NL9102052A - Nucleotide assay affiniteitssensor op basis van geinduceerde afbuiging van licht (diana). - Google Patents

Description

NUCLEOTIDE ASSAY AFFINITEITSSENSOR OP BASIS VAN GEÏNDUCEERDE AFBUIGING VAN LICHT (DIANA).

BESCHRIJVING

De uitvinding betreft een techniek en een instrument voor het meten van een biochemische reaktie, bijvoorbeeld een immuunreaktie, of het binden van een nucleotide met z’n specifieke partner aan het oppervlak van een optische golfgeleider in een vloeibaar medium, en is gebaseerd op de afbuiging van licht in de planaire optische golfgeleider, veroorzaakt door de biochemische reaktie.

Uit de internationale octrooiaanvrage WO 88/07202 is een werkwijze bekend om een ligand te bepalen door middel van de binding met z’n specifieke bindingspartner op het oppervlak van een metaallaag waarin een evanescent veld kan worden opgewekt. Door gebruik te maken van "Surface Plasmon Resonance" kan de binding van het ligand continu worden waargenomen door de intensiteit van het gereflekteerde licht te meten.

Een andere methode om de aanwezigheid van een ligand in een vloeibaar medium te bepalen, is bekend uit "The Potential of the Bulk Acoustic Wave Device as a Liquid Phase Immunosensor", IEEE Transaction on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency control, Vol. UFFC-34, No. 2, maart 1987, door M. Thompson et.al., waar het monster in contact gebracht wordt met z’n specifieke bindingspartner op een trillend voorwerp, waarna de verandering in de frequentie dan wel de voortplantingssnelheid van ingestraalde geluidsgolven informatie geven over het bindingsproces.

Van dergelijke werkwijzen is bekend dat de gevoeligheid en soms ook de reproduceerbaarheid onvoldoende is.

Door gebruik te maken van het evanescente veld van optische golfgeleiders voor het bepalen van biochemische reakties, waar de binding van het ligand plaats vindt aan het oppervlak van de golfgeleider, is het mogelijk de gevoeligheid van het meetinstrument te vergroten door de lengte van de golfgeleider die blootstaat aan de ligand, te vergroten. Een voorbeeld van deze methode staat beschreven in "Development of an Optical Waveguide Interferometric Immunosensor", Sensors and Actuators B, vol. 4, 1991, pag. 297-299, door R.G. Heideman et.al. Een nadeel van deze en andere methoden die gebruik maken van het evanescent veld van een optische golfgeleider, is dat deze apparaten niet alleen gevoelig zijn voor biochemische reakties aan het oppervlak van de golfgeleider, maar ook voor veranderingen in de brekingsindex van het medium waarin het monster zich bevindt, binnen de indringdiepte van het evanescente veld van het licht dat door de de golfgeleider propageert. Dit betekent dat instrumenten die gebruik maken van het evanescente veld van een optische golfgeleider gevoelig zijn voor veranderingen in de brekingsindex van het vloeibare medium waarin het apparaat zich bevindt.

De bedoeling van onze uitvinding is een instrument te leveren dat zeer gevoelig is voor biochemische reakties, maar geen van de eerder genoemde nadelen heeft. In onze uitvinding vindt het binden van de ligand plaats op het oppervlak van een optische golfgeleider, hetgeen leidt tot het afbuigen van licht dat propageert door de golfgeleider, hetgeen gemeten wordt. Echter een verandering in de brekingsindex van het medium waarin de golfgeleider zich bevindt zal niet leiden tot zo’n afbuiging. Dit levert een instrument op, dat uitsluitend zeer gevoelig is voor biochemische reakties aan het oppervlak van de golfgeleider.

In onze uitvinding resulteert het binden van de ligand tot een niet-uniforme dikte van de ligand laag op het golfgeleider oppervlak, met de dikte niet-uniformiteit in de richting loodrecht op de propagatie richting van het licht dat door de golfgeleider loopt. Deze niet-uniforme laag aangroei van de ligand is het gevolg van een behandeling (chemisch of fysisch) van het golfgeleider oppervlak.

