NL8900145A

NL8900145A - New peptide(s) and protein constructs - with specified N terminal sequence useful for stimulating immune response

Info

Publication number: NL8900145A
Application number: NL8900145A
Authority: NL
Original assignee: Tno
Priority date: 1989-01-20
Filing date: 1989-01-20
Publication date: 1990-08-16

Abstract

New opt. modified (e.g. glycosylated) peptides (I) comprise at least 7 amino acids and have a N-terminal sequence of formula A1-A2-A3-A4-A5 (Ia). A1 = Pro, Ala, Met, Tyr, Val, Ile, Leu, Phe, Cys or Trp; A2 = Gly, Asp, Glu, His, Lys or Arg; A3 and A4 = any amino acids; A5 = Asp, Glu, His, Lys or Arg. Also claimed are protein constructs (II) comprising at least one fragment contg. a B cell epitope and at least one fragment of type (I), where the N terminus of (I) is adjacent to two hydrophobic amino acids, each selected from Pro, Ala, Met, Tyr, Val, Ile, Leu, Phe, Cys or Trp. Pref. (I) have A2 and A5 = His, Lys or Arg. They comprise 7-40 amino acids and have two hydrophobic amino acids at the C terminus.

Description

Titel: Peptiden en eiwit-constructen, alsmede preparaten voor het opwekken van een immuunrespons en werkwijzen voor de bereiding van peptidenTitle: Peptides and protein constructs, as well as preparations for eliciting an immune response and methods for the preparation of peptides

De uitvinding heeft betrekking op bepaalde typen van al dan niet gemodificeerde peptiden met een lengte van ten minste 7 aminozuur-resten, waarbij met "gemodificeerd" gedoeld wordt op in de natuur voorkomende modificaties van eiwitten, zoals glycosylering, myristoylering, fosforylering, acetylering, methylering, enz.The invention relates to certain types of modified or unmodified peptides having a length of at least 7 amino acid residues, where "modified" refers to naturally occurring modifications of proteins such as glycosylation, myristoylation, phosphorylation, acetylation, methylation , etc.

De uitvinding heeft verder betrekking op bepaalde typen van eiwit-constructen, d.w.z. kunstmatige eiwitten, die in een of meerdere opzichten afwijken van in de natuur voorkomende eiwitten. Deze eiwit-constructen kunnen eveneens gemodificeerd zijn in de hierboven weergegeven zin.The invention further relates to certain types of protein constructs, i.e. artificial proteins, which differ in one or more respects from naturally occurring proteins. These protein constructs can also be modified in the above sense.

Voorts betreft de uitvinding werkwijzen voor het bereiden van de nieuwe peptiden, alsmede preparaten die een of meerdere van de nieuwe peptiden of eiwit-constructen omvatten en bruikbaar zijn voor het opwekken van een immuunrespons in zoogdieren, bijv. voor vaccinatie doeleinden of in het kader van een werkwijze voor het verkrijgen van antilichamen.The invention further relates to methods of preparing the new peptides, as well as compositions comprising one or more of the new peptides or protein constructs and useful for eliciting an immune response in mammals, e.g. for vaccination purposes or in the context of a method of obtaining antibodies.

Meer specifiek heeft de uitvinding, kort samengevat, betrekking op een eenvoudige werkwijze voor het verkrijgen van immunogene fragmenten van eiwitten, alsmede op het gebruik maken van deze fragmenten dan wel van hun gemeenschappelijke structurele kenmerken om het immunogene vermogen van eiwitten en peptiden in het algemeen te beïnvloeden.More specifically, the invention, briefly summarized, relates to a simple method of obtaining immunogenic fragments of proteins, as well as using these fragments or their common structural features to enhance the immunogenic potential of proteins and peptides in general. to influence.

De immunologische afweer tegen lichaamsvreemde stoffen en (mogelijk ziekteverwekkende) organismen is afhankelijk van een activering van verschillende typen cellen die in deze afweer een essentiële rol spelen. De belangrijkste vertegenwoordigers van deze cellen zijn antigeen presenterende cellen (APC's), T-lymfocyten en B-lymfocyten. Zo is bijvoorbeeld voor de productie van antilichamen, die lichaamsvreemde elementen specifiek binden en daarmee al vaak direct inactiveren, de achtereenvolgende activering van alle drie de bovengenoemde celtypen essentiëel. Een tweede belangrijk voorbeeld van een afweerrespons volgt op de activering van APC's en T-lymfo-cyten en kan leiden tot de vorming van zgn. cytotoxische T-lymfocyten die door ziekteverwekkers geïnfecteerde lichaamscellen specifiek kunnen doden. Voor een belangrijk deel zijn de verschillende vormen van de immunologische afweer afhankelijk van de activering van T-lymfocyten.The immunological defense against foreign substances and (possibly pathogenic) organisms depends on the activation of different types of cells that play an essential role in this defense. The main representatives of these cells are antigen presenting cells (APCs), T lymphocytes and B lymphocytes. For example, for the production of antibodies, which specifically bind foreign elements and thus often inactivate them directly, the sequential activation of all three of the above cell types is essential. A second important example of an immune response follows the activation of APCs and T lymphocytes and may lead to the formation of cytotoxic T lymphocytes that can specifically kill pathogenic cells. To a large extent, the different forms of immunological defense depend on the activation of T lymphocytes.

De huidige inzichten leren dat de activering van T-lymfocyten door een lichaams vreemd element (antigeen) alleen dan kan geschieden wanneer dit antigeen op zijn minst voor een deel uit eiwit bestaat. De reden is, dat T-lymfocyten uitsluitend geactiveerd kunnen worden door de herkenning van eiwitfragmenten, afkomstig van het antigeen. De eiwitfragraenten . worden in het algemeen uit een antigeen losgemaakt door een zich in beperkte mate voltrekkend afbraakproces van het antigeen in het inwendige van speciale cellen uit het afweersysteem, de APC's. Deze beperkte afbraak, die we "processing" noemen, is het gevolg van de inwerking van eiwitsplitsende enzymen (proteasen) die zich binnen de APC vermengen met het antigeen dat in de cel is opgenomen. De inwerking van deze enzymen verloopt op een gecontroleerde wijze binnen bepaalde blaasjes (endosomen) in het inwendige van de APC en de eiwit-fragmenten, die er uit het antigeen worden losgemaakt, kunnen hierna op een speciale manier aan T-lymfocyten ter herkenning worden gepresenteerd.Current insights show that the activation of T lymphocytes by a body foreign element (antigen) can only take place if this antigen consists at least partly of protein. The reason is that T lymphocytes can only be activated by the recognition of protein fragments from the antigen. The protein fragments. are generally released from an antigen by a limited amount of degradation of the antigen in the interior of special cells from the immune system, the APCs. This limited breakdown, which we call "processing", results from the action of protein-splitting enzymes (proteases) that mix within the APC with the antigen contained in the cell. The action of these enzymes takes place in a controlled manner within certain vesicles (endosomes) in the interior of the APC and the protein fragments released from the antigen can then be presented in special manner to T lymphocytes for recognition. .

De eiwitfragmenten, die het produkt vormen van deze antigeen.-processing in de APC's, kunnen niet zonder meer door T-lymfocyten worden herkend. Deze herkenning is namelijk strikt afhankelijk van een speciaal eiwit op het oppervlak van de APC's, dat de ontstane eiwitfragmenten op een stabiele manier kan binden. De erfelijke informatie voor dit speciale eiwit ligt op de genen in het zgn. "major histocompatibility complex" en het eiwit wordt daarom ook wel aangeduid met de term "MHC-product". Het uiteindelijk op het oppervlak van de APC gepresenteerde samenstel van dit MHC-product en het uit het antigeen losgemaakte eiwitfragment vormt de feitelijke herkenningsplaats voor T-lymfocyten en een noodzakelijke en tevens voldoende voorwaarde voor hun activering.The protein fragments, which are the product of this antigen processing in the APCs, cannot be readily recognized by T lymphocytes. Namely, this recognition strictly depends on a special protein on the surface of the APCs, which can bind the resulting protein fragments in a stable manner. The hereditary information for this special protein lies on the genes in the so-called "major histocompatibility complex" and the protein is therefore also referred to as the "MHC product". The assembly of this MHC product finally presented on the surface of the APC and the protein fragment released from the antigen constitutes the actual recognition site for T lymphocytes and a necessary and sufficient condition for their activation.

