NL9002116A

NL9002116A - METHOD FOR GENETICALLY MANIPULATING PLANT CELLS, RECOMBINANT PLASMID, RECOMBINANT BACTERIA, PLANTS.

Info

Publication number: NL9002116A
Application number: NL9002116A
Authority: NL
Original assignee: Clovis Matton N V
Priority date: 1990-09-27
Filing date: 1990-09-27
Publication date: 1992-04-16
Also published as: JPH06501155A; EP0554273A1; CA2089072A1; IE913359A1; WO1992006205A1

Description

BeschrijvingDescription

Werkwijze voor het genetisch manipuleren van plantecellen, recombinante plasmiden, recombinante bacteriën, plantenMethod for the genetic manipulation of plant cells, recombinant plasmids, recombinant bacteria, plants

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het genetisch manipuleren van plantecellen, waarbij vreemd DNA in plantecellen wordt gebracht 'door de plantecellen te infecteren met een of meerdere recombinante Aqrobacterium tumefaciens stammen die naar de plantecellen te transfereren vreemd DNA bevatten tussen de voor een dergelijke transfer noodzakelijke -linker en rechter uiteinden van T-DNA en tot transfer van dit vreemde DNA naar de plantecellen in staat zijn.The invention relates to a method for genetically manipulating plant cells, in which foreign DNA is introduced into plant cells by infecting the plant cells with one or more recombinant Aqrobacterium tumefaciens strains containing foreign DNA to be transferred to the plant cells between the cells for such a transfer necessary left and right ends of T-DNA and capable of transferring this foreign DNA to the plant cells.

Voorts heeft de uitvinding betrekking op een recombinant plasmide, bestaande uit een bacteriëel vectorplasmide en ten minste één DNA insertie, en op een recombinante Acrrobacterium tumefaciens stam, die naar plantecellen te transfereren vreemd DNA bevat tussen de voor een dergelijke transfer noodzakelijke linker en rechter uiteinden van T-DNA en tot transfer van dit vreemde DNA naar de plantecellen in staat is.The invention further relates to a recombinant plasmid, consisting of a bacterial vector plasmid and at least one DNA insert, and to a recombinant Acrrobacterium tumefaciens strain, which contains foreign DNA to be transferred to plant cells between the left and right ends of such transfer necessary for such transfer. T-DNA and is capable of transferring this foreign DNA to the plant cells.

Tenslotte heeft de uitvinding ook betrekking op de van de getransformeerde cellen afstammende planten en op de uit een of meer cellen bestaande delen of produkten daarvan.Finally, the invention also relates to plants originating from the transformed cells and to the parts or products thereof consisting of one or more cells.

De sedert zijn eerste ontdekking sterk ontwikkelde en op grote schaal toegepaste Agrobacterium tumefaciens technologie voor de genetische manipulatie van planten is ondanks alle in de loop der jaren geboekte vooruitgang in beginsel nog steeds beperkt tot een toepassing bij dicotyle plantensoorten, zoals tabak, tomaat, koolzaad, e.d. Een geslaagde transformatie van monocotyle plantensoorten is tot op heden in essentie alleen beschreven voor enkele Liliaceae, nl. Asparagus (Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA M» 5345-5349, 1987) en Narcissus (Hooykaas et al., Nature 311. 763-764, 1984), enkele Iridaceae (Graves et al., J. Bacteriol. 169. 1745-1746, 1987), enkele Dioscoreaceae (Schafer et al., Nature 327. 529-532, 1987), en enkele Gramineae, nl. Zea maïs (Graves en Goldman, Plant Mol. Biol. 1_, 43-50, 1986) en Oryza sativa (Raineri et al., Biotechnology ü, 33-38, 1990). Deze uitzonderingen daargelaten is men er nog niet in geslaagd om met behulp van de Acrrobacterium tumefaciens technologie een efficiënte transformatie van monocotyle plantensoorten, waaronder de belangrijke graangewassen zoals maïs, tarwe, gerst, rogge, haver, rijst en dergelijke te realiseren en stabiel getransformeerde monocotyle planten te produceren.The Agrobacterium tumefaciens technology for the genetic manipulation of plants, which has been widely developed and widely used since its first discovery, is in principle, despite all the progress made over the years, still limited to an application in dicotyledonous plant species, such as tobacco, tomato, rapeseed ed Successful transformation of monocotyledonous plant species has so far been described essentially only for some Liliaceae, namely Asparagus (Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA M »5345-5349, 1987) and Narcissus (Hooykaas et. al., Nature 311, 763-764, 1984), some Iridaceae (Graves et al., J. Bacteriol. 169, 1745-1746, 1987), some Dioscoreaceae (Schafer et al., Nature 327, 529-532, 1987 ), and some Gramineae, viz. Zea maize (Graves and Goldman, Plant Mol. Biol. 1, 43-50, 1986) and Oryza sativa (Raineri et al., Biotechnology,, 33-38, 1990). With these exceptions, it has not yet been possible to achieve an efficient transformation of monocotyledonous plant species, including the important cereal crops such as corn, wheat, barley, rye, oats, rice and the like, and stably transformed monocotyledonous plants using Acrrobacterium tumefaciens technology. to produce.

Er lijken aanwijzingen te bestaan dat het probleem niet ligt bij de transfer van het DNA. Zo is het mogelijk gebleken om in de vorm van DNA gecodeerde virale genomen met behulp van Aarobacterium tumefaciens over te brengen naar maïs (Grimsley et al., Biotechnology 6, 185-189, 1988) en tarwe (Dale et al., Seventh International Wheat Genetics Symposium 1, 719-722, 1988). Wellicht ligt het probleem daarom bij de integratie van het DNA in het genoom: het integratiesysteem dat Agrobacterium tumefaciens bacteriën met succes gebruiken in dicotyle planten zou in monocotyle planten wel eens niet of niet efficiënt kunnen werken. Algemeen wordt echter toch aangenomen dat een slechte transfer van het T-DNA naar de plant verantwoordelijk is voor het falen van de technologie bij monocotyle planten.There seems to be evidence that the problem is not with the transfer of the DNA. For example, it has been possible to transfer DNA-encoded viral genomes using Aarobacterium tumefaciens to maize (Grimsley et al., Biotechnology 6, 185-189, 1988) and wheat (Dale et al., Seventh International Wheat Genetics Symposium 1, 719-722, 1988). Perhaps the problem therefore lies with the integration of the DNA into the genome: the integration system that Agrobacterium tumefaciens bacteria successfully use in dicotyledonous plants may not work or may not work efficiently in monocotyledonous plants. However, it is generally accepted that poor T-DNA transfer to the plant is responsible for technology failure in monocotyledonous plants.

Om toch tot de gewenste transformatie bij monocotyle planten te kunnen komen zijn daarom verschillende alternatieve transformatietechnieken bedacht en ontwikkeld, waarbij geen gebruik wordt gemaakt van Aarobacterium tumefaciens bacteriën voor het overbrengen van DNA naar de plantecel. Voorbeelden daarvan zijn micro-injectie met DNA, beschieting met DNA dragende partikels, elektroporatie van protoplasten met DNA, enz.Therefore, in order to achieve the desired transformation in monocotyledonous plants, various alternative transformation techniques have been devised and developed, which do not use Aarobacterium tumefaciens bacteria for transferring DNA to the plant cell. Examples include microinjection with DNA, bombardment with DNA-carrying particles, electroporation of protoplasts with DNA, etc.

Deze technieken zijn met succes toegepast voor het introduceren van DNA in plantecellen, maar meestal kon men slechts een voorbijgaande expressie van de geïntroduceerde genen waarnemen.These techniques have been successfully used to introduce DNA into plant cells, but usually only transient expression of the introduced genes was observed.

Wat het gebruik van integratiesystemen betreft is tot op heden gekozen voor ófwel homologe genetische recombinatie, hetgeen een weinig efficiënt systeem is en in de praktijk beperkt blijft tot cellen in meiose, ófwel transpositie, hetgeen een efficiënt systeem is dat ook tijdens de normale celcyclus actief is, maar het nadeel heeft dat de ingebrachte genen in de eerste generatie niet stabiel zijn en men één of meerdere generaties moet wachten voordat het transposon en de via transpositie ingebrachte genen gescheiden worden door uit-mendeling.As far as the use of integration systems is concerned, either homologous genetic recombination has so far been chosen, which is a less efficient system and in practice is limited to cells in meiosis, or transposition, which is an efficient system that is also active during the normal cell cycle. however, the drawback is that the introduced genes in the first generation are not stable and one or more generations must be waited before the transposon and the transposed genes are separated by broadcasting.

Transposons zijn nl. genetische elementen die zich kunnen verplaatsen in het genoom van de gastheercellen waarin ze zich normaal bevinden. Ze hebben virtuele uiteinden, gerepeteerde grens-sequenties, die meestal geïnverteerd gerepeteerd zijn en nogal in lengte kunnen verschillen. Op de plaats van hun insertie in het genoom vindt men een stuk gastheer-sequentie links en rechts van de transposon-sequentie direct gerepeteerd terug. Er is meestal geen specifieke keuze van de plaats van insertie. Bij excisie wordt ofwel de oorspronkelijke sequentie hersteld, ofwel treedt een deletie op, ofwel blijft een gedeelte van de sequentie ter plaatse achter (insertie). In zijn meest eenvoudige vorm bestaat een transposon uit een transposase-gen dat gelegen is tussen terminale sequenties die transposase-bindingsplaatsen en eventuele bindingsplaatsen voor andere gastheerenzymen bevatten en eindigen met de gerepeteerde grens-sequentie. Deze terminale sequenties, te samen met de direct gerepeteerde sequenties van het doel-DNA, links en rechts van de grenssequentie, worden hierin verder ook aangeduid als linker en rechter transposon-uiteinden.Transposons are namely genetic elements that can move in the genome of the host cells in which they are normally located. They have virtual ends, repetitive boundary sequences, which are usually inverted repetitively and may vary in length. At the site of their insertion into the genome, a piece of host sequence to the left and right of the transposon sequence is found directly rehearsed. There is usually no specific choice of insertion site. On excision, either the original sequence is restored, or a deletion occurs, or part of the sequence is left in place (insertion). In its simplest form, a transposon consists of a transposase gene located between terminal sequences containing transposase binding sites and optional binding sites for other host enzymes and ending with the repeated border sequence. These terminal sequences, along with the directly repeated sequences of the target DNA, to the left and right of the border sequence, are further referred to herein as left and right transposon ends.

De onderhavige uitvinding verschaft nu een werkwijze die de belangrijkste bezwaren van de bekende methoden opheft en die een tot op heden niet mogelijk gebleken, zeer efficiënte en stabiele transformatie van cellen van monocotyle planten geeft. Daartoe wordt volgens de uitvinding gebruik gemaakt van het efficiënte transfersysteem van Agrobacterium tumefaciens bacteriën in combinatie met het efficiënte integratiesysteem van transposons.The present invention now provides a method which overcomes the main drawbacks of the known methods and which provides a hitherto impossible, highly efficient and stable transformation of cells from monocotyledonous plants. According to the invention, the efficient transfer system of Agrobacterium tumefaciens bacteria is used for this purpose in combination with the efficient integration system of transposons.