Deze behandeling resulteert in het hierna te beschrijven gedrag van de moleculen die specifiek zijn tegen de aan te tonen liganden, die aan het golfgeleider oppervlak gekoppeld worden. In het ideale geval heeft de laag receptor moleculen een uniforme dikte, en een uniform brekingsindex profiel (dus de laag is optisch gezien uniform), maar vertoont een chemische niet-uniformiteit (gradient) in de richting loodrecht op de propagatierichting van het door de golfgeleider te leiden licht. Als nu een monster met daarin de ligand die aangetoond moet worden, in contact wordt gebracht met de uitvinding, zal de binding van de liganden resulteren in de hiervoor beschreven aangroei van een niet-uniforme laagdikte van liganden aan het oppervlak van de golfgeleider, resulterend in een afbuiging van het door de golfgeleider propagerende licht in.de richting loodrecht op deze propagatie richting, hetgeen kan worden gemeten. Doordat de golfgeleider-receptorlaag combinatie optisch gezien uniform is, zullen brekingsindex veranderingen van het vloeibare medium waarin de uitvinding is geplaatst, niet resulteren in zo’n afbuiging. De uniformiteit van de receptorlaag is niet noodzakelijk, maar wel prefereerbaar, vanwege de daarbij horende gereduceerde omgevingsgevoelig-heid.

Een andere mogelijkheid bestaat uit het coaten van het golfgeleider oppervlak met een uniforme laag van receptormoleculen, waarna het monster met de aan te tonen liganden in contact wordt gebracht met de uitvinding, op een zodanige manier dat de aangroei van de liganden toch leidt tot zo’n afbuiging. Dit kan worden bereikt door het monster te laten diffunderen, of te stromen, in de richting loodrecht op de propagatierichting van het geleide licht, resulterend in een inhomogene groei van de ligand laag.

De grootte van de afbuiging van het licht dat door de golfgeleider propageert, geïnduceert door de binding van de liganden, hangt af van de gebruikte golfgeleider configuratie, van de grootte en de aard van de chemische gradient van de receptorlaag, van de polarisatierichting en de golflengte van het gebruikte laserlicht, van de breedte van de laserstraal in de golfgeleider, en van de lengte van het gedeelte van de planaire golfgeleider dat voor de binding van de liganden wordt gebruikt (de interaktielengte L).

De uitvinding zal worden toegelicht aan de hand van de figuren. Allereerst wordt in figuur 1 de dwarsdoorsnede en het bovenaanzicht van een planaire golfgeleider gegeven. De koppeling van laserlicht in en uit de golfgeleider kan b.v. geschieden met behulp van zogenaamde tralie-koppelaars boven op de golfgeleider (zie figuur 1), maar kan ook plaatsvinden door licht aan te bieden aan de gekliefde of gepolijste eidnvlakken van de planaire golfgeleider. Met beide methoden kan tevens het licht eerst worden ingekoppeld in een fiber (de zogenaamde lead fiber), die het licht dan leidt naar de beschreven uitvinding, en daarna worden ingekoppeld in de planaire golfgeleider door gebruik te maken van de bovenbeschreven manieren. Hiermee wordt een zeer flexibel instrument verkregen met gescheiden detektie- en meetkanten.

De planaire golfgeleider wordt dan behandeld, chemisch of fysisch, zodanig dat de receptor moleculen gekoppeld worden aan het golfgeleider oppervlak op zo’n manier, dat de laag optische gezien (dikte, brekingsindex) uniform is, maar chemisch gezien niet-uniform is, met de chemische gradient loodrecht op de propagatierichting van het licht dat door de golfgeleider propageert. Een schematische figuur van de dwarsdoorsnede van de planaire golfgeleider in het interaktielengte gedeelte (zie figuur 1) na de coating van de receptor moleculen is gegeven in figuur 2a. De gebieden van de receptor moleculen die in staat zijn de ligand moleculen te binden, zijn aangegeven met een asterisk (*).

Zoals al eerder beschreven, is het ook mogelijk om het golfgeleider oppervlak te coaten met een ook chemisch gezien unforme laag receptor moleculen, zie figuur 2b. Het is dan echter noodzakelijk om het monster toe te voegen op een zodanige manier (stromen, diffunderen) dat de aangroei van liganden op het golfgeleider oppervlak een niet-uniforme laag tot gevolg heeft, met de laagdikte gradient in de richting loodrecht op de propagatie richting van het door de golfgeleider propagerende licht, resulterend in een afbuiging van dit licht.