Uit de beschikbare voorbeelden is gebleken dat van een eiwitfragment, dat als processingsproduct binnen de APC ontstaat uit een antigeen, meestal slechts een gedeelte direct van belang is voor de binding aan het MHC-product; dit door het MHC-product herkende gedeelte noemen we de agretoop van het eiwitfragment. Daarnaast blijkt ook de T-lymfocyt niet het gehele eiwitfragment direct te herkennen, maar zich slechts te richten op een beperkt segment ervan; dit door de T-cel direct herkende segment noemen we de T-cel epitoop. Een immunologisch functioneel processingsproduct moet dus zowel een geschikte agretoop als T-cel epitoop bevatten. Overigens zij erop gewezen dat men de agretoop en de T-cel epitoop niet als twee gescheiden sequenties moet zien, maar veeleer als elkaar overlappende sequenties. Zie bijvoorbeeld Sette et al, Nature 328. (1987), 395-399, voor ovalbumine, en Fox et al, J. Immunol. 139. (1987), 1578-1588, voor cytochroom C.The available examples have shown that of a protein fragment, which arises as a processing product within the APC from an antigen, usually only a part is directly relevant for binding to the MHC product; we call this part recognized by the MHC product the agretope of the protein fragment. In addition, the T lymphocyte also appears not to recognize the entire protein fragment directly, but only to target a limited segment of it; this segment directly recognized by the T cell is called the T cell epitope. Thus, an immunologically functional processing product must contain both a suitable agretope and T cell epitope. Incidentally, it should be noted that the agretope and the T-cell epitope should not be seen as two separate sequences, but rather as overlapping sequences. See, e.g., Sette et al, Nature 328. (1987), 395-399, for ovalbumin, and Fox et al, J. Immunol. 139. (1987), 1578-1588, for cytochrome C.

De huidige inzichten leren dat in een gegeven antigeen slechts een zeer beperkt aantal segmenten van de aanwezige eiwitketens functioneel is in de activering van T-lymfocyten. Welke segmenten dit zijn, heeft men voor een aantal eiwitten proefondervindelijk kunnen vaststellen door het uitvoeren van een hiertoe geschikte test op een aantal synthetisch verkregen eiwitfragmenten. Slechts enkele van zulke kunstmatig verkregen eiwitfragmenten blijken de activering van T-lymfocyten te kunnen bewerkstelligen. Algemeen wordt aangenomen dat deze beperking een weerspiegeling is van het feit dat tijdens de processing van antigenen binnen een APC niet een groot aantal eiwitfragmenten op een min of meer willekeurige manier uit het antigeen wordt losgemaakt, maar dat in de eiwitsplitsing een zekere selectiviteit heerst. Deze selectiviteit heeft tot gevolg dat de splitsing van een gegeven antigeen volgens een vast patroon verloopt en een vaste set fragmenten oplevert, die als basismateriaal dient voor de presentatie aan T-lymfocyten. Er is nog een tweede verschijnsel dat de hierboven aangegeven proefondervindelijke tests aan het licht hebben gebracht. Dit verschijnsel is het feit dat zich in de aard van de fragmenten die in staat zijn om T-lymfocyten te activeren belangrijke verschillen kunnen voordoen tussen verschillende individuën en soorten. Eiwitfragmenten die binnen een bepaald individu of soort in staat zijn om T-lymfocyten te activeren, blijken dit in een ander individu of soort soms niet of nauwelijks te kunnen. Deze variatie laat zich verklaren uit de rol van het MHC-product. De opbouw van het MHC-product is namelijk zeer variabel en kan verschillen van individu tot individu en van soort tot soort. Deze verschillen hebben tot gevolg dat er verschillende voorkeuren bestaan ten aanzien van de aard van de agretoop die in processingsproducten als bindingsplaats kan worden benut. Omdat een processingsproduct in het algemeen een beperkte omvang heeft, heeft het daarmee ook een beperkt aanbod in mogelijke agretopen. Om deze reden kan het voorkomen dat een processingsproduct door één type MHC-product wel maar door een ander type niet kan worden gebonden, eenvoudigweg omdat het de daartoe benodigde agretoop mist. Het gevolg is dat het processingsproduct in het laatste geval niet aan T-lymfocyten kan worden gepresenteerd en dus nooit deze lymfocyten zal kunnen activeren.Current insights show that in a given antigen, only a very limited number of segments of the protein chains present are functional in the activation of T lymphocytes. Which segments these are has been determined experimentally for a number of proteins by performing an appropriate test on a number of synthetically obtained protein fragments. Only a few such artificially obtained protein fragments appear to be able to effect the activation of T lymphocytes. It is generally accepted that this limitation reflects the fact that during the processing of antigens within an APC, a large number of protein fragments are not released from the antigen in a more or less arbitrary manner, but that there is a certain selectivity in the protein cleavage. This selectivity results in the cleavage of a given antigen following a fixed pattern and yielding a fixed set of fragments, which serve as the base material for presentation to T lymphocytes. There is a second phenomenon that the above experimental tests have revealed. This phenomenon is the fact that in the nature of the fragments capable of activating T lymphocytes, important differences may arise between different individuals and species. Protein fragments that are able to activate T lymphocytes within a certain individual or species, appear to be unable or hardly able to do so in another individual or species. This variation can be explained by the role of the MHC product. The structure of the MHC product is highly variable and can differ from individual to individual and from species to species. As a result of these differences, there are different preferences regarding the nature of the agretope that can be used as a binding site in processing products. Because a processing product is generally limited in size, it also has a limited supply in possible agetopes. For this reason, it is possible that a processing product can be bound by one type of MHC product but not by another type, simply because it lacks the necessary agetope. As a result, in the latter case, the processing product cannot be presented to T lymphocytes and thus will never be able to activate these lymphocytes.

Samengevat kan worden geconcludeerd dat het vermogen van een antigeen om T-lymfocyten te activeren (dit vermogen noemen we de immunogeniciteit) afhankelijk is van zowel de eiwit-structuur van het antigeen als van erfelijke eigenschappen van de gastheer. De eiwitstructuur van het antigeen speelt tijdens de processing een rol en bepaalt de gevoeligheid voor de erop inwerkende eiwitsplitsende enzymen en daarmee, welke fragmenten eruit losgemaakt kunnen worden. De invloed van erfelijke eigenschappen van de gastheer speelt hierin geen rol en aangenomen mag worden dat de losgemaakte set van eiwitfragmenten in verschillende individuen en soorten vrijwel identiek zal zijn. De erfelijke eigenschappen van de gastheer spelen wel een rol in het vastleggen van de individueel bepaalde opbouw van de MHC-producten. Hiermee wordt in de aangeboden set van eiwit- fragmenten, afkomstig uit de processingsstap, een selectie aangebracht omdat sommige fragmenten wel en andere weer niet goed aan het betreffende MHC-product gebonden kunnen worden. Alleen wanneer een stabiele binding kan optreden, worden de losgemaakte eiwitfragmenten aan T-lymfocyten gepresenteerd.In summary, it can be concluded that the ability of an antigen to activate T lymphocytes (we call this immunogenicity) depends on both the protein structure of the antigen and hereditary properties of the host. The protein structure of the antigen plays a role during processing and determines the sensitivity to the protein-splitting enzymes acting on it and thus which fragments can be released from it. The influence of hereditary properties of the host plays no role in this and it can be assumed that the released set of protein fragments will be almost identical in different individuals and species. The hereditary properties of the host do play a role in determining the individually determined structure of the MHC products. A selection is hereby made in the offered set of protein fragments, originating from the processing step, because some fragments can be bound well to the relevant MHC product, while others may not. Only when stable binding can occur, the detached protein fragments are presented to T lymphocytes.

De uitvinding verschaft onder andere een werkwijze voor het verkrijgen van de processingsproducten, zoals die tijdens processing van een antigeen binnen endosomen van een APC gevormd worden. Deze uitvinding verschaft bovendien voor het eerst de belangrijke mogelijkheid om voor een gegeven antigeen vast te stellen, welke set eiwitfragmenten eruit wordt losgemaakt en welke fragmenten derhalve het basismateriaal vormen waaruit alle individuen en soorten een selectie maken (op basis van hun eigen MHC-product) voor presentatie aan en daaropvolgende activering van T-lymfocyten. De tot nu toe beschikbare methoden om de aard van deze eiwitfragmenten te achterhalen bestaan uit het proefondervindelijk testen van kunstmatig, veelal na organisch chemische synthese, verkregen eiwitfragmenten. Twee belangrijke problemen vormen bij deze methoden op dit moment een grote belemmering. Ten eerste is er het probleem dat men bij het testen van kunstmatig verkregen eiwitfragmenten zelf de plaats en lengte van deze fragmenten in een eiwitketen vooraf moet kiezen. Het is eenvoudig in te zien dat dit in geval van een gemiddeld in de natuur voorkomend eiwit met een lengte van ca. 400 aminozuren betekent, dat men een astronomisch aantal verschillende eiwitfragmenten dient aan te maken en te testen wanneer men over de aard van de processingsproducten van dat eiwit geen kennis heeft. De praktische beperkingen maken het vrijwel onmogelijk om binnen een redelijke tijdsduur al deze mogelijkheden na te gaan. Een tweede belangrijk probleem is dat niet alleen het aantal te testen eiwitfragmenten zeer groot is, maar dat dit testen dan bovendien nog in een aantal verschillende gastheren dient te geschieden. Immers, elke gastheer zal op grond van zijn MHC-product weer een individueel bepaalde selectie maken uit een aanbod van eiwitfragmenten om daadwerkelijk te presenteren aan T-lymfocyten. Om een volledig beeld te krijgen van alle potentiële T-cel epitopen van een eiwit, is derhalve een enorme hoeveelheid werk vereist.Among other things, the invention provides a method for obtaining the processing products, such as are formed during processing of an antigen within endosomes of an APC. Moreover, this invention provides for the first time the important possibility to determine for a given antigen, which set of protein fragments are released from it and which fragments thus form the basic material from which all individuals and species select (based on their own MHC product) for presentation to and subsequent activation of T lymphocytes. The methods available to date to determine the nature of these protein fragments consist of the experimental testing of protein fragments obtained artificially, usually after organic chemical synthesis. Two major problems are currently a major obstacle with these methods. First, there is the problem that when testing artificially obtained protein fragments, one has to pre-select the location and length of these fragments in a protein chain. It is easy to see that in the case of an average naturally occurring protein of about 400 amino acids in length, this means that an astronomical number of different protein fragments must be prepared and tested when considering the nature of the processing products. has no knowledge of that protein. The practical limitations make it virtually impossible to investigate all these possibilities within a reasonable period of time. A second important problem is that not only is the number of protein fragments to be tested very large, but that this testing also has to take place in a number of different hosts. After all, based on its MHC product, each host will again make an individually determined selection from a range of protein fragments to actually present them to T lymphocytes. Therefore, to get a complete picture of all potential T cell epitopes of a protein requires a tremendous amount of work.

