica oleracea, een combinatie waarin gezegd de mannelijke steriele somatische hybrideplant Hakuran MS-1 is en een plant als onderwerp van terugkruising is diegene behorend tot Brassica Napus, een combinatie waarin gezegde mannelijke steriele somatische hybrideplant Hakuran MS-2 is en een plant als onderwerp van terugkruisen is diegene behorend tot Brassica oleracea. en een combinatie waarin gezegde mannelijke steriele somatische hybrideplant Hakuran MS-3 is en een plant als onderwerp van terugkruising is diegene behorend tot Brassica campestris, zijn degene die de voorkeur verdienen vanwege eenvoud van terugkruisen.Incidentally, there is no restriction for a plant belonging to Brassica, Pleracea, Brassica campestris, Brassica Napus or Brassica iuncea as subject of this backcrossing insofar as it is a plant belonging to said genus Brassica. As specific examples of the plant belonging to Brassica oleracea, there can be mentioned a cabbage, a broccola, a cauliflower, a decorative kale, Brussels sprouts, kohlrabi, spinazi, a kairan (the albograbra group of Brassica oleracea L.), a kale, etc. As specific examples of the plant belonging to Brassica campestris can be mentioned a Chinese cabbage, a tuber, a chingensai (Brassica rapa L. var. Chinenis), a komatsuna (Brassica rapa L. var. Pervidis), Nabana (Brassica rapa L var. amplexicaulis), a Nozawana (Brassica rapa L. var. rapa), a selected progeny of (a Chugokusaishin x an artificially synthesized rapeseed) etc. As specific examples of the plant belonging to Brassica Napus can be mentioned a rapeseed, a artificially synthesized oilseed rape as a hybridization progeny of (autumn poem x brocoli), etc. As specific examples of the plant belonging to Brassica iuncea can be mentioned a leaf mustard, a collared leaf mustard, an oil leaf mustard, a takana (Brassica ~ ïuncea Czern and Coss var. ineglifolia Kitamura), a zaasai (Brassica iuncea var. bulbifera Mas.), etc. Below, a combination in a male sterile somatic hybrid plant as a parent plant is cabbage-radish MS-2 and a plant as subject of backcrossing is one of Brassica oleracea, a combination in which said the male sterile somatic hybrid plant is Hakuran MS-1 and a plant as subject of backcrossing is the one belonging to Brassica Napus, a combination in which said male sterile somatic hybrid plant is Hakuran MS-2 and a plant as subject of backcrossing is the one belonging to Brassica oleracea. and a combination in which said male sterile somatic hybrid plant is Hakuran MS-3 and a subject of backcross is the one belonging to Brassica campestris are the ones preferred for backcross simplicity.

VOORBEELDENEXAMPLES

Hieronder wordt de onderhavige uitvinding in meer detail beschreven verwijzend naar voorbeelden. Echter, de technische omvang van de onderhavige uitvinding is in geen geval restrictief geïnterpreteerd vanwege gezegde voorbeelden.The present invention is described in more detail below with reference to examples. However, the technical scope of the present invention has by no means been interpreted restrictively because of said examples.

Voorbeeld 1 (A) Produktie van een mannelijke steriele fusieplant van het genus Brassica 1) Isolatie van protoplasten die cytoplasma's bezitten die mannelijke steriliteit overbrengen.Example 1 (A) Production of a male sterile fusion plant of the genus Brassica 1) Isolation of protoplasts possessing cytoplasms that transmit male sterility.

Een Japanse radijs met mannelijk steriel cytoplasma (Ogura) of een kerngesubstitueerde Chinese kool voorzien van genoemde cytoplasma (Ogura) werden aseptisch bewaard en gekweekt in een kweekfles voor ongeveer 1 maand, gevolgd door het snijden van bladeren van de gekweekte planten. De gesneden bladeren werden behandeld met een enzymoplossing die 0,1 % Pectylase Y-23, 2 % Cellulase Onozuka R-10 en 0,5 M mannitol bevatte bij 28°C gedurende 2 uur. Vervolgens werden de protoplasten gezuiverd en geprepareerd onder gebruikmaking van gezegde enzymoplossing volgens een gebruikelijke methode [Nagata, T. en Takebe, I.; Planta, vol. 99, blz. 12 (1971)].A Japanese radish with male sterile cytoplasm (Ogura) or a nuclear substituted Chinese cabbage provided with said cytoplasm (Ogura) were aseptically stored and grown in a culture bottle for about 1 month, followed by cutting leaves from the cultivated plants. The cut leaves were treated with an enzyme solution containing 0.1% Pectylase Y-23, 2% Cellulase Onozuka R-10 and 0.5 M mannitol at 28 ° C for 2 hours. Then, the protoplasts were purified and prepared using said enzyme solution by a conventional method [Nagata, T. and Takebe, I .; Planta, vol. 99, p. 12 (1971)].

Met betrekking tot bovenstaande mannelijke steriele kern gesubstitueerde Chinese kool, werden protoplasten UV bestraald gedurende 120 tot 180 sec. onder gebruikmaking van een UV lamp op en schone tafel na zuivering en daarna onderworpen aan het volgende protoplast fusieproces.With respect to the above male sterile core substituted Chinese carbon, protoplasts were UV irradiated for 120 to 180 sec. using a UV lamp on a clean table after purification and then subjected to the following protoplast fusion process.

Met betrekking tot een Japanse radijs, werden de gezuiverde protoplasten als bovengenoemd direct onderworpen aan protoplastfusie.With respect to a Japanese radish, the purified protoplasts as above were directly subjected to protoplast fusion.

