NL8802294A

NL8802294A - METHOD FOR ACTIVATING NODULATION PROMOTERS OF RHIZOBIUM BACTERIA.

Info

Publication number: NL8802294A
Application number: NL8802294A
Authority: NL
Original assignee: Univ Leiden
Priority date: 1988-09-16
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1990-04-17
Also published as: WO1990002805A1

Description

Werkwijze voor het activeren van nodulatiepromotoren van Rhizobium-bacteriënMethod for activating nodulation promoters of Rhizobium bacteria

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het activeren van nodulatiepromotoren van Rhizobium-, Bradyrhizobium- en verwante bacteriën. Bacteriën van het genus Rhizobium, die in symbiose kunnen leven met bepaalde vlinderbloemige planten, dringen de wortels van die planten binnen en induceren daar de vorming van knolletjes, waarin atmosferische stikstof wordt gefixeerd. Elke bacteriesoort is beperkt tot een specifieke groep gastheerplanten (cross-inoculatiegroep). Recentelijk is R.japonicum, een economisch belangrijke Rhizobium-soort, afgesplitst van het geslacht Rhizobium , en heet nu Bradyrhizobium japonicum. Echter, als in de onderhavige tekst wordt gesproken over Rhizobium-bacteriën, wordt daarmee bedoeld Rhizobium, Bradyrhizobium of verwante bacteriën. Verscheidene nodulatie (nod)genen, die het gast-heerbereik bepalen, zijn geïdentificeerd. In tegenstelling tot deze zogenaamde gastheerspecifieke nod genen, zijn de vijf nod genen ABCIJ, die één operon vormen, functioneel verwisselbaar tussen de verschillende Rhizobium-species. Laatstgenoemde genen worden algemene (common) nod genen genoemd. Zowel de algemene als de gastheerspecif ieke nod genen worden volgens de huidige inzichten op het transcriptieniveau als één regulon gereguleerd, waarbij het (de) constitutief gevormde nodD produkt(en) als (een) positieve regulator(en) optreedt/optreden. Het genoemde nod regulon wordt slechts overgeschreven in aanwezigheid van een inducer ("aahschakel-stof") welke door de wortels van de gastheerplanten wordt geëxudieerd.The invention relates to a method for activating nodulation promoters of Rhizobium, Bradyrhizobium and related bacteria. Bacteria of the genus Rhizobium, which can live in symbiosis with certain leguminous plants, penetrate the roots of those plants and induce the formation of tubers in which atmospheric nitrogen is fixed. Each bacterial species is limited to a specific group of host plants (cross-inoculation group). Recently, R.japonicum, an economically important Rhizobium species, has been spun off from the genus Rhizobium, and is now called Bradyrhizobium japonicum. However, when the present text speaks of Rhizobium bacteria, it means Rhizobium, Bradyrhizobium or related bacteria. Several nodulation (nod) genes, which determine the host range, have been identified. In contrast to these so-called host-specific nodes, the five nodes ABCIJ, which form one operon, are functionally interchangeable between the different Rhizobium species. The latter genes are called general (common) nodes. According to current insights at the transcription level, both the general and the host-specific nodes are regulated as one regulon, with the constitutionally formed nodD product (s) acting as (a) positive regulator (s). The said nod regulon is only transcribed in the presence of an inducer ("switch-on agent") which is exuded by the roots of the host plants.

De in deze exudaten gevonden inducers zijn geïdentificeerd als flavonoiden (o.a. flavonen,flavanonen, isoflavonen) of nauw verwante verbindingen. Hoewel de nodD produkten van de snel groeiende Rhizobia R.leguminosarum, R. trifolii en R.meliloti, welke laatste drie kopieën van het nodD gen bevat, in hoge mate homoloog zijn, en betrekkelijk algemeen zijn wat betreft hun vermogen heterologe induceerbare nod promotoren te activeren, verschillen zij nogal in een aantal andere eigenschappen, (i) Zij reageren verschillend op verschillende flavonoiden of exudaten, wat de basis vormt van de gastheerspecifieke eigenschappen van het nodD gen. (ii). In overigens isogene bacteriën is het maximale niveau van de nod gen inductie belangrijk lager in aanwezigheid van het R.meliloti nodDI gen dan in aanwezighdid van het R.leguminosarum of R.trifolii nodP gen. Naast inducers zijn thans ook anti-inducers bekend, die een remmende werking op de inductie van de transcriptie van induceerbare nod-promotoren uitoefenen. Onder deze verbindingen bevinden zich onder andere flavonoiden, coumarines en verbindingen zoals acetosyringon. Opgemerkt moet worden <fet een activator van een bepaald nodP produkt als anti-inducer van een ander nodP produkt kan optreden. Pit gedrag wordt bepaald door de eigenschappen van het nodP produkt.The inducers found in these exudates have been identified as flavonoids (including flavones, flavanones, isoflavones) or closely related compounds. Although the nodD products of the rapidly growing Rhizobia R. leguminosarum, R. trifolii and R. meliloti, containing the last three copies of the nodD gene, are highly homologous, and are relatively common in their ability to induce heterologous inducible nod promoters. they differ quite a few in some other properties, (i) They respond differently to different flavonoids or exudates, which is the basis of the host-specific properties of the nodD gene. (ii). In otherwise isogenic bacteria, the maximum level of the nod gene induction is significantly lower in the presence of the R. meliloti nodDI gene than in the presence of the R. leguminosarum or R.trifolii nodP gene. In addition to inducers, anti-inducers are now also known which exert an inhibitory effect on the induction of the transcription of inducible nod promoters. These compounds include flavonoids, coumarins and compounds such as acetosyringone. It should be noted that an activator of a particular nodP product can act as an anti-inducer of another nodP product. Pit behavior is determined by the properties of the nodP product.