De uitvinding heeft in een eerste aspect betrekking op een werkwijze voor het genetisch manipuleren van plantecellen, waarbij vreemd DNA in plantecellen wordt gebracht door de plantecellen te infecteren met een of meerdere recombinante Aqrobacterium tumefaciens stammen die naar de plantecellen te transfereren vreemd DNA bevatten tussen de voor een dergelijke transfer noodzakelijke linker en rechter uiteinden van T-DNA en tot transfer van dit vreemde DNA naar de plantecellen in staat zijn, en wordt gekenmerkt doordat het tussen de linker en rechter uiteinden van T-DNA gelegen vreemde DNA een transposase-gen, gelegen in een in de plantecellen werkzame expressiecassette, en een recombinant transposon omvat, waarbij het recombinante transposon de voor integratie in het DNA van de plantecellen noodzakelijke linker en rechter transposon-uiteinden omvat met daartussen een in het DNA van de plantecellen te integreren DNA fragment.The invention relates in a first aspect to a method for the genetic manipulation of plant cells, in which foreign DNA is introduced into plant cells by infecting the plant cells with one or more recombinant Aqrobacterium tumefaciens strains containing foreign DNA to be transferred between the cells. such transfer is necessary to the left and right ends of T-DNA and is capable of transferring this foreign DNA to the plant cells, characterized in that the foreign DNA located between the left and right ends of T-DNA is a transposase gene in an expression cassette acting in the plant cells, and comprising a recombinant transposon, the recombinant transposon comprising the left and right transposon ends necessary for integration into the DNA of the plant cells, with a DNA fragment to be integrated into the DNA of the plant cells therebetween.

Het heeft volgens de uitvinding zeer de voorkeur, dat de tussen de linker en rechter uiteinden van T-DNA gelegen, in de plantecellen werkzame en met een transposase-gen gevulde expressiecassette niet tussen de voor integratie in het DNA van de plantecellen noodzakelijke linker en rechter uiteinden van een transposon is gelegen. Ook heeft het zeer de voorkeur dat het recombinante transposon geen DNA fragment bevat, dat in de plantecellen tot expressie van een werkzaam transposase kan leiden. Dit betekent dat het recombinante transposon een inactief transposon is. In deze voorkeursuitvoeringsvormen kan een gewenste hoge stabiliteit van de getransformeerde planten worden bereikt. Het normaal aan het gebruik van transposons verbonden nadeel van instabiliteit is namelijk een gevolg van de aanwezigheid van een compleet (of actief) transposon, d.w.z. een transposon met een tussen de transposon uiteinden gelegen transposase-gen. Dit gen wordt dan met het transposon mee ingebouwd in het plantegenoom, en kan ten gevolge daarvan verschillende generaties lang tot de ongewenste instabiliteit aanleiding geven. Volgens de onderhavige uitvinding wordt wel een actief transposase-gen toegepast, nl. om een efficiënte integratie van het in een transposon gelegen vreemde DNA in het DNA van de plantecel te verzekeren (in de plantecel leidt het transposase-gen tot de vorming van transposase, dat in samenwerking met nucleaire factoren van de plant in staat is om een efficiënte integratie van het transposon in het genoom te bewerkstelligen), maar wanneer dit transposase-gen conform de voorkeursuitvoeringsvormen buiten het transposon ligt wordt het zelf bij transformatie van monocotylen niet efficiënt in het genoom geïntegreerd. Dit betekent dat reeds bij de eerste generatie planten de gewenste stabiliteit wordt bereikt.It is very preferred according to the invention that the expression cassette located between the left and right ends of T-DNA, active in the plant cells and filled with a transposase gene, does not lie between the left and right cells necessary for integration into the DNA of the plant cells. ends of a transposon is located. It is also very preferred that the recombinant transposon does not contain a DNA fragment, which can express an active transposase in the plant cells. This means that the recombinant transposon is an inactive transposon. In these preferred embodiments, a desired high stability of the transformed plants can be achieved. Namely, the drawback of instability normally associated with the use of transposons is due to the presence of a complete (or active) transposon, i.e., a transposon having a transposase gene located between the transposon ends. This gene is then built into the plant genome along with the transposon, and as a result can lead to the undesired instability for several generations. According to the present invention, an active transposase gene is used, namely to ensure an efficient integration of the foreign DNA located in a transposon into the DNA of the plant cell (in the plant cell the transposase gene leads to the formation of transposase, that in conjunction with nuclear factors of the plant is able to effect an efficient integration of the transposon into the genome), but when this transposase gene lies outside the transposon in accordance with the preferred embodiments, it does not become efficient in the transformation of monocots genome integrated. This means that the desired stability is achieved with the first generation of plants.

Het heeft volgens de uitvinding bijzonder de voorkeur dat het recombinante transposon tussen de linker en rechter transposon-uiteinden ten minste één vreemd gen, gelegen in een in de plantecellen werkzame expressiecassette, omvat. Hiermee wordt elk gen bedoeld, dat men om welke reden dan ook in het genoom van de plant wil inbouwen. Het kan daarbij gaan om een gen, dat codeert voor een gewenste eigenschap van de plant, zoals resistentie tegen herbiciden, tegen pathogenen zoals bepaalde schimmels en insekten, of tegen milieufactoren, of eigenschappen zoals (bij sierteelt) een bepaalde bloemkleur, bloemgeur, bloemgrootte, e.d., of eigenschappen zoals (in het geval van voedingsgewassen) betere voedingseigenschappen, een hoger rendement, enz. Ook kan het gaan om een gen dat codeert voor een stof die men op grote schaal wenst te produceren door het verbouwen van een plantengewas dat dankzij genetische manipulatie in staat is om de stof te vormen. Bij het in de plant te brengen gen kan het derhalve gaan om een gen in het kader van plantenveredeling of om een gen in het kader van biologische produktie van bepaalde produkten (eiwitten en enzymatische produkten, DNA, RNA, enz).It is particularly preferred according to the invention that the recombinant transposon between the left and right transposon ends comprises at least one foreign gene contained in an expression cassette acting in the plant cells. By this is meant any gene that one wants to build into the genome of the plant for whatever reason. This may be a gene that encodes a desired property of the plant, such as resistance to herbicides, to pathogens such as certain fungi and insects, or to environmental factors, or properties such as (in floriculture) a certain flower color, flower scent, flower size, etc., or properties such as (in the case of food crops) better nutritional properties, a higher yield, etc. It could also be a gene encoding a substance that one wishes to produce on a large scale by cultivating a plant crop that, thanks to genetic manipulation is able to form the substance. The gene to be introduced into the plant can therefore be a gene for plant breeding or a gene for organic production of certain products (proteins and enzymatic products, DNA, RNA, etc.).

Het is eveneens mogelijk dat het recombinante transposon tussen de linker en rechter transposon-uiteinden in plaats van een vreemd gen in een in planten werkzame expressiecassette, een in planten werkzame promoter bevat. Hierdoor wordt het mogelijk om het expressiegedrag van bepaalde genen en daarmede het fenotype te veranderen.It is also possible that the recombinant transposon between the left and right transposon ends, instead of a foreign gene in a plant-active expression cassette, contains a plant-active promoter. This makes it possible to change the expression behavior of certain genes and thus the phenotype.

Voorts heeft het de voorkeur, dat tussen de linker en rechter uiteinden van T-DNA tevens een of meer, voor selectie van getransformeerde bacteriën geschikte en in een in de bacteriën werkzame expressiecassette gelegen, selecteerbare merkergenen liggen. Hierdoor kunnen Acrrobacterium tumefaciens bacteriën met de gewenste DNA constructen worden geselecteerd. Voor dit doel geschikte merkergenen zijn aan de deskundige bekend. Veelal gaat het daarbij om genen, waarvan de expressie leidt tot een resistentie tegen bepaalde antibiotica, zoals resistentie tegen kanamycine, chlooramphenicol, ampicilline, tetracycline, spectinomycine, enz.It is further preferred that one or more selectable marker genes suitable for selection of transformed bacteria and located in an expression cassette active in the bacteria also lie between the left and right ends of T-DNA. This allows Acrrobacterium tumefaciens bacteria with the desired DNA constructs to be selected. Marker genes suitable for this purpose are known to the person skilled in the art. These are often genes, the expression of which leads to a resistance to certain antibiotics, such as resistance to kanamycin, chloramphenicol, ampicillin, tetracycline, spectinomycin, etc.

Hierbij heeft het in het bijzonder de voorkeur, dat een of meer, voor selectie van getransformeerde bacteriën geschikte en in een in bacteriën werkzame expressiecassette gelegen, selecteerbare merkergenen deel uitmaken van het recombinante transposon. Deze voorkeursuitvoeringsvorm heeft het voordeel dat de merkergenen gekoppeld aan het vreemde gen mee ingebouwd worden in het genoom van de plant, zodat men in gevallen, dat de getransformeerde plant ten gevolge van het inbouwen van het recombinante transposon in een gen van de gastheer een ander fenotype vertoont (dat niet te wijten is aan de ingebrachte genetische informatie als zodanig), of dat het ingebrachte vreemde gen in latere generaties anders blijkt te functioneren dan in de eerste generaties (bijv. ten gevolge van mutatie), het recombinante transposon voor nader onderzoek weer vanuit het plantegenoom in bacteriën kari kloneren door middel van selectie met het in bacteriën werkzame merkergen.It is particularly preferred here that one or more selectable marker genes suitable for selection of transformed bacteria and contained in an expression cassette active in bacteria act as part of the recombinant transposon. This preferred embodiment has the advantage that the marker genes linked to the foreign gene are incorporated into the genome of the plant, so that in cases where the transformed plant, as a result of the incorporation of the recombinant transposon into a gene of the host, has a different phenotype. (that is not due to the introduced genetic information as such), or that the introduced foreign gene appears to function differently in later generations than in the first generations (e.g. due to mutation), the recombinant transposon for further investigation cloning in bacteria from the plant genome by selection with the marker gene active in bacteria.

Verder heeft het de voorkeur, dat tussen de linker en rechter uiteinden van T-DNA tevens een of meer, voor selectie van getransformeerde plantecellen geschikte en in een in de plantecellen werkzame expressiecassette gelegen, selecteerbare merkergenen liggen. Ook hiervoor geldt dat vele voor dit doel geschikte merkergenen aan de deskundige bekend zijn. Zo kan resistentie tegen bijvoorbeeld antibiotica of herbiciden worden genoemd als een eigenschap die, zoals aan deskundigen bekend is, voor een selectie van succesvol getransformeerde planten kan worden gebruikt.It is further preferred that one or more selectable marker genes suitable for selection of transformed plant cells and located in an expression cassette active in the plant cells also lie between the left and right ends of T-DNA. Here too, many marker genes suitable for this purpose are known to the skilled person. For example, resistance to antibiotics or herbicides, for example, can be cited as a property which, as is known to those skilled in the art, can be used for a selection of successfully transformed plants.

Hierbij heeft het in het bijzonder de voorkeur, dat een of meer, voor selectie van getransformeerde plantecellen geschikte en in een in de plantecellen werkzame expressie-cassette gelegen, selecteerbare merkergenen deel uitmaken van het recombinante transposon. Deze voorkeursuitvoeringsvorm heeft het voordeel dat de merkergenen mee ingebouwd worden in het genoom van de plant, zodat ook latere generaties op basis van de door de merkergenen gecodeerde eigenschappen kunnen worden geselecteerd.It is particularly preferred that one or more selectable marker genes suitable for selection of transformed plant cells and contained in an expression cassette active in the plant cells form part of the recombinant transposon. This preferred embodiment has the advantage that the marker genes are also built into the genome of the plant, so that later generations can also be selected on the basis of the properties encoded by the marker genes.

