NL8900422A - Werkwijze voor het afscheiden en verwijderen van caffeine uit groene koffie. - Google Patents

Description

$ VO 2041

Titel: Werkwijze voor het afscheiden en verwijderen van caffeine uit groene koffie.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het afscheiden en verwijderen van caffeine uit groene koffie, waarbij de groene koffie op zorgvuldige wijze waterig wordt geëxtraheerd en de caffeine uit het extract wordt af-5 gescheiden door middel van gelpermeatie-chromatografie. De caffeine kan vervolgens op eenvoudige wijze in hoge opbrengst en in nagenoeg zuivere vorm worden gewonnen.

De afscheiding van caffeine uit waterige extracten van groene koffie is bekend. Zo worden bijvoorbeeld in het 10 Duitse octrooischrift 685.237 en de Europese octrooiaanvrage 8398 werkwijzen beschreven, waarbij de caffeine uit waterige extracten wordt verwijderd door adsorptie aan geactiveerde kool. Een nadeel van deze werkwijzen is onder meer dat de caffeine moeilijk van de geactiveerde kool te verwijderen 15 is en daardoor niet beschikbaar is voor verder gebruik.

In de Europese octrooiaanvrage 78088 wordt een werkwijze beschreven, waarin de caffeine uit waterige extracten van groene koffie wordt verwijderd door adsorptie aan geschikte harsen. Voor deze werkwijze zijn harsen ver-20 eist met een selectieve en sterke bindingscapaciteit voor caffeine. Als bijzonder geschikt wordt Duolite 5761 van Diamond Shamrock aanbevolen.

Deze werkwijze heeft eveneens een nadeel met betrekking tot de bereiding van zuivere caffeine, omdat de caffe-25 ine slechts met moeite met water uit dergelijke harsen kan worden verwijderd. Daarom wordt aanbevolen de met caffeine beladen hars te behandelen met organische oplosmiddelen om op deze wijze de caffeine te winnen (zie blz. 8, regels 2 - 26) .

30 Het doel van de uitvinding is zorgvuldig caffeine uit een waterig extract van groene koffie te verwijderen op zodanige wijze, dat de caffeine gemakkelijk en nagenoeg volledig kan worden gewonnen zonder de toepassing van organische 89 0 0422.' « - 2 - oplosmiddelen, terwijl tegelijkertijd de produktie van ge-decaffeïneerde groene koffie wordt mogelijk gemaakt.

De werkwijze volgens conclusie 1 en de voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze volgens conclusie 6 worden 5 ' voorgesteld ter oplossing van het gestelde probleem. Bijzonder voordelige procesvarianten zijn te vinden in de volg-conclusies.

Gelpermeatie-chromatografie aan dwarsverknoopte dextranen wordt in het algemeen toegepast voor het afschei-10 den van stofmengsels als functie van de molecuulgrootte, dat wil zeggen dat de moleculen in het eluaat verschijnen in volgorde van afnemende molecuulgrootte. Het is reeds uit EP-A-87901048.6 bekend dat dwarsverknoopte dextranen een selectieve retentiecapaciteit hebben ten opzichte van 15 chlorogeenzuren, welke onafhankelijk is van de moleculaire zeef-functie daarvan, dat wil zeggen dat bij selectie van een dextran met een geschikte dwarsverknopingsgraad de totale hoeveelheid in een extract van groene koffie aanwezige bijmengsels of verontreinigingen met een hoger en lager 20 molecuulgewicht dan het chlorogeenzuur de scheidingskolom in één fractie verlaat, terwijl de chlorogeenzuren selectief worden vastgehouden. Zoals beschreven in EP-A-87901048.6 kunnen zij door verdere eluering met water in een betrekkelijk zuivere en schoon afgescheiden fractie worden gewonnen 25 (zie fig. la).

Volgens de uitvinding werd verrassenderwijze gevonden dat caffeine uit een extract van groene koffie kan worden afgescheiden door middel van gelpermeatie-chromatogra-fie aan hogelijk dwarsverknoopte, gemodificeerde polysaccha-30 riden en op selectieve wijze kan worden gescheiden van de chlorogeenzuren enerzijds en de achterblijvende verontreinigingen anderzijds, indien de geltemperatuur wordt verhoogd tot 40-80°C, bij voorkeur 50-70°C en liefst tot 60°C, en de eluering met water bij overeenkomstige temperaturen wordt 35 uitgevoerd.

8900422.

fc Λ - 3 -

Bijzonder geschikte materialen voor afscheidings-doeleinden zijn gels van dwarsverknoopte dextranen, zoals in de handel verkrijgbaar zijn onder de merknaam Sephadex .

Voor de afscheiding van chlorogeenzuur uit plantextracten 5 wordt in EP-A-87901048.6 reeds vermeld dat de scheidings-efficiency toeneemt bij een toenemende dwarsverknopings-graad van het gebruikte dextrangel. Zo wordt bij een bepaalde kolomlengte met een dextran met een hogere dwarsverkno-pingsgraad een doelmatigere scheiding verkregen dan bij geit) bruik van een gel met een lagere dwarsverknopingsgraad, waarbij het zwelvermogen van het gel bruikbaar is als aanwijzing voor de dwarsverknopingsgraad. Het zwelvermogen daalt bij een stijgende dwarsverknopingsgraad. Zo is bijvoorbeeld voor het verkrijgen van 100 ml gezwollen gel, 20 g Sephadex 15 G 25 in droge toestand vereist, terwijl voor de vorming van hetzelfde gelvolume 40 g van het veel sterker verknoopte Φ

Sephadex G 10 nodig is. Voor de afscheiding van caffeine uit een extract van groene koffie wordt de voorkeur gegeven aan de toepassing van gels, die overeenkomen met de dwars- <5> 20 verknopmgsgraad in Sephadex G 15 of G 10.