Een verdere succesvolle toepassing van inoculatie met Rhizobium-bacteriè'n wordt sterk belemmerd omdat de voor inoculatie gebruikte stammen , met goede symbiotische eigenschappen , de competitie met reeds in de bodem aanwezige Rhizobium-bacteriën veelal verliezen waardoor deze laatsten, met inferieure symbiotische eigenschappen, meestal de wortelknol bevolken. Naast pogingen om het stikstof-fixerend vermogen en het gastheerbereik te beïnvloeden en zo mogelijk te verbeteren is veel onderzoek dan ook gericht op verbetering van het competitief vermogen.A further successful application of inoculation with Rhizobium bacteria is strongly hindered because the strains used for inoculation, with good symbiotic properties, often lose competition with Rhizobium bacteria already present in the soil, so that the latter, with inferior symbiotic properties, usually populate the root tuber. In addition to attempts to influence and, if possible, improve the nitrogen-fixing capacity and the host range, much research is aimed at improving the competitive capacity.

Gevonden is nu,dat de gastheerspecifieke eigenschappen van nodP produktoi ei de regulatie van de hoeveelheden waarin de induceerbare nod-gen-produkten aangemaakt worden,veranderd kunnen worden door hybriden tussen nodP genen te maken.It has now been found that the host-specific properties of nodP product and the regulation of the amounts in which the inducible nod gene products are produced can be altered by making hybrids between nodP genes.

Pe uitvinding heeft derhalve betrekking op een werkwijze voor het activeren van nodulatie promotoren van Rhizobium-bacteriën , waarbij men in de bacterie een PNA fragment introduceert dat identiek is aan, afgeleid is van of omvat een hybride nodP gen dat verkregen kan worden door recomibinatie tussen nodP genen van Rhizobium of verwante bacteriën. Onder de gemaakte hybriden kan dan gezocht worden naar stammen met nodP produkten die nieuwe combinaties van ouderlijke eigenschap^· pen hebben of die nieuwe eigenschappen bezitten . Zo zijn hybriden gevonden die inducerend werken met stoffen, waarmee de ouderlijke nodP produkten niet induceren. Peze stoffen kunnen flavonoiden , eoumarinen of andere stoffen zijn. Sommige van de hybriden leiden tot een breder gastheerbereik, een verbeterde stikstoffixatie en tot een verbeterd vermogen tot competitie.The invention therefore relates to a method for activating nodulation promoters of Rhizobium bacteria, in which a PNA fragment is introduced into the bacterium which is identical to, derived from or comprises a hybrid nodP gene which can be obtained by recombination between nodP genes of Rhizobium or related bacteria. Strains with nodP products which have new combinations of parental properties or which have new properties can then be searched among the hybrids made. For example, hybrids have been found that induce substances that do not induce parental nod products. These substances can be flavonoids, eoumarins or other substances. Some of the hybrids lead to a wider host range, improved nitrogen fixation, and improved ability to compete.

Eén klasse van nodD produkten kon de nodulatiepromotoren van Rhizobia maximaal induceren in de afwezigheid van inducers. Dit maximale activeringsniveau blijkt niet te worden beïnvloed door de aanwezigheid van inducers of anti-inducers. Deze specifieke nodD hybride genen worden hierin aangeduid als nodD FITA (Flavonoid Independent Transcription Activation) genen. Verrassenderwijs is voorts gevonden, dat deze nodD FITA genen, in gebouwd in Rhizobia,een verbetering gevai ten opzichte van de wild-type nodD genen , omdat zij een breder gastheerbereik hebben, en een betere stikstoffixatie geven.One class of nodD products was able to induce Rhizobia nodulation promoters to the maximum in the absence of inducers. This maximum activation level does not appear to be influenced by the presence of inducers or anti-inducers. These specific nodD hybrid genes are referred to herein as nodD FITA (Flavonoid Independent Transcription Activation) genes. Surprisingly, it has also been found that these nodD FITA genes, built in Rhizobia, improve on the wild-type nodD genes because they have a wider host range, and provide better nitrogen fixation.