2) Bereiding van protoplasten van een plant van genus Brassica waarin de mannelijke steriele kenmerken worden overgebracht.2) Preparation of protoplasts from a plant of genus Brassica in which the male sterile characteristics are transferred.

Een blad was verzameld van een aseptische zaailing van een kool (Fj variëteit "Kinshi 201" of de ouderlijn daarvan "F"), waaruit protoplasten werden geprepareerd volgens de bovenstaande protoplastbereidingsmethode. Een volgens een dergelijke bereidingsmethode gezuiverde en geïsoleerde protoplasten werden behandeld door ze onder te dompelen in 7,5 mm aceetamide gedurende 15 min., te centrifugeren bij 800 touren per min. gedurende 3 min. om protoplasten te oogsten en dan te wassen met een W5 oplossing om de gewenste protoplasten te bereiden.A leaf was collected from an aseptic seedling of a cabbage (Fj variety "Kinshi 201" or its parent line "F") from which protoplasts were prepared according to the above protoplast preparation method. Protoplasts purified and isolated by such a preparation method were treated by immersing them in 7.5 mm acetamide for 15 min, centrifuging at 800 rpm for 3 min to harvest protoplasts and then washing with a W5 solution to prepare the desired protoplasts.

3) Protoplastfusie.3) Protoplast Fusion.

De protoplasten van een Japanse radijs met mannelijke steriele cytoplasma's (Ogura) verkregen in bovenstaande 1) en de jodoaceetamide behandelde kool protoplasten verkregen in bovenstaande 2) werden respectievelijk behandeld om een concentratie van 1 x 10^ cellen/ml te verkrijgen. Na het mixen van 1 ml porties van de respectievelijke protoplasten, werd 3 ml van een 33 %-ige polyethyleenglycol (hierna afgekort tot PEG) oplossing toegevoegd en werd gemengd.The protoplasts of a Japanese radish with male sterile cytoplasms (Ogura) obtained in the above 1) and the iodoacetamide treated charcoal protoplasts obtained in the above 2) were treated to obtain a concentration of 1 x 10 6 cells / ml, respectively. After mixing 1 ml aliquots of the respective protoplasts, 3 ml of a 33% polyethylene glycol (hereinafter shortened to PEG) solution was added and mixed.

Daarna werd een 0,1 M calciumchloride oplossing aan gezegd mengsel toegevoegd, gevolgd door fusie bij kamertemperatuur. Vervolgens werd het supernatant verwijderd, en de gefuseerde cellen werden gewassen met een CPW oplossing [Freason et al.; Dev. Biol. Vol. 33, blz. 130-137 (1973)] en onderworpen aan kweek.Then a 0.1 M calcium chloride solution was added to said mixture, followed by fusion at room temperature. Then the supernatant was removed, and the fused cells were washed with a CPW solution [Freason et al .; The V. Biol. Full. 33, 130-137 (1973)] and subjected to culture.

In het geval dat de UV bestraalde protoplasten van de kern gesubstitueerde Chinese kool voorzien van mannelijke steriele cytoplasma's (Ogura) verkregen in bovenstaande 1) en de koolprotoplasten verkregen in bovenstaande 2) werden gefuseerd, werden beide protoplasten respectievelijk gebracht op een concentratie van 1 x 10^ cel/ml op de wijze als boven beschreven, en werden de bovenstaande protoplasten in gelijke hoeveelheden gemixt. De celfusie werd elektrisch uitgevoerd gebruikmakend van een model 301 van BTX, Ine. waarbij 30 v/cm van een alternerende stroom werd toegepast op de gemengde cellen gedurende 30 sec. gevolgd door toepassen van 1400 v/cm van directe stroom op gezegde cellen voor 20 με.In case the UV irradiated protoplasts of the core substituted Chinese charcoal provided with male sterile cytoplasms (Ogura) obtained in above 1) and the carbon protoplasts obtained in above 2) were fused, both protoplasts were brought to a concentration of 1 x 10, respectively. 1 / cell / ml as described above, and the above protoplasts were mixed in equal amounts. Cell fusion was performed electrically using a model 301 from BTX, Ine. applying 30 v / cm of an alternating current to the mixed cells for 30 sec. followed by applying 1400 v / cm of direct current to said cells for 20 με.

4) Kweek van een gefuseerde protoplast en regeneratie van een plant.4) Culture of a fused protoplast and regeneration of a plant.