Indien bijvoorbeeld een waterig extract van groene koffie volgens de uitvinding wordt toegepast met een sterk dwarsverknoopt dextrangel, overeenkomende met Sephadex G 10, bij 60°C en het gel vervolgens bij deze temperatuur met water 25 wordt geëlueerd, blijkt onverwachterwijze dat het extract in drie fracties wordt gescheiden (zie fig. lb). Aldus is er in feite eerst een hoofdfractie, die de totale hoeveelheid van de in het extract van groene koffie aanwezige stoffen met uitzondering van caffeine en chlorogeenzuren bevat.

30 De caffeine verschijnt in een duidelijk gescheiden piek met direkt daaropvolgend de resterende verontreinigingen. Onder de gegeven omstandigheden wordt de caffeïne-doorgang in een doorstromend waterig extract van groene koffie duidelijk en selectief vertraagd, zodat het onder de aangegeven omstan-35 digheden verrassenderwijze mogelijk is een kolomchromatogra- S3 0 0422.

- 4 - fische scheiding van de caffeine van de chlorogeenzuren enerzijds en de resterende verontreinigingen anderzijds tot stand te brengen (zie fig. lb).

Volgens een andere belichaming van de uitvinding is 5 het mogelijk eerst een voorzuivering uit te voeren, waarbij het waterige extract van groene koffie in de eerste trap bij kamertemperatuur wordt gescheiden op een dextran I met ‘een lagere dwarsverknopingsgraad, zoals bijvoorbeeld Sephadex G 15. Zoals beschreven in EP-A-87901048.6 zijn de 10 verontreinigingen, waaronder de caffeine, blijkens de ge-leidbaarheidsmeting aanwezig in een eerste brede piek, die in wezen met het elueringsfront bij de kolomuitlaat verschijnt. Volgens de uitvinding werd echter verrassenderwijze gevonden dat zelfs op een dergelijk gel en bij kamertempera-15 tuur de caffeine in zodanige mate wordt vastgehouden, dat slechts de eluaatfractie, die zich uitstrekt vanaf het maximum van de eerste piek tot het verschijnen van het chlorogeenzuur in het eluaat, caffeine bevat (zie fig. 2, kolom I).

20 Indien de caffeïnebevattende fractie van dit eluaat in een tweede trap op een dextran II met een hogere dwars-verknopingsgraad, zoals bijvoorbeeld Sephadex G 10 wordt gevoerd, is het mogelijk bij kamertemperatuur een waterige caffeïne-oplossing te verkrijgen, die nagenoeg vrij is van 25 verontreinigingen (zie fig. 2, kolom II), terwijl de chlorogeenzuren gemakkelijk volgens het bekende proces uit gel I kunnen worden geëlueerd.

Volgens een belichaming van de uitvinding, die bijzondere voorkeur verdient, wordt de tweede zuiveringstrap 30 echter uitgevoerd bij verhoogde temperatuur, bijvoorbeeld bij 40 - 80°C, bij voorkeur 50 - 70°C en in het bijzonder bij 60°C. Zoals wordt getoond door het elueringspatroon van kolom II in fig. 3 leidt dit tot een bijna volledige scheiding van de caffeïnefractie van de resterende, uit kolom I 35 overgebrachte verontreinigingen.

8S00422.

- 5 - *

Volgens de uitvinding werd ook gevonden dat op de hieronder nader te beschrijven wijze de caffeine een nagenoeg constante hoeveelheid chlorogeenzuren als functie van de temperatuur aan zichzelf bindt. De uitvinding betreft de 5 caffeine, die aan het chlorogeenzuur als het caffeïne-

chlorogeenzuurcomplex (CC complex) is gebonden. Het is gebleken dat deze hoeveelheid bij toenemende temperatuur stijgt. Terwijl de hoeveelheid chlorogeenzuur in het totale mengsel van caffeine en chlorogeenzuren bij 20°C ongeveer 10 20 - 25% bedraagt, stijgt de chlorogeenzuurfractie bij 60°C

tot meer dan 40%.

Gezien deze verrassende vondst wordt de werkwijze volgens de uitvinding in een bijzondere voorkeursuitvoeringsvorm op zodanige wijze uitgevoerd dat de voorzuivering 15 bij kamertemperatuur wordt uitgevoerd op een dextran I teneinde ongeveer een minimum chlorogeenzuurgehalte in de caffeine te brengen. De afscheiding van de caffeine in de tweede trap op een dextran II met een hogere dwarsverkno-pingsgraad wordt dan uitgevoerd bij 60°C teneinde op deze 20 wijze een zeer schone afscheiding van de in de tweede trap overgebrachte verontreinigingen tot stand te brengen (zie fig. 3).

Volgens de uitvinding is verder gebleken dat het CC complex kan worden gesplitst door concentratie van de 25 oplossing (zie voorbeeld IX) ter verkrijging van zuivere caffeine.

Het waterige extract van groene koffie, dat voor de werkwijze volgens de uitvinding wordt gebruikt, kan worden bereid door de groene koffie op een watergehalte van onge-30 veer 50% te brengen en dan in constante beweging te extraheren bij temperaturen van 60 - 100°C gedurende 2-4 uur, bij voorkeur gedurende 3 uur. Dit extract wordt toegevoerd aan de scheidingswerkwijze volgens de uitvinding.