Voorbeelden van hybride nodD genen die bovengenoemde resultaten geven en derhalve bij voorkeur bij de werkwijze volgens de uitvinding worden gebruikt, zijn hybride nodD genen die gedeelten van het nodD gen van R.trifolii en van het nodDl gen van R.meliloti omvatten, waarbij het van R. trifolii afkomstige deel zich aan het 5' uiteinde bevindt mmaxinaaL 45 % van de nucleotiden van het hybride gen omvat, of het van R.meliloti afkomstige deel zich aan het 5' uiteinde bevindt en 40-80% van de nucleotiden van het hybride, gen omvat.Examples of hybrid nodD genes which give the above results and are therefore preferably used in the method according to the invention are hybrid nodD genes which comprise parts of the nodD gene of R.trifolii and of the nodD1 gene of R.meliloti, wherein the R. trifolii-derived portion is at the 5 'end by means of 45% of the nucleotides of the hybrid gene, or the R.meliloti-derived portion is at the 5' end and 40-80% of the nucleotides of the hybrid , gene.

De bij de werkwijze toegepaste hybridegenen kunnen worden verkregen door in vivo homologe recombinatie tussen de genoemde nodD genen op een wijze zoals beschreven door Tommassen et al. (1985) EMBO J., 4, 1583-1587 . Daartoe zijn de plasmiden pMPbOO en pMP800 geconstrueerd (Fig.1). Deze plasmiden van de IncP-klasse bevatten het nodD gen van R. trifolii stam ANU843 en het nodDl gen van R. meliloti stam 2011 in tandem, meteen unieke EcoRI restrictieplaats en het gen dat codeert voor chlooramfenicol-acetyl-transferase (CAT) tussen deze twee genen. Homologe recombinatie tussen de in tandem gelegen nodD genen leidt tot plasmiden die een hybride nodD gen bevatten en niet langer de EcoRI restrictieplaats en het eat-gen. EcoRI behandeling van de plasmide preparaten , gevolgd door transformatie, selecteert derhalve op plasmiden die hybride nodD genen bevatten.The hybrid genes used in the method can be obtained by in vivo homologous recombination between said nodD genes in a manner as described by Tommassen et al. (1985) EMBO J., 4, 1583-1587. To this end, the plasmids pMPbOO and pMP800 have been constructed (Fig. 1). These IncP class plasmids contain the nodD gene of R. trifolii strain ANU843 and the nodD1 gene of R. meliloti strain 2011 in tandem, with a unique EcoRI restriction site and the gene encoding chloramphenicol acetyl transferase (CAT) between these two genes. Homologous recombination between the tandD nodD genes leads to plasmids containing a hybrid nodD gene and no longer the EcoRI restriction site and the eat gene. EcoRI treatment of the plasmid preparations, followed by transformation, therefore selects for plasmids containing hybrid nodD genes.

Een reeks van 94 hybride nodD genen, die een promotor-terminaal gedeelte van het R.meliloti nodDl gen bevatten en een reeks van 40 hybride nodD genen die de promotor-terminale rest van het R.trifolii nodD gen bevatten, werd verkregen. Alle hybriden werden kwalitatief getest met een aantal stoffen en aan de hand hiervan in een aantal groepen ingedeeld . De nodD hybriden met een 5' deel afgeleid van R.meliloti nodD konden verdeeld worden in 8 klassen, de hybriden met een 5'-deel afgeleid van R.trifolii nodD konden in 6 klassen worden verdeeld. Daarnaast werd de recombinatie-plaats in alle nodD hybriden bepaald met behulp van restrictieenzym-analyse, waarbij de vertegenwoordigers van de klassen, als boven beschreven, hun recombinatieplaatsen dicht bij elkaar hadden liggen. De recombinatieplaats van tenminste één vertegenwoordiger van elke klasse werd exact bepaald door het bepalen van de nucleotidesequentie. In figuur 2 zijn de posities van deze recombinatieplaatsen aangegeven tezamen met de bekende afgeleide proteinesequenties van zowel het R. trifolii nodD als het R. meliloti nodD1 gen. Niet-geconserveerde aminozuren zijn in rechthoeken aangegeven. Fusieplaatsen van de verkregen hybride nodD proteïnen zijn aangegeven mé^pijlen die de aard van de recombinatie aangeven. De aanduiding van de hybride genen is vermeld onder de homologe nucleotidesequentie waar recombinatie optrad. De resultaten laten zien dat recombinatie is opgetreden in homologe gebieden van tenminste 4 nucleotiden. In geen van de onderzochte hybdride nodD genen werden deleties, duplicaties of multiple cross-overs waargenomen.A set of 94 hybrid nodD genes containing a promoter terminal portion of the R.meliloti nodD1 gene and a set of 40 hybrid nodD genes containing the promoter terminal moiety of the R.trifolii nodD gene were obtained. All hybrids were tested qualitatively with a number of substances and divided into a number of groups. The nodD hybrids with a 5 'part derived from R.meliloti nodD could be divided into 8 classes, the hybrids with a 5' part derived from R.trifolii nodD could be divided into 6 classes. In addition, the recombination site in all nodD hybrids was determined by restriction enzyme analysis, with the class representatives, as described above, having their recombination sites close together. The recombination site of at least one representative of each class was precisely determined by determining the nucleotide sequence. In Figure 2, the positions of these recombination sites are indicated along with the known derived protein sequences of both the R. trifolii nodD and the R. meliloti nodD1 gene. Unconserved amino acids are shown in rectangles. Fusion sites of the obtained hybrid nodD proteins are indicated by arrows indicating the nature of the recombination. The designation of the hybrid genes is listed under the homologous nucleotide sequence where recombination occurred. The results show that recombination has occurred in homologous regions of at least 4 nucleotides. Deletions, duplications or multiple crossovers were not observed in any of the hybrid nodD genes studied.

