NL9301447A

NL9301447A - Method for growing animal cells.

Info

Publication number: NL9301447A
Application number: NL9301447A
Authority: NL
Original assignee: Bio Intermediair B V
Priority date: 1993-08-20
Filing date: 1993-08-20
Publication date: 1995-03-16

Abstract

A description is given of a method for growing animal cells for the production of, for example, antibodies in an aqueous two-phase system which contains at least two separating polymers such as polyethylene glycol and dextran or a dextrin. The concentrations and molecular weights of the polymers are of importance for obtaining phase separation and good cell growth. Polyethylene glycol preferably has a molecular weight of 20,000- 100,000 and a gross concentration of 1-5% by wt, while dextran preferably has a molecular weight of 1,500-70,000 and a gross concentration of 5-15% by wt.

Description

Werkwijze voor het kweken van dierlijke cellenMethod for culturing animal cells

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het kweken van dierlijke cellen, waaronder zoogdiercellen en insektecellen, in suspensie.The invention relates to a method of culturing animal cells, including mammalian and insect cells, in suspension.

Voor het kweken van dierlijke cellen wordt in het algemeen gebruik gemaakt van gemengde, homogene suspensies, bij voorbeeld zoals beschreven in de Britse octrooiaanvrage GB-A-2153Ö30. Voordeel daarvan ten opzichte van het kweken van geïmmobiliseerde cellen is dat er geen sprake is van concentratiegradiënten, zodat meting en beheersing van het kweekproces betrekkelijk eenvoudig zijn. Voor processen waarvoor de toediening van zuurstof nodig is, kan de zuurstof rechtstreeks in dergelijke suspensies worden toegevoerd.Generally, mixed, homogeneous suspensions are used for the cultivation of animal cells, for example as described in British patent application GB-A-2153Ö30. The advantage of this compared to the cultivation of immobilized cells is that there are no concentration gradients, so that measurement and control of the culture process are relatively simple. For processes that require the administration of oxygen, the oxygen can be fed directly into such suspensions.

Een belangrijk nadeel van het kweken in dergelijke suspensies op grote schaal is dat, als gevolg van de onvermijdelijke lage celdichtheid en dus ook lage produktconcentratie, de reactoren en de opwerkings-apparatuur betrekkelijk groot zullen moeten zijn en produktie dus duur wordt. De celconcentratie kan worden verhoogd door toepassing van celretentiesystemen, bij voorbeeld met behulp van perfusiefilters. De cellen worden dan door deze filters in de reactor gehouden. Doordat hier echter hoge mediumdebieten nodig zijn om remming van de cellen door metabolieten te voorkomen, blijft de produktconcentratie in de uitgaande produktstroom laag.An important drawback of cultivation in such suspensions on a large scale is that, due to the inevitably low cell density and thus also low product concentration, the reactors and the reprocessing equipment will have to be relatively large and production will thus become expensive. Cell concentration can be increased using cell retention systems, for example, using perfusion filters. The cells are then held in the reactor by these filters. However, since high medium flow rates are required here to prevent inhibition of the cells by metabolites, the product concentration in the outgoing product stream remains low.

Gevonden is nu dat dierlijke cellen met voordeel kunnen worden gekweekt in een waterhoudend twee-fasensysteem. Dit tweefasensysteem kan werken als celretentiesysteem, zodat de celfase gemakkelijk van het systeem kan worden afgescheiden en opnieuw kan worden gebruikt. Daarnaast kan ook de produktconcentratie worden verhoogd in een van beide fasen, zodat de volumestroom waaruit het produkt moet worden opgewerkt kan worden verkleind en daarmee kleinere en/of meer economische apparatuur voor de opwerking kan worden gebruikt. Ook leent een dergelijk systeem zich zeer goed voor een continue produktie.It has now been found that animal cells can be advantageously cultured in an aqueous two-phase system. This two phase system can act as a cell retention system, so that the cell phase can be easily separated from the system and reused. In addition, the product concentration can also be increased in one of the two phases, so that the volume flow from which the product is to be reprocessed can be reduced and thus smaller and / or more economical processing equipment can be used. Such a system is also very suitable for continuous production.