Na de bovenstaande fusiebehandeling onder gebruiking van een PEG oplossing of door middel van elektrische pulsen, werd de gefuseerde protoplast gekweekt op callus ondersteunend medium [een gemodificeerd MS medium dat 0,3 m mannitol, 0,5 mg/1 2,4-dichlorofenoxyazijnzuur (hierna afgekort tot 2,4-D), 0,35 mg/1 naftaleenazijnzuur (hierna afgekort tot ΝΔΑ) en 0,5 mg/1 benzylaminopurine (hierna afgekort tot BAP) bevat, gevolgd door toevoegen van een medium met dezelfde samenstelling behalve dat zijn 0,2 molair mannitol bevat op de tiende dag na het begin van de kweek. Na nog 10 dagen werden de kolonies overgebracht naar een 100 ml flacon waarin een vergelijkbaar samengesteld mannitol vrij medium was gebracht en dan geroteerd voor kweek bij 2 touren per minuut. Na 7 dagen van een dergelijke rotatiekweek, werden callus gegroeid tot 1 tot 2 mm lengte in een subcultuur gebracht op regeneratiemedia [MS media bevattende 1 mg/1 benzyladenine (BA)] om de inductie van onvoorziene knoppen te bevorderen. Op deze wijze verkregen onvoorziene knoppen werden overgebracht naar BAP-vrij MS media. Na wortelschieten werden de plantjes gekweekt door ze te acclimatiseren aan de omgeving buiten volgens een gebruikelijke methode. Na bloeien werden de condities van stuifmeelproduktie van de plantjes visueel geëvalueerd om mannelijke steriele individuen te selecteren.After the above fusion treatment using a PEG solution or by electric pulses, the fused protoplast was grown on callus supporting medium [a modified MS medium containing 0.3 m mannitol, 0.5 mg / l 2,4-dichlorophenoxyacetic acid ( hereinafter abbreviated to 2,4-D), 0.35 mg / l naphthalene acetic acid (hereinafter abbreviated to ΝΔΑ) and contains 0.5 mg / l benzylaminopurine (hereinafter abbreviated to BAP), followed by addition of a medium of the same composition except that contains 0.2 molar mannitol on the tenth day after the start of the culture. After a further 10 days, the colonies were transferred to a 100 ml vial into which a similarly composed mannitol free medium was placed and then rotated for culture at 2 rounds per minute. After 7 days of such spin culture, callus grown to 1 to 2 mm in length were subcultured on regeneration media [MS media containing 1 mg / l benzyladenine (BA)] to promote induction of adventitious buds. Contingencies obtained in this way were transferred to BAP-free MS media. After rooting, the plants were grown by acclimating them to the outside environment according to a usual method. After flowering, the conditions of pollen production of the plantlets were visually evaluated to select male sterile individuals.

5) Selectie van een mannelijke steriele plant.5) Selection of a male sterile plant.

Met betrekking tot de aanwezigheid van mannelijke steriliteit, werden de bloeiende planten in het bovengenoemde 4) één voor één onderzocht.With regard to the presence of male sterility, the flowering plants in the above 4) were examined one by one.

Als resultaat van de protoplastfusie van een Japanse radijs voorzien van mannelijk steriel cytoplasma (Ogura) met een kool, werd verkregen een mannelijke steriele plant dragende het gemengde kariotype van een kool en een Japanse radijs (hierna gerefereerd als kool MS-1) en een mannelijke steriele plant die het kariotype van alleen een kool droeg (hieronder gerefereerd als kool MS-2), welke beide goed ontwikkelde nectariën bezaten en niet het vergelen van bladkleur vertoonden (chlorosis) bij lage temperaturen.As a result of the protoplast fusion of a Japanese radish containing male sterile cytoplasm (Ogura) with a cabbage, a male sterile plant bearing the mixed kariotype of a cabbage and a Japanese radish (hereinafter referred to as MS-1 cabbage) and a male was obtained. sterile plant bearing the kariotype of only a cabbage (referred to below as cabbage MS-2), both of which had well-developed nectaries and did not show yellowing of leaf color (chlorosis) at low temperatures.

Overigens, zaden van bovengenoemde kool MS-2 zijn gedeponeerd bij het ATCC als "Cabbage Cybrid CMS-2" met het accessienr. ATCC 75488.Incidentally, seeds of the above cabbage MS-2 have been deposited with the ATCC as "Cabbage Cybrid CMS-2" with the accession No. ATCC 75488.

Als resultaat van de protoplastfusie van een kern gesubstitueerde Chinese kool voorzien van mannelijk steriele cytoplasma's (Ogura) met een kool, werden hakuran type mannelijke steriele planten, die respectievelijk 32, 44 en 34 chromosomen bezaten die allen goed ontwikkelde nectariën bezaten en niet het vergelen van bladkleur bij lagere temperatuur vertoonden verkregen. Hierna wordt naar deze planten gerefereerd als Hakuran MS-1, Hakuran MS-2 en Hakuran MS-3 respectievelijik.As a result of the protoplast fusion of a nuclear substituted Chinese cabbage supplied with male sterile cytoplasmas (Ogura) with a cabbage, hakuran type male sterile plants, having 32, 44 and 34 chromosomes, respectively, all had well-developed nectaries and did not yellow leaf color obtained at a lower temperature. Hereafter these plants are referred to as Hakuran MS-1, Hakuran MS-2 and Hakuran MS-3 respectively.

Overigens, zaden van de bovengenoemde Hakuran MS-3 zijn gedeponeerd in het ATCC als "Hakuran Cybrid CMS-3" met het accessienr. ATCC 75489.Incidentally, seeds of the aforementioned Hakuran MS-3 have been deposited in the ATCC as "Hakuran Cybrid CMS-3" with the accession No. ATCC 75489.

(B) Analyses met de PCR techniek en de RFLP techniek.(B) Analyzes with the PCR technique and the RFLP technique.

Gebruikmakend van vier soorten nieuwe mannelijke steriele lijnen als testvariëteiten te weten een mannelijk steriele variëteit kool MS-2 verkregen door de protoplastfusie van een Japanse radijs voorzien van mannelijke steriel cytoplasma (Ogura) met een kool en mannelijke steriele variëteiten (Hakuran MS-1, Hakuran MS-2 en Hakuran MS-3) verkregen door de protoplastfusie van een kern gesubstitueerde Chinese kool voorzien van mannelijke steriele cytoplasma's (Ogura) en een kool; een Japanse radijs voorzien van (Ogura) cytoplasma's als bron van gebruikelijke mannelijke steriele cellen; en een vertiele kool gebruikt voor celfusie (F]_ variëteit, Kinshi 201) werden de analyses van mitochondrialen DNA's en chloroplast DNA's uitgevoerd volgens de volgende PCR techniek en RFLP techniek.Using four types of new male sterile lines as test varieties, namely a male sterile variety of cabbage MS-2 obtained by the protoplast fusion of a Japanese radish with male sterile cytoplasm (Ogura) with a cabbage and male sterile varieties (Hakuran MS-1, Hakuran MS-2 and Hakuran MS-3) obtained by the protoplast fusion of a nuclear substituted Chinese charcoal with male sterile cytoplasms (Ogura) and a charcoal; a Japanese radish containing (Ogura) cytoplasms as a source of conventional male sterile cells; and a vertical carbon used for cell fusion (F] _ variety, Kinshi 201), analyzes of mitochondrial DNAs and chloroplast DNAs were performed according to the following PCR technique and RFLP technique.