Het vermogen van de hybridegenen de induceerbare R. leguminosarum nodABCIJ promotor te activeren werd kwantitatief bepaald.al dan niet in aanwezigheid van luteoline, een flavonoide dat een goede activator van de nodD produkten van zowel R. meliloti als R, trifolii is. De activiteit van de nodABCIJ promotor, gemeten als ^-galactosidase activiteit, wordt weergegeven als functie van de positie van de recombinatieplaats in figuur 3. De met de nodD oudergenen verkregen resultaten worden aan beide uiteinden van de diagrammen gegeven . Open en gearceerde staven, waarvan de breedte willekeurig is , geven de gemeten hoeveelheid 1^-galactosidase aan , respectievelijk bij aanwezigheid en in afwezigheid van het flavonoide.The ability of the hybrid genes to activate the inducible R. leguminosarum nodABCIJ promoter was quantitated whether or not in the presence of luteolin, a flavonoid which is a good activator of the nodD products of both R. meliloti and R. trifolii. The activity of the nodABCIJ promoter, measured as β-galactosidase activity, is shown as a function of the position of the recombination site in Figure 3. The results obtained with the nodD parent genes are given at both ends of the diagrams. Open and shaded bars, the width of which is arbitrary, indicate the measured amount of 1-galactosidase in the presence and absence of the flavonoid, respectively.

De resultaten laten zien dat de hybride nodD genen sterk verschillen in twee opzichten: (i) de mate van activering van de transcriptie bij afwezigheid van een flavonoid inducer, en (ii)de mate van activering van de transcriptie in aanwezigheid van luteoline. De hybriden volgens de uitvinding met een van R.meliloti afkomstig gedeelte van 40-80% en bij voorkeur 60-75% , vertegenwoordigd door de hybriden nodD635, nodD604, nodD612 en nodD640, activeren de nodABCIJ promotor reeds tot het maximaal waargenomen niveau bij afwezigheid van een inducer. Dit niveau wordt niet beïnvloed door de aanwezigheid van luteoline.The results show that the hybrid nodD genes differ widely in two respects: (i) the degree of transcription activation in the absence of a flavonoid inducer, and (ii) the degree of transcription activation in the presence of luteolin. The hybrids according to the invention with a proportion of 40-80% and preferably 60-75% from R. meliloti, represented by the hybrids nodD635, nodD604, nodD612 and nodD640, already activate the nodABCIJ promoter in the absence state from an inducer. This level is not affected by the presence of luteolin.

Ook werd gevonden cht de nodD FITA stammen de induceerbare promotor konden blijven activeren in aanwezigheid van verbindingen die met ouderlijke nodD’s niet of nauwelijks als inducers, en mogelijk zelfs als anti-inducers,kunnen optreden.It was also found that the nodD FITA strains could continue to activate the inducible promoter in the presence of compounds that can hardly or not act as inducers with parental nodDs, and possibly even as anti-inducers.