Voor de produktie van gedecaffeïneerde groene koffie 35 kunnen de eluaatfracties, die alle verontreinigingen en 5900422.

n -6- % chlorogeenzuren bevatten, alsook de chlorogeenzuren, afge-splitst uit het CC complex gecombineerd tot een procesoplossing door de hydratatie, weer op de uitgangsconcentra-tie van het extract worden gebracht en dan opnieuw door een 5 groene koffie worden gevoerd, bijvoorbeeld op de in DE-OS 31 19 277 beschreven wijze. Hiertoe kan men de procesoplossing in constante beweging bij 60 - 100°C gedurende 2-4 uur, bij voorkeur gedurende 3 uur, op tevoren bevochtigde groene koffie laten inwerken. Daar de procesoplossing 10 met uitzondering van het caffeïnegehalte in evenwicht is met de bestanddelen van de groene koffie, zal de oplossing alleen de caffeine uit de groene koffie verwijderen. Aldus is het door continue uitvoering van het proces mogelijk op zorgvuldige wijze gedecaffeïneerde koffie te bereiden 15 en tegelijkertijd de verwijderde koffie uit de waterige oplossing te winnen.

Een waterig extract met een hoog caffeïnegehalte kan worden verkregen door de caffeïne-vrije procesoplossing, die met betrekking tot de overige bestanddelen op de uit-20 gangsconcentratie is gebracht, in tegenstroom te voeren door een reeks groene koffiefracties met toenemend caffeïne-gehalte, zodanig dat de vers gezuiverde procesoplossing in aanraking komt met de fractie met het laagste caffeïne-gehalte. Indien dit proces continu wordt uitgevoerd wordt 25 elke koffiefractie enige malen geëxtraheerd en kan de caffeine volledig worden verwijderd. Tegelijkertijd wordt de scheidingskolom continu gevoed met een procesoplossing met een hoog caffeïnegehalte.

Volgens een bijzondere voorkeursuitvoeringsvorm van 30 de werkwijze volgens de uitvinding worden caffeine en chlorogeenzuren tegelijkertijd uit een waterig extract van groene koffie afgescheiden en desgewenst gewonnen. Voor dit doel worden alleen de fracties van de eluaten, die geen koffie en chlorogeenzuren bevatten (NCC fracties), gecombi-35 neerd tot een procesoplossing, terwijl de fracties die de 8900421.

- 7 - caffeine en chlorogeenzuren bevatten afzonderlijk worden verzameld. In het kader van de uitvinding heeft de uitdrukking "chlorogeenzuren" betrekking op monocaffeoyl-quinine zuren.

5 De werkwijze volgens de uitvinding kan aldus worden uitgevoerd dat een waterig extract, dat caffeine en chlorogeenzuren bevat en op de hierboven beschreven wijze is verkregen uit groene koffie, eerst bij kamertemperatuur wordt gescheiden op een eerste kolom I, die een gel met een lage 10 dwarsverknopingsgraad bevat, zoals bijvoorbeeld Sephadex® G 15. Zoals eerder vermeld, verlaten bij deze procedure de verontreinigingen, waaronder de caffeine, de kolom in een brede fractie, terwijl de chlorogeenzuren aanvankelijk worden vastgehouden en pas na voortgezet elueren met water als 15 een afzonderlijke fractie verschijnen.

Zoals eerder vermeld vindt in de brede fractie, die de verontreinigingen en de caffeine bevat, een differentiatie plaats in die mate, dat de caffeine binnen deze fractie kolom I pas verlaat na het bereiken van het eerste maximum 20 volgens de weergave van het scheidingspatröon, gebaseerd op de geleidbaarheid en het signaal van de differentiële refractometer.

De werkwijze wordt dan ook bij voorkeur zodanig uitgevoerd dat de eerste fractie van het eluaat vanaf de aan-25 vankelijke stijging tot het eerste maximum van het weergegeven scheidingspatröon afzonderlijk wordt verzameld als NCC fractie I. Het elueringsproces wordt bij het bereiken van het maximum onderbroken en de uitlaat van de kolom, die een gel bevat zoals Sephadex G 15, wordt verbonden met 30 de inlaat van een tweede kolom II, die langer is dan de eerste kolom en een gel met een hogere dwarsverknopingsgraad bevat. De kolom kan bijvoorbeeld een lengte hebben van 30 cm en kan ongeveer 150 ml Sephadex G 10 bevatten.

Het caffeïnebevattende eluaat, dat de eerste kolom verlaat, 35 wordt nu naar de tweede kolom gevoerd, totdat chlorogeen- 89 00422..

- 8 - zuur bij de uitlaat van de eerste kolom verschijnt. Op dit punt wordt het elueringsproces andermaal onderbroken en worden de kolommen van elkaar gescheiden. De kolommen worden nu afzonderlijk geëlueerd met gedeïoniseerd water, gevolgd 5 door eluering van de chlorogeenzuren uit de eerste kolom en van de overige verontreinigingen als NCC fractie II alsmede de gezuiverde caffeine uit de tweede kolom.

Zoals eerder uiteengezet kan ook in deze uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding de tweede 10 kolom II op kamertemperatuur worden gehouden en bij kamertemperatuur worden geëlueerd, maar bij voorkeur wordt de temperatuur van kolom II verhoogd tot 40 - 80°C, in het bijzonder tot 50 - 70°C en liefst tot ongeveer 60°C en wordt de kolom bij deze temperaturen geëlueerd, waardoor - zoals eer-15 der vermeld - een betere scheidingsefficiency wordt verkregen.

Bij continue uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding worden de NCC fracties I en II, alsook de fractie die het chlorogeenzuur bevat gecombineerd onder vorming van 20 een procesoplossing, die op de oorspronkelijke concentratie wordt ingesteld en met verse of gedeeltelijk geëxtraheerde groene koffie in aanraking wordt gebracht. Hiertoe wordt de groene koffie bij voorkeur ingesteld op een watergehalte van ongeveer 50%. De koffie wordt vervolgens in aanraking 25 gebracht met de geconcentreerde procesoplossing, waarvan de samenstelling overeenkomt met die van het verse extract, maar zonder de caffeine. De procesoplossing wordt volgens bekende methoden in evenwicht gebracht met de groene koffie. Vervolgens wordt alleen de caffeine, die in de procesoplos-30 sing ontbreekt, uit de koffie verwijderd, dat wil zeggen dat het "hiaat" in het spectrum van de componenten wordt opgevuld.