De werkwijze volgens de uitvinding voor het kweken van dierlijke cellen wordt derhalve gekenmerkt doordat men de cellen kweekt in een waterhoudend twee-fasensysteem dat ten minste twee ontmengende polymeren bevat.The method of culturing animal cells according to the invention is therefore characterized in that the cells are grown in an aqueous two-phase system containing at least two demixing polymers.

Het is verrassend dat dierlijke cellen, die door het ontbreken van een celwand immers kwetsbaar zijn, goed in de waterhoudende twee-fasen- systemen kunnen worden gekweekt, omdat bekend is dat de in deze systemen te gebruiken stoffen, zoals polyethyleenglycol, een destabiliserende, of zelfs afbrekende werking (fusie) op dierlijke cellen, in het bijzonder zoogdiercellen, hebben.It is surprising that animal cells, which are vulnerable due to the lack of a cell wall, can be cultured well in the two-phase aqueous systems, because it is known that the substances to be used in these systems, such as polyethylene glycol, are destabilizing, or even have degradation (fusion) on animal cells, especially mammalian cells.

Onder een waterhoudend twee-fasensysteem wordt verstaan een mengsel van ten minste twee in water oplosbare stoffen en water, waarbij de twee oplosbare stoffen in een zodanige hoeveelheid ten opzicht van elkaar en van het water aanwezig zijn, dat er twee fasen ontstaan, waarvan een hoofdzakelijk de ene oplosbare stof in water bevat, en de andere fase hoofdzakelijk de andere oplosbare stof in water bevat. De oplosbare stoffen zijn in het algemeen hydrofiele polymeren, zoals polyalcoholen, waaronder polysachariden, en polyethers. Voor het bewerkstelligen van fasenscheiding zijn in hoofdzaak de hydrofiliciteit van de stoffen, bij polymeren onder meer afhankelijk van de ketenlengte, en de concentratie van de stoffen van belang. In geval van polymeren • dient in het algemeen de concentratie hoger te zijn naarmate de ketenlengte geringer is. Waterhoudende twee-fasensystemen zijn in verschillende varianten bekend (Albertsson, P-A. Partition of Cell Particles and Macromolecules, 3rd ed., John Wiley & Sons, 1986).An aqueous two-phase system is understood to be a mixture of at least two water-soluble substances and water, the two soluble substances being present in an amount relative to each other and to the water, resulting in two phases, one of which is mainly one contains soluble in water, and the other phase contains mainly the other soluble in water. The solubles are generally hydrophilic polymers, such as polyalcohols, including polysaccharides, and polyethers. In order to effect phase separation, the hydrophilicity of the substances, in the case of polymers depending, inter alia, on the chain length and the concentration of the substances, are important. In the case of polymers, • generally the concentration should be higher the shorter the chain length. Two-phase aqueous systems are known in several variants (Albertsson, P-A. Partition of Cell Particles and Macromolecules, 3rd ed., John Wiley & Sons, 1986).

Voor de werkwijze volgens de uitvinding bruikbare stoffen die in combinatie een waterhoudend twee-fasensysteem vormen zijn bij voorbeeld polyethyleenglycol (PEG) en dextraan (polyanhydroglucose). Wanneer deze twee stoffen in voldoende hoeveelheid in water aanwezig zijn ontstaan er twee fasen, waarvan de bovenste (lichtste) fase rijk is aan polyethyleenglycol en de onderste (zwaarste) fase rijk is aan dextraan. In plaats van PEG zijn ook andere polymeren bruikbaar, zoals blokcopolymeren van PEG en polypropyleenglycol, ook wel bekend onder de handelsnaam Pluronics. In plaats van dextraan zijn andere polysachariden, zoals andere poly-anhydroglucosen, bij voorbeeld in de vorm van oplosbaar zetmeel of malto-dextrinen, gele dextrinen, polyanhydrosucrosen, enigermate gealkyleerde en gehydroxyalkyleerde derivaten daarvan, en polyvinylpyrrolidon bruikbaar. In het onderstaande worden als twee fasen vormende polymeren bij wijze van voorbeeld telkens PEG (polyethyleenglycol) en dextraan genoemd, maar deze kunnen vervangen worden door andere twee fasen vormende stoffen zoals hierboven bedoeld.Substances useful for the process according to the invention which in combination form an aqueous two-phase system are, for example, polyethylene glycol (PEG) and dextran (polyanhydroglucose). When these two substances are present in sufficient quantity in water, two phases are formed, of which the upper (lightest) phase is rich in polyethylene glycol and the lower (heaviest) phase is rich in dextran. Instead of PEG, other polymers can also be used, such as block copolymers of PEG and polypropylene glycol, also known under the trade name Pluronics. Instead of dextran, other polysaccharides, such as other polyanhydroglucoses, for example, in the form of soluble starch or malto-dextrins, yellow dextrins, polyanhydrosucroses, some alkylated and hydroxyalkylated derivatives thereof, and polyvinylpyrrolidone are useful. In the following, as two-phase-forming polymers, for example, each time PEG (polyethylene glycol) and dextran are mentioned, but these can be replaced by other two-phase-forming substances as referred to above.