De uitvinding reduceert nu op inventieve wijze deze hoeveelheid werk door het openen van de mogelijkheid om de processingsproducten van een antigeen op eenvoudige wijze in handen te krijgen en daarmee de volledige set van losgemaakte eiwitfragmenten direct in kaart te brengen. Daarmee worden de hierboven vermelde twee problemen opgelost doordat de keuze van geschikte eiwitfragmenten wordt overgelaten aan de eiwit-splitsende enzymen die dat in de natuurlijke situatie ook doen en doordat het effect van erfelijk bepaalde aspecten van T-lymfocyt activering wordt omzeild.The invention now inventively reduces this amount of work by opening the possibility of easily obtaining the processing products of an antigen and thereby directly mapping the full set of detached protein fragments. This solves the above two problems by leaving the choice of suitable protein fragments to the protein-splitting enzymes that do so in the natural situation and bypassing the effect of hereditary aspects of T-lymphocyte activation.

Bovendien is door de toepassing van deze uitvinding op verschillende eiwitten komen vast te staan dat er in de natuurlijke situatie één eiwitsplitsend enzym binnen de APC is, dat zich op een wel zeer dominante manier bezighoudt met het aanbrengen van breuken in de eiwitketens van het antigeen. Het dominante optreden van dit enzym, dat bekend staat als cathepsine D (E.C. 3.4.23.5), is zelfs zó sterk, dat de processing van een antigeen zoals dat binnen de APC gebeurt, in veel gevallen nauwkeurig is na te bootsen door een behandeling van het antigeen met uitsluitend dit betreffende enzym. Deze nieuwe vinding maakt het verkrijgen van een set processingsproducten voor veel antigenen een praktisch zeer eenvoudige en dus toegankelijke bezigheid, waarvan het resultaat belangrijke toepassingen mogelijk maakt.Moreover, by applying this invention to different proteins, it has been established that in the natural situation there is one protein-splitting enzyme within the APC, which is very dominantly involved in breaks in the protein chains of the antigen. In fact, the dominant action of this enzyme, known as cathepsin D (EC 3.4.23.5), is so strong that in many cases the processing of an antigen as it happens within the APC can be closely mimicked by treating the antigen containing only this particular enzyme. This new invention makes obtaining a set of processing products for many antigens a practically very simple and thus accessible activity, the result of which allows important applications.

Een derde belangrijke en nieuwe vinding, die het resultaat is van de toepassing van de twee eerder genoemde, is het gegeven dat het hierboven genoemde enzym cathepsine D niet op willekeurige plaatsen breuken aanbrengt in eiwitketens, maar dit bij voorkeur doet op een plaats waar een zekere vaste volgorde bestaat van bepaalde typen aminozuren. De aanwezigheid van een dergelijk patroon van aminozuren in een eiwit-keten vergroot de kans dat op deze plaats door cathepsine D een breuk kan worden aangebracht. Het bezit van dit aminozuur- patroon heeft derhalve betekenis voor het vermogen van een antigeen om tijdens processing binnen een APC voldoende eiwit-fragmenten op te leveren die ter presentatie aan T-lymfocyten kunnen worden gebruikt. Met andere woorden: het aminozuur-patroon heeft betekenis voor het immunogene vermogen van een antigeen en kan derhalve in kunstmatig te verkrijgen antigenen worden toegepast om dit vermogen te beïnvloeden. In een aantal gevallen zullen deze toepassingen een verhoging van de immuno-geniciteit ten doel hebben, bijvoorbeeld waar het gaat om de opwekking van antilichamen voor medische of wetenschappelijke doeleinden. Aan de andere kant kan het verlagen van de immuno-geniciteit van antigenen in diezelfde sectoren betekenis hebben, bijvoorbeeld waar het gaat om het verbeteren van de · werkzaamheid van eiwitbevattende therapeutica, in welk geval een hoge immunogeniciteit juist grote nadelen met zich meebrengt. Tenslotte kan worden vastgesteld dat de processingsproducten die ontstaan na de inwerking van cathepsine D, welke dus een belangrijk deel vertegenwoordigen van de in de APC’s gevormde processingsproducten, door de werkingsvoorkeur van het enzym gemeenschappelijke structurele kenmerken zullen dragen aan de uiteinden. De laatste, op de eerste vindingen gebaseerde vinding is derhalve dat een belangrijk deel van de processingsproducten van antigenen een gemeenschappelijk structureel kenmerk bezitten, dat zich manifesteert aan de uiteinden van de betreffende eiwitfragmen-ten, en dat één of beide kenmerken een voldoende omschrijving is van een veelgebruikte agretoop en het bezit ervan daardoor voor eiwitfragmenten de kans vergroot dat het fragment door een MHC-product gebonden kan worden en dus aan T-lymfocyten kan worden gepresenteerd. Het kenmerk kan op een eenvoudige wijze in kunstmatig aangemaakte eiwitfragmenten worden ingébracht en brede toepassing vinden in de activering van T-lymfocyten door kunstmatig verkregen antigenen (met kunstmatig verkregen wordt gedoeld op alle denkbare productiemethoden, zoals chemische synthese, productie door genetisch getrans formeerde cellen of organismen, in vitro translatie van de bijbehorende genetische informatie, enz.).A third important and novel finding, which results from the application of the two aforementioned, is the fact that the above-mentioned enzyme cathepsin D does not randomly break protein chains, but preferably does so where a certain fixed order of certain types of amino acids. The presence of such a pattern of amino acids in a protein chain increases the chance that a break can be made at this location by cathepsin D. The possession of this amino acid pattern therefore has significance for the ability of an antigen to yield sufficient protein fragments during processing within an APC that can be used for presentation to T lymphocytes. In other words, the amino acid pattern has significance for the immunogenic potential of an antigen and can therefore be used in artificially obtainable antigens to influence this potency. In a number of cases, these uses will aim to increase immunogenicity, for example, in the generation of antibodies for medical or scientific purposes. On the other hand, decreasing the immunogenicity of antigens in the same sectors may be meaningful, for example when it comes to improving the efficacy of protein-containing therapeutics, in which case high immunogenicity entails major drawbacks. Finally, it can be concluded that the processing products that arise after the action of cathepsin D, which therefore represent an important part of the processing products formed in the APCs, will bear common structural characteristics at the ends due to the action preference of the enzyme. The latest finding, based on the first findings, is therefore that an important part of the processing products of antigens have a common structural characteristic, which manifests itself at the ends of the relevant protein fragments, and that one or both characteristics sufficiently describe a commonly used agretope and its possession for protein fragments therefore increases the likelihood that the fragment can be bound by an MHC product and thus presented to T lymphocytes. The trait can be easily introduced into artificially produced protein fragments and find wide application in the activation of T lymphocytes by artificially derived antigens (artificially obtained refers to all conceivable production methods, such as chemical synthesis, production by genetically transformed cells or organisms, in vitro translation of the associated genetic information, etc.).

De uitvinding wordt in de eerste plaats belichaamd in een al dan niet gemodificeerd (bijv. geglycosyleerd) peptide met een lengte van ten minste 7 aminozuur-resten, welk peptide gekenmerkt wordt doordat het amino-terminale gedeelte een agretoop-seguentie omvat, waarbij, gezien vanaf het amino-terminale uiteinde, het eerste aminozuur een hydrofoob aminozuur, gekozen uit proline, alanine, methionine, tyrosine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine, cysteïne en tryptofaan is, het tweede aminozuur glycine of een geladen aminozuur, gekozen uit asparaginezuur, glutaminezuur, histidine, lysine en arginine is, en het vijfde aminozuur een geladen aminozuur, gekozen uit asparaginezuur, glutaminezuur, histidine, lysine en arginine is.The invention is primarily embodied in a modified or unmodified (e.g. glycosylated) peptide of at least 7 amino acid residues in length, the peptide characterized in that the amino-terminal portion comprises an agretope sequence, wherein from the amino-terminal end, the first amino acid is a hydrophobic amino acid selected from proline, alanine, methionine, tyrosine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine, cysteine and tryptophan, the second amino acid is glycine or a charged amino acid selected from aspartic acid, glutamic acid, histidine, lysine and arginine, and the fifth amino acid is a charged amino acid selected from aspartic acid, glutamic acid, histidine, lysine and arginine.

