NL9002157A - DNA FRAGMENTS AND DNA PROBES AND PRIMERS BASED ON THAT. - Google Patents
DNA FRAGMENTS AND DNA PROBES AND PRIMERS BASED ON THAT. Download PDFInfo
- Publication number
- NL9002157A NL9002157A NL9002157A NL9002157A NL9002157A NL 9002157 A NL9002157 A NL 9002157A NL 9002157 A NL9002157 A NL 9002157A NL 9002157 A NL9002157 A NL 9002157A NL 9002157 A NL9002157 A NL 9002157A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- dna
- methicillin
- probe
- staphylococcus
- resistant
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Titel: DNA fragmenten en daarop gebaseerde DNA-probes en primers.Title: DNA fragments and DNA probes and primers based thereon.
De uitvinding heeft betrekking op een DNA fragment dat afgeleid is van een methicilline-resistente Staphylococcus stam, alsmede op een op zo'n DNA fragment gebaseerde DNA-probe voor de detectie van Staphylococcus bacteriën die resistent zijn tegen methicilline en verwante voor β-lactamase ongevoelige penicillines en DNA-primer voor DNA-amplificatie door middel van een polymerase kettingreactie.The invention relates to a DNA fragment derived from a methicillin-resistant Staphylococcus strain, and to a DNA probe based on such a DNA fragment for the detection of Staphylococcus bacteria that are resistant to methicillin and related beta-lactamase insensitive penicillins and DNA primer for DNA amplification by a polymerase chain reaction.
Van de Staphylococcus bacteriën is Staphylococcus aureus de belangrijkste voor mensen pathogene bacterie. Het verschijnen van methicilline-resistente stammen van deze bacterie is een ernstig probleem bij de antibacteriële chemotherapie (1,2). Dergelijke stammen zijn resistent tegen methicilline en ook tegen nauw verwante voor β-lactamase ongevoelige penicillines zoals cloxacilline, flucloxacilline, enz. In de hierna volgende beschrijving zullen deze stammen kortheidshalve als methicilline-resistente stammen worden aangeduid.Of the Staphylococcus bacteria, Staphylococcus aureus is the most important bacterium that is pathogenic to humans. The appearance of methicillin-resistant strains of this bacterium is a serious problem in antibacterial chemotherapy (1,2). Such strains are resistant to methicillin and also to closely related β-lactamase insensitive penicillins such as cloxacillin, flucloxacillin, etc. In the following description, these strains will be referred to as methicillin resistant strains for brevity.
Methicilline-resistentie is gebleken samen te gaan met de aanwezigheid van een uniek penicilline-bindend proteïne (PBP2a of PBP2') dat klaarblijkelijk niet aanwezig is in gevoelige Staphylococcus stammen. De genetische determinant voor methicilline-resistentie (mee) bevindt zich op het chromosomale DNA (3). Diverse publikaties zijn gewijd aan de betrokkenheid van mee en mogelijk nog een tweede factor bij de methicilline-resistentie van Staphylococcus stammen (4-10). Door experimenten, waarbij het mee-een van een methicilline-resistent S. aureus isolaat door insertie van een transposon werd geïnactiveerd, is aangetoond dat het mec-aen noodzakelijk is voor resistentie (7). In methicilline-resistente stammen van Staphylococcus epidermidis, £.hhemolytious, S.hsminis., S.simulans en S.saprophvticus komt een penicilline bindend eiwit voor dat vergelijkbaar is met het produkt van het mec-gen (8,9) en verantwoordelijk is voor resistentie tegen methicilline. Bij de regulatie van de expressie van methicilline resistentie is nog een tweede element betrokken, aangeduid met mecR (10), dat echter niet in alle resistente stammen voorkomt.Methicillin resistance has been shown to be associated with the presence of a unique penicillin binding protein (PBP2a or PBP2 ') that is apparently not present in susceptible Staphylococcus strains. The genetic determinant for methicillin resistance (co) is located on the chromosomal DNA (3). Various publications have been devoted to the involvement of mee and possibly a second factor in the methicillin resistance of Staphylococcus strains (4-10). Experiments inactivating the part of a methicillin-resistant S. aureus isolate by inserting a transposon have shown that the molecule is necessary for resistance (7). A methicillin-resistant strain of Staphylococcus epidermidis, Hemhemytious, S.hsminis, S.simulans and S.saprophvticus contains a penicillin binding protein similar to the product of the mec gene (8.9) and responsible for resistance to methicillin. Regulation of the expression of methicillin resistance involves a second element, designated mecR (10), which, however, does not exist in all resistant strains.
De in de praktijk gebruikelijke methode voor het aantonen van methicilline-resistente Staphylococcus stammen bestaat uit het kweken van de stam op agar-platen in aanwezigheid van methicilline gedurende ongeveer 48 uur.The conventional method for detecting methicillin-resistant Staphylococcus strains consists of growing the strain on agar plates in the presence of methicillin for about 48 hours.
Naast deze conventionele methode is in de klinische laboratoria het gebruik van zogenaamde DNA-probes sterk in opkomst. DNA-probes zijn kleine segmenten enkelstrengig nucleïnezuur, gelabeld met bijvoorbeeld een enzym of een radioisotoop, die zeer specifiek binden aan complementaire nucleïnezuursequenties (hybridisatie). De detectie van gebonden label duidt op de aanwezigheid van het aan te tonen pathogeen in een klinisch monster. Zo zijn probes ontwikkeld voor de detectie van bijvoorbeeld bacteriën, virussen, protozoa en zelfs schimmels. Er zijn al een aantal probe-kits commercieel verkrijgbaar. Een probleem bij het ontwikkelen van een probe is dat deze gevoelig en zeer specifiek moet zijn. Gestreefd wordt naar een zo klein mogelijke probe die voldoende specifiek is.In addition to this conventional method, the use of so-called DNA probes is rapidly emerging in clinical laboratories. DNA probes are small segments of single-stranded nucleic acid, labeled with, for example, an enzyme or a radioisotope, which bind very specifically to complementary nucleic acid sequences (hybridization). Bound label detection indicates the presence of the detectable pathogen in a clinical specimen. For example, probes have been developed for the detection of, for example, bacteria, viruses, protozoa and even fungi. A number of probe kits are already commercially available. A problem in developing a probe is that it must be sensitive and very specific. The aim is to have the smallest possible probe that is sufficiently specific.
Een probe voor de detectie van resistentie tegen een bepaald antibioticum is bijvoorbeeld bekend uit de Franse octrooiaanvrage 2.602.794. Deze aanvrage heeft betrekking op een DNA fragment dat tenminste een deel van het tetM-aen bevat, dat codeert voor een tetracycline-resistentie proteïne en waarvan de nucleotidesequentie is gegeven. Een dergelijk fragment kan worden gebruikt voor de bereiding van een DNA-probe voor de detectie van tetracycline-resistentie in een celkweek. De enige probe die bruikbaar blijkt is een tamelijk groot DNA fragment van 850 bp.A probe for the detection of resistance to a particular antibiotic is known, for example, from French patent application 2,602,794. This application relates to a DNA fragment containing at least part of the tetM gene encoding a tetracycline resistance protein and the nucleotide sequence of which has been given. Such a fragment can be used for the preparation of a DNA probe for the detection of tetracycline resistance in a cell culture. The only probe that proves useful is a fairly large 850 bp DNA fragment.