Voor een efficiënte kweek van diercellen, waarbij de cellen vitaal en produktief blijven, blijkt de ketenlengte van de te gebruiken polymeren van belang. Voor PEG is het minimale gemiddelde molecuulgewicht in het algemeen ongeveer 6.000 dalton (Da). Bij voorkeur gebruikt men PEG met een gemiddeld molecuulgewicht van ten minste 20.000, met meer voorkeur van ten minste 35*000 Da. De bovengrens van het molecuulgewicht van PEG is minder kritisch; molecuulgewichten boven ongeveer 100.000 Da hebben weinig praktische betekenis.The chain length of the polymers to be used appears to be important for efficient culture of animal cells, in which the cells remain vital and productive. For PEG, the minimum average molecular weight is generally about 6,000 daltons (Da). Preferably, PEG is used with an average molecular weight of at least 20,000, more preferably of at least 35,000 Da. The upper limit of the molecular weight of PEG is less critical; molecular weights above about 100,000 Da have little practical significance.

Van het dextraan kan het molecuulgewicht enige honderdduizenden Da bedragen. Het heeft echter voordeel op de verdeling van cellen en celprodukten wanneer het dextraan een minder hoog molecuulgewicht van bij voorbeeld ten hoogste 100.000 Da heeft. Bij voorkeur heeft het dextraan een gemiddeld molecuulgewicht van ten hoogste 70.000, met meer voorkeur van ten hoogste 45*000 Da. De ondergrens voor het molecuulgewicht van het dextraan ligt bij ongeveer 1.500 Da.The molecular weight of the dextran can amount to several hundred thousand Da. However, it benefits the distribution of cells and cell products when the dextran has a lower molecular weight of, for example, up to 100,000 Da. Preferably the dextran has an average molecular weight of at most 70,000, more preferably at most 45,000 Da. The lower molecular weight limit of the dextran is about 1,500 Da.

De concentratie PEG dient in de PEG-arme, dextraan-rijke fase, waarin de dierlijke cellen geconcentreerd zijn, niet te hoog te zijn, bij voorkeur niet hoger dan 2,5 gew.#. In het gehele waterhoudende systeem bedraagt de concentratie PEG bij voorkeur niet meer dan 5 gew.#, waarbij deze in het bijzonder tussen 1 en 3 gew.# ligt. Een lagere concentratie dan 1# leidt, afhankelijk van de molecuulgewichten van PEG en dextraan en van de dextraanconcentratie, tot een onvoldoende fasenscheiding.The concentration of PEG should not be too high in the PEG-poor, dextran-rich phase in which the animal cells are concentrated, preferably not more than 2.5% by weight. In the entire aqueous system, the concentration of PEG is preferably not more than 5 wt.%, Particularly between 1 and 3 wt.%. Depending on the molecular weights of PEG and dextran and on the dextran concentration, a concentration lower than 1 # leads to an insufficient phase separation.