Daarbij heeft het volgens de uitvinding de voorkeur dat, gezien vanaf het amino-terminale uiteinde, het vijfde aminozuur een geladen aminozuur, gekozen uit histidine, lysine en arginine is.In addition, according to the invention, it is preferred that, viewed from the amino-terminal end, the fifth amino acid is a charged amino acid selected from histidine, lysine and arginine.

Verder heeft het volgens de uitvinding de voorkeur dat, gezien vanaf het amino-terminale uiteinde, het tweede aminozuur een geladen aminozuur, gekozen uit histidine, lysine en arginine is.Furthermore, according to the invention, it is preferred that, viewed from the amino-terminal end, the second amino acid is a charged amino acid selected from histidine, lysine and arginine.

Peptiden volgens de uitvinding, die gekenmerkt worden doordat, gezien vanaf het carboxy-terminale uiteinde, het eerste en het tweede aminozuur een hydrofoob aminozuur, gekozen .uit proline, alanine, methionine, tyrosine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine, cysteïne en tryptofaan zijn, hebben eveneens de voorkeur. Voor deze peptiden geldt dat, gezien vanaf het carboxy-terminale uiteinde, het eerste aminozuur bij voorkeur een hydrofoob aminozuur, gekozen uit leucine, phenylalanine, tyrosine en tryptofaan is.Peptides of the invention, characterized in that, viewed from the carboxy-terminal end, the first and second amino acids are a hydrophobic amino acid selected from proline, alanine, methionine, tyrosine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine, cysteine and tryptophan are also preferred. For these peptides, viewed from the carboxy-terminal end, the first amino acid is preferably a hydrophobic amino acid selected from leucine, phenylalanine, tyrosine and tryptophan.

In verband met de beoogde toepassingen, waarin T-cel activering een belangrijke rol speelt, wordt geprefereerd dat het peptide volgens de uitvinding 7-40 aminozuur-resten omvat.In connection with the intended uses, in which T cell activation plays an important role, it is preferred that the peptide of the invention comprises 7-40 amino acid residues.

Een bijzondere voorkeursklasse van peptiden volgens de uitvinding wordt gekenmerkt doordat het peptide overeenstemt met een eiwitfragment, dat uit een eiwit kan worden vrijgemaakt door een of meerdere, bij de processing van antigenen in antigeen presenterende cellen betrokken proteasen.A particularly preferred class of peptides according to the invention is characterized in that the peptide corresponds to a protein fragment which can be released from a protein by one or more proteases involved in the processing of antigens in antigen presenting cells.

Meer in het bijzonder wordt een peptide geprefereerd, dat overeenstemt met een eiwitfragment, dat uit een eiwit kan worden vrijgemaakt door het bij de processing van antigenen in antigeen presenterende cellen betrokken protease cathepsine D.More particularly, a peptide corresponding to a protein fragment that can be released from a protein is preferred by the protease cathepsin D involved in the processing of antigens in antigen-presenting cells.

Verder gaat voorkeur uit naar peptiden, die van peptiden uit deze voorkeursklassen zijn afgeleid, maar daarvan in een of meerdere opzichten verschillen, in het bijzonder doordat de amino-terminale agretoop-sequentie in het eerste, tweede en/of vijfde aminozuur, gezien vanaf het amino-terminale uiteinde, afwijkt van de in het natuurlijke eiwitfragment voorkomende sequentie, en/of doordat het peptide in vergelijking tot het natuurlijke eiwitfragment een of meerdere extra agretoop-sequenties omvat, en/of doordat het peptide in vergelijking tot het natuurlijke eiwitfragment uitgebreid is met een of meerdere B-cel epitopen.Furthermore, preference is given to peptides derived from peptides of these preferred classes, but differing in one or more respects, in particular in that the amino-terminal agretope sequence in the first, second and / or fifth amino acid, seen from the amino-terminal end, differs from the sequence occurring in the natural protein fragment, and / or in that the peptide comprises one or more additional agretope sequences compared to the natural protein fragment, and / or in that the peptide is extended in comparison to the natural protein fragment with one or more B cell epitopes.

De uitvinding wordt in de tweede plaats belichaamd in een eiwit-construct, dat ten minste een fragment bevat, waarop een. B-cel epitoop is gelegen, en ten minste een fragment bevat, dat overeenstemt met een peptide volgens de uitvinding, waarbij de aan het amino-terminale uiteinde van het laatstgenoemde fragment gelegen agretoop-sequentie aansluit op twee hydrofobe aminozuren, elk gekozen uit proline, alanine, methionine, tyrosine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine, cysteïne en tryptofaan.Secondly, the invention is embodied in a protein construct containing at least one fragment on which a. B cell epitope is located, and contains at least one fragment corresponding to a peptide of the invention, wherein the agretope sequence located at the amino terminal end of the latter fragment connects to two hydrophobic amino acids, each selected from proline, alanine, methionine, tyrosine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine, cysteine and tryptophan.

De uitvinding strekt zich ook uit over een eiwit-construct, dat in hoofdzaak overeenstemt met een natuurlijk voorkomend, al dan niet gemodificeerd eiwit, maar daarvan afwijkt doordat een of meerdere herkennings-sequenties van een bij de processing van antigenen in antigeen presenterende cellen betrokken protease zijn verwijderd, veranderd of toegevoegd.The invention also extends to a protein construct which substantially corresponds to a naturally occurring, modified or unmodified protein, but which differs in that one or more recognition sequences of a protease involved in the processing of antigens in antigen presenting cells have been removed, changed or added.

In de derde plaats wordt de uitvinding belichaamd in een werkwijze voor het bereiden van al dan niet gemodificeerde (bijv. geglycosyleerde) peptiden, die geschikt kunnen zijn voor het activeren van T-cellen, welke werkwijze gekenmerkt wordt doordat men een eiwit in vitro bloot stelt aan een of meerdere bij de processing van antigenen in antigeen presenterende cellen betrokken proteasen.Third, the invention is embodied in a method of preparing modified or unmodified (e.g., glycosylated) peptides, which may be suitable for activating T cells, which method is characterized by exposing a protein in vitro to one or more proteases involved in the processing of antigens in antigen-presenting cells.

De uitvinding strekt zich tevens uit over een werkwijze voor het bereiden van al dan niet gemodificeerde (bijv. geglycosyleerde) peptiden, die geschikt kunnen zijn voor het activeren van T-cellen, waarbij men een eiwit in vitro bloot stelt aan het bij de processing van antigenen in antigeen presenterende cellen betrokken protease cathepsine D, of waarbij men een eiwit in vitro bloot stelt aan, uit antigeen presenterende cellen geïsoleerde en toegankelijk gemaakte endosomen.The invention also extends to a method of preparing modified or unmodified (e.g. glycosylated) peptides, which may be suitable for activating T cells, whereby a protein is exposed in vitro to the processing of antigens in antigen presenting cells involved protease cathepsin D, or exposing a protein in vitro to endosomes isolated and made accessible from antigen presenting cells.

In de vierde plaats wordt de uitvinding belichaamd in een preparaat voor het opwekken van een immuunrespons in zoogdieren, welk preparaat als immunogeen dan wel als immuun-stimulerend adjuvans een of meerdere peptiden of een of meerdere eiwit-constructen volgens de uitvinding omvat.Fourth, the invention is embodied in a composition for eliciting an immune response in mammals, which composition comprises, as an immunogen or as an immunostimulatory adjuvant, one or more peptides or one or more protein constructs of the invention.

De hier beschreven uitvinding heeft verscheidene toepas-sings-mogelijkheden, die thans nader zullen worden aangeduid.The invention described here has several application possibilities, which will now be further indicated.

A. Het vaststellen van de aard van de processings-producten van een gegeven antigeen zoals die in endosomen van APC's worden gevormd.A. Determining the nature of the processing products of a given antigen as formed in endosomes of APCs.

B. Het voorspellen van de aard van de processings-producten van een gegeven antigeen op basis van de aanwezigheid van een patroon van aminozuren, zoals dat herkend kan worden door cathepsine D, en daardoor plaatsen markeert die een verhoogde kans bezitten om tijdens processing breuken in de eiwitketen op te leveren. Dit aminozuur-patroon (dat verder in deze tekst als het cathepsine D herkenningspatroon wordt aangeduid) bestaat uit de volgende elementen: - eerste aminozuur: één der hydrofobe aminozuren (proline, alanine, tyrosine, valine, methionine, isoleucine, leucine, phenylalanine, cysteïne of tryptofaan) - tweede aminozuur: één der genoemde hydrofobe aminozuren, bij voorkeur leucine, phenylalanine, tyrosine of tryptofaan.B. Predicting the nature of the processing products of a given antigen based on the presence of a pattern of amino acids, as can be recognized by cathepsin D, thereby highlighting sites that have an increased probability of breaking in processing to deliver the protein chain. This amino acid pattern (hereinafter referred to in this text as the cathepsin D recognition pattern) consists of the following elements: - first amino acid: one of the hydrophobic amino acids (proline, alanine, tyrosine, valine, methionine, isoleucine, leucine, phenylalanine, cysteine or tryptophan) - second amino acid: one of said hydrophobic amino acids, preferably leucine, phenylalanine, tyrosine or tryptophan.

derde aminozuur: één der genoemde hydrofobe aminozuren, vierde aminozuur: glycine of één der geladen aminozuren (asparaginezuur, glutaminezuur, histidine, lysine of arginine) zevende aminozuur: één der genoemde geladen aminozuren, bij voorkeur histidine, lysine of arginine.third amino acid: one of said hydrophobic amino acids, fourth amino acid: glycine or one of charged amino acids (aspartic acid, glutamic acid, histidine, lysine or arginine) seventh amino acid: one of said charged amino acids, preferably histidine, lysine or arginine.