Bijzonder voordelige resultaten kunnen worden bereikt door continue doorvoer in tegenstroom van de caffeïne-35 vrije (NCaf) procesoplossing door een reeks groene koffie- 890042*: $ - 9 - fracties. Dit leidt tot een concentratiegradiënt binnen de groene koffrefracties, waarbij de vers gezuiverde oplossing altijd in aanraking komt met de fractie met het laagste caffeïnegehalte. Daardoor kan continu groene koffie met een 5 zeer laag caffeïnegehalte worden verkregen en tegelijkertijd een procesoplossing met een hoog caffeïnegehalte in de scheidingsinrichting worden toegevoerd.

De snelheid van de selectieve extractie of de tijdsduur tot de instelling van het evenwicht kan worden aange-10 past door de temperatuur en roersnelheden. Daar caffeine en chlorogeenzuur met verschillende snelheden uit de groene koffiebonen worden geëxtraheerd, kan de verhouding van het chlorogeenzuur en de caffeine in de behandelde koffie worden beïnvloed door overeenkomstige procesregeling. Ook kunnen de 15 twee componenten in een andere verhouding uit de koffie worden geëxtraheerd door variatie van de concentratie van de overeenkomstige componenten in de procesoplossing.

Volgens de uitvinding werd gevonden dat de NCC fracties bijna volledig kunnen worden bevrijd van chlorogeen-20 zuur en caffeïne. Het chlorogeenzuur werd ook bijna vrij van caffeine verkregen. Zoals reeds uiteengezet was het tot nu toe niet mogelijk de caffeïnefractie volledig van chloro-geenzuren te bevrijden (zie fig. 5).

Door scheidingsproeven onder toepassing van model-25 mengsels met een constante hoeveelheid caffeïne en variërende hoeveelheden chlorogeenzuur kon worden bewezen dat de caffeine een duidelijk gedefiniëerde hoeveelheid chlorogeenzuur aan zich bindt (zie fig. 6). Zoals eerder vermeld is deze hoeveelheid ook afhankelijk van de temperatuur van de oplos-30 sing.

Verrassenderwijze werd echter gevonden dat de binding tussen het chlorogeenzuur en de caffeïne, die in verdunde oplossingen wordt waargenomen, bij concentratie wordt verbroken. Indien aldus een waterig eluaat, dat ongeveer 0,3% 35 caffeïne bevat (zie voorbeeld II), ongeveer honderdvoudig wordt geconcentreerd, wordt de caffeïne als een vaste stof 8900422.

- 10 - * met een zuiverheidsgraad van bijna 100% (blijkens HPLC analyse) geprecipiteerd (zie voorbeeld VI). De precipitatie-snelheid van zuivere caffeine kan worden verhoogd door afkoeling als gevolg van het beschreven temperatuureifect.

5 De uitvinding verschaft aldus de mogelijkheid zuive re caffeine te verkrijgen zonder toepassing van organische oplosmiddelen.

De uitvinding wordt aan de hand van de volgende voorbeelden nader toegelicht.

10 Voorbeeld I

300 g groene Columbia koffie met een vochtgehalte van 8,30% werd gemengd met 1500 ml water en gedurende 3 uur in een waterbad op 80°C gehouden onder gelijktijdige vibratie. Vervolgens werd het extract van de koffiebonen 15 afgescheiden. Het had een pH van 5,56 en werd geconcentreerd tot 160 ml.

Het extract had een droge-stofgehalte van 24,19%, een chlorogeenzuurgehalte van 4,82% en een eaffeïnegehalte van 1,55%, steeds berekend op het vloeibare concentraat.

20 Aanwezige kleine deeltjes werd uit de oplossing af gescheiden door centrifugeren bij 3000 G. 15,0 g van het extract werd toegevoerd aan een kolom met een lengte van 20 cm en een diameter van 2,5 cm, die 150 ml Sephadex G 10 bevatte. De kolomtemperatuur bedroeg ongeveer 20°C. De kolom 25 werd vervolgens geëlueerd bij een stroomsnelheid van 200 ml/ uur met gedeloniseerd water met een temperatuur van ongeveer 20°C. Het uittredende eluaat werd door de meetcel van een differentiële refractometer gevoerd en werd continue verzameld.

30 De fracties ondergingen HPLC analyse onder de vol gende omstandigheden: &9 0 0 4 2 2.

- 11 -

Kolom : Waters 8 C 18 10u Radialpak

Mobiele fase : 1,5% tetrahydrofuran + 0,1% azijn zuur in water

Stroomsnelheid : 4 ml/min 5 Detector ï Waters, model 440 bij 280 nm

Integrator : Shimadzu CR 3 A

Het elueringspatroon volgens de differentiële refractometermeting wordt getoond in fig. la. Het laat de uit EP-A-87901048.6 bekende extractscheiding onder de gege-10 ven omstandigheden zien waarbij de tweede fractie de chloro-geenzuren in nagenoeg zuivere vorm bevat.

De beschreven werkwijze werd herhaald, doch met dit verschil dat de kolom tot een temperatuur van ongeveer 60°C werd verwarmd en dat de eluering werd uitgevoerd met water 15 van ongeveer deze temperatuur.

Het scheidingspatroon van deze kolom is weergegeven in fig. lb. Daarin wordt getoond dat drie duidelijk gescheiden fracties werden verkregen, die afzonderlijk werden verzameld en geanalyseerd, zoals gegeven in fig. lb.

20 Het droge-stofgehalte werd bepaald door indampen van porties gedurende 16 uur in de droogoven bij 105°C. De chlo-rogeenzuur- en caffeine-analyses werden uitgevoerd op de hierboven met HPLC beschreven wijze.