1) PCR techniek1) PCR technique

Uit bladeren op de 40ste tot de 50ste dag na zaaien werd chloioplast DNA (hierna afgekort tot cpDNA) en mitochondriaal DNA hierna afgekort tot mtDNA) volgens de Kemble (1987) methode geëxtraheerd en onderworpen aan PCR-analyse.From leaves on the 40th to 50th day after sowing, chloioplast DNA (hereinafter abbreviated to cpDNA) and mitochondrial DNA hereinafter abbreviated to mtDNA) were extracted by the Kemble (1987) method and subjected to PCR analysis.

PCR-primers werden zodanig bereid dat specifieke plaatsen op mtDNA's van een Japanse radijs voorzien van mannelijke steriele cytoplasma's (Ogura), een gewone mannelijke vertiele Japanse radijs, een mannelijke steriele koolzaad voorzien van S type cytoplasma die reeds beschreven zijn (Thompson, 1972; Shiga, T. en Baba, S., 1973) en een mannelijke steriele koolzaad voorzien van Polima-type cytoplasma's [Fu, T.D.; Cruciferae News Letter, vol. 6, blz. 6-7 (1981)] zouden kunnen worden geamplificeerd.PCR primers were prepared such that specific sites on Japanese radish mtDNAs provided with male sterile cytoplasms (Ogura), a common male digest Japanese radish, a male sterile rapeseed provided with S type cytoplasm have already been described (Thompson, 1972; Shiga , T. and Baba, S., 1973) and a male sterile oilseed rape provided with Polima-type cytoplasms [Fu, TD; Cruciferae News Letter, vol. 6, pp. 6-7 (1981)] could be amplified.

Dat wil zeggen dat primers waarvan elk zo was gekozen dat zij de regio beginnend bij het promotordeel 300-bp stroomopwaarts van de transcriptie initiatieplaats van DNA coderend voor ATPase subunit 6 in bovengenoemd mtDNA zou kunnen amplificeren [Kadowaki, K. et al.; Mol. Gen. Gent., vol. 224, blz. 10-16 (1990)] (hierna afgekort tot atp 6) tot aan de helft (-1) of het geheel (-2) van het structurele gen (hierna afgekort tot ORF) werden gesynthetiseerd. De basevolgorde van de respectievelijke primers A tot F zijn A (sequentie nr. 1), B (sequentie nr. 2), C (sequentie nr. 3), D (sequentie nr. 4), E (sequentie nr. 5) en F (sequentie nr. 4). De combinaties en de te amplificeren onderwerpen van deze primers zijn de volgende: A + B : Og - 1 A+C:Og-2 D + B.-P-l D + C : P - 2 E + B-.N-l E + C : N - 2 F + B : R - 1 F + C : R - 2That is, primers each chosen to amplify the region starting at the promoter portion 300-bp upstream of the transcription initiation site of DNA encoding ATPase subunit 6 in the above mtDNA [Kadowaki, K. et al .; Mol. Gene. Ghent., Vol. 224, pp. 10-16 (1990)] (hereinafter abbreviated to atp 6) until half (-1) or all (-2) of the structural gene (hereinafter abbreviated to ORF) were synthesized. The base order of the primers A to F, respectively, are A (sequence No. 1), B (sequence No. 2), C (sequence No. 3), D (sequence No. 4), E (sequence No. 5), and F (sequence No. 4). The combinations and subjects to be amplified of these primers are the following: A + B: Og - 1 A + C: Og-2 D + B.-Pl D + C: P - 2 E + B-. E + C : N - 2 F + B: R - 1 F + C: R - 2

Overigens, tussen de bovengenoemde primers, werd de verwantschap tussen Og en R (Ogura en een Japanse radijs) ontworpen volgens "Christopher A. Makaroff, Ingrid J. Ape en Jeffrey D. Palmer; The Journal of Biological Chemistry, vol. 264, blz. 11706-11713 (1989)".Incidentally, among the above primers, the relationship between Og and R (Ogura and a Japanese radish) was designed according to "Christopher A. Makaroff, Ingrid J. Ape and Jeffrey D. Palmer; The Journal of Biological Chemistry, vol. 264, p. 11706-11713 (1989) ".

De verwantschap tussen N en P (Napus en Polima) werd ontworpen volgens "Mahipal Singh en Gregory G. Brown, the Plant Cell, vol. 3, blz. 1349-1362 (1991).The relationship between N and P (Napus and Polima) was designed according to "Mahipal Singh and Gregory G. Brown, the Plant Cell, vol. 3, pp. 1349-1362 (1991).