Daartoe werden de volgende stoffen gebruikt ·: (i) een aantal s al dan niet geglucolyseerde flavonoiden met een of meer hydroxy-of methoxygroepen. Geteste voorbeelden van zulke verbindingen zijn hesperitine, sakuranetine, scutellareine, 5-hydroxyflavon ,naringine, taxifoline, galangine, morine en 6,7,4’-trihydroxyisoflavon en (ii) een groep verbindingen waarvan bekend is dat ze als anti-inducers op kunnen treden met de ouderlijke nodD produkten en wel: isoferulinezuur, ferulióezuur, phloretine, coumarine, p-coumaarzuur , m-coumaarzuur , genisteine, daidzeine, genistine, umbelliferon, syringinezuur, syringaldehyde, sinapinezuur,aceto-syringon,formoncnetine .Ockmethanolextractèi vankLetiplaitenvanGlycine max., Vicia sativa , Trifolium repens en T. pratense hadden geen invloed op de activatie van induceerbare nod promotoren door nodD FITA.For this purpose, the following substances were used: (i) a number of s or non-glycolysed flavonoids with one or more hydroxy or methoxy groups. Tested examples of such compounds are hesperitin, sakuranetine, scutellarein, 5-hydroxyflavone, naringine, taxifoline, galangine, morine and 6,7,4'-trihydroxyisoflavone and (ii) a group of compounds known to act as anti-inducers enter with the parental need products and is: isoferulic acid, ferulic acid, phloretine, coumarin, p-coumaric acid, m-coumaric acid, genistein, daidzein, genistin, umbelliferone, syringic acid, syringaldehyde, sinapinic acid, formoncole-lecyltinocetinol acetyl. Vicia sativa, Trifolium repens and T.alkingse did not influence the activation of inducible nod promoters by nodD FITA.

Het hybride gen nodD604 werd vervolgens nog nader onderzocht in Rhizobium op activering van 6 induceerbare nod promotoren van R. leguminosarum,R. trifolii en R.meliloti.The hybrid gene nodD604 was then further investigated in Rhizobium for activation of 6 inducible nod promoters of R. leguminosarum, R. trifolii and R.meliloti.

De mate van activering door nodD604 werd vergeleken met het active-ringsniveau in aanwezigheid van de nodD(1) genen van deze soorten in aanwezigheid van het flavon luteoline, een algemene in-ducer voor al deze nodD genen. De resultaten ( tabel A) geven aan, dat nodD604 elke onderzochte nod promotor kan activeren bij afwezigheid van een inducer. Het activeringsniveau is tenminste even hoog, maar in de meeste gevallen hoger, dan het niveau dat wordt bereikt met elke promotor in aanwezigheid van het homologe nodD gen en luteoline. In dit opzicht lijkt het nodD604 gen op het R.trifolii nodD oudergen in de geïnduceerde situatie.The degree of activation by nodD604 was compared to the activation level in the presence of the nodD (1) genes of these species in the presence of the flavone luteoline, a common inducer for all these nodD genes. The results (Table A) indicate that nodD604 can activate any tested node promoter in the absence of an inducer. The activation level is at least as high, but in most cases higher, than the level achieved with each promoter in the presence of the homologous nodD gene and luteolin. In this regard, the nodD604 gene resembles the R.trifolii nodD parent in the induced situation.

Om de biologische consequenties van de nieuwe eigenschappen van dg nodD FITA genen te onderzoeken, werden nodD604 en als controle, de nodD genen van R. leguminosarum, R.trifolii en R.meliloti elk gemobiliseerd in een R.leguminosarum- en R. trifolii-stam waarin het wild type nodD was geïnactiveerd door een Tn5-insertie. Elk van de verkregen twee stellen van vier stammen werd vervolgens geinoculeerd op tenminste 15 plantesoorten behorend tot de eross-inociilatLegrDq) van de betreffende bacteriesoort.To investigate the biological consequences of the novel properties of dg nodD FITA genes, nodD604 and as control, the nodD genes of R. leguminosarum, R.trifolii and R.meliloti were each mobilized in R.leguminosarum and R.trifolii- strain in which the wild type nodD was inactivated by a Tn5 insert. Each of the obtained two sets of four strains was then inoculated to at least 15 plant species belonging to the eross inociilatLegrDq) of the respective bacterial species.

De resultaten , met vijf representatieve plantesoorten (tabel B) van elke cross-inoculatiegroep, laten zien dat vervanging van hetThe results, with five representative plant species (Table B) from each cross-inoculation group, show that replacement of the

Tabel ATable A

Expressie van induceerbare nod promotoren van verschillende Rhizobium-species al dan niet in aanwezigheid van luteoline met hybride of wild-type nodD genenExpression of inducible nod promoters from different Rhizobium species in the presence or absence of luteolin with hybrid or wild-type nodD genes

Gedoneerde nod promotor Relatief expressie-niveau met verschillende nodD genen bij van verschillende afwezigheid (-) of in aanwezigheid (+) van luteolineDonated nod promoter Relative expression level with different nodD genes of different absence (-) or in presence (+) of luteolin