Een eerste variant van de werkwijze volgens de uitvinding wordt gekenmerkt doordat men de plantecellen infecteert met een mengsel van twee verschillende recombinante A. tumefaciens stammen, waarvan de ene tussen de linker en rechter uiteinden van T-DNA het transposase-gen, gelegen in een in de plantecellen werkzame expressiecassette, en de andere tussen de linker en rechter uiteinden van T-DNA het recombinante transposon omvat. Deze variant heeft het voordeel van een grote veelzijdigheid, d.w.z. dat men steeds van dezelfde Aqrobacterium stam, die het transposase-gen levert, gebruik kan maken en slechts de tweede stam, die het recombinante transposon bevat, voor elk nieuw gen moet construeren. Er wordt bij deze tweede stam dan gebruik gemaakt van een construct waarbij een multipile cloning site gelegen is tussen de transposon-uiteinden, zodat men een grote keuze-vrijheid heeft ten aanzien van de in het transposon op te nemen DNA fragmenten.A first variant of the method according to the invention is characterized in that the plant cells are infected with a mixture of two different recombinant A. tumefaciens strains, one of which is the transposase gene, located between the left and right ends of T-DNA, in a the plant cell active expression cassette, and the other between the left and right ends of T-DNA comprises the recombinant transposon. This variant has the advantage of great versatility, i.e. that one can always use the same Aqrobacterium strain which supplies the transposase gene and only have to construct the second strain, which contains the recombinant transposon, for each new gene. In this second strain, use is then made of a construct in which a multipile cloning site is located between the transposon ends, so that there is a large freedom of choice with regard to the DNA fragments to be included in the transposon.

In de praktijk zullen bij deze eerste variant volgens de uitvinding zowel de eerste als de tweede A. tumefaciens stam tussen de linker en rechter uiteinden van het T-DNA ten minste één merkergen voor selectie van getransformeerde bacteriën en ten minste één merkergen voor selectie van getransformeerde plantecellen bevatten. Hierbij heeft het de voorkeur dat ten minste de merkergenen voor selectie van getransformeerde plantecellen, die de beide bacteriestammen binnen de T-DNA uiteinden dragen, van elkaar verschillen zodat plantecellen, die met succes door beide stammen zijn getransformeerd, kunnen worden herkend.In practice, in this first variant of the invention, both the first and second A. tumefaciens strains between the left and right ends of the T-DNA will have at least one marker gene for selection of transformed bacteria and at least one marker gene for selection of transformed contain plant cells. Here, it is preferred that at least the marker genes for selection of transformed plant cells carrying the two bacterial strains within the T-DNA ends differ from each other so that plant cells successfully transformed by both strains can be recognized.

Een alternatieve uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding wordt gekenmerkt doordat men de plantecellen infecteert met één recombinante A. tumefaciens stam, die tussen de linker en rechter uiteinden van T-DNA zowel het transposase-gen, gelegen in een in de plantecellen werkzame expressiecassette, als het recombinante transposon omvat. Deze variant heeft het voordeel van een hogere slagingskans van de transformatie, d.w.z. dat bij een groter gedeelte van de behandelde plantecellen de gewenste DNA transfer zal hebben plaatsgevonden.An alternative embodiment of the method according to the invention is characterized in that the plant cells are infected with one recombinant A. tumefaciens strain, which contains between the left and right ends of T-DNA both the transposase gene, located in an expression cassette active in the plant cells, if it comprises recombinant transposon. This variant has the advantage of a higher chance of success of the transformation, i.e. that the desired DNA transfer will have taken place in a larger part of the treated plant cells.

In de praktijk zal bij deze tweede variant volgens de uitvinding de A. tumefaciens stam tussen de linker en rechter uiteinden van het T-DNA ten minste één merkergen voor selectie van getransformeerde bacteriën en ten minste één merkergen voor selectie van getransformeerde plantecellen bevatten.In practice, in this second variant of the invention, the A. tumefaciens strain between the left and right ends of the T-DNA will contain at least one marker gene for selection of transformed bacteria and at least one marker gene for selection of transformed plant cells.

De werkwijze volgens de uitvinding is vooral van belang voor de transformatie van plantecellen van een monocotyle plantensoort, zoals maïs, tarwe, gerst, haver, rogge, rijst, enz. Een efficiënte transformatie van dergelijke gewassen was tot op heden niet mogelijk gebleken.The method according to the invention is particularly important for the transformation of plant cells of a monocotyledonous plant species, such as maize, wheat, barley, oats, rye, rice, etc. An efficient transformation of such crops has hitherto not been possible.

De uitvinding kan echter ook worden toegepast met het doel om fenotypische kenmerken van planten, die het gevolg zijn van de aanwezigheid van onwerkzame transposons in een of meerdere genen van de plant, te veranderen door zo'n transposon uit het gen waarin het zich bevindt te verwijderen. De uitvinding verschaft daartoe een werkwijze voor het genetisch manipuleren van plantecellen, waarbij vreemd DNA in plantecellen wordt gebracht door de plantecellen te infecteren met een recombinante Agrobacterium tumefaciens stam die naar de plantecellen te transfereren vreemd DNA bevat tussen de voor een dergelijke transfer noodzakelijke linker en rechter uiteinden van T-DNA en tot transfer van dit vreemde DNA naar de plantecellen in staat is, welke werkwijze gekenmerkt wordt doordat men plantecellen infecteert, die een of meerdere inactieve transposons bevatten maar geen werkzaam transposase-gen bevatten en dat het tussen de linker en rechter uiteinden van T-DNA gelegen vreemde DNA een transposase-gen omvat, gelegen in een in de plantecellen werkzame expressiecassette, die niet tussen de voor integratie in het DNA van de plantecellen noodzakelijke linker en rechter uiteinden van een transposon is gelegen.However, the invention can also be applied for the purpose of altering phenotypic characteristics of plants, which result from the presence of inactive transposons in one or more genes of the plant, by removing such a transposon from the gene in which it is located. remove. To this end, the invention provides a method for genetically manipulating plant cells, wherein foreign DNA is introduced into plant cells by infecting the plant cells with a recombinant Agrobacterium tumefaciens strain containing foreign DNA to be transferred to the plant cells between the left and right necessary for such a transfer. is capable of transferring this foreign DNA to the plant cells, which method is characterized by infecting plant cells containing one or more inactive transposons but not containing an active transposase gene and between the left and right ends of T-DNA foreign DNA comprises a transposase gene contained in an expression cassette acting in the plant cells, which is not located between the left and right ends of a transposon necessary for integration into the plant cell DNA.

De onderhavige uitvinding is, voor wat betreft de wijze waarop de te transformeren plantecellen met de Aqrobacterium tumefaciens bacteriën in contact worden gebracht, niet aan bijzondere beperkingen onderhevig. Om meerdere generaties van getransformeerde planten te kunnen verkrijgen heeft het echter in het bijzonder de voorkeur dat men cellen van het apicaal meristeem in kiemende zaden met de bacteriën infecteert.The present invention is not particularly limited as to how the plant cells to be transformed are contacted with the Aqrobacterium tumefaciens bacteria. However, in order to obtain multiple generations of transformed plants, it is particularly preferred that cells of the apical meristem are infected with the bacteria in germinating seeds.

In verband met praktische voordelen, met name een hoge produktie per tijdseenheid en een hoge precisie, heeft het de voorkeur dat men de infectie uitvoert door middel van naaldloze hoge-druk injectie. Hiermee wordt bedoeld een op cellen van het apicaal meristeem gerichte beschieting onder hoge druk van kiemende zaden van de te transformeren planten met een vloeistof die de Aqrobacterium tumefaciens bacteriën bevat. Voor een dergelijke beschieting geschikte instrumenten, zoals een hoge-druk "pistool", zijn op zichzelf bekend.In view of practical advantages, in particular high production per unit time and high precision, it is preferred that the infection be carried out by means of needle-free high-pressure injection. By this is meant a high-pressure bombardment of germinating seeds of the plants to be transformed at cells of the apical meristem with a liquid containing the Aqrobacterium tumefaciens bacteria. Instruments suitable for such bombardment, such as a high-pressure "gun", are known per se.

De uitvinding is echter niet tot een dergelijke methode beperkt en omvat de mogelijkheid, dat men de infectie uitvoert door middel van micro-injectie. Men kan bovendien ook andere meristematische of embryogene weefsels of cellen gebruiken voor de introductie van een vreemd gen.However, the invention is not limited to such a method and includes the possibility of carrying out the infection by microinjection. Moreover, other meristematic or embryogenic tissues or cells can also be used for the introduction of a foreign gene.

In een ander aspect betreft de uitvinding een recombinant plasmide, bestaande uit een bacteriëel vectorplasmide en ten minste één DNA insertie, waarbij dit recombinante plasmide gekenmerkt wordt doordat ten minste één DNA insertie een transposase-gen, gelegen in een in plantecellen werkzame expressiecassette, omvat, welke in plantecellen werkzame en met een transposase-gen gevulde expressiecassette niet tussen de voor integratie in het DNA van plantecellen noodzakelijke linker en rechter uiteinden van een transposon is gelegen.In another aspect, the invention relates to a recombinant plasmid consisting of a bacterial vector plasmid and at least one DNA insert, said recombinant plasmid characterized in that at least one DNA insert comprises a transposase gene contained in an expression cassette acting in plant cells, which expression cassette active in plant cells and filled with a transposase gene is not located between the left and right ends of a transposon necessary for integration into the plant cell DNA.

Voorts betreft de uitvinding een recombinant plasmide, bestaande uit een bacteriëel vectorplasmide en ten minste één DNA insertie, waarbij dit recombinante plasmide gekenmerkt wordt doordat ten minste één DNA insertie een recombinant transposon omvat dat de voor integratie in het DNA van plante-cellen noodzakelijke linker en rechter uiteinden van een transposon omvat maar geen DNA fragment bevat, dat in plante-cellen tot expressie van een werkzaam transposase kan leiden.The invention further relates to a recombinant plasmid, consisting of a bacterial vector plasmid and at least one DNA insertion, said recombinant plasmid being characterized in that at least one DNA insertion comprises a recombinant transposon which contains the linker and the cells necessary for integration into the DNA of plant cells. right ends of a transposon includes but does not contain a DNA fragment, which can express active transposase in plant cells.

Een voorkeursuitvoeringsvorm van zo'n recombinant plasmide wordt gekenmerkt doordat het recombinante transposon tussen de linker en rechter transposon-uiteinden een of meerdere, als kloneringssite geschikte restrictie-endonuclease herkenningssequenties omvat. Een dergelijk plasmide is zeer veelzijdig toepasbaar als drager voor genen, die men in het genoom van planten wil brengen.A preferred embodiment of such a recombinant plasmid is characterized in that the recombinant transposon between the left and right transposon ends comprises one or more restriction endonuclease recognition sequences suitable as cloning site. Such a plasmid is very versatile in its use as a carrier for genes which are intended to be introduced into the genome of plants.

Een bijzondere voorkeursuitvoeringsvorm van dergelijke plasmiden wordt gekenmerkt doordat het recombinante transposon tussen de linker en rechter transposon-uiteinden ten minste één vreemd gen, gelegen in een in plantecellen werkzame expressiecassette, omvat.A particularly preferred embodiment of such plasmids is characterized in that the recombinant transposon between the left and right transposon ends comprises at least one foreign gene located in an expression cassette acting in plant cells.

Bij dergelijke recombinante plasmiden heeft het verder de voorkeur dat het recombinante transposon tussen de linker en rechter transposon-uiteinden een of meer, voor selectie van getransformeerde plantecellen geschikte en in een in plantecellen werkzame expressiecassette gelegen, selecteerbare merkergenen omvat, alsmede de voorkeur dat het recombinante transposon tussen de linker en rechter transposon-uiteinden een of meer, voor selectie van getransformeerde bacteriën geschikte en in een in bacteriën werkzame expressiecassette gelegen, selecteerbare merkergenen omvat.In such recombinant plasmids it is further preferred that the recombinant transposon between the left and right transposon ends comprises one or more selectable marker genes suitable for selection of transformed plant cells and located in an expression cassette acting in plant cells, and it is preferred that the recombinant transposon between the left and right transposon ends comprises one or more selectable marker genes suitable for selection of transformed bacteria and located in a bacterial expression cassette.