Na de coating met receptor moleculen wordt de uitvinding in contact gebracht met het vloeibare medium waaruit het monster bestaat. Als het monster de aan te tonen liganden bevat, zullen deze specifiek binden met de receptor moleculen, resulterend in de aangroei van een ligand laag die een niet-uniforme laagdikte bezit, zie figuur 3. De resulterende afbuiging van het licht dat door de planaire golfgeleider propageert, kan bijvoorbeeld worden gemeten met behulp van een intensiteit-split-detector, nadat het licht uit de golfgeleider is gekoppeld, zie figuur 4.

Claims (7)

1. De combinatie van het gebruik van een planaire optische golfgeleider met een laag van receptor moleculen, zoals beschreven in de volgende alinea, die specifiek zijn tegen het aan te tonen ligand, op het golfgeleider oppervlak. Dit resulteert in een afbuiging van het door de golfgeleider loppende licht in de richting loodrecht op de propagatie richting, als de binding van de aan te tonen liganden plaatsvindt. De receptor moleculen vormen een laag op het golfgeleider oppervlak, die prefereerbaar maar niet noodzakelijkerwijs uniform is wat betreft dikte en brekingsindex profiel, maar niet-uniform in chemische gedrag, met deze chemische gradient in de richting loodrecht op de propagatie richting van het door de golfgeleider lopende licht.

2. Het gebruik van een planaire optische golfgeleider met een laag van receptor moleculen die homogeen is in optische opzicht (dikte, brekingsindex profiel) en chemisch opzicht, waarbij de receptor moleculen specifiek zijn tegen de aan te tonen liganden, in combinatie met elke methode van toediening van een monster die de aan te tonen liganden bevat, mits die toediening resulteert in de aangroei van een ligand laag die niet-uniform is in de richting loodrecht op de propagatierichting van het door de golfgeleider lopende licht, resulterend in de afbuiging van dit licht.

3. Het gebruik van de combinatie van het instrument als beschreven in conclusies 1 of 2, met een instrument dat in staat is om een afbuiging te meten, zoals bijvoorbeeld een intensiteits-split detector, ofwel vast gemonteerd aan de planaire optische golfgeleider, ofwel daar in geïntegreerd, met als resultaat een biochemische sensor.

4. Het gebruik van een laser lichtbron zoals een gaslaser (bijvoorbeeld een Helium-Neon laser) of een halfgeleider laserdiode, in combinatie met een fiberoptische golfgeleider te gebruiken als lead fiber, in combinatie met het instrument als beschreven in conclusies 1, 2 en 3 met als doel de mogelijkheid tot het verkrijgen van een biochemische sensor met "remote" werking. De lead fiber kan vast gemonteerd zitten aan de planaire golfgeleider. Tussen de lead fiber en de koppelingsmechanis-men die eerder in de beschrijving zijn beschreven, kan een microlens of gradient index lens zitten, tevens vast gemonteerd door middel van verlijming, of smelting, aan zowel de lead fiber als de planaire optische golfgeleider.

5. Het gebruik van het instrument als beschreven in conclusies 1 t/m 4 voor invasieve metingen. Dit kan worden bereikt door gebruik te maken van de lead fiber optie, waarbij de lead fiber vast zit gemonteerd aan de planaire golfgeleider, ofwel aan de tralie koppelaar, ofwel aan het gepolijste of gekliefde eindvlak van de planaire golfgeleider.

6. Het gebruik van de techniek als beschreven in "A wettability Gradient Method for Studies of Macromolecular Interactions at the Liquid/Solid Interface", Journal of Colloid and Interfacial Science, Vol. 119, No. 1, september 1987, door H. Elwing et.al., met als doel een laag van receptor moleculen op het oppervlak van een planaire optische golfgeleider te verkrijgen die optisch gezien uniform is (dikte, brekingsindex profiel) maar chemisch gezien niet-uniform is, met de chemische gradient in de richting loodrecht op de propagatie richting van het door de golfgeleider lopende licht.

7. Het gebruik van de techniek van diffusie of stroming van de aan te tonen liganden zoals aanwezig in het monster, in een richting loodrecht op de propagatie richting van het door de golfgeleider lopende licht, waarbij op het golfgeleider oppervlak een chemisch en optisch gezien uniforme laagdikte van receptor moleculen aanwezig is. Het resultaat is de aangroei van een niet-uniforme laag van liganden, leidend tot een afbuiging van het door de golfgeleider lopende licht, in de richting van het stromen of het diffunderen.