De analytische resultaten van de individuele fracties 25 zijn vermeld in tabel A.

$900422.

- 12 - Λ Ο Μ-Ί Ο Ό +> β W · φ CM ιΗ Γ" ^ Ο) I < - - φ D1 Ο Ο ΓΗ Μ Ο ^ φ Ρ Λ φ ÖP β ΙΗ (D σ σ\ m σ\ mo ο <η mm I ο οο ο cd ^ * - * u tJi Ο Ο Ο Λ ο Μ-Ι 0 <ϋ +> β cη φ ,Μ Φ Φ tJi ro m ο Η Μ Ο I - ρ φ Μ ο οο m β ΛΌ fN γ- Ν β o'? Φ Φ <; II tn &ι II Ο νΆ II Μ ο m co m Μ II Ο ο I γη rH η ffl II Η Η Ο Ο 00 <3 II ,β ^ - Ε-ι II U 01 ο ο ο m —.

ο tJ> -Ρ w ο Ο Ο 00 00 φ m ι r' η 0^ \ Ο γΗ τΗ ο & “ " " ί-| ^ V CM Η

Q

Η φ .β ιΗ φ ^ Φ tn ο η in νο > ^ w in cm ιο Φ Ο a φ •Η

+J

ο m cnj m rr cd

P

Ph 89 00UZ,

A

- 13 -

Uit tabel A blijkt dat eerst een voorloop van ongeveer 60 g wordt verkregen, die vrij is van extractbestand-delen. Deze voorloop wordt gevolgd door fractie 2, die het grootste deel van de extractbestanddelen bevat, maar nage-5 noeg geen chlorogeenzuur en geen caffeine. Fractie 3 bevat bijna alle caffeine uit het koffieëxtract en een gedeelte van de chlorogeenzuren. Fractie 4 bevat de chlorogeenzuren echter in bijna zuivere vorm.

Voorbeeld II

10 Scheiding van een extract van groene koffie onder toepassing van een 2-kolommenmethode in NCC-, caffeine- en chlorogeen-zuurfracties bij 20°C.

15 g van het concentraat volgens voorbeeld I werd toegevoerd aan een kolom I met een lengte van 20 cm en een 15 diameter van 2,5 cm, die 100 ml Sephadex G 15 bevatte.

De kolom werd vervolgens geëlueerd met gedeioniseerd water van kamertemperatuur bij een stroomsnelheid van 200 ml/uur.

Het eluaat werd bewaakt door middel van een differentieel refractometertestsignaal en werd continu verzameld. Bij het 20 bereiken van het eerste piekmaximum werd de eluering onderbroken en werd het uittredende eluaat toegevoerd in een tweede kolom II met een lengte van 30 cm, een diameter van 2,5 cm, die 150 ml Sephadex G 10 bevatte. De temperatuur van kolom II was eveneens 20°C. Bij het bereiken van het 25 eerste minimum werden de kolommen weer van elkaar gescheiden en werd het eluaat van de eerste kolom continu verzameld op de eerder beschreven wijze. De tweede kolom werd geëlueerd onder dezelfde omstandigheden als hierboven vermeld. Het scheidingspatroon van de twee kolommen I en II is weergege-30 ven in fig. 2.

De eluaten van de kolommen I en II werden in elk der gevallen gecombineerd tot de volgende fracties: 1. Voorlopen : Eluaten zonder extractbestanddelen uit kolommen I en II.

8800422.

- 14 - 2. NCC fractie : Eluaat uit kolom I vanaf de eerste krommestijging tot het maximum van de en eluaat uit kolom II vanaf de krommestij ging tot het buigpunt van de eer-5 ste piek.

3. Chlorogeenzuur- fractie : Eluaat van kolom I vanaf het buigpunt van de eerste piek tot het einde van de tweede piek.

10 4. Caffeïnefractie : Eluaat van kolom II vanaf het buigpunt van de eerste piek tot het einde van de tweede piek.

8900422.' - 15 -

TABEL B

Totaal Extract Chlorogeenzuren Caffeine hoeveel- Droge heid stof ge- Concen- Extract % Concen- Extract % halte tratie fractie tratie fractie 5 g g/100 g g/100 g g/100 g

Groene koffie- 15,0 24,19 4,82 19,93 1,55 6,41 extract

Kolom I

10 eerste run 43 - - - - NCC fractie I 34 3,77 0 0 0,02 0,53

Chlorogeen- zuur 15 fractie 110 0,76 0,55 73,37 0 0

Kolom II

eerste run 58 - - NCC fractie II 49 1,77 0 0 0,003 0,17 20 Caffeïne- fractie 77 0,55 0,09 16,36 0,31 56,36

Uit tabel B blijkt dat eerst uit kolom I een hoeveelheid van 43 g wordt verkregen, die vrij is van extract-bestanddelen. Met het elutiefront verschijnt dan de NCC 25 fractie I, die geen chlorogeenzuren en nagenoeg geen caffeine bevat. Na omkering van het eluaat wordt de fractie verkregen, die de chlorogeen zuren bevat en vrij is van caffeine.

Uit kolom II wordt volgend op de eerste run met 890042£- - 16 - het elutiefront NCC fractie II verkregen, die vrij is van chlorogeenzuren en nagenoeg vrij is van caffeine. Vervolgens wordt in een duidelijk afzonderlijke piek de caffeïnefractie van het eluaat verkregen, die echter nog chlorogeenzuren be-5 vat.

Voorbeeld III

De procedure van voorbeeld II werd herhaald met dit verschil dat kolom II tot een temperatuur van ongeveer 60°C werd verwarmd en met gedeïoniseerd water van deze tem-10 peratuur werd geëlueerd. De scheidingspatronen van de kolommen I en II volgens deze uitvoeringsvorm zijn weergegeven in fig. 3. Daarin wordt getoond dat bij 60°C in kolom II een duidelijk betere scheiding van de caffeine van de overige verontreinigingen wordt verkregen dan bij 20°C 15 (zie fig. 2).