In weer een ander aspect verschaft de uitvinding een recombinante Aarobacterium tumefaciens stam, die naar plantecellen te transfereren vreemd DNA bevat tussen de voor een dergelijke transfer noodzakelijke linker en rechter uiteinden van T-DNA en tot transfer van dit vreemde DNA naar de plantecellen in staat is, waarbij deze stam gekenmerkt wordt doordat tussen de linker en rechter uiteinden van T-DNA een transposase-gen, gelegen in een in plantecellen werkzame expressiecassette, ligt, welke in plantecellen werkzame en met een transposase-gen gevulde expressiecassette niet tussen de voor integratie in het DNA van plantecellen noodzakelijke linker en rechter uiteinden van een transposon is gelegen.In yet another aspect, the invention provides a recombinant Aarobacterium tumefaciens strain containing foreign DNA to be transferred to plant cells between the left and right ends of T-DNA necessary for such transfer and capable of transferring this foreign DNA to the plant cells wherein this strain is characterized in that between the left and right ends of T-DNA is a transposase gene located in an expression cassette acting in plant cells, which expression active in plant cells and filled with a transposase gene is not between the expression cassette for integration into the DNA of plant cells is located on the necessary left and right ends of a transposon.

Wat dit aspect betreft verschaft de uitvinding ook een recombinante Aqrobacterium tumefaciens stam, die naar plantecellen te transfereren vreemd DNA bevat tussen de voor een dergelijke transfer noodzake'lijke linker en rechter uiteinden van T-DNA en tot transfer van dit vreemde DNA naar de plantecellen in staat is, waarbij deze stam gekenmerkt wordt doordat tussen de linker en rechter uiteinden van T-DNA een recombinant transposon ligt dat de voor integratie in het DNA van plantecellen noodzakelijke linker en rechter uiteinden van een transposon omvat maar geen DNA fragment bevat, dat in plantecellen tot expressie van een werkzaam transposase kan leiden.In this regard, the invention also provides a recombinant Aqrobacterium tumefaciens strain, which contains foreign DNA to be transferred to plant cells between the left and right ends of T-DNA necessary for such transfer and to transfer this foreign DNA to the plant cells in state, wherein this strain is characterized in that between the left and right ends of T-DNA is a recombinant transposon comprising the left and right ends of a transposon necessary for integration into the DNA of plant cells but not containing a DNA fragment contained in plant cells expression of an active transposase.

Voor zo'n recombinante Aqrobacterium tumefaciens stam geldt opnieuw dat het recombinante transposon tussen de linker en rechter transposon-uiteinden ten minste één vreemd gen, gelegen in een in plantecellen werkzame expressiecassette, en/of een of meer, voor selectie van getransformeerde plantecellen geschikte en in een in plantecellen werkzame expressiecassette gelegen, selecteerbare merkergenen, en/of een of meer, voor selectie van getransformeerde bacteriën geschikte en in een in bacteriën werkzame expressiecassette gelegen, selecteerbare merkergenen kan omvatten.Again, for such a recombinant Aqrobacterium tumefaciens strain, the recombinant transposon between the left and right transposon ends contains at least one foreign gene, located in an expression cassette acting in plant cells, and / or one or more transformable plant cells suitable for selection. selectable marker genes contained in a plant cell active expression cassette and / or one or more selectable marker genes suitable for selection of transformed bacteria and contained in a bacterial active expression cassette.

Een bijzondere uitvoeringsvorm van een dergelijke recombinante Aqrobacterium tumefaciens stam wordt gekenmerkt, doordat tussen de linker en rechter uiteinden van T-DNA tevens een transposase-gen, gelegen in een in plantecellen werkzame expressiecassette, ligt, welke in plantecellen werkzame en met een transposase-gen gevulde expressiecassette niet tussen de voor integratie in het DNA van plantecellen noodzakelijke linker en rechter uiteinden van een transposon is gelegen.A special embodiment of such a recombinant Aqrobacterium tumefaciens strain is characterized in that between the left and right ends of T-DNA there is also a transposase gene, located in an expression cassette active in plant cells, which active in plant cells and with a transposase gene filled expression cassette is not located between the left and right ends of a transposon necessary for integration into the DNA of plant cells.

De uitvinding wordt ten slotte ook belichaamd in planten en uit een of meer cellen bestaande delen of produkten daarvan, welke planten afstammen van plantecellen die door de werkwijze volgens de uitvinding zijn getransformeerd. Met delen en produkten van planten wordt gedoeld op bijv. de bol, de knol of de wortel, de bloemen, het zaad en het daarvan gemaakte meel, enz.Finally, the invention is also embodied in plants and one or more cell parts or products thereof, which plants are descended from plant cells transformed by the method according to the invention. By parts and products of plants is meant, for example, the bulb, the tuber or the root, the flowers, the seed and the flour made therefrom, etc.

De uitvinding zal thans aan de hand van de tekening nader worden toegelicht. De tekening toont op schematische wijze in fig.l een T-DNA construct dat een vreemd gen X, opgenomen in een actief transposon, omvat, fig.2 een T-DNA construct dat zowel een vreemd gen X, opgenomen in een inactief transposon, als een actief transposon omvat, fig.2a een T-DNA construct dat een vreemd gen X omvat, dat opgenomen is in een inactief transposon, fig.2b een T-DNA construct dat in combinatie met dat van fig.2a kan worden gebruikt en een actief transposon omvat, fig.3 een T-DNA construct zoals getoond in fig.2, waarin het actief transposon echter gelegen is in een merkergen voor het selecteren van getransformeerde plantecellen, fig.4 een T-DNA construct zoals getoond in fig.3, waarin het actief transposon echter in het vreemde gen X ligt, fig.5 een T-DNA construct dat zowel een vreemd gen X, opgenomen in een inactief transposon, als een niet in een actief transposon gelegen transposase-gen omvat, fig.5a een T-DNA construct dat een vreemd gen X omvat, dat opgenomen is in een inactief transposon, fig .5b een T-DNA construct dat in combinatie met dat van fig.5a kan worden gebruikt en een transposase-gen omvat, dat niet in een actief transposon is gelegen, fig.6a een T-DNA construct dat een vreemd gen X omvat, opgenomen in een inactief transposon, waarbij het inactief transposon een door een tweede inactief transposon onderbroken merkergen voor het selecteren van getransformeerde plantecellen omvat, fig.6b een T-DNA construct dat in combinatie met dat van fig.6a kan worden gebruikt en een transposase-gen omvat, dat niet in een actief transposon is gelegen, fig.7a een T-DNA construct dat een vreemd gen X omvat, opgenomen in een inactief transposon, waarbij dit vreemd gen X door een tweede inactief transposon onderbroken is, fig.7b een T-DNA construct dat in combinatie met dat van fig.7a kan worden gebruikt en een transposase-gen omvat, dat niet in een actief transposon is gelegen, fig.8a de struktuur van het recombinante plasmide pMHIO en fig.8b een voorbeeld van een T-DNA construct volgens de uitvinding, fig.9a de struktuur van het recombinante plasmide pMG15 en fig.9b een voorbeeld van een T-DNA construct volgens de uitvinding, fig.lOa en fig.lOb tonen respectievelijk de struktuur van het recombinante plasmide pUCSSAcT19 en de struktuur van het recombinante plasmide pUCSS19tpnP35S-Ac9.The invention will now be further elucidated with reference to the drawing. The drawing schematically shows in Fig. 1 a T-DNA construct comprising a foreign gene X incorporated in an active transposon, Fig. 2 a T-DNA construct comprising both a foreign gene X incorporated in an inactive transposon, as an active transposon, Figure 2a comprises a T-DNA construct comprising a foreign gene X contained in an inactive transposon, Figure 2b a T-DNA construct usable in combination with that of Figure 2a, and an active transposon, FIG. 3 is a T-DNA construct as shown in FIG. 2, however, the active transposon is located in a marker gene for selecting transformed plant cells, FIG. 4 is a T-DNA construct as shown in FIG. 3, however, wherein the active transposon is in the foreign gene X, FIG. 5 a T-DNA construct comprising both a foreign gene X contained in an inactive transposon and a transposase gene not in an active transposon, FIG. 5a a T-DNA construct comprising a foreign gene X contained in an ina active transposon, Fig. 5b a T-DNA construct which can be used in combination with that of Fig. 5a and comprises a transposase gene, which is not located in an active transposon, Fig. 6a a T-DNA construct which contains a foreign gene X contained in an inactive transposon, wherein the inactive transposon comprises a marker gene interrupted by a second inactive transposon to select transformed plant cells, Fig. 6b a T-DNA construct which can be used in combination with that of Fig. 6a and a transposase gene not located in an active transposon, Fig. 7a a T-DNA construct comprising a foreign gene X contained in an inactive transposon, said foreign gene X interrupted by a second inactive transposon, Figure 7b is a T-DNA construct usable in combination with that of Figure 7a and comprises a transposase gene not located in an active transposon, Figure 8a the structure of the recombinant plasmid pMHIO and Figure 8b an example of a T-DNA construct according to the invention, Fig. 9a the structure of the recombinant plasmid pMG15 and Fig. 9b an example of a T-DNA construct according to the invention, Fig. 10a and Fig. 10b respectively show the structure of the recombinant plasmid pUCSSAcT19 and the structure of the recombinant plasmid pUCSS19tpnP35S-Ac9.

In de tekening hebben de symbolen de hierna volgende betekenissen: X stelt een vreemd gen voor, gelegen in een niet apart weergegeven, in plantecellen werkzame expressiecassette; als het gen door een insertie onderbroken is, worden de samenstellende delen van het gen weergegeven door resp. X' en X"; 51 stelt een merkergen voor, dat voor de selectie van getransformeerde plantecellen kan worden gebruikt; ook hier worden de samenstellende delen in het geval van een door een insertie onderbroken gen weergegeven door resp. SI' en SI"; 52 en S3 stellen eveneens voor de selectie van geslaagd getransformeerde plantecellen geschikte merkergenen, verder aangeduid als plantenselectiegenen, voor; sl en s2 stellen voor de selectie van getransformeerde bacteriën geschikte merkergenen, verder aangeduid als bacteriënselectiegenen, voor; tpn stelt een transposase-gen voor, gelegen in een niet apart weergegeven expressiecassette die in plantecellen kan functioneren; LTA en RTA stellen resp. het linkeruiteinde van T-DNA en het rechteruiteinde van T-DNA voor, welke uiteinden nodig zijn voor transfer van het T-DNA door de Agrobacterium tumefaciens bacteriën naar de plantecel; LTS en RTS stellen resp. het linkeruiteinde van een transposon en het rechteruiteinde van een al dan niet actief transposon voor.In the drawing, the symbols have the following meanings: X represents a foreign gene located in an expression cassette, which is not shown separately, in plant cells; if the gene has been interrupted by an insertion, the constituent parts of the gene are represented by resp. X 'and X "; 51 represents a marker gene which can be used for the selection of transformed plant cells; here again, in the case of an insert interrupted gene, the constituents are represented by SI' and SI", respectively; 52 and S3 also represent suitable marker genes, hereinafter referred to as plant selection genes, for the selection of successfully transformed plant cells; sl and s2 represent suitable marker genes, hereinafter referred to as bacteria selection genes, for the selection of transformed bacteria; tpn represents a transposase gene located in an expression cassette, not shown separately, that can function in plant cells; LTA and RTA state respectively. the left end of T-DNA and the right end of T-DNA for which ends are required for transfer of the T-DNA by the Agrobacterium tumefaciens bacteria to the plant cell; LTS and RTS respectively. the left end of a transposon and the right end of an active or inactive transposon.