De concentratie dextraan is afhankelijk van de ketenlengte van het dextraan en van de ketenlengte en de concentratie van de gebruikte PEG. In de onderliggende PEG-arme, dextraan-rijke fase bedraagt de dextraanconcentratie in het algemeen 5 tot 25 gew.# en bij voorkeur tussen de δ en l6 gew.#. In het gehele waterhoudende systeem bedraagt de dextraanconcentratie in het algemeen 4 tot 20 gew.# en bij voorkeur tussen de 5 en 15 gew.#. De genoemde ondergrenzen voor de dextraanconcentratie gelden bij voorbeeld voor een dextraan van 40.000 Da, bij 3 gew.# PEG van 35*000 Da. Wanneer de PEG-concentratie lager is en/of het molecuulgewicht van dextraan en/of PEG lager is, gelden hogere minimumconcentraties voor het dextraan.The concentration of dextran depends on the chain length of the dextran and on the chain length and the concentration of the PEG used. In the underlying PEG-poor, dextran-rich phase, the dextran concentration is generally 5 to 25 wt.% And preferably between δ and 16 wt. #. Throughout the aqueous system, the dextran concentration is generally from 4 to 20% by weight, and preferably from 5 to 15% by weight. The said lower limits for the dextran concentration apply, for example, to a dextran of 40,000 Da, at 3 wt. # PEG of 35 * 000 Da. When the PEG concentration is lower and / or the molecular weight of dextran and / or PEG is lower, higher minimum concentrations apply to the dextran.

Het volgens de uitvinding toe te passen waterhoudende twee-fasen-systeem bevat verder de bestanddelen die nodig zijn voor de celgroei. Daartoe behoren de voedingsstoffen, essentiële elementen, substraten e.d.. Ook de osmotische druk van het systeem dient zodanig te zijn dat de cellen kunnen groeien en produceren. In het algemeen dient het systeem een osmotische druk van ongeveer 230-450 mOs/kg, in het bijzonder van 260-360 mOs/kg, te hebben. De osmotische druk kan op de gewenste waarde worden ingesteld door toevoeging van een zout, zoals natriumchloride.The aqueous two-phase system to be used according to the invention further contains the components necessary for cell growth. This includes the nutrients, essential elements, substrates, etc. The osmotic pressure of the system must also be such that the cells can grow and produce. In general, the system should have an osmotic pressure of about 230-450 mOs / kg, especially 260-360 mOs / kg. The osmotic pressure can be adjusted to the desired value by adding a salt, such as sodium chloride.

De werkwijze is geschikt voor het kweken van dierlijke cellen met uiteenlopende toepassingen. Het kan daarbij gaan om het kweken van natuurlijke (wild-type) cellen, hybride cellen of recombinante cellen. De cellen worden in het algemeen gekweekt met het oog op het verkrijgen van een celprodukt; dit produkt kan zowel door de cellen in het kweek-medium worden uitgescheiden als intracellulair worden opgehoopt.The method is suitable for the cultivation of animal cells with various applications. This may involve the cultivation of natural (wild-type) cells, hybrid cells or recombinant cells. The cells are generally cultured for the purpose of obtaining a cell product; this product can be secreted by the cells in the culture medium or accumulated intracellularly.

Voorbeelden van toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding zijn het kweken van hybridoma's en myeloma’s voor de produktie van mono-klonale antilichamen, het kweken van insektecellen, bij voorbeeld van Spodopteva frugiperda, voor de produktie van wild-type virussen of voor de produktie van recombinant eiwit, en het kweken van zoogdiercellen, bij voorbeeld CHO (Chinese Hamster Ovary) cellen, voor de produktie van recombinante eiwitten.Examples of application of the method according to the invention are the cultivation of hybridomas and myelomas for the production of monoclonal antibodies, the cultivation of insect cells, for example of Spodopteva frugiperda, for the production of wild-type viruses or for the production of recombinant protein, and culturing mammalian cells, for example CHO (Chinese Hamster Ovary) cells, for the production of recombinant proteins.