C. Het gebruik van de kennis van processingsproducten van antigenen als basis voor het ontwikkelen van synthetische immunogenen en vaccins. Het streven bij een vaccin is in het algemeen om met een zo onschadelijk mogelijk kunstmatig antigeen (het vaccin) de cellen van het immuunsysteem te activeren; de opgewekte specificiteit van de respons moet zo goed mogelijk gelijken op die, welke door de natuurlijke ziekteverwekker, waartegen het vaccin is gericht, wordt opgewekt. Voor zover het de activering van T-lymfocyten betreft, is de gelijkenis optimaal als het vaccin in de gastheer dezelfde eiwitfragmenten oplevert als die welke na processing van de ziekteverwekker in die gastheer ontstaan. ,C. Using knowledge of antigen processing products as a basis for developing synthetic immunogens and vaccines. The aim of a vaccine is generally to activate the cells of the immune system with an as harmless as possible artificial antigen (the vaccine); the specificity of the response evoked should be as close as possible to that elicited by the natural pathogen targeted by the vaccine. As far as the activation of T lymphocytes is concerned, the similarity is optimal if the vaccine in the host yields the same protein fragments as those that arise after processing of the pathogen in that host. ,

Omdat de activering van T-lymfocyten in verreweg de meeste gevallen een essentiëel element is in de werking van een vaccin, is kennis van deze fragmenten van groot belang voor het op kunstmatige wijze vervaardigen van een vaccin. Kennis van de processingsproducten van een ziekteverwekkend antigeen kan op tenminste drie manieren bij de vervaardiging van een vaccin worden gebruikt.Since the activation of T lymphocytes is by far the most essential element in the action of a vaccine, knowledge of these fragments is of great importance for the artificial manufacture of a vaccine. Knowledge of the processing products of a pathogenic antigen can be used in at least three ways in the manufacture of a vaccine.

1. Constructie van een vaccin waarbij de processingsproducten van de ziekteverwekker in kwestie als losse eiwit-fragmenten aanwezig zijn in het vaccin. In dit geval is geen processing van het kunstmatige antigeen/vaccin vereist om de gewenste processingsproducten in de gastheer te introduceren.Construction of a vaccine in which the processing products of the pathogen in question are present as loose protein fragments in the vaccine. In this case, no processing of the artificial antigen / vaccine is required to introduce the desired processing products into the host.

2. Constructie van een vaccin waarbij de processingsproducten elk afzonderlijk, of in combinatie de basis vormen voor een hiervan afgeleid peptide waaraan structuren zijn toegevoegd of in zijn gewijzigd met als doel om ook andere typen cellen dan T-lymfocyten te activeren. Het kunstmatige antigeen/vaccin bestaat dan uit losse eiwitfragmenten, die een structurele afgeleide vormen van één of meerdere van de oorspronkelijk vastgestelde processingsproducten.A vaccine construction in which the processing products, individually or in combination, form the basis of a peptide derived therefrom to which structures have been added or modified for the purpose of also activating types of cells other than T lymphocytes. The artificial antigen / vaccine then consists of loose protein fragments, which form a structural derivative of one or more of the originally identified processing products.

3. Constructie van een eiwit/peptide antigeen waarin binnen de aminozuurvolgorde doelbewust getracht wordt een cathepsine D herkenningspatroon op te bouwen zodanig dat de kans verhoogd wordt dat op deze plaatsen tijdens processing binnen APC's een breuk wordt aangebracht. Het gewenste processingsproduct, overeenstemmend met dat van de ziekteverwekker in kwestie, kan in het kunstmatige antigeen/vaccin direct vóór, na of tussen dergelijke voor breuk gevoelige aminozuur-patronen geplaatst worden in de verwachting dat het tijdens processing in de gastheer wordt vrijgemaakt uit het antigeen.3. Construction of a protein / peptide antigen in which a deliberate attempt is made within the amino acid sequence to build up a cathepsin D recognition pattern such that the likelihood of fracture at these sites during processing within APCs is increased. The desired processing product, similar to that of the pathogen in question, can be placed in the artificial antigen / vaccine immediately before, after or between such fracture-prone amino acid cartridges, expecting it to be released from the antigen during processing in the host. .

Een mogelijke toepassing van de uitvinding is meer in concreto de constructie van een eiwitproduct, dat één of meer B-cel epitopen bevat, waarin de processingsproducten van een ander eiwit op een zodanige wijze zijn ingebouwd dat deze producten tijdens processing van het ontstane hybride eiwit binnen APC's vrijgemaakt worden en weer in hun oorspronkelijke vorm terugkeren. Dit kan bereikt worden door op die plaatsen waar de aminozuurvolgordes van de processingsproducten overgaan in die van het gastheer-eiwit, aminozuren te plaatsen die voldoen aan het patroon dat tijdens processing door de betrokken proteasen kan worden herkend. Bij voorkeur komt dit patroon overeen met het door cathepsine D herkende patroon (hydrofoob-hydrofoob-hydrofoob-Gly/geladen-Xl-X2-geladen). In dit laatste patroon zal tijdens processing bij voorkeur tussen het tweede en derde aminozuur worden geknipt. De voor de processingsproducten gewenste uiteinden dienen derhalve voor wat betreft de N-terminus te voldoen aan de voorwaarden voor residue 3 t/m 7 uit het patroon en voldoen voor wat betreft de C-terminus bij voorkeur aan die voor residuen 1 en 2. De direct hierop aansluitende aminozuren van het gastheer-eiwit moeten liefst op beide posities het volledige herkennings-patroon completeren.More concretely, a possible application of the invention is the construction of a protein product, which contains one or more B-cell epitopes, in which the processing products of another protein are incorporated in such a way that these products are processed during processing of the resulting hybrid protein. APCs are released and return to their original form. This can be achieved by placing amino acids that conform to the pattern that can be recognized by the involved proteases during processing in those places where the amino acid sequences of the processing products transition to those of the host protein. Preferably, this pattern corresponds to the pattern recognized by cathepsin D (hydrophobic-hydrophobic-hydrophobic-Gly / charged-X1-X2-charged). The latter pattern will preferably cut between the second and third amino acids during processing. Therefore, the ends desired for the processing products should satisfy the conditions for residue 3 to 7 from the cartridge as far as the N-terminus is concerned, and preferably for the C-terminus as those for residues 1 and 2. The amino acids of the host protein directly following it should preferably complete the complete recognition pattern at both positions.

Deze mogelijkheid kan belangrijk zijn voor de constructie van kunstmatige immunogenen en vaccins. De functie van een vaccin is de activering van zowel T-lymfocyten als B-lymfo-cyten met dezelfde antigeen-specificiteit als die welke door de natuurlijke ziekteverwekker zou worden geactiveerd. Geslaagde activering van zowel T- als B-lymfocyten door het vaccin leidt mede tot de opbouw van zogenaamd immunologisch geheugen. Met dit laatste wordt bedoeld dat een gedeelte van de geactiveerde T- en B-lymfoctyten in "gemobiliseerde" ofwel zeer snel activeerbare toestand in het lichaam bewaard blijven. Het zijn nu juist deze achterblijvende lymfocyten, de zogenaamde geheugen-cellen, die de beoogde bescherming bieden. Wanneer op een zeker tijdstip na vaccinatie een ziekteverwekker het lichaam binnendringt, zal deze bij processing in APC's de voor deze ziekteverwekker kenmerkende processingsproducten opleveren. Vervolgens kunnen door deze producten T-lymfocyten, en hierna B-lymfocyten geactiveerd worden. De snelheid waarmee deze activering plaatsvindt, en dus de snelheid, waarmee de ziekteverwekker kan worden uitgeschakeld is dramatisch groter wanneer de activering eventueel aanwezige geheugencellen betreft. Dit laatste kan uitsluitend als de antigeen specificiteit van deze geheugencellen, zowel op T-als op B-lymfocyt niveau, geschikt is om de betreffende epitopen van de ziekteverwekker te herkennen. Deze geschiktheid wordt ook wel aangeduid met de term "kruisreactiviteit". De specificiteit van de T-geheugencellen is gericht tegen de T-cel epitopen, gelegen op de processingsproducten van het vaccin. De meest geschikte specificiteit van T-geheugencellen (de grootste kruisreactiviteit tussen vaccin en ziekteverwekker) wordt daarom verkregen met een vaccin dat dezelfde processingsproducten oplevert als de uiteindelijke ziekteverwekker (Weliswaar kan een T-cel epitoop slechts een beperkt deel uitmaken van een processingsproduct, de ruimtelijke oriëntatie van dit beperkte deel wordt wel beïnvloed door de rest van het processingsproduct en deze ruimtelijke oriëntatie is mede bepalend voor de specificiteit van de geactiveerde T-lymfocyt).This potential may be important for the construction of artificial immunogens and vaccines. The function of a vaccine is the activation of both T lymphocytes and B lymphocytes with the same antigen specificity as that which would be activated by the natural pathogen. Successful activation of both T and B lymphocytes by the vaccine contributes to the development of so-called immunological memory. By the latter it is meant that part of the activated T and B lymphoctytes are kept in the body in "mobilized" or very rapidly activatable state. It is precisely these remaining lymphocytes, the so-called memory cells, that provide the intended protection. When a pathogen enters the body at a certain time after vaccination, it will yield the processing products that are characteristic of this pathogen when processed in APCs. Subsequently, T-lymphocytes and subsequently B-lymphocytes can be activated by these products. The rate at which this activation takes place, and thus the rate at which the pathogen can be turned off, is dramatically greater when the activation involves any memory cells present. The latter is only possible if the antigen specificity of these memory cells, both at T and B lymphocyte level, is suitable for recognizing the relevant epitopes of the pathogen. This suitability is also referred to by the term "cross-reactivity". The specificity of the T memory cells is directed against the T cell epitopes located on the processing products of the vaccine. The most appropriate specificity of T-memory cells (the greatest cross-reactivity between vaccine and pathogen) is therefore obtained with a vaccine that produces the same processing products as the ultimate pathogen (Although a T-cell epitope can only form a limited part of a processing product, the spatial orientation of this limited part is influenced by the rest of the processing product and this spatial orientation partly determines the specificity of the activated T lymphocyte).