Figuur 1 laat een eenvoudig T-DNA construct zien, dat op één plasmide tussen de T-DNA uiteinden LTA en RTA naast een bacteriënselectiegen sl zowel een vreemd gen X als een actief transposon bevat. In de getoonde uitvoeringsvorm maakt het vreemde gen X deel uit van het actieve transposon, doordat het samen met een transposase-gen tpn en met een plantenselectie-gen Sl tussen transposonuiteinden LTS en RTS ligt.Figure 1 shows a simple T-DNA construct, containing on one plasmid between the T-DNA ends LTA and RTA next to a bacteria selection gene sl both a foreign gene X and an active transposon. In the shown embodiment, the foreign gene X is part of the active transposon, in that it lies between transposon ends LTS and RTS together with a transposase gene tpn and with a plant selection gene S1.

Figuur 2 laat een soortgelijk eenvoudig T-DNA construct zien, dat op één plasmide tussen de T-DNA uiteinden LTA en RTA twee separate transposons bevat. Het ene transposon is een actief transposon, dat tussen transposonuiteinden LTS en RTS een transposase-gen tpn alsmede een plantenselectiegen S2 bevat. Het andere transposon is een inactief transposon, dat tussen transposonuiteinden LTS en RTS een vreemd gen X alsmede een plantenselectiegen Sl bevat. Het in.figuur 2 getoonde T-DNA bevat verder twee bacteriënselectiegenen, sl en s2.Figure 2 shows a similarly simple T-DNA construct, which contains two separate transposons on one plasmid between the T-DNA ends LTA and RTA. One transposon is an active transposon, which contains a transposase gene tpn and a plant selection gene S2 between transposon ends LTS and RTS. The other transposon is an inactive transposon, which contains a foreign gene X as well as a plant selection gene S1 between transposon ends LTS and RTS. The T-DNA shown in Figure 2 further contains two bacteria selection genes, sl and s2.

Voor alle duidelijkheid zij erop gewezen dat de onderhavige uitvinding geenszins beperkt is tot de concreet getoonde constructen. Zo kan in het construct van figuur 2 gemakkelijk worden volstaan met slechts één bacteriënselectiegen. Ook kan de plaats van de verschillende elementen worden gevariëerd, bijv. in figuur 2 een bacteriënselectiegen worden geplaatst tussen de twee transposons, een bacteriënselectiegen worden opgenomen in een van beide of in beide transposons, of kan de plaats van de plantenselectiegenen ten opzichte van de andere elementen van de transposons worden gewijzigd. Ook kunnen T-DNA constructen conform de uitvinding additionele of andere elementen bevatten dan in de tekening zijn getoond, bijv. een of meer extra vreemde genen, een of meer extra bacteriën- of plantenselectiegenen, e.d.For the avoidance of doubt, it should be noted that the present invention is by no means limited to the concrete structures shown. Thus, in the construct of Figure 2, it is easy to suffice with only one bacteria selection gene. Also, the location of the different elements can be varied, e.g. in Figure 2 a bacteria selection gene is placed between the two transposons, a bacteria selection gene is included in either or both transposons, or the location of the plant selection genes relative to the other elements of the transposons are changed. Also, T-DNA constructs according to the invention may contain additional or different elements than shown in the drawing, e.g. one or more extra foreign genes, one or more extra bacteria or plant selection genes, etc.

De figuren 2a en 2b tonen een analoog construct, waarbij echter de elementen over twee verschillende plasmiden zijn verdeeld. Het inactieve transposon met daarin een vreemd gen X en een plantenselectiegen SI ligt op een eerste plasmide, waarvan het T-DNA in fig.2a is weergegeven. Fig.2b toont het T-DNA van een tweede plasmide, dat het actieve transposon met daarin een plantenselectiegen S2 bevat. Wanneer overigens het voor een efficiënte inbouw in het plantegenoom benodigde enzym transposase door de ontvangende plantecellen zelf kan worden geleverd, kan het in figuur 2a getoonde construct ook alleen, dus zonder het construct van fig.2b, worden toegepast.Figures 2a and 2b show an analogous construct, however, the elements are divided over two different plasmids. The inactive transposon containing a foreign gene X and a plant selection gene S1 lies on a first plasmid, the T-DNA of which is shown in Figure 2a. Fig. 2b shows the T-DNA of a second plasmid, which contains the active transposon containing a plant selection gene S2. Incidentally, if the enzyme transposase required for efficient incorporation into the plant genome can be supplied by the recipient plant cells themselves, the construct shown in Figure 2a can also be used alone, i.e. without the construct of Figure 2b.

Andersom is het ook mogelijk planten, die in hun genoom een recombinant transposon in de zin van fig.2a, maar dan zonder de Aarobacterium sequenties bevatten, te injecteren met Aarobacterium stammen die een construct in de zin van fig.2b bevatten. Hierbij wordt excisie van een recombinant transposon beoogd.Conversely, it is also possible to inject plants containing a recombinant transposon within the meaning of Figure 2a in their genome, but without the Aarobacterium sequences, with Aarobacterium strains containing a construct within the meaning of Figure 2b. This aims at excision of a recombinant transposon.

Figuur 3 toont een soortgelijk T-DNA construct als in fig.2 is getoond. Behalve dat, louter ter illustratie van deze mogelijkheid, het tweede bacteriënselectiegen s2 ontbreekt, verschilt dit construct vooral van dat volgens fig.2 doordat het actief transposon in het inactief transposon is opgenomen, en wel in het plantenselectiegen SI dat daardoor onwerkzaam is zolang de SI sequentie door het actief transposon onderbroken is. Zoals in fig.3 weergegeven, bevat het actief transposon een eigen plantenselectiegen S2.Figure 3 shows a similar T-DNA construct as shown in Figure 2. Apart from the fact that the second bacteria selection gene s2 is missing, merely to illustrate this possibility, this construct differs mainly from that according to figure 2 in that the active transposon is included in the inactive transposon, namely in the plant selection gene SI which is thereby inactive as long as the SI sequence is interrupted by the active transposon. As shown in Figure 3, the active transposon contains its own plant selection gene S2.

Figuur 4 toont eenzelfde soort T-DNA construct als fig.3, met dien verstande dat niet plantenselectiegen SI, maar vreemd gen X door het actief transposon wordt onderbroken. Dergelijke constructen zoals getoond in figuren 3-4 en 6a-7a kunnen tot een expressie in een beperkt aantal cellen aanleiding geven, hetgeen nuttig kan zijn in situaties waarin vreemd gen X of plantenselectiegen Sl slechts in beperkte mate tot expressie mag komen.Figure 4 shows the same kind of T-DNA construct as figure 3, with the proviso that it is not plant selection gene SI, but foreign gene X that is interrupted by the active transposon. Such constructs as shown in Figures 3-4 and 6a-7a may give rise to expression in a limited number of cells, which may be useful in situations where foreign gene X or plant selection gene S1 may only be expressed to a limited extent.

Figuur 5 toont een voorkeursuitvoeringsvorm van een T-DNA construct volgens de uitvinding, waarbij één plasmide tussen de T-DNA uiteinden LTA en RTA zowel een inactief transposon met daarin een vreemd gen X en een plantenselectiegen SI, als ook een niet op een actief transposon gelegen transposase-gen tpn bevat. De in fig.5 getoonde selectiegenen zijn overigens facultatief, waarbij met name één van de bacteriënselectie-genen en één van de plantenselectiegenen eventueel gemist kunnen worden. Wat het transposase-gen betreft, is van belang dat het niet op een actief transposon ligt. Dit betekent niet dat de transposon-uiteinden volledig moeten ontbreken: veelal zal verwijdering van (een significant deel van) één van de transposon-uiteinden voldoende zijn om een efficiënte inbouw van het transposase-gen in het genoom van de getransformeerde plantecellen te verhinderen. Zo zou bijvoorbeeld vóór (in fig.5 links van) het transposase-gen tpn nog een linker transposon-uiteinde LTS kunnen liggen.Figure 5 shows a preferred embodiment of a T-DNA construct according to the invention, in which one plasmid between the T-DNA ends LTA and RTA contains both an inactive transposon containing a foreign gene X and a plant selection gene S1, as well as a non-active transposon located transposase gene contains tpn. The selection genes shown in Fig. 5 are otherwise optional, in particular one of the bacteria selection genes and one of the plant selection genes may be missed if desired. As far as the transposase gene is concerned, it is important that it does not lie on an active transposon. This does not mean that the transposon ends must be completely missing: removal of (a significant part of) one of the transposon ends will usually suffice to prevent efficient incorporation of the transposase gene into the genome of the transformed plant cells. For example, a left transposon end LTS could lie in front of (in Figure 5 left of) the transposase gene tpn.

De figuren 5a en 5b tonen een uit een analoog construct bestaande voorkeursuitvoeringsvorm, waarbij de elementen over twee verschillende plasmiden zijn verdeeld. Het inactieve transposon met daarin een vreemd gen X en een plantenselectiegen SI ligt op een eerste plasmide, waarvan het T-DNA in fig.5a is weergegeven. Fig.5b toont het T-DNA van een tweede plasmide, dat een transposase-gen en een plantenselectiegen S2 bevat. Zoals in de figuren 5a en 5b weergegeven bevatten de beide T-DNA constructen ook nog elk een bacteriënselectiegen (sl resp. s2) .Figures 5a and 5b show a preferred embodiment consisting of an analogous construction, in which the elements are divided over two different plasmids. The inactive transposon containing a foreign gene X and a plant selection gene S1 lies on a first plasmid, the T-DNA of which is shown in Figure 5a. Fig. 5b shows the T-DNA of a second plasmid, which contains a transposase gene and a plant selection gene S2. As shown in Figures 5a and 5b, both T-DNA constructs also each contain a bacteria selection gene (sl and s2, respectively).

De figuren 6a en 6b tonen een voorkeursuitvoeringsvorm, die gelijkenis vertoont met die volgens de figuren 5a en 5b. Een inactief transposon met daarin een vreemd gen X en een plantenselectiegen Sl ligt op een eerste plasmide, waarvan het T-DNA in fig.6a is weergegeven. In dit geval wordt echter het plantenselectiegen Sl onderbroken door een tweede inactief transposon, dat eventueel, zoals getoond in fig.6a, een eigen plantenselectiegen S3 bevat. Fig.6b toont het T-DNA van een tweede plasmide, dat een tra.nsposase-gen en een plantenselectiegen S2 bevat. Dit plasmide is identiek aan het in fig.5b getoonde plasmide.Figures 6a and 6b show a preferred embodiment, which resembles that of figures 5a and 5b. An inactive transposon containing a foreign gene X and a plant selection gene S1 lies on a first plasmid, the T-DNA of which is shown in Figure 6a. In this case, however, the plant selection gene S1 is interrupted by a second inactive transposon, which optionally contains its own plant selection gene S3, as shown in Fig. 6a. Fig. 6b shows the T-DNA of a second plasmid, which contains a trasposase gene and a plant selection gene S2. This plasmid is identical to the plasmid shown in Figure 5b.

De figuren 7a en 7b tonen een voorkeursuitvoeringsvorm, die overeenkomt met die van de figuren 6a en 6b, met dien verstande dat het tweede inactief transposon niet het plantenselectiegen SI, maar het vreemde gen X onderbreekt.Figures 7a and 7b show a preferred embodiment, similar to that of Figures 6a and 6b, with the proviso that the second inactive transposon does not interrupt the plant selection gene S1, but the foreign gene X.

De figuren 8a en 8b, 9a en 9b, en 10a en 10b tonen DNA constructen, die in de voorbeelden 1-4 nader zullen worden toegelicht.Figures 8a and 8b, 9a and 9b, and 10a and 10b show DNA constructs, which will be further explained in Examples 1-4.

VOORBEELDEN Voorbeeld 1.EXAMPLES Example 1.

Eliminatie van insertiemutaties van transposon Ac (Activator) afgeleide sequenties (Ds) bij maïs.Elimination of insertion mutations of transposon Ac (Activator) derived sequences (Ds) in maize.