De met de werkwijze volgens de uitvinding te verkrijgen produkten kunnen op verschillende wijzen worden geïsoleerd. Indien het celprodukt zich in de PEG-rijke bovenfase van het twee-fasensysteem verzamelt, kan deze fase worden gemengd met bij voorbeeld een geconcentreerde fosfaat-buffer. Een IgG blijkt in dat geval in de zoutfase terecht te komen. Na een dergelijke scheiding kan het produkt op bekende wijze, bij voorbeeld door middel van gelfiltratie, verder worden gezuiverd. Indien het produkt zich in de dextraan-rijke onderfase concentreert, kan het van de cellen en van andere eiwitten worden gescheiden bij voorbeeld met behulp van een gefluïdiseerd bed met affiniteitsliganden, en zo nodig worden nagezuiverd met gelfiltratie.The products to be obtained by the method according to the invention can be isolated in various ways. If the cell product accumulates in the PEG-rich upper phase of the two-phase system, this phase can be mixed with, for example, a concentrated phosphate buffer. In that case, an IgG appears to enter the salt phase. After such a separation, the product can be further purified in known manner, for example by means of gel filtration. If the product concentrates in the dextran-rich lower phase, it can be separated from the cells and other proteins, for example, by means of a fluidized bed with affinity ligands, and if necessary post-purified with gel filtration.

Voorbeeld IExample I

Produktie van monoklonale antilichamen in een waterig twee-fasensvsteem.Production of monoclonal antibodies in an aqueous two-phase system.

Gebruik werd gemaakt van de cellijn BIF 6A7, een muis/muis-hybridoma, afkomstig van een SP2/0-myeloma. Deze cellijn produceert een monoklonaal antilichaam tegen het complex van Factor VIII en Von Willebrand-Factor, dat een rol speelt bij de stremming van menselijk bloed. BIF 6A7 was afkomstig van Bio-Intermediair (Groningen). De cellijn werd voorgekweekt in een serum-vrij eiwitarm medium op basis van DME/F12 3:1 (DME = Dulbecco's Modification of Eagle medium; F12 = Ham's medium F12). De osmotische druk in dit medium was ongeveer 320 mOs/kg.Use was made of the cell line BIF 6A7, a mouse / mouse hybridoma from an SP2 / 0 myeloma. This cell line produces a monoclonal antibody against the Factor VIII and Von Willebrand Factor complex, which plays a role in the coagulation of human blood. BIF 6A7 came from Bio-Intermediair (Groningen). The cell line was pre-cultured in a serum-free low protein medium based on DME / F12 3: 1 (DME = Dulbecco's Modification of Eagle medium; F12 = Ham's medium F12). The osmotic pressure in this medium was about 320 mOs / kg.

Entmateriaal werd genomen uit een continu geroerde cultuur van 1 liter van BIF 6A7 (verdunning: 0,028 h-1). Tijdens de continu geroerde cultuur bleven celdichtheid, viabiliteit en produktieniveau constant.Inoculum was taken from a 1 L continuously stirred culture of BIF 6A7 (dilution: 0.028 h-1). During the continuously stirred culture, cell density, viability and production level remained constant.

Voor de beënting werden cellen tot een dichtheid van 8,0 E6- cellen/ml geconcentreerd door centrifugeren (5 min., 3000 rpm) en gehersuspendeerd in het supernatant.Before inoculation, cells were concentrated to a density of 8.0 E6 cells / ml by centrifugation (5 min, 3000 rpm) and resuspended in the supernatant.

Lang lopende groeiexperimenten in waterhoudende twee-fasensystemen werden uitgevoerd in T-kolven volgens de "repeated-batch"-modus. De begin-celdichtheid was ongeveer 30 E4-cellen/ml. Het kweekvolume bedroeg 40 ml.Long-term growth experiments in two-phase aqueous systems were performed in T-flasks in the "repeated-batch" mode. Initial cell density was about 30 E4 cells / ml. The culture volume was 40 ml.