Nu geldt in veel gevallen dat de B- en T-cel epitopen van een ziekteverwekker, die geschikt zijn om als basis te dienen voor een synthetisch vaccin, niet op één en hetzelfde eiwit-molecuul zijn gelegen. Het hierboven beschreven product biedt een nieuwe, inventieve en immunologisch functionele combinatie van B- en T-cel epitopen binnen één enkel eiwitproduct.In many cases it now holds that the B and T cell epitopes of a pathogen, which are suitable as a basis for a synthetic vaccine, are not located on one and the same protein molecule. The product described above offers a new, inventive and immunologically functional combination of B and T cell epitopes within a single protein product.

D. Gebruikmaking van de structurele kenmerken die tijdens processing door cathepsine D in antigenen worden herkend en leiden tot een verhoogde kans dat op deze plaatsen een breuk wordt aangebracht door het enzym. Gebruikmaking van deze kenmerken kan op tenminste drie verschillende manieren leiden tot verandering van de immunogeniciteit (het vermogen van een antigeen om T-lymfocyten te activeren) van een antigeen.D. Using the structural features recognized in antigens during processing by cathepsin D lead to an increased likelihood that the enzyme will break at these sites. Using these features can alter the immunogenicity (the ability of an antigen to activate T lymphocytes) of an antigen in at least three different ways.

1. Het verhogen van de immunogeniciteit van een antigeen door bij de kunstmatige vervaardiging van zo'n antigeen cathepsine D herkenningspatronen in te brengen, zodanig dat de kans verhoogd wordt dat op deze plaatsen tijdens processing binnen APC's een breuk wordt aangebracht. Hiermee kan doelbewust de kans worden verhoogd dat het antigeen tijdens processing eiwitfragmenten oplevert die vervolgens aan T-lymfocyten kunnen worden gepresenteerd en deze hierop kunnen activeren.1. Increasing the immunogenicity of an antigen by introducing cathepsin D recognition patterns in the artificial manufacture of such an antigen, so as to increase the likelihood of fracture at these sites during processing within APCs. This can purposefully increase the chance that the antigen will yield protein fragments during processing which can then be presented to and activated on T lymphocytes.

2. Het verlagen van de immunogeniciteit van een eiwit-bevattende stof door bij de kunstmatige vervaardiging ervan cathepsine D herkenningspatronen te verwijderen, zodanig dat de kans verlaagd wordt dat op deze plaatsen tijdens processing binnen APC's een breuk wordt aan gebracht. Hiermee kan doelbewust worden vermeden dat het antigeen tijdens processing eiwitfragmenten oplevert die vervolgens aan T-lymfocyten kunnen worden gepresenteerd en deze hierop kunnen activeren.2. Decreasing the immunogenicity of a protein-containing substance by removing cathepsin D recognition patterns in its artificial manufacture, thereby reducing the likelihood of fracture at these sites during processing within APCs. This can deliberately prevent the antigen from producing protein fragments during processing which can then be presented to and activated on T lymphocytes.

3. Het verhogen van de immunogeniciteit van een peptide door het bij de vervaardiging van zo’n peptide inbrengen van de structurele kenmerken die vele natuurlijke processings-producten met elkaar gemeenschappelijk hebben. Met name wordt hiermee gedoeld op het kenmerk, bestaande uit de aanwezigheid aan het N-terminale uiteinde van het peptide of eiwitfragment van een hydrofoob aminozuur (één der volgende aminozuren: proline, alanine, methionine, tyrosine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine, cysteïne of tryptofaan), direct gevolgd door glycine of een geladen aminozuur (één der volgende aminozuren: asparaginezuur, glutaminezuur, histidine, lysine of arginine) en drie residuen hieropvolgend wederom een geladen aminozuur, bij voorkeur histidine, lysine of arginine. Een optioneel tweede kenmerk bestaat uit de aanwezigheid aan het C-terminale uiteinde van twee achtereenvolgende hydrofobe aminozuren met op de C-terminale positie bij voorkeur leucine, tyrosine, phenylalanine of tryptofaan.3. Increasing the immunogenicity of a peptide by introducing the structural features common to many natural processings products in the manufacture of such a peptide. This refers in particular to the characteristic consisting of the presence at the N-terminal end of the peptide or protein fragment of a hydrophobic amino acid (one of the following amino acids: proline, alanine, methionine, tyrosine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine, cysteine or tryptophan), directly followed by glycine or a charged amino acid (one of the following amino acids: aspartic acid, glutamic acid, histidine, lysine or arginine) and three residues again a charged amino acid, preferably histidine, lysine or arginine. An optional second feature consists of the presence at the C-terminal end of two consecutive hydrophobic amino acids with at the C-terminal position preferably leucine, tyrosine, phenylalanine or tryptophan.

De uitvinding zal aan de hand van de hiernavolgende experimentele informatie nader worden toegelicht.The invention will be further elucidated on the basis of the following experimental information.

1.Het verkrijgen van orocessingsoroducten met behulp van een endosoom-fractie__uit antiaeen-presenterende cellen (APC's)1. Obtaining Orocessing Products Using an Endosome Fraction From Antiaene-Presenting Cells (APCs)

Als APC zijn in beginsel alle type cellen bruikbaar, maar macrofagen of macrofaag-afgeleide cellijnen verdienen om diverse redenen de voorkeur. Een van deze redenen is de hoge concentratie eiwitsplitsende enzymen binnen dit type cellen. Voor het processen van antigenen kunnen celbestanddelen gebruikt worden die eiwitsplitsende enzymen bevatten, bij voorkeur een endosoom-fractie. Een endosoom-fractie kan op verschillende manieren uit de APC worden bereid en mag als zodanig worden aangeduid wanneer het gaat om een celfractie waarin het enzym B-hexosaminidase geheel of bijna geheel afwezig is (bij voorkeur minder dan 10% van de totale cellulaire inhoud) terwijl de fractie tegelijkertijd een proteolytische activiteit bezit, die werkzaam is bij pH 6 of lager maar niet boven pH 6. Een dergelijke endosoom-fractie kan bijvoorbeeld worden bereid door middel van een fractionering van gelyseerde APC's met behulp van een Percoll-gradiënt (Galloway et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, (1983), 3334-3338, of Van Renswoude et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 22., (1982), 6186-6190).In principle, all types of cells can be used as APC, but macrophages or macrophage-derived cell lines are preferred for various reasons. One of these reasons is the high concentration of protein-splitting enzymes within this type of cells. Cell components containing protein splitting enzymes, preferably an endosome fraction, can be used for antigen processing. An endosome fraction can be prepared from the APC in various ways and may be labeled as such in the case of a cell fraction in which the enzyme B-hexosaminidase is completely or almost completely absent (preferably less than 10% of the total cellular content) while at the same time the fraction has a proteolytic activity, which is active at pH 6 or less but not above pH 6. Such an endosome fraction can be prepared, for example, by fractionation of lysed APCs using a Percoll gradient (Galloway et al, Proc, Natl, Acad, Sci, USA 80, (1983), 3334-3338, or Van Renswoude et al, Proc, Natl, Acad, Sci, USA, 22. (1982), 6186-6190).