Door een aktief transposon Ac door middel van kruising in het genoom van maïs in te brengen, kan men in de volgende generaties de aktiviteit van dit transposon waarnemen door het ontstaan van mutaties (insertie in een gen) of door het elimineren van een aan Ac-insertie te wijten mutatie (excisie uit een gen). In het hier beschreven voorbeeld wordt het Ac transposase-gen gebruikt om insertiemutaties (in dit geval Ds) te elimineren uit genen van maïs. Daarbij wordt conform de hierboven beschreven technologie Aqrobacterium gebruikt om het transposase-gen in cellen van het apicaal meristeem van maïs binnen te brengen.By introducing an active transposon Ac by crossing into the maize genome, one can observe the activity of this transposon in the following generations by the development of mutations (insertion in a gene) or by the elimination of an Ac- insertion due to mutation (excision from a gene). In the example described here, the Ac transposase gene is used to eliminate insertion mutations (in this case Ds) from maize genes. In addition, in accordance with the technology described above, Aqrobacterium is used to introduce the transposase gene into cells of the maize apical meristem.

Het plasmide pMHIO (fig. 8a) bevat de PstI kloon van transposon Ac9 in het waxy gen van maïs (Müller-Neumann et al., 1984), een Pstl-BamHI fragment van plasmide pBR322 (Bolivar et al., 1977) met een funktionele ori sequentie voor replicatie in gram-negatieve bacteriën, maar een niet funktioneel amp en tet resistentie-gen en bovendien een BamHI-Pstl fragment van plasmide pR702 (Hedges en Jacobs, 1974 enThe plasmid pMHIO (Fig. 8a) contains the PstI clone of transposon Ac9 in the maize waxy gene (Müller-Neumann et al., 1984), a Pstl-BamHI fragment of plasmid pBR322 (Bolivar et al., 1977) with a functional sequence for replication in gram-negative bacteria, but a non-functional amp and tet resistance gene and additionally a BamHI-Pstl fragment of plasmid pR702 (Hedges and Jacobs, 1974 and

Leemans et al., 1981) dat de sequentie bevat van een str / spc resistentie-gen. Het plasmide werd verkregen van het Laboratorium voor Genetika RUG, Gent, België.Leemans et al., 1981) containing the sequence of a str / spc resistance gene. The plasmid was obtained from the Laboratory for Genetics RUG, Ghent, Belgium.

In dit plasmide werd het BamHI fragment bevattende de pBR322 sequentie en het rechter Ac9(wx) transposon-uiteinde vervangen door een BamHI fragment bevattende het volledige pUC8 plasmide (Vieira en Messing, 1982). Het verkregen plasmide heet pMHIOlLTS (fig. 8a). Het pMHIOlLTS-plasmide wordt door conjugatie overgebracht naar een rif resistente Acrrobacterium tumefaciens (A. turn.) C58 stam bevattende het Ti plasmide pGV3850 (Zambryski et al., 1983), waarin pBR322 als een HindiII fragment gekloneerd is in het T-DNA van pTi C58 waaruit verder alle HindlII fragmenten uitgeknipt werden, behalve het Linker Border (LB)-fragment (HindIII-10) en het Rechter Border (RB)-fragment (HindIII-23), bevattende het nopaline-synthase-gen (nos).In this plasmid, the BamHI fragment containing the pBR322 sequence and the right Ac9 (wx) transposon end was replaced by a BamHI fragment containing the complete pUC8 plasmid (Vieira and Messing, 1982). The resulting plasmid is called pMHIOlLTS (Fig. 8a). The pMHIOlLTS plasmid is conjugated to a reef resistant Acrrobacterium tumefaciens (A. turn.) C58 strain containing the Ti plasmid pGV3850 (Zambryski et al., 1983), in which pBR322 has been cloned into the T-DNA of a HindiiII fragment. pTi C58 from which all HindIII fragments were further excised, except the Left Border (LB) fragment (HindIII-10) and the Right Border (RB) fragment (HindIII-23) containing the nopaline synthase gene (nos).

De methode van conjugatie werd beschreven door Van Haute et al. (1983). Door selectie van transconjuganten voor rif, str/spc en amp resistentie werd een coïntegraat geselecteerd, waarbij pMHIOlLTS tussen de borders van het T-DNA is geïntegreerd.The conjugation method was described by Van Haute et al. (1983). By selecting transconjugants for reef, str / spc and amp resistance, a co-integrate was selected, with pMHIOlLTS integrated between the borders of the T-DNA.

Maïslijnen, die door ten minste tien jaar inteelt werden verkregen, werden ter beschikking gesteld, in de vorm van zaad, door de firma Clovis Matton, Avelgem-Kerkhove, België. Deze lijnen bevatten geen aktief transposon Ac, hetgeen o.a. bewezen kon worden door het DNA van jonge bladeren af te breken met PvuII en te hybridiseren met het interne HindlII fragment van Ac (Ac9(wx): bp: 1270-2877) : er werd geen hybri- diserende band waargenomen die overeenkomt met het 2626 bp grote, interne PvuII-fragment van Ac (Ac9(wx): bp: 719-3345); er werden wel verschillende banden gevonden maar de kleinste was groter dan 4 kb. Kruisingen met test-lijnen voor Ac-aktiviteit hebben bij de gebruikte lijnen nooit transpositie-fenomenen aangetoond. De lijnen worden gebruikt voor de produktie van commerciële hybriden.Maize lines, which have been inbred for at least ten years, were made available, in the form of seed, by Clovis Matton, Avelgem-Kerkhove, Belgium. These lines did not contain any active transposon Ac, which could be proven by breaking down the DNA of young leaves with PvuII and hybridizing with the internal HindlII fragment of Ac (Ac9 (wx): bp: 1270-2877): no hybridizing band observed corresponding to the 2626 bp internal PvuII fragment of Ac (Ac9 (wx): bp: 719-3345); several bands were found, but the smallest was larger than 4 kb. Crosses with test lines for activity have never shown transposition phenomena in the lines used. The lines are used for the production of commercial hybrids.

Zaden van tien maïs-lijnen werden, na ontsmetting met NaCIO 2%, bij 25°C in het donker op steriel nat zand te kiemen gelegd. Drie dagen na de kieming werd 50 nl geïnduceerde A. turn, kuituur met de constructie Wx-Ac9RTS" geïntegreerd door genetische recombinatie tussen de borders van het T-DNA (fig. 8b), in het apicale meristeem ingespoten via micro-injectie.Seeds of ten corn lines were seeded after sterilization with NaCIO 2% at 25 ° C on sterile wet sand in the dark. Three days after germination, 50 nl induced A. turn culture with the construction Wx-Ac9RTS "integrated by genetic recombination between the borders of the T-DNA (Fig. 8b) was injected into the apical meristem by microinjection.

Het inductiemedium is beschreven door Vernade et al.The induction medium has been described by Vernade et al.

(1988) . Na een week bij 20°C werden de jonge plantjes samen met niet behandelde plantjes in grote potten in een geklimati-seerde serre gekweekt in een mengsel van potgrond en zandleem, in hun normale groeiseizoen (mei tot oktober) . Elke plant werd met de hand bevrucht, waarbij zowel de pluim als de aar in zakjes werden gehouden. Elke plant werd individueel bewaterd in de pot. De kolven werden geoogst in september en oktober en het zaad, na drogen, bij 6°C gedurende de winter bewaard in papieren zakken. Het volgende jaar werden de planten op aarlijnen gezaaid in de serre in de grond en opnieuw met de hand bevrucht en geëvalueerd door maïskwekers op hun karakteristieken zowel tijdens de groei als bij surmaturiteit.(1988). After a week at 20 ° C, the young plants, together with untreated plants, were grown in large pots in a climate-controlled greenhouse in a mixture of potting soil and sandy loam, in their normal growing season (May to October). Each plant was fertilized by hand, keeping both the plume and the ear in bags. Each plant was watered individually in the pot. The flasks were harvested in September and October and the seed, after drying, stored in paper bags at 6 ° C during the winter. The following year, the plants were sown on lines in the greenhouse in the ground and re-fertilized by hand and evaluated by maize growers for their characteristics both during growth and surmaturity.

De volgende verbeteringen ten opzichte van de oorspronkelijke lijnen werden bij enkele aarlijnen vastgesteld: - pluim meer vertakt - 30 - 50 cm hogere planten - steviger stengel - significante toename van het aantal korrelrijen per kolf - langer groen blijven - afwezigheid van fusariose - betere verankering door secundaire wortelsThe following improvements compared to the original lines were observed at a few spikes: - plume more branched - 30 - 50 cm higher plants - firmer stem - significant increase in the number of grain rows per cob - stay green longer - absence of fusario - better anchoring by secondary roots

Zaden van planten met afwijkende kenmerken, zowel als van controleplanten werden in het laboratorium onder steriele omstandigheden gekiemd en van de jonge bladeren werd DNA bereid, waarna de plantjes in de serre werden geplant in grote potten.Seeds of plants with abnormal characteristics, as well as of control plants, were germinated in sterile conditions in the laboratory and DNA was prepared from the young leaves, after which the plants were planted in the greenhouse in large pots.

Het DNA van elk plantje werd vervolgens zoals voor RFLP mapping afgebroken met verschillende restrictie-enzymen en gehybridiseerd met het interne HindlII fragment van Ac9. De controleplantjes vertoonden hetzelfde bandenpatroon, voor wat betreft de prominente banden, als de oorspronkelijke lijn. Bij de plantjes met afwijkende kenmerken werd ófwel verdwijning van een of meerdere met de DNA probe hybridiserende fragmenten, ófwel het verdwijnen van een fragment en het verschijnen van een nieuw fragment met een groter molecuulgewicht vastgesteld.The DNA of each plant was then degraded with various restriction enzymes as for RFLP mapping and hybridized with the internal HindIII fragment of Ac9. The control plants showed the same tire pattern, as far as the prominent tires are concerned, as the original line. Either disappearance of one or more fragments hybridizing with the DNA probe, or disappearance of a fragment and the appearance of a new fragment with a higher molecular weight, were observed in the plants with abnormal characteristics.

Voorbeeld 2.Example 2.

Insertie van een vreemd gen in het genoom van maïs, door gebruik van Aarobacterium tumefaciens als transfer-systeem en transposon Ac als integratiesysteem.Insertion of a foreign gene into the maize genome, using Aarobacterium tumefaciens as the transfer system and transposon Ac as the integration system.

Bij wijze van uitzondering wordt hier gebruik gemaakt van een actief transposon Ac9(wx) om het effekt beter te kunnen zien. Door gebruik te maken van de integratie-eigenschappen van het transposon Ac en de transfer-eigenschappen van A. turn, kan men een vreemd gen, gelegen tussen de herkennings-sequenties van het transposon, door middel van de transposase van hetzelfde transposon in het genoom van maïs inbouwen.As an exception, an active transposon Ac9 (wx) is used here to better see the effect. By using the integration properties of the transposon Ac and the transfer properties of A. turn, one can find a foreign gene, located between the recognition sequences of the transposon, by means of the transposase of the same transposon in the genome. of corn.

Zoals beschreven wordt bij wijze van voorbeeld gebruik gemaakt van twee A. turn, stammen. De eerste bevat het β-glucuronidase-gen van Escherichia coli. gelegen tussen de linker en rechter transposon-uiteinden van Ac9(wx), hetwelk op zijn beurt gelegen is tussen de Linker en Rechter-Border (LB en RB) van het T-DNA op een niet oncogeen Ti-plasmide. De tweede bevat een volledig transposon Ac9(wx) gelegen tussen LB en RB van het T-DNA.As described, two A. turn strains are used by way of example. The first contains the β-glucuronidase gene of Escherichia coli. located between the left and right transposon ends of Ac9 (wx), which in turn is located between the Left and Right Border (LB and RB) of the T-DNA on a non-oncogenic Ti plasmid. The second contains a complete transposon Ac9 (wx) located between LB and RB of the T-DNA.