Onderzocht werden twee waterige twee-fasensystemen: ATPS-1 met 1,5% (m/v) PEG (mw 35-000) en 10% (m/v) dextraan (mw 40.000); ATPS-2 met 1% (m/v) PEG (mw 35-000) en 13% (m/v) dextraan (mw 40.000). In beide polymeer-houdende ATPS-media werd gebruik gemaakt van DME/F12 3:1 zonder NaCl. De twee-fasensystemen werden bereid uit voorraad-oplossingen van de polymeren en vier maal geconcentreerd medium op basis van DME/F12 3:1 zonder NaCl. De systemen werden door toevoeging van NaCl op de gewenste osmotische druk (300 mOs/kg) gebracht. De polymeren werden als 30# (m/m) oplossing bij 121eC gedurende 20 minuten gesteriliseerd.Two aqueous two phase systems were examined: ATPS-1 with 1.5% (w / v) PEG (MW 35-000) and 10% (w / w) Dextran (MW 40,000); ATPS-2 with 1% (w / v) PEG (MW 35-000) and 13% (w / w) Dextran (MW 40,000). DME / F12 3: 1 without NaCl was used in both polymer-containing ATPS media. The two phase systems were prepared from stock solutions of the polymers and four times concentrated medium based on DME / F12 3: 1 without NaCl. The systems were brought to the desired osmotic pressure (300 mOs / kg) by adding NaCl. The polymers were sterilized as a 30 # (m / m) solution at 121 ° C for 20 minutes.

Aan de media werd bij het begin 1% (m/v) foetaal kalfsserum toegevoegd. De kweekkolven werden bij 37onder lucht met 5% C02 geïncubeerd. Na telkens 2 of 3 dagen werden de cellen verdund met vers ATPS-medium tot een begin-celdichtheid van 15-20 E4-cellen/ml. Dagelijks werden monsters genomen die bij -20°C werden bewaard tot het moment van analyse.1% (w / v) fetal calf serum was initially added to the media. The culture flasks were incubated with 5% CO2 under air. After 2 or 3 days each, the cells were diluted with fresh ATPS medium to an initial cell density of 15-20 E4 cells / ml. Samples were taken daily and stored at -20 ° C until analysis.

De verdelingscoëfficiënt, die is gedefinieerd als de concentratie van een component in de bovenste fase gedeeld door de concentratie van die component in de onderste fase, is voor het hybridomaprodukt (mono-klonaal antilichaam) in ATPS-1 0,08 en in ATPS-2 0,02.The partition coefficient, defined as the concentration of a component in the upper phase divided by the concentration of that component in the lower phase, for the hybridoma product (monoclonal antibody) in ATPS-1 is 0.08 and in ATPS-2 0.02.

De cellen bevinden zich vrijwel uitsluitend in de onderste fase (verdelingscoëfficiënt * 0).The cells are almost exclusively in the bottom phase (partition coefficient * 0).

In de bijgaande figuren 1 en 2 is het verloop van de celconcentra-ties en produktconcentraties weergegeven voor een "repeated-batch" -kweek. Volgens deze kweekmethode wordt, telkens wanneer de kweekfles volgegroeid is (hoge celconcentraties), het kweekmengsel verdund met vers medium (lage celconcentraties). Figuur 1 geeft de concentraties weer voor medium ATPS-1 en figuur voor ATPS-2. De open cirkels in de figuren geven het aantal levende cellen per ml weer volgens de waarden op de linker as; het betreft de bruto-concentratie, d.w.z. het aantal cellen gedeeld door het volume van onder- en bovenfase. De pieken en dalen in de celcontratie zijn het gevolg van de "repeated-batch"-methode. De gesloten cirkels geven de produktconcentratie weer volgens de waarden van de rechter as. Ook dit is een bruto-concentratie. De produktconcentraties zijn telkens voor het verdunnen gemeten. De pijl in de figuren geeft de overgang op serumvrij medium aan.The accompanying Figures 1 and 2 show the progression of the cell concentrations and product concentrations for a "repeated-batch" culture. According to this culture method, every time the culture bottle is full (high cell concentrations), the culture mixture is diluted with fresh medium (low cell concentrations). Figure 1 shows the concentrations for medium ATPS-1 and figure for ATPS-2. The open circles in the figures represent the number of live cells per ml according to the values on the left axis; it concerns the gross concentration, i.e. the number of cells divided by the volume of the lower and upper phases. The peaks and troughs in the cell concentration are the result of the "repeated-batch" method. The closed circles represent the product concentration according to the values of the right axis. This is also a gross concentration. The product concentrations were each measured before dilution. The arrow in the figures indicates the transition to serum-free medium.