Rhizobium-species hybride R.meliloti R.trifolii R.legumino-Rhizobium species hybrid R.meliloti R.trifolii R.legumino-

nodD604 nodDl nodP sarum nodPnodD604 nodDl nodP sarum nodP

- + - + + + pr.nodABCIJ 142 130 1.5 43 3 110 1 100 (R.leguminosarum) pr.nodABC 105 108 3 23 5 100 4 73 (R.trifolii ) pr.nodABC 287 271 11 100 16 286 19 200 (R.meliloti) pr.nodFE 253 227 11 27 11 227 9 100 (R.leguminosarum) pr.nodFE 102 98 2 14 5 100 3 30 (R.trifolii) pr.nodM 180 170 6 30 10 180 4 100 (R.leguminosarum) t- + - + + + pr.nodABCIJ 142 130 1.5 43 3 110 1 100 (R. leguminosarum) pr.nodABC 105 108 3 23 5 100 4 73 (R.trifolii) pr.nodABC 287 271 11 100 16 286 19 200 ( R.meliloti) pr.nodFE 253 227 11 27 11 227 9 100 (R.leguminosarum) pr.nodFE 102 98 2 14 5 100 3 30 (R.trifolii) pr.nodM 180 170 6 30 10 180 4 100 (R. leguminosarum) t

Tabel BTable B

Nodulatie van planten van verschillende cross-inoculatie-groepen door Rhizobium-stammen die hybride of wild-type nodD genen bevattenNodulation of plants of different cross-inoculation groups by Rhizobium strains containing hybrid or wild-type nodD genes

Nodulatiekenmerken en gemiddeld aantal knollen per genoduleerde plant met elk nodD genNodulation characteristics and average number of tubers per modulated plant with each nodD gene

Gebruikte Rhizobium hybride R.meliloti R.trifolii R.legurninosarumUsed Rhizobium hybrid R.meliloti R.trifolii R.legurninosarum

stammen en geteste plant nodD604 nodDl nodD nodDstrains and tested plant nodD604 nodDl nodD nodD

R.lequminosarua RBL5561R.lequminosarua RBL5561

Vicia sativa + (2) + (2) + (2) + (2) V.anQustifolium + (40) + (45) + (40) + (38) V. lathyroides + {5) - + (4) +(5)Vicia sativa + (2) + (2) + (2) + (2) V.anQustifolium + (40) + (45) + (40) + (38) V. lathyroides + {5) - + (4) + (5)

Lathyrus nissolia + (5) + (8) - + (3) V.vicoides + (7) +/-(1) +/-C2) + (8) R.trifolii ANU851Lathyrus nissolia + (5) + (8) - + (3) V.vicoides + (7) +/- (1) +/- C2) + (8) R.trifolii ANU851

Trifolium repens +(4) +(2) +(4) + (4) T.lappaceum + (3) + (3) + (3) + (3) T.leucanthum + (5) + (2) + (4) - T.scabrum + (3) · - + (2) + (4) T.arvense 1 + (12) - + (12) - R.trifolii ANU851 K.atropurpureum 2 + (6) - - ~Trifolium repens + (4) + (2) + (4) + (4) T.lappaceum + (3) + (3) + (3) + (3) T.leucanthum + (5) + (2) + ( 4) - T.scabrum + (3) - - + (2) + (4) T.arvense 1 + (12) - + (12) - R.trifolii ANU851 K.atropurpureum 2 + (6) - - ~

Lablab purpureus 2 + (4) - -Lablab purpureus 2 + (4) - -

Leucaena +/-(1) - - _ leucocephalum 2 l +, meer dan 80% van de planten genoduleerd; +/-, minder dan 20% van de planten genoduleerd; geen planten genoduleerd.Leucaena +/- (1) - - leucocephalum 2 l +, modulated over 80% of the plants; +/-, less than 20% of the plants modulated; no plants modulated.

* Identieke resultaten werden verkregen met T. pratense, T.campestre, T. angustifolium, T.pannonicum en T.squamosum.* Identical results were obtained with T.alkingse, T.campestre, T. angustifolium, T.pannonicum and T.squamosum.

2 .2.