De A. turn, stam die het transposon Ac9 bevat in het T-DNA is beschreven in fig. 8a. De andere A. turn, stam werd op de volgende wijze verkregen:The A. turn strain containing the transposon Ac9 in the T-DNA is described in Fig. 8a. The other A. turn strain was obtained in the following manner:

Plasmide pBI 221 bevat het β-glucuronidase-gen van E.coli (uidA) onder de controle van de CaMV 35S promoter (Cauliflower Mosaic Virus 35S RNA promoter) en het mRNA distaai einde van het nopaline-synthase-gen van het Ti-plasmide van A.turn. T37.Plasmid pBI 221 contains the β-glucuronidase gene of E.coli (uidA) under the control of the CaMV 35S promoter (Cauliflower Mosaic Virus 35S RNA promoter) and the mRNA distant end of the nopaline synthase gene of the Ti plasmid from A.turn. T37.

Dit plasmide werd verkregen van Dr R. Jefferson, PBI Cambridge, UK.This plasmid was obtained from Dr R. Jefferson, PBI Cambridge, UK.

Het plasmide pMHlO, beschreven in fig. 8a, werd geknipt met EcoRI en partiëel met HindlII en het 10,1 kb fragment geligeerd met het EcoRI-HindlII fragment van pBI 221, bevattende de sequentie van het chimeer uidA-gen van dit laatste plasmide. Het verkregen plasmide pMG15 bevat het chimeer uidA-aen in een transcriptie-oriëntatie tegengesteld aan deze van het (partiëel) gedeleteerde transposase-gen.The plasmid pMH10, described in Figure 8a, was digested with EcoRI and partially with HindIII and the 10.1 kb fragment ligated with the EcoRI-HindIII fragment of pBI 221 containing the sequence of the chimeric uidA gene of the latter plasmid. The resulting plasmid pMG15 contains the chimeric uidA gene in a transcription orientation opposite to that of the (partially) deleted transposase gene.

A. tum. bacteriën met dit plasmide, hierin ingebracht op de in Voorbeeld 1 beschreven wijze, vertonen β-glucuronidase aktiviteit. De constructie is afgebeeld in fig. 9a en fig. 9b.A. tum. bacteria with this plasmid introduced herein in the manner described in Example 1 exhibit β-glucuronidase activity. The construction is shown in Fig. 9a and Fig. 9b.

Dezelfde maïslijnen, beschreven in voorbeeld 1, werden gebruikt voor de transformatie. Bij drie dagen oude kiemen werd het apicaal meristeem door micro-injectie besmet met 50 nl van een mengsel van de twee hierboven beschreven A. turn, stammen, geïnduceerd voor transfer. In een eerste fase werden enkele honderdtallen kiemen na 1 of 2 weken getest op β-glucuronidase aktiviteit door een stuk weefsel, bevattende het apicaal meristeem, te incuberen met X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-glucuronide). Bij ongeveer 7,5% van de weefsels trad blauwkleuring op. Met een donkerveldmicroscoop was duidelijk te zien dat de cellen in de weefselsneden en niet de overblijvende bacteriën de oorsprong waren van de purperkleur. Vooral kleine cellen rond de vaatbundels waren gekleurd. Met een electronenmicroscoop werd het neerslag van dimeer bromo-chloro-indool gevonden in cellen, die tot tien cellagen verwijderd waren van de injectieplaats. Sporadisch waren doorgesneden bacteriën te zien, die zich uitsluitend in de extra-cellulaire ruimten bevonden, maar geen neerslag vertoonden.The same corn lines described in Example 1 were used for the transformation. In three day old germs, the apical meristem was microinjected with 50 µl of a mixture of the two A. turn strains described above induced for transfer. In the first phase, a few hundred germs were tested for 1 or 2 weeks for β-glucuronidase activity by incubating a piece of tissue containing the apical meristem with X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D- glucuronide). Blue staining occurred in about 7.5% of the tissues. Using a dark field microscope it was clear that the cells in the tissue cuts and not the remaining bacteria were the origin of the purple color. Small cells around the vascular bundles in particular were stained. With an electron microscope, the precipitate of dimer bromo-chloro-indole was found in cells that were up to ten cell layers away from the injection site. Sected bacteria were seen sporadically, which were only located in the extracellular spaces, but showed no precipitation.

Andere behandelde kiemen werden opgegroeid in de serre in een normaal groeiseizoen, met de hand bevrucht en het zaad geoogst, zoals beschreven in Voorbeeld 1.Other treated germs were grown in the greenhouse in a normal growing season, fertilized by hand and the seed harvested as described in Example 1.

Tijdens de wintermaanden werden deze zaden in steriele omstandigheden gekiemd en van de jonge bladeren werden de proteïnen geïsoleerd en onderworpen aan polyacrylamide-gel-electroforese (PAGE) onder niet-denaturerende omstandigheden. Bèta-glucuronidase aktiviteit werd gedetecteerd door de gel te overdekken met een dunne agarose gel, bevattende het substraat methyl-umbelliferyl-D-glucuronide, dat in UV licht fluoresceert indien het β-glucuronidase enzyme methyl-umbelliferone doet vrijkomen.During the winter months, these seeds were germinated in sterile conditions and the proteins were isolated from the young leaves and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) under non-denaturing conditions. Beta-glucuronidase activity was detected by covering the gel with a thin agarose gel containing the substrate methyl-umbelliferyl-D-glucuronide, which fluoresces in UV light when the β-glucuronidase enzyme releases methyl-umbelliferone.

Een fluorescerende band werd aangetroffen bij ongeveer 1% van de geteste plantjes. Uit bladeren en wortel-stukjes van deze planten werd DNA bereid en zoals bij RFLP mapping gehybridiseerd met een 2,9 kb groot HindlII-EcoRI fragment, bevattende het chimeer uidA-gen. In de laan van de agarosegel, die met HindlII en EcoRI afgebroken maïs DNA bevatte, werd hybridisatie gevonden met de probe ter hoogte van de plaats waar ongeveer 3 kb fragmenten migreren.A fluorescent band was found in about 1% of the tested plants. DNA was prepared from leaves and root pieces of these plants and hybridized as with RFLP mapping to a 2.9 kb HindIII-EcoRI fragment containing the chimeric uidA gene. In the lane of the agarose gel, containing maize DNA degraded with HindII and EcoRI, hybridization was found with the probe at the site where approximately 3 kb fragments migrate.

Van jonge Fl plantjes werden stukjes blad en wortel geïncubeerd in X-gluc zoals beschreven door Jefferson (GUS gene fusion system user's manual, 1987). Blauwe vlekken, zónes en sectoren werden gevonden in de weefselstukken van PAGE-β-glucuronidase positieve planten: rond de vaatbundels, rond de stomata, V-vormige segmenten van de wortel, enz..From young Fl plants, leaf and root pieces were incubated in X-gluc as described by Jefferson (GUS gene fusion system user's manual, 1987). Blue spots, zones and sectors were found in the tissue pieces of PAGE-β-glucuronidase positive plants: around the vascular bundles, around the stomata, V-shaped segments of the root, etc.

Voorbeeld 3.Example 3.

Constructie van een recombinant transposon met een multiple cloning site tussen de transposonuiteinden.Construction of a recombinant transposon with a multiple cloning site between the transposon ends.

Het Sohl-Kpnl fragment uit mini-Sa, een derivaat van pR702 (Leemans et al., 1983) bevattende het sm-sp adenosyl-transferase-gen, dat resistentie tegen streptomycine en speetinomycine codeert, werd blunt end gemaakt met T4 DNA polymerase en gekloneerd in het plasmide pUC19 (Pridmore, 1987), blunt end geknipt met Sspl. Dit plasmide was 4330bp groot en wordt hier verder pUCSS19 genoemd.The Sohl-Kpnl fragment from mini-Sa, a derivative of pR702 (Leemans et al., 1983) containing the sm-sp adenosyl transferase gene, encoding resistance to streptomycin and speetinomycin, was blunted with T4 DNA polymerase and cloned in the plasmid pUC19 (Pridmore, 1987), blunt end cut with Sspl. This plasmid was 4330bp in size and is further referred to herein as pUCSS19.

Beide oriëntaties van het sm/sp resistentie-gen zijn geschikt. Er werd echter verder gewerkt met het plasmide waarin het amp resistentie-gen en het sm/sp resistentie-gen dezelfde transcriptie oriëntatie hebben. pUCSS19 werd blunt end geknipt met PvuII en zowel het 4030bp grote vectorfragment als het 300bp grote MCS fragment werden gescheiden en bewaard.Both orientations of the sm / sp resistance gene are suitable. However, work continued with the plasmid in which the amp resistance gene and the sm / sp resistance gene have the same transcription orientation. pUCSS19 was cut blunt end with PvuII and both the 4030bp vector fragment and the 300bp MCS fragment were separated and stored.

Uit pMHIO (fig. 8a) werd de PstI clone van Wx-Ac9 geknipt en blunt end gemaakt met T4 DNA polymerase. Dit fragment werd gekloneerd in het 4030bp grote PvuII fragment van pUSS19. Dit plasmide was 8840bp groot en wordt hier verder pUCSSAc9 genoemd.From PMHIO (Fig. 8a), the PstI clone of Wx-Ac9 was cut and blunt-ended with T4 DNA polymerase. This fragment was cloned into the 4030bp PvuII fragment of pUSS19. This plasmid was 8840bp in size and is further referred to herein as pUCSSAc9.

pUCSSAc9 werd geknipt met Nsil en Mscl en het Nsil uiteinde blunt end gemaakt met T4 DNA polymerase. Dit fragment was 4980bp groot en bevatte de uiteinden van transposon Ac9. Hierin werd nu het 300bp grote PvuII fragment van pUC19 gekloneerd. Een van de oriëntaties wordt getoond in fig. 10a. Het plasmide was 5280bp groot en wordt pUCSSAcT19 genoemd. Het kan gebruikt worden voor de klonering van tal van genen met hun expressiecassette. Het kan naar Aqrobacterium met plasmide pGV3850 worden geconjugeerd zoals beschreven in het eerste voorbeeld door bijkomende selectie met spectinomycine.pUCSSAc9 was cut with Nsil and Mscl and the Nsil end blunt end made with T4 DNA polymerase. This fragment was 4980bp in size and contained the ends of transposon Ac9. Here the 300bp PvuII fragment of pUC19 was now cloned. One of the orientations is shown in Fig. 10a. The plasmid was 5280bp in size and is called pUCSSAcT19. It can be used for the cloning of many genes with their expression cassette. It can be conjugated to Aqrobacterium with plasmid pGV3850 as described in the first example by additional selection with spectinomycin.

Voorbeeld 4.Example 4.

Constructie van een recombinant plasmide dat het transposase-gen van Ac bevat onder controle van de CaMV 35S promoter.Construction of a recombinant plasmid containing the Ac transposase gene under the control of the CaMV 35S promoter.

Het plasmide pMHIO (fig. 8a) werd geknipt met PstI en het 4810bp grote Ac9 wx fragment, gekloneerd in pUC19, geknipt met PstI. Dit plasmide was 7500bp groot en wordt hierna pUC19Ac9wx genoemd. Er werd verder gewerkt met de oriëntatie 1, namelijk deze waarin de BamHI sites het verst van elkaar verwijderd liggen.The plasmid pMHIO (Fig. 8a) was cut with PstI and the 4810bp Ac9 wx fragment cloned in pUC19 cut with PstI. This plasmid was 7500bp in size and is hereinafter referred to as pUC19Ac9wx. Work continued with orientation 1, namely that in which the BamHI sites are furthest from each other.