De amplificatie werd uitgevoerd door gezegde primers als PCR primers toe te passen en mtDNA's van de bovengenoemde verschillende mannelijke steriele gefuseerde cellen als templates (sjabloon) te gebruiken en een hittecyclus te herhalen van 94°C (1 min.), 55°C (1 min.) en 72°C (2 min.) voor 30 keer. De verkregen PCR amplificatieprodukten werden middels agarose elektroforese geanalyseerd.Amplification was performed by using said primers as PCR primers and using mtDNAs from the above different male sterile fused cells as templates (template) and repeating a heat cycle of 94 ° C (1 min.), 55 ° C (1 min.) and 72 ° C (2 min.) for 30 times. The obtained PCR amplification products were analyzed by agarose electrophoresis.

Met betrekking tot chloroplast (cp) DNA's, werd de analyse uitgevoerd gebruikmakend van sondes bereid door het digereren van chloroplast DNA's van Brassica Napus met een restrictie-enzym EcoRI en integratie van de digesten in Blue Script plasmiden.With respect to chloroplast (cp) DNAs, the analysis was performed using probes prepared by digesting chloroplast DNAs from Brassica Napus with a restriction enzyme EcoRI and incorporating the digests into Blue Script plasmids.

De resultaten van deze analyses zijn gegeven in tabel 1.The results of these analyzes are shown in Table 1.

TABEL 1 PCR-analyse in cpDNA's en mtDNA's van de verschillende mannelijke steriele gefuseerde cellenTABLE 1 PCR analysis in cpDNAs and mtDNAs of the different male sterile fused cells

In tabel 1 wordt met + de mate van aanwezigheid van PCR produkt aangegeven in die zin dat de kwantiteit van verkregen PCR produkt groter wordt als het aantal plusjes toeneemt. Aan de andere kant betekent - dan geen PCR op het produkt werd verkregen. Verder betekent cp dat een chloroplast DNA als template werd gebruikt en betekent mt dat een mitochondriaal DNA als template werd gebruikt. De gebieden van amplificatie met verschillende PCR's zijn weergegeven in tabel 1.In Table 1, + indicates the presence of PCR product in that the quantity of PCR product obtained increases as the number of pluses increases. On the other hand, - means then no PCR on the product was obtained. Furthermore, cp means that a chloroplast DNA was used as a template and mt means that a mitochondrial DNA was used as a template. The areas of amplification with different PCRs are shown in Table 1.

Uit deze resultaten werd het duidelijk dat in het geval van het Hakuran MS-1 cytoplasma een nieuw PCR produkt kon worden verkregen wanneer het gebied van amplificatie door PCRFrom these results, it became clear that in the case of the Hakuran MS-1 cytoplasm, a new PCR product could be obtained when the region of amplification by PCR

was vastgelegd voor N-l en N-2 voor het cpDNA, wanneer vergeleken met het (Ogura) mannelijk steriele cytoplasma zoals dat in de natuur bestaat.was recorded for N-1 and N-2 for the cpDNA when compared to the (Ogura) male sterile cytoplasm as it exists in nature.

Additioneel vormde het Hakuran MS-2 cytoplasma PCR produkten met N-l en N-2 voor zowel het cpDNA en het mtDNA als vergeleken met het (Ogura) mannelijk steriele cytoplasma bestaand in de natuur.Additionally, the Hakuran MS-2 cytoplasm generated PCR products with N-1 and N-2 for both the cpDNA and the mtDNA as compared to the (Ogura) male sterile cytoplasm existing in nature.

Aan de andere kant, vormde het Hakuran MS-3 cytoplasma PCR produkten met N-l en N-2 voor cpDNA alleen, vergeleken met het (Ogura) mannelijk steriele cytoplasma bestaand in de natuur.On the other hand, the Hakuran MS-3 cytoplasm generated PCR products containing N-1 and N-2 for cpDNA alone, compared to the (Ogura) male sterile cytoplasm existing in nature.

En, het kool MS-2 cytoplasma, hetzelfde als voorgenoemde MS-2, vormde PCR produkten met N-l en N-2 voor zowel het cpDNA als het mtDNA.And, the carbon MS-2 cytoplasm, the same as the aforementioned MS-2, produced PCR products with N-1 and N-2 for both the cpDNA and the mtDNA.

2) RFLP techniek2) RFLP technique

Uit de mesofylen van de mannelijke steriele kolen MS-1 en MS-2 verkregen door een protoplastfusie en de mannelijke steriele Hakuran MS-1, MS-2 en MS-3 verkregen met de protoplast fusie werden volgens de Kemble (1978) methode mpDNA's geëxtraheerd en vevolgens gedigereerd met restrictie enzymen BamHI en HindlII. Gezegde DNA-fragmenten werden geëlektroforeerd op 1 % agarose en vervolgens onderworpen aan sudden hybridisatie volgens het Genius systeem (geproduceerd door Boehringer Mannheim Co.). Als sondes werden DNA fragmenten coderend voor ATPase subunit a in het mtDNA van een rijstplant [Kadowaki, K. et al.; Nucleic Acids Res., vol. 17, no. 5 (1990)] (hierna afgekort tot atp A), bovengenoemde atp 6 en cytochroom oxydase subunit 1 [Kadowaki, K. et al.; Nucleic Acids Res., vol. 17, no. 18 (1989)] (hierna afgekort tot cox-I) gebruikt.From the mesophylls of the male sterile coal MS-1 and MS-2 obtained by a protoplast fusion and the male sterile Hakuran MS-1, MS-2 and MS-3 obtained by the protoplast fusion, mpDNAs were extracted according to the Kemble (1978) method and then digested with restriction enzymes BamHI and HindlII. Said DNA fragments were electrophoresed on 1% agarose and then subjected to sudden hybridization according to the Genius system (produced by Boehringer Mannheim Co.). As probes, DNA fragments encoding ATPase subunit a in the mtDNA of a rice plant [Kadowaki, K. et al .; Nucleic Acids Res., Vol. 17, no. 5 (1990)] (hereinafter abbreviated to atp A), the above atp 6 and cytochrome oxidase subunit 1 [Kadowaki, K. et al .; Nucleic Acids Res., Vol. 17, no. 18 (1989)] (hereinafter abbreviated to cox-I).