Als antigeen is in beginsel elke eiwitbevattende stof of organisme bruikbaar, zolang de eiwitcomponent (en tevens de . daarvan afgeleide fragmenten) door middel van een chemische of radiochemische modificatie herkenbaar is en blijft voor (bio)chemische analysetechnieken, en daardoor gevolgd kan worden in de context van de APC-geassociëerde eiwitten en peptiden. Belangrijk is hierbij dat de modificatie op een stabiele wijze en voldoende verspreid over de eiwitketen wordt aangebracht, terwijl tegelijkertijd de structurele verandering die met de modificatie gepaard gaat, zo beperkt mogelijk is. Een voorbeeld van zo'n modificatie is reductieve methylering van alle primaire aminogroepen in een eiwit met gebruikmaking van [14C]-formaldehyde en cyanoboorhydride (zoals beschreven door Means en Feeney, Biochemistry 2/(1968), 2192-2201).In principle, any protein-containing substance or organism can be used as an antigen, as long as the protein component (and also the fragments derived from it) is and remains recognizable by chemical or radiochemical modification for (bio) chemical analysis techniques, and can therefore be followed in the context of the APC-associated proteins and peptides. It is important here that the modification is applied in a stable manner and sufficiently spread over the protein chain, while at the same time the structural change associated with the modification is as limited as possible. An example of such a modification is reductive methylation of all primary amino groups in a protein using [14 C] formaldehyde and cyanoborohydride (as described by Means and Feeney, Biochemistry 2 / (1968), 2192-2201).

De endosoom-fractie dient vóór gebruik tenminste éénmaal, bij voorkeur ook niet vaker, in bevroren toestand te zijn gebracht, bij voorkeur door middel van een snelle invriesstap in vloeibare stikstof bij een temperatuur van -196°C. De hierna ontdooide endosomale blaasjes bezitten door deze vries-ontdooi stap een voldoende geperforeerde wand om direct contact mogelijk te maken tussen de eiwitsplitsende enzymen binnen in de endosomen en antigeen dat aan deze endosomen van buitenaf wordt toegevoegd.The endosome fraction should be frozen at least once, preferably not more often, before use, preferably by a rapid freezing step in liquid nitrogen at a temperature of -196 ° C. The thawed endosomal vesicles have a sufficiently perforated wall through this freeze-thaw step to allow direct contact between the protein-splitting enzymes within the endosomes and antigen added to these endosomes from the outside.

De processing van het antigeen vindt plaats in een suspensie van deze geperforeerde endosomen. De suspensie bestaat uit een hoeveelheid endosomen (0,1-50 mg/ml) in een buffer van 10-500 mM natrium-acetaat/azijnzuur pH 2-6, bij voorkeur 50-150 mM natrium-acetaat/azijnzuur pH 4-5. Hieraan wordt een hoeveelheid van het antigeen toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,1-50 mg/ml, waarna het mengsel bij een temperatuur tussen 10-50°C, bij voorkeur tussen 35-40°C, wordt geïncubeerd. Na enige tijd tussen 0 en 24 uur, afhankelijk van het antigeen en de gewenste graad van afbraak, kan de processing worden beëindigd. Deze beëindiging kan op verschillende manieren worden gerealiseerd, bijvoorbeeld door het verhogen van de pH tot een waarde boven pH 6, het toevoegen van organische oplosmiddelen ter precipitatie van eiwitmateriaal, het verlagen van de temperatuur of het toevoegen van chemische verbindingen, die de eiwitsplitsende enzymen remmen in hun werking. De eiwitfragmenten, afkomstig van het antigeen, kunnen hierna volgens algemeen bekende methoden en technieken worden geanalyseerd en gezuiverd.The antigen is processed in a suspension of these perforated endosomes. The suspension consists of an amount of endosomes (0.1-50 mg / ml) in a buffer of 10-500 mM sodium acetate / acetic acid pH 2-6, preferably 50-150 mM sodium acetate / acetic acid pH 4-5 . An amount of the antigen is added to this to a final concentration of 0.1-50 mg / ml, after which the mixture is incubated at a temperature between 10-50 ° C, preferably between 35-40 ° C. After some time between 0 and 24 hours, depending on the antigen and the desired degree of degradation, processing can be terminated. This termination can be accomplished in various ways, for example by raising the pH to a value above pH 6, adding organic solvents to precipitate protein material, lowering the temperature, or adding chemical compounds that inhibit the protein-splitting enzymes in their operation. The protein fragments from the antigen can then be analyzed and purified by well known methods and techniques.

2.Het verkrijgen van anticeenfragmenten door een milde behandeling met een asoaraginezuur-proteinase2. Obtaining Anticene Fragments by Mild Treatment with an Asoic Acid Proteinase

Voor het processen van een antigeen door middel van een milde behandeling met een asparaginezuur-proteinase, bij voorkeur cathepsine D, dient het antigeen te worden opgenomen in een buffer van 10-500 mM natriumacetaat/azijnzuur pH 2-6, bij voorkeur 50-150 mM natriumacetaat/azijnzuur pH 4-5. De antigeenconcentratie in deze buffer dient 0,1-10 mg/ml te bedragen, bij voorkeur 1-3 mg/ml. Hieraan wordt het asparaginezuur-proteinase, bij voorkeur cathepsine D, toegevoegd tot een concentratie van 0,001-10 mg/ml waarna het mengsel bij 10-50°C, bij voorkeur bij 35-40°C, wordt geïncubeerd. Na enige tijd tussen 0 en 24 uur, afhankelijk van het antigeen en de gewenste graad van afbraak, kan de processing worden beëindigd. Deze beëindiging kan op zeer veel verschillende manieren plaatsvinden (zie hierboven). De eiwitfragmenten, afkomstig van het antigeen, kunnen hierna volgens algemeen bekende methoden en technieken worden geanalyseerd en gezuiverd.To process an antigen by mild treatment with an aspartic proteinase, preferably cathepsin D, the antigen should be incorporated into a buffer of 10-500 mM sodium acetate / acetic acid pH 2-6, preferably 50-150 mM sodium acetate / acetic acid pH 4-5. The antigen concentration in this buffer should be 0.1-10 mg / ml, preferably 1-3 mg / ml. To this the aspartic proteinase, preferably cathepsin D, is added to a concentration of 0.001-10 mg / ml after which the mixture is incubated at 10-50 ° C, preferably at 35-40 ° C. After some time between 0 and 24 hours, depending on the antigen and the desired degree of degradation, processing can be terminated. This termination can take place in many different ways (see above). The protein fragments from the antigen can then be analyzed and purified by well known methods and techniques.

3. Amlnozuurvolgordes van enkele tot nu .toe, bepaalde processingsoroducten 1. van potvis myoglobine:3. Amino acid sequences from some to date, certain processing products 1. of sperm whale myoglobin:

Alais-Lys-Val-Glu-Ala-Asp-Val-Ala-Gly-His-Gly-Gln-Asp-Ile-Alais-Lys-Val-Glu-Ala-Asp-Val-Ala-Gly-His-Gly-Gln-Asp-Ile-

LeU29LeU29

Ileii2”His-Val-Leu-His-Ser-Arg-His-Pro-Gly-Asp-Phe-Gly-Ileii2 ”His-Val-Leu-His-Ser-Arg-His-Pro-Gly-Asp-Phe-Gly-

Ala-Asp-Ala-Gln-Gly-Ala-Met-Asn-Lys-Ala-Leu-Glu-Leui37Ala-Asp-Ala-Gln-Gly-Ala-Met-Asn-Lys-Ala-Leu-Glu-Leui37

Phei38-Arg-Lys-Asp-*Ile-Ala-Ala-Lys-Tyr-Lys-Glu-Leu-Gly-Phei38-Arg-Lys-Asp- * Ile-Ala-Ala-Lys-Tyr-Lys-Glu-Leu-Gly-

Tyr-Gln-Glyi53 N.B. fragment 138-153 bevat de C-terminus van myoglobine: Gly-153.Tyr-Gln-Glyi53 N.B. fragment 138-153 contains the C-terminus of myoglobin: Gly-153.

2. van duive cytochroom c:2. from pigeon cytochrome c:

Leugg-Glu-Asn-Pro-Lys-Lys-Tyr-Ile-Pro-Gly-Thr-Lys-Met-Ile-Leugg-Glu-Asn-Pro-Lys-Lys-Tyr-Ile-Pro-Gly-Thr-Lys-Met-Ile-

Phee2Phee2

Ala83~Gly-Ile-Lys-Lys-Lys-Ala-Glu-Arg-Ala-Asp-Leu-Ile-Ala-Ala83 ~ Gly-Ile-Lys-Lys-Lys-Ala-Glu-Arg-Ala-Asp-Leu-Ile-Ala-

Tyr97Tyr97

Leu98“Lys-Gln-Ala-Thr-Ala-Lysi04 N.B. fragment 98-104 bevat de C-terminus van cytochroom c: Lys-104. Ook het fragment 83-104 wordt als processingsproduct aangetroffen.Leu98 “Lys-Gln-Ala-Thr-Ala-Lysi04 N.B. fragment 98-104 contains the C-terminus of cytochrome c: Lys-104. The fragment 83-104 is also found as a processing product.