Voorbeeld IV

Selectieve extractie van caffeine en chloroqeenzuur uit groene Colombia koffie met de NCC procesoplossing.

54,5 g groene Colombia koffie met een aanvankelijk 20 vochtgehalte van 8,30% werd ter aanpassing tot een vochtgehalte van ongeveer 50% in een polyetheenfles van 250 ml gemengd met 45,5 g water en gedurende 30 minuten met behulp van een vibrator in een waterbad van 80°C in beroering gehouden. Vervolgens werd 125 g van een procesoplossing toe-25 gevoegd, die verkregen was door combinatie van NCC fracties I en II volgens voorbeeld II. Het mengsel werd gedurende 300 minuten onder de genoemde omstandigheden in beweging gehouden, waarbij met regelmatige intervallen monsters van 1 ml werden genomen ter bepaling van het caffeine- en 30 chlorogeenzuurgehalte van de vloeistof.

De caffeine- en chlorogeenzuurgehalten van de procesoplossing na 30 en 300 minuten incubatietijd worden in tabel C vergeleken met de oorspronkelijke koffie. Het extractiepatroon is weergegeven in fig. 4.

as 0 0 42 2..

*

- 17 -TABEL C

Chlorogeenzuur- Caffeine- Chlorogeenzuur/ concentratie concentratie caffeine g/100 g g/100 g ^18°1

Procesoplossing 5 na 30 min. 0,42 0,19 2,21

Procesoplossing na 300 min. 1,13 0,33 3,42

Oorspronkelijke koffie 5,35 1,36 3,93

De resultaten tonen dat caffeine en chlorogeenzuren 10 tegelijkertijd uit groene koffie kunnen worden geëxtraheerd met NCC procesoplossing. De stoffen worden echter met verschillende snelheden geëxtraheerd en in het bijzonder bij het begin van de extractieduur gaat caffeine sneller in de procesoplossing over dan chlorogeenzuren. Na een extractie-15 duur van 300 minuten was echter evenwicht bereikt en kwam het chlorogeenzuur/caffeïne quotiënt bij benadering overeen met dat van de oorspronkelijke koffie (zie tabel C).

Voorbeeld V

Meertraps selectieve extractie van caffeine uit groene 20 Columbia koffie.

De werkwijze volgens voorbeeld IV werd herhaald, doch met dit verschil dat dezelfde groene koffielading enige malen in evenwicht werd gebracht met verse caffeïne-vrije (NCaf) procesoplossing om het caffelnegehalte verder te ver-25 lagen.

De groene koffie werd voorbehandeld op de in voorbeeld III beschreven wijze en werd achtereenvolgens drie maal gedurende 3 uur bij 80QC in evenwicht gebracht met 8900USL" - 18 - NCaf procesoplossing met een totaal droge stof-gehalte van ongeveer 15%, die nagenoeg vrij was van chlorogeenzuren en caffeine (zie tabel E). (Bij voorafgaande proeven was gebleken dat een aldus aangepaste NCaf procesoplossing geen 5 NCaf bestanddelen verwijderde uit groene koffie, die was ingesteld op een vochtgehalte van 50%).

Zoals beschreven in voorbeeld IV werden de extrac-tietrappen uitgevoerd in gesloten polyetheenflessen en in een thermostatisch regelbare vibrator. Bij het einde van 10 elke extractietrap werden koffie en procesoplossing op een zeef van elkaar gescheiden en werd de procesoplossing onderworpen aan HPLC analyse (zie tabel E). Na driemaal te zijn geëxtraheerd werd de groene koffie gewogen en voor bepaling van het vochtgehalte gedurende 16 uur in de droogoven bij 15 103°C gedroogd. De koffie werd vervolgens gemalen, waarna het caffeïnegehalte door HPLC analyse werd bepaald. De HPLC analyses werden op de in voorbeeld I beschreven wijze uitgevoerd.

De resultaten zijn vermeld in tabellen D en E.

20 TABEL D

Totaal gewicht Water- Totaal gewicht Caffeïne- vochtige gehalte droge koffie gehalte koffie g % g % 25 Oorspronkelijke koffie 54,5 8,30 50,0 1,36

Behandelde koffie 103,2 54,25 47,2 0,13 S3 0 042*·' - 19 -

TABEL E

Hoeveel- Totaal Extract Caffeine Hoeveelheid conc. hoeveel- conc. heid heid g g/100 g g g/100 g g 5 NCC uitgangs- oplossing 125,0 14,73 18,41 0 0

Procesoplossing 1 115,3 16,66 19,21 0,30 0,35

Procesoplossing 2 122,2 15,92 19,45 0,15 0,18

Procesoplossing 3 124,4 15,19 18,85 0,06 0,07 10 De resultaten tonen dat het caffeïnegehalte van de behandelde groene koffie van 1,36% kan worden verlaagd tot 0,131, berekend op het droge gewicht van de koffie.

Voorbeeld VI

Bereiding van een procesoplossing, verrijkt met caffeine 15 en chlorgeenzuren.

Een NCC procesoplossing met een droge stof-gehalte van 15%, die grotendeels vrij was van caffeine en chlorogeen-zuren ( zie tabel F), in overeenstemming met de werkwijze van voorbeeld IV werd achtereenvolgens driemaal gedurende 20 3 uur bij 80°C tot evenwicht gebracht met steeds 50 g verse groene Colombia koffie (vochtgehalte ongeveer 50%). Tussen de individuele trappen werden de koffie en de procesoplossing op een zeef van elkaar gescheiden en werd de procesoplossing onderworpen aan HPLC analyse. De resultaten zijn vermeld 25 in tabel F.

8900422.