Met betrekking ook tot het chloroplast DNA, werden cpDNA's geëxtraheerd volgens de bovengenoemde Kemble (1987) methode en gedigereerd met HindlII en EcoRI. Daarna werden de Southern hybridisatie uitgevoerd gebruikmakend van cpDNA probes (sondes) van het genus Brassica (fig. 2-7).Also with regard to the chloroplast DNA, cpDNAs were extracted according to the above Kemble (1987) method and digested with HindIII and EcoRI. Southern hybridization was then performed using cpDNA probes (probes) of the genus Brassica (Figures 2-7).

De resultaten van deze RFLP worden in tabel 2 weergegeven.The results of this RFLP are shown in Table 2.

TABEL 2TABLE 2

Resultaten van RFLP techniek in mtDNA's en cpDNA's van mannelijke steriele planten.Results of RFLP technique in mtDNAs and cpDNAs of male sterile plants.

In tabel 2 betekent een dat geen polymorfisme kon worden waargenomen, betekent "a" een chloroplast probe, betekent "Og" een Ogura type, betekent "Cab" een kooltype, "ree" een gerecombineerd type en betekent "ND" niet bepaald.In Table 2, one means that no polymorphism could be observed, "a" means a chloroplast probe, "Og" means an Ogura type, "Cab" means a cabbage type, "roe" means a recombined type and "ND" has not been determined.

Als resultaat met betrekking tot kool MS-1 (weergegeven in tabel 2 als kool radijs MS-1), werd gevonden dat haar cpDNA was veranderd in dat van het kooltype, als vergeleken met het bestaande mannelijke steriele (Ogura) cytoplasma.As a result with respect to cabbage MS-1 (shown in Table 2 as cabbage radish MS-1), it was found that its cpDNA was changed to that of the cabbage type, as compared to the existing male sterile (Ogura) cytoplasm.

Met betrekking tot kool MS-2 (weergegeven in tabel 2 als kool radijs MS-2), atp 6 en cox I in het mtDNA daarvan waren veranderd in die behorend bij het kooltype en additioneel was het cpDNA eveneens veranderd in dat van het kooltype.With respect to cabbage MS-2 (shown in Table 2 as cabbage radish MS-2), atp 6 and cox I in its mtDNA were changed to those associated with the cabbage type and additionally, the cpDNA was also changed to that of the cabbage type.

Met betrekking tot Hakuran MS-1 werd gevonden dat een nieuwe band werd gevormd en dat recombinatie van genen toe te schrijven aan de protoplastfusie optrad in ATP-A in het mtDNA.With regard to Hakuran MS-1, it was found that a new band was formed and that recombination of genes due to the protoplast fusion occurred in ATP-A in the mtDNA.

Met betrekking tot Hakuran MS-2 werd een nieuwe band toe te schrijven aan recombinatie gevormd in ATP-A in het mtDNA, vergelijkbaar met het Hakuran MS-1.With respect to Hakuran MS-2, a new band due to recombination was generated in ATP-A in the mtDNA, similar to the Hakuran MS-1.

Met betrekking tot Hakuran MS-3 werd geen verschil gevonden in mtDNA tussen gezegd Hakuran MS-3 en het bestaande mannelijke steriele (Ogura) cytoplasma, vergelijkbaar met de resultaten van de bovengenoemde PCR techniek. In het cpDNA echter werd het duidelijk dat een een nieuwe band werd gevormd en dat dus recombinatie plaatsvond.Regarding Hakuran MS-3, no difference was found in mtDNA between said Hakuran MS-3 and the existing male sterile (Ogura) cytoplasm, similar to the results of the above PCR technique. In the cpDNA, however, it became clear that a new band was formed and thus recombination took place.

Als beschreven in bovenstaande 1) en 2), werd het duidelijk dat de combinatie van de PCR techniek met de RFLP techniek gebruikmakend van een mtDNA en een cpDNA in een cytoplasma als indexes het mogelijk maakt om de definitieve indicatie van het verschil van het betrokken mannelijke steriele cytoplasma van de bestaande mannelijke steriele cytoplasma's en tegelijkertijd classificatie en karakterisatie van individuele cytoplasma's mogelijk maakt.As described in 1) and 2) above, it became clear that the combination of the PCR technique with the RFLP technique using an mtDNA and a cpDNA in a cytoplasm as indexes allows to make the final indication of the difference of the male involved. sterile cytoplasm of the existing male sterile cytoplasms while allowing classification and characterization of individual cytoplasms.

Voorbeeld 2Example 2

Produktie van de gewenste mannelijke steriele plant volgens terugkruisen.Production of the desired male sterile plant according to backcrossing.

Onder een somatische hybridecel van het genus Brassica die nieuwe mannelijke steriele cytoplasma's hadden verkregen volgens voorbeeld 1, werd kool MS-2 geacht in staat te zijn om te worden gehybridiseerd met een groep van conspecifieke oogst variëteiten omdat haar karyotype hetzelfde was als dat van Brassica oleracea.Under a somatic hybrid cell of the genus Brassica that had obtained new male sterile cytoplasms according to example 1, cabbage MS-2 was considered to be able to be hybridized with a group of conspecific harvest varieties because its karyotype was the same as that of Brassica oleracea .