3. van runder cytochroom c:3. from bovine cytochrome c:

Leu68~Glu-Asn-Pro-Lys-Lys-Tyr-Ile-Ile-Pro-Gly-Lys-Met-Ile-Leu68 ~ Glu-Asn-Pro-Lys-Lys-Tyr-Ile-Ile-Pro-Gly-Lys-Met-Ile-

Phee2Phee2

Alae3-Gly-Ile-Lys-Lys-Lys-Gly-Glu-Arg-Glu-Asp-Leu-Ile-Ala-Alae3-Gly-Ile-Lys-Lys-Lys-Gly-Glu-Arg-Glu-Asp-Leu-Ile-Ala-

Tyr97Tyr97

Leu98~Lys-Lys-Ala-Thr-Asn-Gluio4 N.B. fragment 98-104 bevat de C-terminus van cytochroom c: Glu-104. Ook het fragment 83-104 wordt als processingsproduct aangetroffen.Leu98 ~ Lys-Lys-Ala-Thr-Asn-Gluio4 N.B. fragment 98-104 contains the C-terminus of cytochrome c: Glu-104. The fragment 83-104 is also found as a processing product.

4. van runder serum albumine: Tyr354-Glu-Tyr-Ser-Arg-Arg-His-Pro-Glu-Tyr-Ala-Val-Ser-From bovine serum albumin: Tyr354-Glu-Tyr-Ser-Arg-Arg-His-Pro-Glu-Tyr-Ala-Val-Ser-

Val-Leu368Val-Leu368

Val43i-Arg-Tyr-Thr-Arg-Lys-Val~Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Pro-Val43i-Arg-Tyr-Thr-Arg-Lys-Val ~ Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Pro-

Thr-Leu445 5. van elongatie factor Tu uit Escherichia coli;Thr-Leu445 5. of elongation factor Tu from Escherichia coli;

Seri-Lys-Glu-Lys-Phe-Glu-Arg-Thr-Lys-Pro-His-Val-Asn-Val-Seri-Lys-Glu-Lys-Phe-Glu-Arg-Thr-Lys-Pro-His-Val-Asn-Val-

Gly-Thr-Ile-Gly-His-Val-Asp-His-Gly-Lys-Thr-Thr-Leu-Thr-Gly-Thr-Ile-Gly-His-Val-Asp-His-Gly-Lys-Thr-Thr-Leu-Thr-

Ala-Ala-Ile-Thr-Thr-Val-Leu35Ala-Ala-Ile-Thr-Thr-Val-Leu 35

Ser3i2-Lys-Asp-Glu-Gly-Gly-Arg-His-Thr-Pro-Phe-Phe-Lys-Gly-Tyr-Arg-P ro-Gln-Phe-Tyr33i N.B. fragment 1-35 bevat de N-terminus van de elongatie factor Tu.Ser3i2-Lys-Asp-Glu-Gly-Gly-Arg-His-Thr-Pro-Phe-Phe-Lys-Gly-Tyr-Arg-P ro-Gln-Phe-Tyr33i NB fragment 1-35 contains the N-terminus of the elongation factor Tu.

De vijf sequenties die verder van belang zijn, zijn die welke de C-terminale begrenzing vormen van de knipplaatsen die leiden tot de hiervoor vermelde processingsproducten, maar zelf niet in een vrijgekomen peptide aanwezig zijn. Deze sequenties, waarvan hier de eerste vijf aminozuren zijn gegeven,, dragen bij tot de vermelde inzichten in het patroon van aminozuren dat kennelijk tijdens processing wordt herkend en leidt tot een verhoogde kans op knippen, in myoglobine volgend op het bij processing losgeknipte fragment 15-29:The five sequences of further interest are those that form the C-terminal boundary of the cleavage sites leading to the aforementioned processing products, but are not themselves present in a released peptide. These sequences, the first five amino acids of which are given here, contribute to the reported insights into the amino acid pattern that is apparently recognized during processing and leads to an increased probability of cutting, in myoglobin following the fragment cut out during processing. 29:

Ile-Arg-Leu-Phe-Lys in runder serum albumine, volgend op fragment 353-368: Leu-Arg-Leu-Ala-Lys idem, volgend op fragment 431-445:Ile-Arg-Leu-Phe-Lys in bovine serum albumin, following fragment 353-368: Leu-Arg-Leu-Ala-Lys ditto, following fragment 431-445:

Val-Glu-Val-Ser-Arg in elongatie factor Tu, volgend op fragment 1-35:Val-Glu-Val-Ser-Arg in elongation factor Tu, following fragment 1-35:

Ala-Lys-Thr-Tyr-Gly idem, volgend op fragment 312-331:Ala-Lys-Thr-Tyr-Gly ditto, following fragment 312-331:

Phe-Arg-Thr-Thr-AspPhe-Arg-Thr-Thr-Asp

Hetzelfde geldt voor sequenties die de N-terminale begrenzing vormen van de processingsproducten, maar zelf niet in een vrijgekomen peptide teruggevonden worden; van deze sequenties zijn telkens de twee C-terminale residuen gegeven. myoglobine, voorafgaand aan 15-29: Val-Trp idem, voorafgaand aan 112-137: Ala-Ile duive cytochroom c, voorafgaand aan 68-82: Glu-Tyr runder cytochroom c, voorafgaand aan 68-82: Glu-Tyr serum albumine, voorafgaand aan 354-368: Phe-Leu idem, voorafgaand aan 431-445: Leu-Ile elongatie factor Tu, voorafgaand aan 312-331: Ile-LeuThe same applies to sequences that form the N-terminal boundary of the processing products, but are not themselves found in a released peptide; the two C-terminal residues of each of these sequences are given. myoglobin, prior to 15-29: Val-Trp ditto, prior to 112-137: Ala-Ile pigeon cytochrome c, prior to 68-82: Glu-Tyr bovine cytochrome c, prior to 68-82: Glu-Tyr serum albumin , prior to 354-368: Phe-Leu idem, prior to 431-445: Leu-Ile elongation factor Tu, prior to 312-331: Ile-Leu

Claims

1. Modified or unmodified (eg glycosylated) peptide of at least 7 amino acid residues in length, characterized in that the amino-terminal portion comprises an agretope sequence / wherein, viewed from the amino-terminal end, the first amino acid is a hydrophobic amino acid selected from proline, alanine, methionine, tyrosine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine, cysteine and tryptophan, the second amino acid is glycine or a charged amino acid selected from aspartic acid, glutamic acid, histidine, lysine and arginine , and the fifth amino acid is a charged amino acid selected from aspartic acid, glutamic acid, histidine, lysine and arginine.

Peptide according to claim 1, characterized in that, viewed from the amino-terminal end, the fifth amino acid is a charged amino acid selected from histidine, lysine and arginine.

Peptide according to claim 1 or 2, characterized in that, viewed from the amino-terminal end, the second amino acid is a charged amino acid selected from histidine, lysine and arginine.

Peptide according to any one of claims 1 to 3, characterized in that, viewed from the carboxy-terminal end, the first and second amino acids are a hydrophobic amino acid selected from proline, alanine, methionine, tyrosine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine, cysteine and tryptophan.

Peptide according to claim 4, characterized in that, viewed from the carboxy-terminal end, the first amino acid is a hydrophobic amino acid selected from leucine, phenylalanine, tyrosine and tryptophan.

Peptide according to any one of claims 1 to 5, characterized in that it comprises 7-40 amino acid residues.

Peptide according to any one of claims 1 to 6, characterized in that it corresponds to a protein fragment which can be released from a protein by one or more proteases involved in the processing of antigens in antigen presenting cells.

Peptide according to claim 7, characterized in that it corresponds to a protein fragment which can be released from a protein by the protease cathepsin D involved in the processing of antigens in antigen presenting cells.

Peptide according to claim 7 or 8, characterized in that the amino-terminal agretope sequence in the first, second and / or fifth amino acid, when viewed from the amino-terminal end, differs from the sequence occurring in the natural protein fragment.

Peptide according to any one of claims 7-9, characterized in that it comprises one or more additional agretope sequences compared to the natural protein fragment.

A peptide according to any one of claims 7-10, characterized in that it is expanded with one or more B cell epitopes compared to the natural protein fragment.

Protein construct, characterized in that it contains at least one fragment on which a B cell epitope is located, and contains at least one fragment corresponding to a peptide according to any one of claims 1-11, wherein the the agretope sequence located at the amino-terminal end of the latter fragment connects to two hydrophobic amino acids, each selected from proline, alanine, methionine, tyrosine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine, cysteine and tryptophan.

Protein construct, characterized in that it substantially corresponds to a naturally occurring, modified or unmodified protein, but differs in that one or more recognition sequences are of a protease involved in the processing of antigens in antigen-presenting cells removed, changed or added.

A method for preparing modified or unmodified (e.g. glycosylated) peptides, which may be suitable for activating T cells, characterized in that a protein is exposed in vitro to one or more in the processing of antigens in antigen presenting cells involved proteases.

A method of preparing modified or unmodified (e.g. glycosylated) peptides, which may be suitable for activating T cells, characterized in that a protein is exposed in vitro to the processing of antigens in antigen presenting cells involved protease cathepsin D.

A method of preparing modified or unmodified (e.g. glycosylated) peptides, which may be suitable for activating T cells, characterized in that a protein is exposed in vitro to cells isolated from antigen presenting and accessible endosomes.

Preparation for eliciting an immune response in mammals, characterized in that as an immunogen or as an immunostimulating adjuvant one or more peptides according to any one of claims 1-11, or one or more protein constructs according to any one of claims 12-13.