- 20 -

TABEL F

Hoeveelheid Totaal Extract Chlorogeenzuur Caffeine oplossing Conc. Hoeveel- Conc. Hoeveel- Conc.Hoeveelheid heid heid g g/100g g g/100g g g/100g g 5 NCC uit-· gangsop- lossing 125,0 14,73 18,41 0,04 0,05 0 0

Procesoplossing 98,6 19,47 19,20 2,20 2,17 0,66 0,65 10 De resultaten tonen dat volgens de beschreven werk wijze het caffeïnegehalte van de procesoplossing kon worden verhoogd tot 0,066 g/100 g en het chlorogeenzuurgehalte tot 2,20 g/100 g.

Voorbeeld VII

15 De bij de werkwijze van voorbeeld VI verkregen, caffeine en chlorogeenzuren bevattende procesoplossing werd volgens de werkwijze van voorbeeld II op twee dextrangels I en II gescheiden in NCC fracties, chlorogeenzuren en cafferine.

20 De resultaten zijn vermeld in tabel G. De HPLC

piek patronen van de procesoplossing voor de scheiding, de NCC fracties I en II en de chlorogeenzuur- en caffeïne-fracties zijn weergegeven in de fig. 5.

8900422- - 21 -

TABEL G

Totaal Extract Chlorogeenzuren Caffeine hoeveel- Droge heid stof ge- Concen- Extract % Concen- Extract % halte tratie fractie tratie fractie 5 g g/100 g g/100 g g/100 g

Procesoplossing 15,0 19,47 2,20 11,30 0,66 3,39

Kolom I eerste 10 run I 41 - - NCC fractie I 36 3,59 0 0 0,004 0,11

Chloro- geenzuur- 15 fractie 100 0,41 0,28 68,29 0 0

Kolom II eerste run II 57 NCC frac- 20 tie II 63 1,53 0000

Caffeïne- fractie 66 0,21 0,04 19,05 0,14 66,67

De resultaten tonen dat de NCC fracties I en II verkregen uit kolommen I (Sephadex G 15) en II 25 (Sephadex ®G 10), konden worden bevrijd van caffeine en chlorogeenzuren met uitzondering van geringe resthoeveelhe-den. Daardoor zijn deze fracties geschikt voor toepassing als proces oplossingen in continue processen voor de selectieve extractie van caffeine en desgewenst chlorogeenzuren 30 uit groene koffie.

8900422.

- 22 -

De scheiding op kolommen I en II kwam overeen met het in fig. 2 weergegeven patroon.

De individuele fracties, verkregen uit kolommen I en II, worden onderworpen aan HPLC analyse, zoals beschreven 5 in voorbeeld I. De resultaten zijn weergegeven in fig. 5, waarin de absolute piekhoogten voor het onderhavige geval geen betekenis hebben, daar de voor analyse gebruikte monsters verschillende verdunningen vertoonden.

. Op basis van de werkwijze van dit voorbeeld werd 10 caffeine verkregen met een zuiverheid van 66,67% en chlorogeenzuren met een zuiverheid van 68,29%.

Voorbeeld VIII

Scheiding van modelmengsels van chloroqeenzuur en caffeine

Voor een onderzoek naar het mechanisme van de 15 binding van chlorogeenzuren aan caffeine werden drie model-oplossingen bereid, waarin het caffelnegehalte constant was, maar de chlorogeenzuurgehalten verschilden (zie tabel H).

Alle oplossingen hadden een pH van 5,8 en alle scheidingen werden uitgevoerd bij 20°C op kolommen met een 20 lengte van 30 cm en een diameter van 2,5 cm, die 150 ml

Sephadex G 10 bevatten. De scheidingspatronen werden gevolgd door geleidbaarheidsmetingen en het differentiële refracto-metersignaal. Daar met de geleidbaarheidsmeting alleen chlorogeenzuren konden worden gedecteerd maakte vergelijking 25 van de twee testsignalen tegelijkertijd het mogelijk het chlorogeenzuurgehalte in de betrokken fractie te meten. De chlorogeenzuren en de caffeine in de fracties werden bepaald door HPLC, zoals beschreven in voorbeeld I. De resultaten zijn weergegeven in fig. 6, en vermeld in tabel H.

8900422· f - 23 -

VD

Ï_1 tr> f' O'! O

3 0 04 O o 0 U 0 - · '

M t—I O O O

C

<D Di ω

Di Φ O CD1 S-ι HO

O Φ 0 Λ _

Η ΉΗ O O O

Λ Ή "" O Λ Di

U

«

Uu (0 1—1 01 <#>ü “1 C o vo o ö Q) ΡΊ 04 04

U

C

Ή

3 £ 5 2 S

K II « UC o ° o * 1 ΰ * ω ii <u

CQ 11 β (D

ij! ^ Ö O' rH rH ST

& " tS WO 5 01 04 ïï <U<=>

« ÏÏC OOO

U (S D

U

iw U-)

*0 O' O CO

O O 00 £5 ·> * * Φ n o *3* dP Q t" 10 01

Dl O C ^ 0 -<+ 2 ·-{ 2 01 σ' Λ „ 52 tn * o o o oi c

0 o in 10 ui QJ

r-i o«-» - - * Λ "" ^ 1-1 ° ? g ^ 2 •H <ü 0

Di C Di „ ^ Γ3 QJ WO O O O £ cq o O >43 143 Ό °

IH H *· - * I

14-1 t-4 ιΗ rH 01 (d Dl o 11 IW u 0 rH 04 ΟΙ *

Cj

CU

&9 0DU2.