Het Ac9 wx fragment werd er opnieuw uitgeknipt, als BamHI fragment. Dit fragment werd partiëel geknipt met CfrlOl en twee fragmenten werden bewaard: het 3,4 kb CfrlOl fragment en het 4,2 kb BamHI-CfrlOl fragment. Het eerst bevatte een transposase-gen zonder promoter en het tweede een met promoter. Het 4,2 kb fragment werd gekloneerd in pUCSS19, geknipt met Xmal en BamHI. Dit plasmide (8,5kb) bevatte het normale transposase-gen van Ac maar geen transposon-uiteinden (pUCSS19tpnAc9) en kon door conjugatie worden overgebracht naar Acrrobacterium en geïntegreerd in het T-DNA van pGV3850 door bijkomende selectie van spectinomycine-resistentie. Het 3,4 kb fragment werd gekloneerd in pUC19, geknipt met Xmal. en de oriëntatie werd bepaald gebruikmakende van de Xbal site in de MCS en in het transposase-gen (positie 1260) . Dit plasmide (7,7 kb) wordt pUCSS19tpnPAc9 genoemd en kan dienen voor het kloneren van nieuwe promoters stroomopwaarts van het transposase-gen.The Ac9 wx fragment was cut out again, as a BamHI fragment. This fragment was cut partially with Cfr101 and two fragments were preserved: the 3.4 kb Cfr101 fragment and the 4.2 kb BamHI-Cfr101 fragment. The first contained a transposase gene without a promoter and the second one with a promoter. The 4.2 kb fragment was cloned into pUCSS19, digested with Xmal and BamHI. This plasmid (8.5kb) contained the normal Ac transposase gene but no transposon ends (pUCSS19tpnAc9) and could be conjugated to Acrrobacterium and integrated into the T-DNA of pGV3850 by additional selection of spectinomycin resistance. The 3.4 kb fragment was cloned into pUC19 digested with Xmal. and the orientation was determined using the Xbal site in the MCS and in the transposase gene (position 1260). This plasmid (7.7 kb) is called pUCSS19tpnPAc9 and may serve to clone new promoters upstream of the transposase gene.

Voor verder gebruik werd pUCSS19tpnPAc9 in oriëntatie 1 genomen, waarbij het Xbal fragment uit dit plasmide 2,5 kb groot was. Dit plasmide werd geknipt met PstI en BamHI en het CaMV 35S promoter fragment uit pBl221, uitgeknipt met PstI en BamHI. werd hierin gekloneerd.For further use, pUCSS19tpnPAc9 was taken in orientation 1, the Xbal fragment from this plasmid being 2.5 kb in size. This plasmid was excised with PstI and BamHI and the CaMV 35S promoter fragment from pBl221 excised with PstI and BamHI. was cloned herein.

Het aldus verkregen plasmide heet pUCSS19tpnP35S-Ac9 (fig. 10b). Het kan zoals reeds beschreven geconjugeerd worden naar Aorobacterium en geïntegreerd worden in pGV3850 door bijkomende selectie voor spectinomycine.The plasmid thus obtained is called pUCSS19tpnP35S-Ac9 (Fig. 10b). As already described, it can be conjugated to Aorobacterium and integrated into pGV3850 by additional selection for spectinomycin.

LiteratuurLiterature

Bolivar, F. et al., Gene 2: 95-113 (1977)Bolivar, F. et al., Gene 2: 95-113 (1977)

Hedges, R.W. en Jacob, A., Mol. Gen. Genet. 132: 31-40 (1974) Leemans, J. et al., J. Mol. Appl. Genet. 1:149-164 (1981) Müller-Neumann, M., Yoder, I. en Starlinger, P., Mol. Gen. Genet. 128: 19-24 (1984)Hedges, R.W. and Jacob, A., Mol. Gene. Genet. 132: 31-40 (1974) Leemans, J. et al., J. Mol. Appl. Genet. 1: 149-164 (1981) Müller-Neumann, M., Yoder, I. and Starlinger, P., Mol. Gene. Genet. 128: 19-24 (1984)

Pridmore, R.D., Gene 2£: 309-312 (1987)Pridmore, R.D., Gene 2 £: 309-312 (1987)

Van Haute, E. et al., EMBO J. 2: 411-418 (1983)Van Haute, E. et al., EMBO J. 2: 411-418 (1983)

Vernade, D. et al., J. Bacteriol. 170: 5822-5829 (1988)Vernade, D. et al., J. Bacteriol. 170: 5822-5829 (1988)

Vieira, J. en Messing, J., Gene 12: 259-268 (1982)Vieira, J. and Messing, J., Gene 12: 259-268 (1982)

Zambryski, P. et al., EMBO J. 2: 2143-2150 (1983)Zambryski, P. et al., EMBO J. 2: 2143-2150 (1983)

Claims

A method for genetically manipulating plant cells, in which foreign DNA is introduced into plant cells by infecting the plant cells with one or more recombinant Agrobacterium tumefaciens strains containing foreign DNA to be transferred to the plant cells between the linker necessary for such a transfer and right ends of T-DNA and capable of transferring this foreign DNA to the plant cells, characterized in that the foreign DNA located between the left and right ends of T-DNA is a transposase gene located in a in the plant cells active expression cassette, and a recombinant transposon, the recombinant transposon comprising the left and right transposon ends necessary for integration into the DNA of the plant cells, with a DNA fragment to be integrated into the DNA of the plant cells therebetween.

Method according to claim 1, characterized in that the expression cassette located between the left and right ends of T-DNA, active in the plant cells and filled with a transposase gene, is not between the linker necessary for integration into the DNA of the plant cells. and right ends of a transposon is located.

Method according to claim 1 or 2, characterized in that the recombinant transposon does not contain a DNA fragment which can express an active transposase in the plant cells.

A method according to any one of the preceding claims, characterized in that the recombinant transposon between the left and right transposon ends comprises at least one foreign gene contained in an expression cassette acting in the plant cells.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that between the left and right ends of T-DNA there are also one or more selectable marker genes suitable for selection of transformed bacteria and located in a bacterial expression cassette.

Method according to claim 5, characterized in that one or more selectable marker genes suitable for selection of transformed bacteria and located in a bacterial expression cassette are part of the recombinant transposon.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that between the left and right ends of T-DNA there are also one or more selectable marker genes suitable for selection of transformed plant cells and located in an expression cassette active in the plant cells.

Method according to claim 7, characterized in that one or more selectable marker genes suitable for selection of transformed plant cells and located in an expression cassette active in the plant cells form part of the recombinant transposon.

Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the plant cells are infected with a mixture of two different recombinant A. tumefaciens strains, one of which is between the left and right ends of T-DNA in one in the plant cells active expression cassette located transposase gene and the other between the left and right ends of T-DNA comprises the recombinant transposon.

Method according to claim 9, characterized in that each of the strains between the T-DNA ends contains at least one marker gene for selection of transformed bacteria and at least one marker gene for selection of transformed plant cells.

The method according to claim 10, characterized in that the two strains between the T-DNA ends each contain at least one different marker gene for selection of transformed plant cells.

Method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the plant cells are infected with one recombinant tumefaciens strain, which is located between the left and right ends of T-DNA and in an expression cassette active in the plant cells. transposase gene as the recombinant transposon.

A method according to claim 12, characterized in that the strain between the T-DNA ends contains at least one marker gene for selection of transformed bacteria and at least one marker gene for selection of transformed plant cells.

Method according to any one of the preceding claims, characterized in that plant cells of a monocotyledonous plant species, such as corn, wheat, barley, oats, rye, rice, etc., are treated.

Method according to any of the preceding claims, characterized in that meristematic or embryogenic cells or tissues are infected with the bacteria.

Method according to claim 15, characterized in that cells of the apical meristem are infected with the bacteria in germinating seeds.

Method according to any one of claims 15-16, characterized in that the infection is carried out by means of needle-free high-pressure injection.

A method according to any one of claims 15-16, characterized in that the infection is carried out by microinjection.

A recombinant plasmid, consisting of a bacterial vector plasmid and at least one DNA insert, characterized in that at least one DNA insert comprises a transposase gene, contained in an expression cassette acting in plant cells, active in plant cells and having a transposase gene-filled expression cassette is not sandwiched between the left and right ends of a transposon necessary for integration into plant cell DNA.

A recombinant plasmid, consisting of a bacterial vector plasmid and at least one DNA insert, characterized in that at least one DNA insert comprises a recombinant transposon which comprises the left and right ends of a transposon necessary for integration into the DNA of plant cells. includes but does not contain a DNA fragment capable of expressing an active transposase in plant cells.

A recombinant plasmid according to claim 20, characterized in that the recombinant transposon between the left and right transposon ends comprises one or more restriction endonuclease recognition sequences suitable as cloning site.

A recombinant plasmid according to claim 20 or 21, characterized in that the recombinant transposon between the left and right transposon ends comprises at least one foreign gene located in an expression cassette acting in plant cells.

A recombinant plasmid according to any one of claims 20-22, characterized in that the recombinant transposon between the left and right transposon ends is one or more selectable marker genes suitable for selection of transformed plant cells and located in an expression cassette acting in plant cells. includes.

A recombinant plasmid according to any one of claims 20-23, characterized in that the recombinant transposon between the left and right transposon ends contains one or more selectable marker genes suitable for selection of transformed bacteria and located in a bacterial expression cassette. includes.

25. Recombinant Aarobacterium tumefaciens strain, which contains foreign DNA to be transferred to plant cells between the left and right ends of T-DNA necessary for such transfer and capable of transferring this foreign DNA to the plant cells, characterized in that between the left and right ends of T-DNA are a transposase gene, located in an expression cassette acting in plant cells, which expression active in plant cells and filled with a transposase gene is not between the left and right expression cells necessary for integration into the DNA of plant cells ends of a transposon is located.

26. Recombinant Acrrobacterium tumefaciens strain, which contains foreign DNA to be transferred to plant cells between the left and right ends of T-DNA necessary for such transfer and capable of transferring this foreign DNA to the plant cells, characterized in that between the left and right ends of T-DNA is a recombinant transposon which comprises the left and right ends of a transposon necessary for integration into the DNA of plant cells, but which does not contain a DNA fragment, which can express an active transposase in plant cells.

The recombinant Aqrobacterium tumefaciens strain according to claim 26, characterized in that the recombinant transposon between the left and right transposon ends comprises at least one foreign gene contained in an expression cassette acting in plant cells.

The recombinant Acrrobacterium tumefaciens strain according to any one of claims 26-27, characterized in that the recombinant transposon between the left and right transposon ends is one or more expression cassettes suitable for selection of transformed plant cells, and contained in an expression cassette active in plant cells, selectable marker genes.

A recombinant Aqrobacterium tumefaciens strain according to any one of claims 26-28, characterized in that the recombinant transposon between the left and right transposon ends contains one or more expression bacteria suitable for selection of transformed bacteria, selectable marker genes.

A recombinant Aqrobacterium tumefaciens strain according to any one of claims 26-29, characterized in that between the left and right ends of T-DNA there is also a transposase gene, located in an expression cassette active in plant cells, which active in plant cells and an expression cassette filled with a transposase gene is not located between the left and right ends of a transposon necessary for integration into the DNA of plant cells.

Plants and one or more cell parts or products thereof, which plants are descended from plant cells transformed by the method according to any one of claims 1-18.

32. A method of genetically engineering plant cells, wherein foreign DNA is introduced into plant cells by infecting the plant cells with a recombinant Aqrobacterium tumefaciens strain containing foreign DNA to be transferred to the plant cells between the left and right ends of T necessary for such transfer. DNA and is capable of transferring this foreign DNA to the plant cells, characterized in that one infects plant cells which contain one or more inactive transposons but do not contain an active transposase gene and that it is between the left and right ends of T DNA located in foreign DNA comprises a transposase gene contained in an expression cassette acting in the plant cells, which is not located between the left and right ends of a transposon necessary for integration into the plant cell DNA.