Nodulatie werd beoordeeld 6 weken na infectie.Nodulation was assessed 6 weeks after infection.

oorspronkelijke nodD gen van elke soort door dat van een andere soort hun gastheerbereik verkleint. Men kan dan ook concluderen, dat de wild-type nodD genen passen bij hun eigen cross^-inoculat ie groep. Het nodD FITA gen daarentegen kan functioneren bij de nodulatie van elke onderzochte gastheerplant ( tabel B) . Het aantal knollen op elke plant met nodD604 was hetzelfde als met het wild-type nodD gen van de betreffende cross -inoculatiegroep en normale nodu-latiekinetiek werd waargenomen. Bovendien werden met de elektronenmicroscoop geen verschillen waargenomen in het aantal bacterioiden. Verrassenderwijs breidden zowel het nodD FITA gen als ook de nodD hybriden nodD 804,808, 812,807 en 815 het ïiodulatiebereik van nodD mutanten van snelgroeiende Rhizobia zelfs uit tot tropische vlinderbloemigen van de geslachten Macroptileum, Leucaena en Lablab, hoewel de gevormde knolletjes geen bacteroiden bevatten en geen stikstof fixeerden.native nodes of each species by that of another species narrows their host range. It can therefore be concluded that the wild-type nodD genes fit their own cross-inoculation group. The nodD FITA gene, on the other hand, can function at the nodulation of any host plant examined (Table B). The number of tubers on each plant with nodD604 was the same as with the wild-type nodD gene of the appropriate cross-inoculation group, and normal production kinetics were observed. In addition, no differences in the number of bacterioids were observed with the electron microscope. Surprisingly, both the nodD FITA gene and the nodD hybrids nodD 804,808, 812,807 and 815 even extended the range of nodD nodes of fast-growing Rhizobia to tropical legumes of the genera Macroptileum, Leucaena and Lablab, although the tubers formed contain no bacteroids and no nitrogen. fixed.

Om het stikstof fixerende vermogen van Rhizobium-soorten met een nodD FITA gen te bestuderen werden vertegenwoordigers van twee cross-inoculatiegroepen , Vicia sativa en Trifolium repens, geinoculeerd met de Rhizobium-stammen die het nodD604 gen , het nodD807gen, of de wild-type nodD genen bevatten, zoals gebruikt voor de proeven, ^an tabel B. De stikstoffixatie van de genoduleerde planten werd met tussenpozen gedurende 6 Weken gemeten. De resultaten ( fig. 4) geven aan , dat Rhizobium-stammen die het nodD FITA gen of het nodD807 gen bevatten althans een deel van de groeiperiode stikstof significant beter fixeren dan stammen die wild-type nodD genen bevatten .To study the nitrogen fixation potential of Rhizobium species with a nodD FITA gene, representatives of two cross-inoculation groups, Vicia sativa and Trifolium repens, were inoculated with the Rhizobium strains carrying the nodD604 gene, the nodD807 gene, or the wild-type nodD genes, as used for the experiments, in Table B. The nitrogen fixation of the modulated plants was measured intermittently for 6 weeks. The results (Figure 4) indicate that Rhizobium strains containing the nodD FITA gene or the nodD807 gene fix at least part of the growth period nitrogen significantly better than strains containing wild-type nodD genes.

Onder de nodD hybriden komen nieuwe klassen nodD genen voor die fenotypisch sterk verschillen van alle tot nu toe bekende wild-type nodD genen of gerapporteerde mutanten van nodD. De uitvinding heeft derhalve ook betrekking op een DNA-fragment dat identiek is aan, afgeleid is van , of omvat een hybride nodD gen, dat verkregen kan worden door homologe recombinatie tussen het nodD gen van R. trifolii en het nodD1 gen van R.meliloti.Vcorbeelckn v=n dergüLjke DN4-ffagmentenziji de hierin beschreven hybriden nodD 604, 612, 635, 640 , 804, 808, 812, 807 en 815.Among the nodD hybrids there are new classes of nodD genes that are phenotypically very different from all previously known wild-type nodD genes or reported nodD mutants. The invention therefore also relates to a DNA fragment which is identical to, derived from or comprises a hybrid nodD gene, which can be obtained by homologous recombination between the nodD gene of R. trifolii and the nodD1 gene of R. meliloti Examples of such DN4 fragments include the hybrids described herein, ND 604, 612, 635, 640, 804, 808, 812, 807, and 815.

Voorts heeft de uitvinding betrekkingjop alle plasmiden die een hierboven genoemd DNA-fragment bevatten, en op alle Rhizobium-staïïimen die zo’n fragment bevatten. Een Rhizobium-stam die het nodD604 gen, en een Rhizobium-stam die het nodD807 gen zoals hierin beschreven, bevat, is hierbij gedeponeerd bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS) in Baarn, respectievelijk onder nr. 559.88 en 560.88Furthermore, the invention relates to all plasmids containing an above-mentioned DNA fragment, and to all Rhizobium stains containing such a fragment. A Rhizobium strain containing the nodD604 gene, and a Rhizobium strain containing the nodD807 gene as described herein, are hereby deposited with the Central Bureau of Fungal Cultures (CBS) in Baarn under Nos. 559.88 and 560.88, respectively.