Ook voor het onderscheiden van methicilline-resistente en methicilline-gevoelige Staphylococcus stammen is hybridisatie analyse met behulp van DNA-probes voorgesteld (11). Hierbij is als DNA-probe een 3.9 kb HindlII restrictiefragment van chromosomaal DNA van een tegen methicilline resistente Staphylococcus aureus stam gebruikt, welk fragment hybridiseerde met het eerder door Beek et al. (5) beschreven 3.5 kb BcrlII restrictiefragment. De 3.9 kb DNA-probe hybridiseerde met chromosomaal DNA van alle geselecteerde methicilline-resistente Staphylococcus haemolvticus en Staphylococcus epidermidis stammen, terwijl geen hybridisatie optrad met de negatieve hybridisatie controles, te weten een methicilline-gevoelig Staphylococcus heamolyticus isolaat en een methicilline-gevoelig Staphylococcus epidermidis isolaat.Hybridization analysis using DNA probes has also been proposed to distinguish between methicillin-resistant and methicillin-sensitive Staphylococcus strains (11). As a DNA probe, a 3.9 kb HindII restriction fragment of chromosomal DNA of a methicillin resistant Staphylococcus aureus strain was used, which hybridized with the 3.5 kb BcrII restriction fragment described earlier by Beek et al. (5). The 3.9 kb DNA probe hybridized with chromosomal DNA from all selected methicillin-resistant Staphylococcus haemolvticus and Staphylococcus epidermidis strains, while no hybridization occurred with the negative hybridization controls, namely a methicillin-sensitive Staphylococcus heamolyticus isolate and a methicillin-susceptible Staphylococcus epidermidis .
De grootte (3.9 kb) en onbekende basenvolgorde van deze probe staan echter de ontwikkeling van gevoelige en specifieke tests in de weg. Hetzelfde geldt voor de onlangs voorgestelde (12) probe, die op een 1.1 kb BcrlII-Xbal fragment van het voor PBP2a coderende mee gen is gebaseerd.However, the size (3.9 kb) and unknown base order of this probe impede the development of sensitive and specific assays. The same applies to the recently proposed (12) probe, which is based on a 1.1 kb BcrlII-Xbal fragment of the gene encoding PBP2a.
Er is in de klinische praktijk een grote behoefte aan een gevoelige en specifieke DNA-probe voor de detectie van methicilline-resistente Staphylococcus bacteriën , in het bijzonder Staphylococcus aureus, maar ook Staphylococcus epidermidis. Staphylococcus saproohyticus. Staphylococcus haemolvticus. Staphylococcus warneri. Staphylococcus hominis. Staphylococcus simulans r enz. Evenzo is er grote behoefte aan DNA fragmenten die als DNA-primers in een PCR-techniek (Polymerase Chain Reaction) voor een specifieke amplificatie van DNA van methicilline-resistente Staphylococcus bacteriën kunnen worden toegepast.There is a great need in clinical practice for a sensitive and specific DNA probe for the detection of methicillin-resistant Staphylococcus bacteria, in particular Staphylococcus aureus, but also Staphylococcus epidermidis. Staphylococcus saproohyticus. Staphylococcus haemolvticus. Staphylococcus warneri. Staphylococcus hominis. Staphylococcus simulans r, etc. Likewise, there is a great need for DNA fragments that can be used as DNA primers in a polymer polymer chain reaction (PCR) technique for a specific amplification of DNA from methicillin-resistant Staphylococcus bacteria.
De uitvinding voorziet in deze behoeftes door middel van een DNA fragment, afgeleid van een tegen methicilline resistente Staphylococcus stam en in essentie bestaande uit de in de sequentielijst onder seq. id. nr. 1 getoonde nucleotidensequentie of uit een verwante nucleotidensequentie, zoals een van de in de sequentielijst onder seq. id. nrs. 2-8 getoonde nucleotidensequenties, dan wel uit een deel van een dergelijke nucleotidensequentie met een lengte van ten minste 14 nucleotiden.The invention addresses these needs by means of a DNA fragment derived from a methicillin resistant Staphylococcus strain and consisting essentially of those listed in the sequence list under seq. id. No. 1 nucleotide sequence or from a related nucleotide sequence, such as one of those listed in the sequence list under seq. id. Nos. 2-8 shown nucleotide sequences, or from part of such a nucleotide sequence with a length of at least 14 nucleotides.
Het DNA fragment volgens de uitvinding is afgeleid van een tegen methicilline-resistente Staphylococcus stam. In beginsel is de uitvinding niet beperkt tot DNA fragmenten die van een bepaalde soort van Staphylococcus bacteriën zijn afgeleid. Zo kunnen de DNA fragmenten afgeleid zijn van een tegen methicilline-resistente stam van Staphylococcus aureus. Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophvticus. Staphylococcus haemolvticus, Staphylococcus warneri. Staphylococcus hominis. Staphylococcus simulans. enz. De DNA fragmenten met de nucleotidensequenties volgens de Seq. ld. Nrs. 1-8 zijn alle afgeleid van methicilline-resistente Staphylococcus aureus stammen. Desondanks kunnen ze ook worden gebruikt voor het detecteren van methicilline-resistente stammen van andere soorten van Staphylococcus bacteriën, dankzij de grote homologie tussen de betrokken sequenties van de verschillende Staphylococcus soorten.The DNA fragment of the invention is derived from a methicillin-resistant Staphylococcus strain. In principle, the invention is not limited to DNA fragments derived from a specific species of Staphylococcus bacteria. For example, the DNA fragments may be derived from a methicillin-resistant strain of Staphylococcus aureus. Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophvticus. Staphylococcus haemolvticus, Staphylococcus warneri. Staphylococcus hominis. Staphylococcus simulans. etc. The DNA fragments with the nucleotide sequences according to the Seq. ld. Nos. 1-8 are all derived from methicillin resistant Staphylococcus aureus strains. Nevertheless, they can also be used to detect methicillin-resistant strains from other Staphylococcus bacteria species, due to the large homology between the involved sequences of the different Staphylococcus species.
De in de sequentielijst onder seq.id. nr. 1 getoonde nucleotidensequentie is afgeleid van de methicilline-resistente S.aureus stam 05723. Met een daarmee verwante nucleotidensequentie wordt bedoeld de overeenkomstige sequentie in andere methicilline-resistente Staphylococcus stammen, zowel methicilline-resistente stammen van de soort S.aureus als methicilline-resistente stammen van andere Staphylococcus soorten (zoals de hierboven genoemde soorten). Voorbeelden van dergelijke verwante sequenties worden gegeven in de sequentielijst onder de seq.id. nrs. 2-8, welke resp. zijn afgeleid van de methicilline-resistente S.aureus stammen 00646, A216, 02599, 214, 215C, 06231 en 1335. Zoals deze voorbeelden laten zien, bestaat er een grote mate van homologie tussen deze sequenties, maar kunnen ook significante verschillen in lengte optreden: de DNA sequenties, afgeleid van de S.aureus stammen 02599, 214, 215C, 06231 en 1335, blijken ca. 70 nucleotiden korter te zijn dan die van de andere getoonde voorbeelden.The in the sequence list under seq.id. No. 1 nucleotide sequence shown is derived from the methicillin-resistant S.aureus strain 05723. A related nucleotide sequence means the corresponding sequence in other methicillin-resistant Staphylococcus strains, both methicillin-resistant strains of the species S.aureus and methicillin- resistant strains of other Staphylococcus species (such as the species mentioned above). Examples of such related sequences are provided in the sequence listing under the seq.id. Nos. 2-8, which resp. are derived from the methicillin-resistant S.aureus strains 00646, A216, 02599, 214, 215C, 06231 and 1335. As these examples show, there is a high degree of homology between these sequences, but significant differences in length may also occur The DNA sequences, derived from the S.aureus strains 02599, 214, 215C, 06231 and 1335, appear to be about 70 nucleotides shorter than those of the other examples shown.