Echter, vergeleken met het normale chromosoom aantal van een plant van de soort oleracea had de gezegde plant een toegenomen chromosoom aantal als gevolg van de protoplastfusie.However, compared to the normal chromosome number of a plant of the oleracea species, the said plant had an increased chromosome number due to the protoplast fusion.

Daarom werd de ovule kweekmethode tezamen geadopteerd met het terugkruisen met het doel om efficiënt nakomelingschap te verkrijgen. Dat wil zeggen na gezegde terugkruising werden twee weken oude onvolwassen zaden aseptisch verzameld en vervolgens gekweekt door ze op MS media te plaatsen met een gehalveerde concentratie bevattende 5 % glucose en 1 g/1 Casamino zuur, zodat nakomelingschap verkregen werd. Door de gezamenlijke adoptie van gezegde ovule kweekmethode, werd kool MS-2 meerdere malen teruggekruist met pure lijnen van een kool, een broccoli, een bloemkool, een decoratieve boerenkool, een boerenkool, een kairan, spinazi een koolrabie behorend tot de soort oleracia vergelijkbaar met de kool MS-2, maar door moederplantlijn gekweekt werd van het genus Brassica die een hoog zuivere kern van Brassica oleracea droeg met een nieuw mannelijk steriel cytoplasma van kool MS-2.Therefore, the ovule culture method was adopted together with backcrossing for the purpose of obtaining efficient progeny. That is, after said backcrossing, two week old immature seeds were aseptically collected and then grown by placing them on MS media with a halved concentration containing 5% glucose and 1 g / l Casamino acid to give progeny. Through the joint adoption of said ovule cultivation method, cabbage MS-2 was backcrossed several times with pure lines of a cabbage, a broccoli, a cauliflower, a decorative kale, a kale, a kairan, spinazi a kohlrabi belonging to the species oleracia similar to the cabbage MS-2, but was grown by mother plant line of the genus Brassica carrying a high-purity core of Brassica oleracea with a new male sterile cytoplasm of cabbage MS-2.

Overigens hoewel zo'n plant dichter komt bij de pure lijn variëteiten onderworpen aan de hybridisatie naarmate de frequentie van gezegde terugkruising toeneemt, werd dat concreet bepaald volgens de RAPD methode [Williams, J. G. et al.; Nucleic Acid Res., vol. 18, blz. 6531-6535 (1991)]. Met betrekking tot het kern DNA van het nakomelingschap verkregen met gezegde terugkruising werd het verschil tussen beide getest volgens de RAPD methode gebruikmakend van een commercieel verkrijgbare primer kit geproduceerd door Operon, Ine. (1000 Atlantic Ave., suite 108, Alameda, CA., USA). Als een resultaat daarvan werd gevonden dat het nodig was om gezegde terugkruising ongeveer 7 keer uit te voeren.Incidentally, although such a plant gets closer to the pure line varieties subject to hybridization as the frequency of said backcross increases, it was concretely determined by the RAPD method [Williams, J. G. et al .; Nucleic Acid Res., Vol. 18, pp. 6531-6535 (1991)]. Regarding the offspring core DNA obtained with said backcross, the difference between the two was tested according to the RAPD method using a commercially available primer kit produced by Operon, Ine. (1000 Atlantic Ave., suite 108, Alameda, CA., USA). As a result, it was found that it was necessary to perform said back crossing about 7 times.

Op dit moment werd, om te bepalen dat de mannelijke steriliteit bewaard bleef omdat een mannelijk steriel cytoplasma wordt overgedragen van alleen de moederplant, werd een deel van gezegde planten die kool MS-2 mannelijke steriele cytoplasma's bezaten geïsoleerd vlak voor de bloei om ook te bevestigen dat zaden van zelf-bevruchtig nakomelingschappen niet kon worden verkregen.At this time, to determine that male sterility was maintained because a male sterile cytoplasm is transferred from the mother plant only, a portion of said plants containing cabbage MS-2 male sterile cytoplasms was isolated just before flowering to confirm that seeds from self-fertile offspring could not be obtained.

Wanneer een nieuw mannelijk steriel cytoplasma Hakuran MS-1 als moederplant genomen werd, werden synthetische koolzaadplanten voorzien van kernen van zowel Brassica oleracea als Brassica campestris kunstmatig geproduceerd volgens de voorgenoemde ovule kweekmethode en werden die van Brassica campestris gebruikt voor terugkruising. In geval dat hakuran MS-2 als een moederplant genomen werd, werden een broccoli, een bloemkool en een kool behorend tot Brassica oleracea; een Chinese kool, een knol en zatsuna behorend tot Brassica campestris: en een bladmosterd behorend tot Brassica iuncea teruggekruist. In het geval dat Hakuran MS-3 als moederplant genomen werd, werden een Chinese kool, zatsuna en kukidachina behorend tot Brassica campestris teruggekruist. In ieder geval werd de ovule kweekmethode gezamenlijk toegepast op de eerste generatie of de eerste tot de tweede generaties om nakomelingschappen te verkrijgen in de gezegde terugkruising. Met betrekking tot de frequentie van de terugkruising, het verschil in kern DNA tussen elke zuivere lijnvariëteit gebruikt voor gezegde terugkruising en elk nakomelingenschap dat werd verkregen werd getest volgens de RAPD methode, vergelijkbaar als beschreven voor kool MS-2.When a new male sterile cytoplasm Hakuran MS-1 was taken as a mother plant, synthetic rapeseed plants containing cores of both Brassica oleracea and Brassica campestris were artificially produced according to the aforementioned ovule culture method and those of Brassica campestris were used for backcrossing. In case hakuran MS-2 was taken as a mother plant, a broccoli, a cauliflower and a cabbage belong to Brassica oleracea; a Chinese cabbage, a tuber and a zatsuna belonging to Brassica campestris: and a leaf mustard belonging to Brassica iuncea backcrossed. In case Hakuran MS-3 was taken as a mother plant, a Chinese cabbage, zatsuna and kukidachina belonging to Brassica campestris were crossed back. In any case, the ovule culture method was jointly applied to the first generation or the first to the second generations to obtain progeny in the saying backcross. Regarding the frequency of the backcross, the difference in core DNA between each pure line variety used for said backcross and each progeny obtained was tested according to the RAPD method, similar as described for cabbage MS-2.