- 24 -

De resultaten tonen dat de caffeine in waterige oplossing met een pH van 5,8 een bij benadering constante hoeveelheid chlorogeenzuur aan zich bindt. Bij een gewichtsverhouding van caffeine tot chlorogeenzuur in de beginoplos-5 sing van 1:1 bevat de caffeïnefractie 73,81% caffeine en 26,19% chlorogeenzuur. Bij verlaging van de kwantitatieve hoeveelheid chlorogeenzuur tot minder 1:0,5 (zie proef 3) werd de totale hoeveelheid chlorogeenzuur aan caffeine gebonden (zie fig. 6).

10 Voorbeeld IX

Bereiding van zuivere caffeine 420 g van de met chlorogeenzuren verontreinigde caffeïnefractie, die bij de werkwijze volgens voorbeeld II als eluaat uit kolom II werd verkregen, werd in een rote-15 rende verdamper tot 4,9 g geconcentreerd. Uit de sterk geconcentreerde oplossing werd een vast materiaal verkregen, dat op een nutsch filter werd afgezogen. Het vaste materiaal werd op het filter gewassen met 2 ml water, vervolgens andermaal krachtig afgezogen en dan gedurende 2 uur bij 110°C 20 in een droogoven gedroogd.

Er werd 0,64 g van een witte stof verkregen, die op de in voorbeeld I beschreven wijze door HPLC werd geanalyseerd. Het resultaat toonde dat de verkregen witte stof bestond uit caffeine met een zuiverheid van 99,7%.

25 Voorbeeld X

Afscheiding van caffeine uit de procesoplossing.

De in de voorbeelden II, III en VII genoemde kolomcapaciteiten werden 100-voudig vergroot door toepassing van kolommen met een overeenkomstig grotere diameter. Ver-30 groting van de hoogte van het gelbed was niet nodig.

Fig. 7 toont schematisch de scheidingsinrichting, die in dit voorbeeld werd gebruikt. Kolom I had een hoogte © van 20 cm en bevatte 12,5 1 Sephadex G 15 van 12°C en kolom II had een hogte van 30 cm en bevatte 14,5 1 890042t- - 25 -

Sephadex G 10 van 65°C. Differentiële refractometers werden als detectors gebruikt en de stroomsnelheid in beide kolommen bedroeg 30 1/uur.

De kolommen werden afzonderlijk en tegelijkertijd 5 door middel van twee pompen geëlueerd met uitzondering van de fase waarin het voorbehandelde, caffeïne-bevattende extract uit kolom I direct werd toegevoerd in kolom II.

De resultaten van één scheidingscyclus zijn vermeld in tabel I.

TABEL I

10 Droge stof Caffeïne- concentratie concentratie (g/100 g op- (g/100 g oplossing) lossing)

Caffeine bevattende 15 procesoplossing 15,96 0,493

Procesoplossing na verwijdering van caffeine en indamping 15,45 0,009

De resultaten tonen dat de scheidingspatronen, die 20 bij de op grote schaal uitgevoerde werkwijze werden verkregen, bijna identiek zijn aan de met kleine kolommen in voorbeelden II, III en VII verkregen patronen, en dat een nagenoeg volledige afscheiding van de caffeine in slechts één cyclus mogelijk was.

25 Voorbeeld XI

De werkwijze volgens voorbeeld X werd herhaald met dit verschil, dat ter verhoging van de economische doelmatigheid een opeenvolging van cycli op zodanige wijze in elkaar werd geschoven dat de fracties van elke cyclus geen &SO0U&·' - 26 - overlapping vertoonden.

In totaal werd 9,5 kg caffeïne-bevattende procesoplossing gescheiden in een reeks van vijf opeenvolgende cycli, waarbij in elke cyclus een hoeveelheid van 1,5 kg 5 werd behandeld. De elueringstijd per cyclus bedroeg 45 minuten. De scheidingspatronen van beide kolommen tijdens vijf scheidingscycli, zoals opgenomen op een wederzijdse recorder, zijn weergegeven in fig. 8.

89 00412.

Claims (6)

1. Werkwijze voor het afscheiden van caffeine uit een waterig extract van groene koffie door middel van gelpermea-tiechromatografie op een moleculaire zeef van dwarsver-knoopt dextran onder toepassing van water als eluerings- 5 middel, met het kenmerk, dat de afscheiding van caffeine selectief plaatsvindt op een sterk dwarsverknoopt dextrangel tussen 40 en 80°C.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de afscheiding van caffeine plaatsvindt tussen 50 en 70°C 10 en bij voorkeur bij ongeveer 60°C.

3. Werkwijze voor de afscheiding van caffeine uit een waterig extract van groene koffie door middel van gelper-meatiechromatografie op een moleculaire zeef van dwarsverknoopt dextran onder toepassing van water als elueringsmid- 15 del, met het kenmerk, dat de in het extract aanwezige caffeine wordt afgescheiden door middel van gelpermeatie-chromatografie op tenminste twee sterk dwarsverknoopte dextrangels, waarvan het eerste gel de laagste dwarsver-knopingsgraad vertoont, de caffeïne-bevattende fractie van 20 het eluaat van het eerste gel wordt toegevoerd op het tweede gel en de caffeine uit het eluaat van het tweede gel wordt verkregen bij temperaturen bij of boven kamertemperatuur.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de chromatografie op het tweede gel wordt uitgevoerd tussen 25 40 en 80°C, in het bijzonder tussen 50 en 70°C en liefst bij ongeveer 60°C.

5. Werkwijze volgens een der conclusies 1-4, met het kenmerk, dat de werkwijze continu wordt uitgevoerd en de van caffeine bevrijde fractie van het eluaat na aanpassing 30 daarvan tot de beginconcentratie van het extract wordt gebruikt als procesoplossing voor de vorming van caffeine-extract door contact van de oplossing met groene koffie. 8900422; - 28 -

6. Werkwijze volgens een der conclusies 1-5, met het kenmerk dat de caffeine in praktisch zuivere vorm uit het eluaat wordt geprecipiteerd door verwijdering van water. S9 0QU2.^