De uitvinding verschaft DNA probes en primers, die op DNA fragmenten als hierboven gedefinieerd zijn gebaseerd. DNAThe invention provides DNA probes and primers based on DNA fragments as defined above. DNA
probes zijn gelabelde DNA fragmenten waarmee complementaire sequenties kunnen worden gedetecteerd. Bruikbare labeling methoden zijn aan de deskundige bekend. Bij wijze van voorbeeld worden genoemd labeling met radioisotopen, enzymen, fluorescerende stoffen, pigmenten, het biotine-avidine systeem, enz. DNA probes volgens de uitvinding kunnen worden gebruikt voor de detectie van Staphylococcus bacteriën die resistent zijn tegen methicilline en verwante voor β-lactamase ongevoelige penicillines.probes are labeled DNA fragments capable of detecting complementary sequences. Useful labeling methods are known to the person skilled in the art. For example, mention is made of labeling with radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, pigments, the biotin-avidin system, etc. DNA probes according to the invention can be used for the detection of Staphylococcus bacteria that are resistant to methicillin and related to β-lactamase insensitive penicillins.
De uitvinding voorziet dan ook tevens in een diagnostische testkit voor de detectie in een monster van Staphylococcus bacteriën die resistent zijn tegen methicilline en verwante voor β-lactamase ongevoelige penicillines, omvattende a) een DNA probe volgens de uitvinding, b) een reagens dat hybridisatie van de probe met het DNA van de te detecteren bacteriën in het monster mogelijk maakt, c) een hybridisatievaatje waarin de hybridisatie tussen de probe en het DNA van de bacteriën kan optreden, d) een geschikte wasvloeistof voor het verwijderen van niet gehybridiseerde probe, en e) middelen voor het analyseren van de eventuele hybridisatie.The invention therefore also provides a diagnostic test kit for the detection in a sample of Staphylococcus bacteria resistant to methicillin and related β-lactamase insensitive penicillins, comprising a) a DNA probe according to the invention, b) a reagent that hybridizes allows the probe containing the DNA of the bacteria to be detected in the sample, c) a hybridization vessel in which the hybridization between the probe and the DNA of the bacteria can occur, d) a suitable washing liquid for removing un-hybridized probe, and e means for analyzing the possible hybridization.
Ook voorziet de uitvinding in een werkwijze voor het detecteren in een monster van Staphylococcus bacteriën die resistent zijn tegen methicilline en verwante voor β-lactamase ongevoelige penicillines, waarbij men a) het DNA van de bacteriën in het monster isoleert, b) het geïsoleerde DNA in aanraking brengt met een DNA probe volgens de uitvinding in aanwezigheid van een reagens dat hybridisatie van de probe met het geïsoleerde DNA mogelijk maakt, c) niet gehybridiseerde probe uitwast, en e) de eventuele hybridisatie analyseert.The invention also provides a method for detecting in a sample of Staphylococcus bacteria resistant to methicillin and related β-lactamase insensitive penicillins, wherein a) the DNA of the bacteria in the sample is isolated, b) the isolated DNA in contacts a DNA probe according to the invention in the presence of a reagent which permits hybridization of the probe with the isolated DNA, c) washes out non-hybridized probe, and e) analyzes the possible hybridization.
DNA primers zijn DNA fragmenten die complementair zijn aan een gedeelte van een "target" DNA en na hybridisatie daaraan dienst kunnen doen als startpunt voor DNA polymerase, dat in aanwezigheid van de noodzakelijke bouwstoffen de aan het target DNA complementaire keten synthetiseert. Door twee schikte primers in een DNA fragment volgens de uitvinding te kiezen kan op een zeer gevoelige en specifieke wijze met behulp van de PCR methode de aanwezigheid in een monster van DNA van methicilline-resistente Staphyloccocus stammen worden vastgesteld.DNA primers are DNA fragments that are complementary to a part of a "target" DNA and after hybridization can serve as a starting point for DNA polymerase, which synthesizes the complementary chain to the target DNA in the presence of the necessary building materials. By selecting two suitable primers in a DNA fragment according to the invention, the presence in a sample of DNA of methicillin-resistant Staphyloccocus strains can be determined in a very sensitive and specific manner using the PCR method.
Primers zullen in het algemeen relatief kort zijn, mits ze nog voldoende specifiek zijn voor het beoogde target DNA. DNA fragmenten met een lengte van 14 nucleotiden zijn veelal voldoende, maar iets langere fragmenten, zeg van 15 tot 40, liefst van 18 tot 32 nucleotiden, hebben de voorkeur. Dergelijke relatief korte DNA fragmenten kunnen ook voor DNA probes worden gebruikt, maar langere fragmenten, in het bijzonder de volledige sequenties zoals weergegeven in de sequentielijst, hebben in dat geval de voorkeur.Primers will generally be relatively short, provided they are still sufficiently specific to the target DNA target. DNA fragments with a length of 14 nucleotides are usually sufficient, but slightly longer fragments, say from 15 to 40, most preferably from 18 to 32 nucleotides, are preferred. Such relatively short DNA fragments can also be used for DNA probes, but longer fragments, especially the full sequences as shown in the Sequence Listing, are preferred in that case.
De uitvinding voorziet verder in een plasmide, in essentie bestaande uit een bacteriële kloneringsvector met daarin een uit een DNA fragment volgens de uitvinding bestaande insertie, en in bacteriën die ten minste één zo'n plasmide bevatten.The invention further provides a plasmid consisting essentially of a bacterial cloning vector containing an insert consisting of a DNA fragment of the invention, and bacteria containing at least one such plasmid.
Een DNA fragment met de nucleotidensequentie volgens Seq. Id. Nr. 1, bevindt zich in het plasmide pAA29-l in E.coli DH5aF', welke stam op 15 november 1989 gedeponeerd is onder toegangsnr. CBS 588.89 bij het Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) te Baarn, Nederland. Een op dit DNA fragment gebaseerde probe is zeer specifiek. Bij alle onderzochte Staphylococcus stammen gaf deze probe een perfecte correlatie met methicilline-resistentie.A DNA fragment with the nucleotide sequence of Seq. Id. No. 1, is contained in the plasmid pAA29-1 in E.coli DH5aF ', which strain was deposited on November 15, 1989 under accession no. CBS 588.89 at the Central Bureau of Mold Cultures (CBS) in Baarn, the Netherlands. A probe based on this DNA fragment is very specific. In all Staphylococcus strains examined, this probe gave a perfect correlation with methicillin resistance.
Een DNA fragment volgens de uitvinding kan met de volgende werkwijze worden verkregen: a) partiële digestie van gezuiverd DNA van een methicilline-resistente Staphylococcus stam met bijv. Sau 3AI, b) hybridisatie van de verkregen fragmenten met gelabelde DNA-fragmenten van een methicilline-gevoelige Staphylococcus stam, c) verzamelen van de vrije DNA-fragmenten, d) herhaling van de stappen b) en c), e) ligatie van de verkregen fragmenten in een piasmide en transformatie van een geschikte bacteriestam met dit plasmide, f) kweken van de transformanten en isolatie van het DNA uit de transformanten, g) hybridisatie van het geïsoleerde DNA met gelabeld DNA van een klein aantal methicilline-resistente en methicilline-gevoelige Staohvlococcus stammen, h) selectie van de transformanten die alleen hybridisatie vertonen met DNA van de methicilline-resistente stam of stammen, i) digestie met bijv. PstI en EcoRl van het DNA van de geselecteerde transformanten, j) labeling op een gebruikelijke wijze van de gedigereerde DNA-fragmenten, k) hybridisatie van de gelabelde DNA-fragmenten met DNA van een groot aantal methicilline-resistente en methicilline-gevoelige Staphylococcus stammen, l) selectie van gelabelde DNA-fragmenten die alleen hybridisatie vertonen met DNA van methicilline-resistente stammen.A DNA fragment according to the invention can be obtained by the following method: a) partial digestion of purified DNA from a methicillin-resistant Staphylococcus strain with, for example, Sau 3AI, b) hybridization of the obtained fragments with labeled DNA fragments of a methicillin sensitive Staphylococcus strain, c) collecting the free DNA fragments, d) repeating steps b) and c), e) ligation of the obtained fragments into a piasmid and transformation of a suitable bacterial strain with this plasmid, f) cultivation of the transformants and isolation of the DNA from the transformants, g) hybridization of the isolated DNA with labeled DNA from a small number of methicillin-resistant and methicillin-sensitive Staohvlococcus strains, h) selection of the transformants showing hybridization only with DNA of the methicillin -resistant strain or strains, i) digestion with e.g. PstI and EcoRl of the DNA of the selected transformants, j) labeling on a usual wi Using the digested DNA fragments, k) hybridization of the labeled DNA fragments with DNA from a large number of methicillin-resistant and methicillin-sensitive Staphylococcus strains, l) selection of labeled DNA fragments showing hybridization only with DNA of methicillin- resistant strains.