Hieruit bleek dat in elk geval terugkruising bij voorkeur ongeveer 7 keer moest gebeuren. Additioneel, met betrekking tot mannelijke steriliteit in nakomelingschappen, werd het niet alleen gezien dat er geen stuifmeel werd geproduceerd maar werd ook bevestigd dat zaden van zelf bevruchte nakomelingenschappen niet werden verkregen wanneer een deel van de moederplanten werd geïsoleerd.This showed that in any case backcrossing should preferably be done about 7 times. Additionally, with regard to male sterility in progeny, it was not only seen that pollen was not produced, but it was also confirmed that seeds from self-fertilized progeny were not obtained when some of the mother plants were isolated.

LIJST VAN SEQUENTIES:LIST OF SEQUENCES:

Sequentie nr. 1 Lengte van de sequentie: 20 Soort sequentie: nucleïnezuur Aantal strengen: enkelstrengs Topologie: lineairSequence No. 1 Length of sequence: 20 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear

Soort sequentie: andere nucleïnezuur synthetiserend DNA Sequentie: TGCGAGTCAA TCCACTAACT 20Sequence type: other nucleic acid synthesizing DNA Sequence: TGCGAGTCAA TCCACTAACT 20

Sequentie nr. 2 Lengte van de sequentie: 20 Soort sequentie: nucleïnezuur Aantal strengen: enkelstrengs Topologie: lineairSequence No. 2 Length of the sequence: 20 Type of sequence: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear

Soort sequentie: andere nucleïnezuur synthetiserend DNA Sequentie: CTATTTGTTC CTTTACCAGG 20Sequence type: other nucleic acid synthesizing DNA Sequence: CTATTTGTTC CTTTACCAGG 20

Sequentie nr. 3 Lengte van de sequentie: 20 Soort sequentie: nucleïnezuur Aantal strengen: enkelstrengs Topologie: lineairSequence No. 3 Length of the sequence: 20 Type of sequence: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear

Soort sequentie: andere nucleïnezuur synthetiserend DNA Sequentie: AACACTACTC TCATCCCTCG 20Sequence type: other nucleic acid synthesizing DNA Sequence: AACACTACTC TCATCCCTCG 20

Sequentie nr. 4 Lengte van de sequentie: 20 Soort sequentie: nucleïnezuur Aantal strengen: enkelstrengs Topologie: lineairSequence No. 4 Length of the sequence: 20 Type of sequence: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear

Soort sequentie: andere nucleïnezuur synthetiserend DNA Sequentie: ATCCTTTCGGC ACCTTGATCG 20Sequence type: other nucleic acid synthesizing DNA Sequence: ATCCTTTCGGC ACCTTGATCG 20

Sequentie nr. 5 Lengte van de sequentie: 20 Soort sequentie: nucleïnezuur Aantal strengen: enkelstrengs Topologie: lineairSequence No. 5 Length of the sequence: 20 Type of sequence: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear

Soort sequentie: andere nucleïnezuur synthetiserend DNA Sequentie: AGCTTGGTAG CTCGCAAGGA 20Sequence type: other nucleic acid synthesizing DNA Sequence: AGCTTGGTAG CTCGCAAGGA 20

Sequentie nr. 6 Lengte van de sequentie: 20 Soort sequentie: nucleïnezuur Aantal strengen: enkelstrengs Topologie: lineairSequence No. 6 Length of the sequence: 20 Type of sequence: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear

Soort sequentie: andere nucleïnezuur synthetiserend DNA Sequentie: CTAGTTGAGG TCTGAAAGCC 20Sequence type: other nucleic acid synthesizing DNA Sequence: CTAGTTGAGG TCTGAAAGCC 20

Claims

A method of preparing a plant in which the male reproductive organs are not functionally present, wherein a cell fusion is carried out between a cytoplasm which ensures the sterility of the male reproductive organs and a purebred nucleus of a species compatible with that cytoplasm, or a hybrid core of two purebred compatible species.

The method of claim 1, wherein the cell nucleus or hybrid cell nucleus and cytoplasm are derived from plant material belonging to the family of brassicaceae (cruciferae).

The method of claim 2, wherein the cell nucleus or hybrid cell nucleus and cytoplasm are derived from plant material belonging to the genus Brassica.

The method of claim 3, wherein the purebred cell nucleus is from Brassica Oleracea.

The method of claim 3, wherein the hybrid cell nucleus is from a plant that is a hybrid between Brassica campestris and Brassica Oleracea.

A method according to any one of the preceding claims, wherein the cytoplasm at least partly consists of Ogura cytoplasm.

A method of preparing a male sterile plant, wherein a plant obtainable by a method according to any one of the preceding claims is backcrossed with a purebred brassicaceae.

The method of claim 7, wherein the brassicaceae is a plant of the genus Brassica.

The method of claim 8, wherein the plant of the genus Brassica is a palnt of the species Brassica campestris, Brassica Napus or Brassica Juncea.