Voorbeeld IIExample II

Gebruik werd gemaakt van cellijn BIF 6A7 en tweefasensysteem ATPS-2 zonder serum {zie voorbeeld I). De entprocedure en het ent-materiaal waren dezelfde als in voorbeeld I. De beginconcentratie van de cellen was echter 4.105/ml. Tijdens een batch-experiment in een geroerde fles (spinner-fles), met een kweekvolume van 100 ml werd exponentiële groei waargenomen. Tijdens de kweek waren de twee waterige fasen als een goed gemengde emulsie aanwezig. De volumeverhouding tussen de beide fasen bedroeg 1/18 (boven/onder). Dat de cellen ook in emulsies van ATPS-2 kunnen groeien is van belang voor de kweek in zgn. mixer-settler-bio-reactoren. In figuur 3 is de groei van de cellen weergeven.Cell line BIF 6A7 and two-phase system ATPS-2 without serum were used (see example I). The inoculation procedure and the inoculum were the same as in Example 1. However, the initial concentration of the cells was 4,105 / ml. Exponential growth was observed during a batch experiment in a stirred bottle (spinner bottle), with a culture volume of 100 ml. During the culture, the two aqueous phases were present as a well-mixed emulsion. The volume ratio between the two phases was 1/18 (top / bottom). The fact that the cells can also grow in emulsions of ATPS-2 is important for the culture in so-called mixer-settler bio-reactors. Figure 3 shows the growth of the cells.

Vergelijkend voorbeeldComparative example

Bij batch-gewijze kweek van hybridoma BIF 6A7 (1/5 verdunning van ent-materiaal volgens Voorbeeld I) in een waterig twee-fasensysteem bestaande uit 5 gew.# PEG 2000, PEG 10.000 of PEG 35*000 met 5 gew.JÏ dextraan 500.000 en DME/F12 3:1 (concentratie 0,63), natriumchloride en natriumbicarbonaat (320 mOs/kg in het medium) in T-kolven van 50 ml werd celgroei waargenomen; in het geval van PEG 2000 werd er echter geen twee-fasensysteem gevormd, en in het geval van PEG 10.000 en 35-000 werd er weliswaar een twee-fasensysteem gevormd, maar concentreerden de cellen zich aan het grensvlak in plaats van in de onderliggende fase. Werd in plaats van 5# dextraan 500.000 55· dextraan 40.000 gebruikt (met 5% PEG 35-000), dan verzamelden de cellen zich geheel in de dextraanfase.Batch culture of hybridoma BIF 6A7 (1/5 dilution of inoculum according to Example I) in an aqueous two-phase system consisting of 5 wt. # PEG 2000, PEG 10,000 or PEG 35 * 000 with 5 wt. Dextran 500,000 and DME / F12 3: 1 (concentration 0.63), sodium chloride and sodium bicarbonate (320 mOs / kg in the medium) in 50 ml T flasks, cell growth was observed; however, in the case of PEG 2000, no two-phase system was formed, and in the case of PEG 10,000 and 35-000, although a two-phase system was formed, the cells concentrated at the interface rather than in the underlying phase . If instead of 5 # dextran 500,000 55 · dextran 40,000 was used (with 5% PEG 35-000), the cells collected completely in the dextran phase.

Claims

A method for culturing animal cells, characterized in that the cells are grown in an aqueous two-phase system containing at least two demixing polymers.

The method of claim 1, wherein the two-phase system contains polyethylene glycol.

The method of claim 2, wherein the polyethylene glycol has an average molecular weight of at least 20,000.

The method of claim 3. wherein the polyethylene glycol has an average molecular weight of at least 35-000.

A method according to any one of claims 1-4, wherein the two phase system contains 1.0 to 5.0% by weight of polyethylene glycol.

6. A method according to any one of claims 1-5. wherein the two phase system contains dextran or a dextrin.

The method of claim 6, wherein the dextran has an average molecular weight of up to 70,000.

The method of claim 7. wherein the dextran has an average molecular weight between 1,500 and 45,000.

The method of any one of claims 6-8, wherein the two-phase system contains 5 to 15% by weight dextran.

10. A method according to any one of claims 1-9. the two phase system having an osmotic pressure of 260-360 mOs / kg.

A method according to any one of claims 1-10 for the production of monoclonal antibodies.