Alle stappen van deze werkwijze bestaan uit op zichzelf bekende methoden, en zullen -voor zover nodig in het gedeelte "Materialen en Methoden" of in het Voorbeeld verder worden toegelicht.All steps of this method consist of methods known per se, and will be further explained as necessary in the "Materials and Methods" section or in the Example.
De Staphyloccus stammen die in de stappen a, b, d, g en k worden gebruikt, kunnen elke Staohvloccus stam of isolaat zijn, mits zij voldoen aan het desbetreffende kriterium van methicilline-resistentie of methicilline-gevoeligheid dat in de verschillende stappen vereist wordt.The Staphyloccus strains used in steps a, b, d, g and k can be any Staohvloccus strain or isolate, provided they meet the appropriate criterion of methicillin resistance or methicillin sensitivity required in the different steps.
Stap b) bestaat bij voorkeur uit hybridisatie in oplossing bij verhoogde temperatuur van de verkregen fragmenten met "sheared" gebiotinyleerde DNA-fragmenten van een methicilline-gevoelige Staphylococcus stam.Step b) preferably consists of solution hybridization at elevated temperature of the obtained fragments with "sheared" biotinylated DNA fragments of a methicillin-sensitive Staphylococcus strain.
Stap e) bestaat bij voorkeur uit ligatie van de verkregen fragmenten in de unieke BamHI restrictieplaats van pUC18, en transformatie van E.coli DH5aF' met dit plasmide.Step e) preferably consists of ligation of the obtained fragments into the unique BamHI restriction site of pUC18, and transformation of E.coli DH5aF 'with this plasmid.
Stap f) bestaat bij voorkeur uit kweken van de transformanten, lyse en DNA-fixatie op filters.Step f) preferably consists of culturing the transformants, lysis and DNA fixation on filters.
Stap g) bestaat bij voorkeur uit Southern-hybridisatie van het geïsoleerde DNA met gelabeld DNA van ten hoogste drie methicilline-resistente Staphylococcus stammen en ten hoogste drie methicilline-gevoelige Staphylococcus stammen.Step g) preferably consists of Southern hybridization of the isolated DNA with labeled DNA of up to three methicillin-resistant Staphylococcus strains and up to three methicillin-sensitive Staphylococcus strains.
In het hierna volgende voorbeeld wordt uitvoeriger beschreven op welke wijze de probe volgens de uitvinding kan worden verkregen. In combinatie met deze werkwijze wordt een andere werkwijze beschreven, welke begint met digestie met HinduI, maar niet tot een gewenste probe leidde. De specificiteit van de probe volgens de uitvinding blijkt uit de daarmee uitgevoerde hybridisatieproeven, die een perfecte correlatie tonen met methicilline-resistentie.The following example describes in more detail how the probe according to the invention can be obtained. In combination with this method, another method is described which starts with digestion with HinduI, but did not lead to a desired probe. The specificity of the probe according to the invention is evident from the hybridization tests performed therewith, which show a perfect correlation with methicillin resistance.
Materialen en methoden a) De isolaten van methicilline-resistente Staphylococcus aureus die bij de bereiding van de probe en bij de hybridisatieproeven werden gebruikt, worden beschreven in onderstaande tabel A. De isolaten van methicilline-gevoelige Staphylococcus aureus die bij de bereiding van de probe en bij de hybridisatieproeven werden gebruikt, worden beschreven in tabel B.Materials and Methods a) The isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus used in the preparation of the probe and in the hybridization experiments are described in Table A below. The isolates of methicillin-sensitive Staphylococcus aureus used in the preparation of the probe and hybridization tests are described in Table B.
De MIC's voor methicilline en gentamicine werden bepaald onder toepassing van de agar-verdunningsmethode. De MIC's voor methicilline werden bepaald door inoculatie van 100 μΐ van een 108 cfu/ml bacterie-suspensie op Mueller-Hinton-agar gevolgd door incubatie bij 30°C. Isolaten met een MIC > 4 werden als resistent beschouwd. De MIC's voor gentamycine werden bepaald door inoculatie van 100 μΐ van een suspensie van 106 cfu/ml op Isosensitest gevolgd door incubatie bij 37°C. Isolaten met een MIC > 4 werden als resistent beschouwd.The MICs for methicillin and gentamicin were determined using the agar dilution method. The MICs for methicillin were determined by inoculating 100 µl of a 108 cfu / ml bacterial suspension on Mueller-Hinton agar followed by incubation at 30 ° C. Isolates with MIC> 4 were considered resistant. The MICs for gentamycin were determined by inoculation of 100 μΐ of a suspension of 106 cfu / ml on Isosense test followed by incubation at 37 ° C. Isolates with MIC> 4 were considered resistant.
Tabel ATable A
Toegepaste methicilline-resistente Staphylococcus aureus» isolatenApplied methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates
1 Geïmporteerd met een patient uit Italië 2 Geïmporteerd met een patient uit Frankrijk 3 Geïmporteerd met een patient uit Portugal 4 Geïmporteerd met een patient uit Joegoslavië.1 Imported with a patient from Italy 2 Imported with a patient from France 3 Imported with a patient from Portugal 4 Imported with a patient from Yugoslavia.
b) Staphylococcus aureus DNA werd gezuiverd met de methode zoals beschreven door Lindberg c.s. (13), behalve dat na lyse van de bacteriën de suspensie werd geextraheerd met fenol/chloroform zoals beschreven door Maniatis c.s. (14). Na de eerste extractie werd het mengsel behandeld met RNase en nog een keer geextraheerd met fenol/chloroform. Plasmide DNA werd gezuiverd zoals beschreven door Maniatis c.s., gevolgd door centrifugering met CsCl dichtheidsgradiënt (14).b) Staphylococcus aureus DNA was purified by the method as described by Lindberg et al. (13), except that after lysis of the bacteria, the suspension was extracted with phenol / chloroform as described by Maniatis et al. (14). After the first extraction, the mixture was treated with RNase and extracted one more time with phenol / chloroform. Plasmid DNA was purified as described by Maniatis et al. Followed by centrifugation with CsCl density gradient (14).
c) Digesties met restrictie-endonucleases werden uitgevoerd volgens de voorschriften van de fabrikant (GIBCO Laboratories, Paisley, Renfrewshire, Groot-Brittannië).c) Digestions with restriction endonucleases were performed according to manufacturer's instructions (GIBCO Laboratories, Paisley, Renfrewshire, Great Britain).
d) De kweek, lyse en fixatie van transformanten op Zeta-probe-fliters is eerder beschreven (15).d) The culture, lysis and fixation of transformants on Zeta probe flashes has been previously described (15).
Het als probe gebruikte Staphylococcus aureus DNA werd gelabeld met a-32P-dCTP (specifieke activiteit 800 Ci/mmol; Amersham, Groot-Brittannië) -onder toepassing van een "nick-translatie"-kit van GIBCO. Nick-translaties werden uitgevoerd zoals aangegeven door de fabrikant. Het DNA van de plasmide-inserts werd gelabeld met digoxigenine van Boehringer (Mannheim, West-Duitsland) onder toepassing van incubatie-omstandigheden zoals aangegeven door de fabrikant. Southern-hybridisaties werden uitgevoerd zoals beschreven door Maniatis c.s. (14) .The Staphylococcus aureus DNA used as a probe was labeled with α-32P-dCTP (specific activity 800 Ci / mmol; Amersham, Great Britain) using a "nick translation" kit from GIBCO. Nick translations were performed as indicated by the manufacturer. The DNA from the plasmid inserts was labeled with digoxigenin from Boehringer (Mannheim, West Germany) under incubation conditions as indicated by the manufacturer. Southern hybridizations were performed as described by Maniatis et al. (14).
VoorbeeldExample
Een methode beschreven door Welcher c.s. (15) werd gebruikt om DNA-fragmenten die specifiek zijn voor methicilline-resistentie te verrijken. Hierbij werd gezuiverd DNA uit het methicilline-resistente isolaat 05723 partieel gedigereerd met Sau 3AI, waardoor fragmenten kleiner dan 4 kb werden verkregen. Teneinde D'NA-fragment en te vinden die specifiek zijn voor methicilline-resistente stammen werd hybridisatie in oplossing uitgevoerd onder toepassing van de Sau 3AI restrictiefragmenten en "sheared" gebiotinyleerde DNA-fragmenten van de methicilline-gevoelige stam Ps-47-8325.A method described by Welcher et al. (15) was used to enrich DNA fragments specific for methicillin resistance. Purified DNA from the methicillin-resistant isolate 05723 was partially digested with Sau 3AI to obtain fragments smaller than 4 kb. In order to find D'NA fragment specific for methicillin resistant strains, hybridization in solution was performed using the Sau 3AI restriction fragments and sheared biotinylated DNA fragments of the methicillin sensitive strain Ps-47-8325.
5 μg Sau 3AI fragmenten en 6 μg gebiotinyleerd DNA werden door verhitting gedenatureerd, waarna men ze bij 62°C in oplossing liet hybridiseren. Na 4 uur bij 62°C werd een suspensie van avidine-agarosekorrels toegevoegd. De gebiotinyleerde probe en de hybriden werden na 5 min bij kamertemperatuur tot een pellet gecentrifugeerd. De vrije DNA-fragmenten in oplossing werden verzameld en de boven beschreven handelwijze werd herhaald. De verkregen fragmenten werden geligeerd in de unieke BamHI restrictieplaats van pUC18.5 µg Sau 3AI fragments and 6 µg biotinylated DNA were denatured by heating and allowed to hybridize in solution at 62 ° C. After 4 hours at 62 ° C, a suspension of avidin agarose beads was added. The biotinylated probe and the hybrids were centrifuged after 5 min at room temperature. The free DNA fragments in solution were collected and the procedure described above was repeated. The resulting fragments were ligated into the unique BamHI restriction site of pUC18.
Daarnaast werd, als alternatieve procedure, gezuiverd DNA van het methicilline-resistente isolaat 05723 en de methicilline-gevoelige stam Ps-47-8325 gedigereerd met het restrictie-endonuclease HindlII en geanalyseerd op agarose-gel. Het methicilline-resistente isolaat vertoonde extra banden bij ongeveer 9 kb en 3.5 kb. Deze fragmenten werden geïsoleerd en gekloneerd in de unieke HindlII restrictieplaats van pUC18.In addition, as an alternative procedure, purified DNA from the methicillin resistant isolate 05723 and the methicillin sensitive strain Ps-47-8325 was digested with the restriction endonuclease HindIII and analyzed for agarose gel. The methicillin resistant isolate showed additional bands at approximately 9 kb and 3.5 kb. These fragments were isolated and cloned into the unique HindIII restriction site of pUC18.
Transformatie van Escherichia coli DH5aF' met de hierboven beschreven plasmiden leidde tot 770 klonen die een insert in ofwel de BamHI ofwel de HindlII restrictieplaats bevatten. De transformanten werden gekweekt op Zeta-Probe-filters en na lyse en DNA-fixatie geselecteerd met Southern-hybridisaties onder toepassing van 32P-gelabeld chromosomaal DNA uit één methicilline-resistent isolaat (A216) en 3 methicilline-gevoelige isolaten (isolaten 8075, 9838 en 9848) als probes. Negen transformanten werden geselecteerd die hybridisatie vertoonden met probe-DNA van de methicilline-resistente isolaten maar niet met probe-DNA van de gevoelige isolaten. De transformanten werden gekarakteriseerd door digesties met restrictie-endonucleases. De transformanten met een insert in de HindlII-plaats bevatten Staphylococcus aureus DNA-sequenties van ongeveer 3.5 kb. De inserts in de BamHI-plaats varieerden van ongeveer 0.1 tot 1.5 kb.Transformation of Escherichia coli DH5aF 'with the plasmids described above resulted in 770 clones containing an insert in either the BamHI or the HindII restriction site. The transformants were grown on Zeta-Probe filters and selected after lysis and DNA fixation by Southern hybridizations using 32 P-labeled chromosomal DNA from one methicillin resistant isolate (A216) and 3 methicillin sensitive isolates (isolates 8075, 9838 and 9848) as probes. Nine transformants were selected which showed hybridization with probe DNA from the methicillin resistant isolates but not with probe DNA from the sensitive isolates. The transformants were characterized by digestions with restriction endonucleases. The transformants with an insert in the HindII site contain Staphylococcus aureus DNA sequences of about 3.5 kb. The inserts in the BamHI site ranged from about 0.1 to 1.5 kb.
De inserts van deze transformanten werden geïsoleerd door digestie met PstI en EcoRI en daarna gelabeld met digoxigenine en gebruikt bij Southern-hybridisaties gedurende ongeveer 24 uur met DNA dat geïsoleerd was uit 25 methicilline-resistente stammen en 41 methicilline-gevoelige isolaten. De gebruikte isolaten waren klinische isolaten uit verschillende plaatsen (zie Materialen en Methoden). De resultaten van de hybridisatieproeven vertoonden een consistente hybridisatie van DNA uit één specifieke kloon met DNA uit methicilline-resistente isolaten. Deze kloon was verkregen uit de werkwijze waarbij in de eerste stap met Sau 3AI was gedigereerd. Het betreffende DNA-insert was ongeveer 300 bp lang. Er trad echter geen hybridisatie op van het DNA uit deze kloon met DNA dat verkregen was uit de 41 methicilline-gevoelige isolaten.The inserts of these transformants were isolated by digestion with PstI and EcoRI and then labeled with digoxigenin and used in Southern hybridizations for about 24 hours with DNA isolated from 25 methicillin resistant strains and 41 methicillin sensitive isolates. The isolates used were clinical isolates from different sites (see Materials and Methods). The results of the hybridization tests showed a consistent hybridization of DNA from one specific clone with DNA from methicillin resistant isolates. This clone was obtained from the method of digesting with Sau 3AI in the first step. The respective DNA insert was approximately 300 bp in length. However, no hybridization of the DNA from this clone with DNA obtained from the 41 methicillin-sensitive isolates occurred.
De hybridisaties met de inserts van de andere klonen vertoonden geen enkele correlatie met de afwezigheid of aanwezigheid van methicilline-resistentie. Van geen enkel DNA-insert kon een correlatie worden aangetoond met gentamycine-resistentie.The hybridizations with the inserts of the other clones showed no correlation with the absence or presence of methicillin resistance. No DNA insert could be correlated with gentamycin resistance.
Uit de hierboven beschreven resultaten blijkt dat de gevonden sequentie van circa 300 bp een uitstekende correlatie vertoont met het voorkomen van methicilline-resistentie in Staphylococcus stammen. Deze sequentie kan derhalve worden toegepast als probe voor de detectie van methicilline-resistente Staphylococcus stammen.The results described above show that the approximately 300 bp sequence found exhibits an excellent correlation with the occurrence of methicillin resistance in Staphylococcus strains. This sequence can therefore be used as a probe for the detection of methicillin resistant Staphylococcus strains.
De basenvolgorde van deze uit S.aureus stam 05723 afgeleide probe wordt in de separate sequentielijst getoond onder sequentie identificatienummer 1.The base sequence of this probe derived from S.aureus strain 05723 is shown in the separate sequence listing under sequence identification number 1.
Voor verschillende andere methicilline-resistente S. aureus stammen is de DNA sequentie van het overeenkomstige gebied bepaald. In de sequentielijst worden de DNA sequenties van het probe gebied van de S.aureus stammen 00646, A216, 02599, 214, 215C, 06231 en 1335 getoond onder resp. de sequentie identificatienummers 2, 3, 4, 5, 6, 7 en 8.For several other methicillin resistant S. aureus strains, the DNA sequence of the corresponding region has been determined. In the sequence list, the DNA sequences of the probe region of the S.aureus strains 00646, A216, 02599, 214, 215C, 06231 and 1335 are shown under resp. the sequence identification numbers 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8.
L ITF.RATTIURl· IJSTL ITF.RATTIURl · ICE CREAM
1. Locksley, R.M., Cohen, M.L., Quinn. T.C., Tompkins, L.S., Coyle. M.B., Kirihara, J.M., Counts, G.W.: Multiply antibiotic-resistant Staphylococcus aureus: introduction, transmission and evolution of nosocomial infection.1. Locksley, R.M., Cohen, M.L., Quinn. T.C., Tompkins, L.S., Coyle. M.B., Kirihara, J.M., Counts, G.W .: Multiply antibiotic-resistant Staphylococcus aureus: introduction, transmission and evolution of nosocomial infection.
Annals of Internal Medicine 1982: 97, 317-324.Annals of Internal Medicine 1982: 97, 317-324.
2. Bradley, J.M., Noone, P., Townsend, D.E., Grubb. W.B.: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a London hospital. Lancet 1985: 1, 1493-1495.2. Bradley, J.M., Noone, P., Townsend, D.E., Grubb. W.B .: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a London hospital. Lancet 1985: 1, 1493-1495.
3. S-iöström, J.-E., Löfdahl, S., Philipson, L.: Transformation reveals a chromosomal locus of gene(s) for methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology 1975: 123, 905-915.3. S-iström, J.-E., Löfdahl, S., Philipson, L .: Transformation reveals a chromosomal locus of gene (s) for methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology 1975: 123, 905-915.
4. Kornblum. J., Hartman. B.J., Novick, R.P., Tomasz. A.: Conversion of a homogeneously methicillin-resistant strain of Staphylococcus aureus to heterogeneous resistance by Tn551-mediated insertional inactivation. European Journal of Clinical Microbiology 1986: 5, 714-718.4. Kornblum. J., Hartman. B.J., Novick, R.P., Tomasz. A .: Conversion of a homogeneously methicillin-resistant strain of Staphylococcus aureus to heterogeneous resistance by Tn551-mediated insertional inactivation. European Journal of Clinical Microbiology 1986: 5, 714-718.
5. Beck, W.D.. Beraer-Bachi. B.. Kavser, F.H.: Additional DNA in methicillin-resistant Staphylococcus aureus and molecular cloning of mec-specific DNA. Journal of Bacteriology 1986: 165, 373-378.5. Beck, W.D. Beraer-Bachi. B .. Kavser, F.H .: Additional DNA in methicillin-resistant Staphylococcus aureus and molecular cloning of mec-specific DNA. Journal of Bacteriology 1986: 165, 373-378.
6. Matthews, P.R., Reed, K.C.. Stewart, P.R.: The cloning of chromosomal DNA associated with methicillin and other resistances in Staphylococcus aureus. Journal of General Microbiology 1987: 133, 1919-1929.6. Matthews, P.R., Reed, K.C .. Stewart, P.R .: The cloning of chromosomal DNA associated with methicillin and other resistances in Staphylococcus aureus. Journal of General Microbiology 1987: 133, 1919-1929.
7. Matthews. P.. Tomasz. A.: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Sept. 1990, 34: 1777-1779.7. Matthews. P .. Tomasz. A .: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Sept. 1990, 34: 1777-1779.
8. Pierre, J,. Williamson. R., Bornet, M,, Gutmann, L.: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Sept. 1990, 34: 1691-1694.8. Pierre, J ,. Williamson. R., Bornet, M ,, Gutmann, L .: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Sept. 1990, 34: 1691-1694.
9. Stratton. C.W.. Gelfand. M.S., Gerberding, J.L.,9. Stratton. C.W .. Gelfand. M.S., Gerberding, J.L.,
Chambers, H.F.: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Sept. 1990, 34: 1780-1782.Chambers, H.F .: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Sept. 1990, 34: 1780-1782.
10. Tesch, W., Rvffel, C., Strassle. A.. Kavser, F.H., Beraer-Bachi, B.: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Sept. 1990, 34: 1703-1706.10. Tesch, W., Rvffel, C., Strassle. A .. Kavser, F.H., Beraer-Bachi, B .: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Sept. 1990, 34: 1703-1706.
11. Frocraatt, J.W., Johnston, J.L., Galetto, D.w,, Archer, G.L.: Antimicrobial resistance in nosocomial isolates of Staphylococcus haemolvticus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, April 1989: 33, 460-466.11. Frocraatt, J.W., Johnston, J.L., Galetto, D.w., Archer, G.L .: Antimicrobial resistance in nosocomial isolates of Staphylococcus haemolvticus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, April 1989: 33, 460-466.
12. Archer. G.l·., Pennell. E.: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Sept. 1990, 34: 1720-1724.12. Archer. G.l., Pennell. E .: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Sept. 1990, 34: 1720-1724.
13. Lindberc, M.. Siöström. J.-E.. Johansson. T.: Transformation of chromosomal and plasmid characters in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology 1972, 109: 844-847.13. Lindberc, M .. Siöström. J.-E. Johansson. T .: Transformation of chromosomal and plasmid characters in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology 1972, 109: 844-847.
14. Maniatis. T.. Fritsch, E.F.. Sambrook, J.: Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982, p. 387.14. Maniatis. T .. Fritsch, E.F .. Sambrook, J .: Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982, p. 387.
15. Fluit, A,C., Baas, P.D., Van Boom, J.H., Veeneman, G.H., Jansz, H.S.: Gene A protein cleavage of recombinant plasmids containing the 0X174 replication origin. Nucleic Acids Research 1984, 12: 6443-6454.15. Flute, A, C., Baas, P.D., Van Boom, J.H., Veeneman, G.H., Jansz, H.S .: Gene A protein cleavage of recombinant plasmids containing the 0X174 replication origin. Nucleic Acids Research 1984, 12: 6443-6454.
16. Welcher, A.A., Torres, A.R., Ward. D.C.: Selective enrichment of specific DNA, cDNA, and mRNA sequences using biotinylated probes, avidin and copper-chelat agarose. Nucleic Acids Research 1986: 10020-10036.16. Welcher, A.A., Torres, A.R., Ward. D.C .: Selective enrichment of specific DNA, cDNA, and mRNA sequences using biotinylated probes, avidin and copper-chelat agarose. Nucleic Acids Research 1986: 10020-10036.
SEQUENTIELIJST Sea. Id. No. 1SEQUENCE LIST Sea. Id. No. 1
Nucleotide sequentie van de probe uit Staphylococcus aureus stam 05723.Nucleotide sequence of the probe from Staphylococcus aureus strain 05723.
GATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGACTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGACTATC CATTGCCATA CCTCCTAAAC ATTTGCCTAA AAGCATTGTA TGCCCAATAA ATGAATTTTA GGGGTTCTGT TGCAAAGTAA AAAAATATAG CTAACCACTA ATTTATCATG TCAGTGTTCG CTTAACTTGC TAGCATGATG CTAATTTCGT GGCATGGCGA AAATCCGTAG ATCGATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGACTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGACTATC CATTGCCATA CCTCCTAAAC ATTTGCCTAA AAGCATTGTA TGCCCAATAA ATGAATTTTA GGGGTTCTGT TGCAAAGTAA AAAAATATAG CTAACCACTA ATTTATCATG TCAGTGTTCG CTTAACTTGC TAGCATGATG CTAATTTCGT GGCATGGCGA AAATCCGTAG ATC
Seq. Id. No. 2 DNA sequentie voor het probe gebied van Staphylococcus aureus stam 00646.Seq. Id. No. 2 DNA sequence for the probe region of Staphylococcus aureus strain 00646.
GATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGACTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGACTATC CATTGCCATA CCTCCTAAAC ATTTGCCTAA AAGCATTGTA TGCCCAATAA ATGAATTTTA GGGGTTTTGT TGCAAAGTAA AAAAATATAG CTAACCACTA ATTTATCATG TCAGTGTTCG CTTAACTTGC TAGCATGATG CTAATTTCGT GGCATGGCGA AAATCCGTAG ATCGATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGACTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGACTATC CATTGCCATA CCTCCTAAAC ATTTGCCTAA AAGCATTGTA TGCCCAATAA ATGAATTTTA GGGGTTTTGT TGCAAAGTAA AAAAATATAG CTAACCACTA ATTTATCATG TCAGTGTTCG CTTAACTTGC TAGCATGATG CTAATTTCGT GGCATGGCGA AAATCCGTAG ATC
Seq. Id. No. 3 DNA sequentie voor het probe gebied van Staphylococcus aureus stam A216.Seq. Id. No. 3 DNA sequence for the probe region of Staphylococcus aureus strain A216.
GATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGACTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGACTATC CATTGCCATA CCTCTTAAAC ATTTGCCTAA AAGCATTGTA TGCCCAATAA ATGAATTTTA GGGGTTCTGT TGCAAAGTAA AAAATATAGC TAACCACTAA TTTATCATGT CAGTGTTCGC TTAACTTGCT AGCATGATGC TAATTTCGTG GCATGGCGAA AATCCGTAGA TCGATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGACTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGACTATC CATTGCCATA CCTCTTAAAC ATTTGCCTAA AAGCATTGTA TGCCCAATAA ATGAATTTTA GGGGTTCTGT TGCAAAGTAA AAAATATAGC TAACCACTAA TTTATCATGT CAGTGTTCGC TTAACTTGCT AGCATGATGC TAATTTCGTG GCATGGCGAA AATCCGTAGA TC
Seq. Id. No. 4 DNA sequentie voor het probe gebied van Staphylococcus aureus stam 02599.Seq. Id. No. 4 DNA sequence for the probe region of Staphylococcus aureus strain 02599.
GATCTTATAT ACTATCGTGC GTTTCCATGG CCCGCTATTG TACCAAATTA ATCGTCTCAT TGTTGCTTCC TGGGGATATC CATACTTACT AATTATGGTT TTTGCCCCTT CCAACGGTGG TCCCTGCCAA TAGGACAAAA TGTGATTTAA ATGGGTTCTG TTGCAAAGTA AAAAAATATA GCTAACCACT AATTTATCAT GTCAGTGTTC GCTTAACTTG CTAGCATGAT GCTAATTTCG TGGCATGGCG AAAATCCGTA GATCGATCTTATAT ACTATCGTGC GTTTCCATGG CCCGCTATTG TACCAAATTA ATCGTCTCAT TGTTGCTTCC TGGGGATATC CATACTTACT AATTATGGTT TTTGCCCCTT CCAACGGTGG TCCCTGCCAA TAGGACAAAA TGTGATTTAA ATGGGTTCTG TTGCAAAGTA AAAAAATATA GCTAACCACT AATTTATCAT GTCAGTGTTC GCTTAACTTG CTAGCATGAT GCTAATTTCG TGGCATGGCG AAAATCCGTA GATC
Sea. Id. No. 5 DNA sequentie voor het probe gebied van Staphylococcus aureus stam 214.Sea. Id. No. 5 DNA sequence for the probe region of Staphylococcus aureus strain 214.
GATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGTCTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGGGTTCT GTTGCAAAGT AAAAAAATAT AGCTAACCAC TAATTTATCA TGTCAGTGTT CGCTTAACTT GCTAGCATGA TGCTAATTTC GTGGCATGGC GAAAATCCGG ATCGATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGTCTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGGGTTCT GTTGCAAAGT AAAAAAATAT AGCTAACCAC TAATTTATCA TGTCAGTGTT CGCTTAACTT GCTAGCATGA TGCTAATTTC GTGGCATGGC GAAAATCCGG ATC
DNA sequentie voor het probe gebied van Staphylococcus aureus stam 215C.DNA sequence for the probe region of Staphylococcus aureus strain 215C.
GATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGTCTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGGGTTCT GTTGCAAAGT AAAAAAATAT AGCTAACCAC TAATTTATCA TGTCAGTGTT CGCTTAACTT GCTAGCATGA GCTAATTTCG TGGCATGGCG AAAATCCGTA GATCGATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGTCTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGGGTTCT GTTGCAAAGT AAAAAAATAT AGCTAACCAC TAATTTATCA TGTCAGTGTT CGCTTAACTT GCTAGCATGA GCTAATTTCG TGGCATGGCG AAAATCCGTA GATC
Seq. Id. No. 7 DNA sequentie voor het probe gebied van Staphylococcus aureus stam 06231.Seq. Id. No. 7 DNA sequence for the probe region of Staphylococcus aureus strain 06231.
GATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGTCTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGGGTTCT GTTGCAAAGT AAAAAAATAT AGCTAACCAC TAATTTATCA TGTCAGTGTT CGCTTAACTT GCTAGCATGA TGCTAATTTC GTGGCATGGC GAAAATCCGT AGATCGATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGTCTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGGGTTCT GTTGCAAAGT AAAAAAATAT AGCTAACCAC TAATTTATCA TGTCAGTGTT CGCTTAACTT GCTAGCATGA TGCTAATTTC GTGGCATGGC GAAAATCCGT AGATC
Seq. Id. No. 8 DNA sequentie voor het probe gebied van Staphylococcus aureus stam 1335.Seq. Id. No. 8 DNA sequence for the probe region of Staphylococcus aureus strain 1335.
GATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGTCTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGGGTTCT GTTGCAAAGT AAAAAAATAT AGCTAACCAC TAATTTATCA TGTCAGTGTT CGCTTAACTT GCTAGCATGA TGCTAATTTC GTGGCATGGC GAAAATCCGT AGATCGATCCTTATA TACTATCGTG CGTTTCCATG GCCCGCTATT GTACCAAATT AATCGTCTCA TTGTTGCTTC CTGGGGATAT CCATACTTAC TAATTATGGT TTTTGCCCCT TCCAACGGTG GTCCCTGCCA ATAGGACAAA ATGTGATTTA AATGGGTTCT GTTGCAAAGT AAAAAAATAT AGCTAACCAC TAATTTATCA TGTCAGTGTT CGCTTAACTT GCTAGCATGA TGCTAATTTC GTGGCATGGC GAAAATCCGT AGATC
Claims (7)
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL9002157A NL9002157A (en) | 1989-11-27 | 1990-10-04 | DNA FRAGMENTS AND DNA PROBES AND PRIMERS BASED ON THAT. |
| PCT/NL1990/000178 WO1991008305A1 (en) | 1989-11-27 | 1990-11-27 | Dna fragments and dna probes and primers based thereon |
| AU69507/91A AU6950791A (en) | 1989-11-27 | 1990-11-27 | Dna fragments and dna probes and primers based thereon |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8902926A NL8902926A (en) | 1989-11-27 | 1989-11-27 | Novel DNA fragment and probes - for detection of methicillin-resistant Staphylococcal strains, by polymerase chain reaction hybridisation assay |
| NL8902926 | 1989-11-27 | ||
| NL9002157 | 1990-10-04 | ||
| NL9002157A NL9002157A (en) | 1989-11-27 | 1990-10-04 | DNA FRAGMENTS AND DNA PROBES AND PRIMERS BASED ON THAT. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL9002157A true NL9002157A (en) | 1991-06-17 |
Family
ID=26646613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL9002157A NL9002157A (en) | 1989-11-27 | 1990-10-04 | DNA FRAGMENTS AND DNA PROBES AND PRIMERS BASED ON THAT. |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| AU (1) | AU6950791A (en) |
| NL (1) | NL9002157A (en) |
| WO (1) | WO1991008305A1 (en) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5620847A (en) * | 1990-10-05 | 1997-04-15 | Hoffman-La Roche Inc. | Methods and reagents for detection of bacteria in cerebrospinal fluid |
| CA2075423A1 (en) * | 1991-08-13 | 1993-02-14 | Paul Luther Skatrud | Rapid method for detection of methicillin resistant staphylococci |
| US5656432A (en) * | 1992-02-10 | 1997-08-12 | Bio Merieux | Genomic DNA fragment of Streptococcus pneumoniae, hybridization probe, amplification primer, reagent and method for the detection of Streptococcus pneumoniae |
| FR2687168B1 (en) * | 1992-02-10 | 1994-03-25 | Bio Merieux | FRAGMENT OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE GENOMIC DNA, HYBRIDIZATION PROBE, AMPLIFIER PRIME, REAGENT AND METHOD FOR DETECTION OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE. |
| ATE307200T1 (en) * | 1992-07-07 | 2005-11-15 | Fuso Pharmaceutical Ind | PROBE FOR DIAGNOSING AN INFECTIOUS DISEASE CAUSED BY STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS |
| EP0625575A3 (en) * | 1993-04-30 | 1995-02-22 | Lilly Co Eli | Fem A gene of staphylococcus epidermidis, fem A protein, and vectors of microorganisms comprising the fem A gene. |
| IL109411A0 (en) * | 1993-04-30 | 1994-07-31 | Ell Lilly And Company | Femb gene of staphylococcus epidermidis, femb protein, and vectors and microorganisms comprising the femb gene |
| US6001564A (en) * | 1994-09-12 | 1999-12-14 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US20020055101A1 (en) | 1995-09-11 | 2002-05-09 | Michel G. Bergeron | Specific and universal probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US5994066A (en) * | 1995-09-11 | 1999-11-30 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US20030049636A1 (en) | 1999-05-03 | 2003-03-13 | Bergeron Michel G. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
| US20100267012A1 (en) | 1997-11-04 | 2010-10-21 | Bergeron Michel G | Highly conserved genes and their use to generate probes and primers for detection of microorganisms |
| DE19731292A1 (en) * | 1997-07-21 | 1999-01-28 | Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh | Nucleic Acid Molecule, Kit, and Use |
| DE19822108A1 (en) * | 1998-05-12 | 2000-02-03 | Schering Ag | Method for the detection of microorganisms in products, in particular in medicines and cosmetics |
| US6242223B1 (en) * | 1998-09-28 | 2001-06-05 | Creighton University | Primers for use in detecting beta-lactamases |
| JP2003511015A (en) | 1999-09-28 | 2003-03-25 | インフェクティオ ダイアグノスティク（アイ．ディー．アイ．）インコーポレイティド | Generating highly conserved genes, as well as species-specific, genus-specific, family-specific, group-specific and universal nucleic acid probes and amplification primers, algae, archaea, bacteria, fungi from diagnostic clinical specimens And their use for rapid detection and identification of parasite microorganisms |
| US7045291B2 (en) | 2002-05-17 | 2006-05-16 | Creighton University | Multiplex PCR for the detection of AmpC beta-lactamase genes |
| JP2008507296A (en) * | 2004-07-26 | 2008-03-13 | ナノスフェアー インコーポレイテッド | A method for distinguishing methicillin-resistant Staphylococcus aureus from methicillin-sensitive Staphylococcus aureus in mixed cultures |
-
1990
- 1990-10-04 NL NL9002157A patent/NL9002157A/en not_active Application Discontinuation
- 1990-11-27 AU AU69507/91A patent/AU6950791A/en not_active Abandoned
- 1990-11-27 WO PCT/NL1990/000178 patent/WO1991008305A1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1991008305A1 (en) | 1991-06-13 |
| AU6950791A (en) | 1991-06-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL9002157A (en) | DNA FRAGMENTS AND DNA PROBES AND PRIMERS BASED ON THAT. | |
| US5989821A (en) | Universal targets for species identification | |
| Zapparoli et al. | Design and evaluation of malolactic enzyme gene targeted primers for rapid identification and detection of Oenococcus oeni in wine | |
| JP4176146B2 (en) | Specific and universal probes and amplification primers for the rapid detection and identification of common bacterial pathogens and antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories | |
| US6015666A (en) | Rapid DNA test for detecting quinolone-resistant Staphylococcus aureus pathogens in clinical material | |
| KR950008574B1 (en) | Mycobacterium primers and proces | |
| Ullrich et al. | Molecular characterization of field isolates of Pseudomonas syringae pv. glycinea differing in coronatine production | |
| US5747257A (en) | Genetic markers and methods for the detection of escherichia coli serotype-0157:H7 | |
| US5489513A (en) | Specific gene probes and processes for the diagnostic investigation of Candida albicans | |
| Müller et al. | Multiplex PCR for the detection of Lactobacillus pontis and two related species in a sourdough fermentation | |
| JP2002537824A (en) | Bacterial identification | |
| US6013435A (en) | Drug resistance screening method using multiplex amplification | |
| US8673566B2 (en) | Method for detection of Staphylococcus epidermidis | |
| KR100436741B1 (en) | Genes for detecting bacteria and detection method by using the same | |
| US5869642A (en) | Detection of the genus pectinatus | |
| JP2001510688A (en) | Nucleic acid molecules, kits and uses | |
| JPH10210980A (en) | Oligonucleotide for detecting lactic acid bacterium and detection of the same bacterium | |
| JPH1094396A (en) | Method for obtaining nucleotide sequence using randomly primed amplification | |
| NL8902926A (en) | Novel DNA fragment and probes - for detection of methicillin-resistant Staphylococcal strains, by polymerase chain reaction hybridisation assay | |
| JP4238319B2 (en) | Mycoplasma detection method | |
| JP4037926B2 (en) | S. Primer used to detect diastaticus | |
| WO1994017203A1 (en) | Amplified dna fingerprinting method for detecting genomic variation | |
| AU705198C (en) | Specific and universal probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories | |
| EP1436414B1 (en) | Detection of rpob sequences of mycobacterium tuberculosis | |
| JP2001515710A (en) | Nucleic acid sequences and methods for detecting bacteria of the genus Pseudomonas |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BV | The patent application has lapsed |