Rhizob ium-stammen , die een nodP FITA gen of een nodP gen van het 807 type volgens de uitvinding bevatten, vertoonden betere stikstof binding dan stammen die één van de ouder nodP genen bevatten. Pe uitvinding heeft derhalve ook betrekking op een werkwijze voor het verbeteren van het vermogen om stikstof te binden van nodulerende planten , waarbij het zaad of de plant in contact wordt gebracht met een Rhizobium-stam die een nodP FITA gen volgens de uitvinding bevat. Rhizobium stammen , die het nodP FITA gen volgens de uitvinding bevatten ,zijn niet gevoelig voor anti-inducers, terwijl op het zaad of in de bodem -voorkomende Rhizob ia dit wel zijn. De uitvinding heeft derhalve ook betrekking op het verbeteren van het competitief vermogen ten aanzien van in. de natuur voorkomende Rhizobium stammen , waarbij door de gelijktijdige toevoeging van Rhizobium stammen met een nodP FITA genen een anti-inducer voor van nature voorkomende Rhizobium stammen de laatsten wordt verhinderd te noduleren.Rhizobium strains containing a nodP FITA gene or a nodP gene of the 807 type of the invention showed better nitrogen binding than strains containing one of the parent nodP genes. The invention therefore also relates to a method of improving the nitrogen-binding ability of nodulating plants, wherein the seed or plant is contacted with a Rhizobium strain containing a nodP FITA gene of the invention. Rhizobium strains containing the nodP FITA gene according to the invention are not sensitive to anti-inducers, whereas Rhizobia is present on the seed or in the soil. The invention therefore also relates to improving the competitive ability with regard to in. naturally occurring Rhizobium strains, whereby the simultaneous addition of Rhizobium strains with a nodP FITA genes prevents an anti-inducer for naturally occurring Rhizobium strains from nodulating.

In het hierna volgende worden de gebruikte materialen en methoden uitvoeriger beschreven.The materials and methods used are described in more detail below.

BacteriestammenBacterial strains

Pe Rhizobium-stam LPR5045 is een Sym-plasmide-loos, tegen rifampicine resistent derivaat van RCR5 (Pl'asmid, 8, 73-82 , (1982)). Pe E.coli-stammen waren JM101 (Gene, 33, 103-119, (1985)) voor transformatie van bacteriofaag M13-derivaten en KMBL1164 (E.coli K12 del (lac-proAB) thi F ) voor alle andere doeleinden. Plasmiden met een breed gastheerbereik werden gemobiliseerd uit E. coli naar Rhizobium met behulp van pRK2013 als een helperplasmide (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7347-7351, (1980)). Selectie van transcon-juganten werd uitgevoerd op YMB-medium (J. Gen.Microbiol., (1977) , 98 , 477-484) onder toevoeging van 10 mg.l ^ chloor-amfenicol en 1 g.l * streptomycine (met IncQ-plasmiden) of -1 2 mg.l tetracycline ( met IncP-plasmiden) voor plasmideselectie -1 en 20 mg.l rifampicme voor selectie tegen E.coli. Om de activering van de transcriptie van de induceerbare R. leguminosarum nodABCIJ promotor als ^-galactosidase-activiteit te kunnen meten, werden IncP-plasmiden die nodD genen of hybride nodD genen bevatten, gemobiliseerd naar de stam LPR5045.pMP 154 (Nature, 328 , 337 - 340 (1987)) , die deze induceerbare promotor , gedoneerd voor het E.coli lacZ gen, bevat.The Rhizobium strain LPR5045 is a Sym plasmidless, rifampicin resistant derivative of RCR5 (Pl'asmid, 8, 73-82, (1982)). Pe E.coli strains were JM101 (Gene, 33, 103-119, (1985)) for transformation of bacteriophage M13 derivatives and KMBL1164 (E.coli K12 del (lac-proAB) thi F) for all other purposes. Plasmids with a broad host range were mobilized from E. coli to Rhizobium using pRK2013 as a helper plasmid (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7347-7351, (1980)). Selection of transconjugants was performed on YMB medium (J. Gen. Microbiol., (1977), 98, 477-484) with the addition of 10 mg.l ^ chloramphenicol and 1 µl * streptomycin (with IncQ plasmids ) or -1 2 mg.l tetracycline (with IncP plasmids) for plasmid selection -1 and 20 mg.l rifampicme for selection against E.coli. In order to measure transcriptional activation of the inducible R. leguminosarum nodABCIJ promoter as β-galactosidase activity, IncP plasmids containing nodD genes or hybrid nodD genes were mobilized to the strain LPR5045.pMP 154 (Nature, 328, 337-340 (1987)), which contains this inducible promoter donated to the E.coli lacZ gene.

Constructie van plasmiden DNA-manipulatie- en transformatietechnieken waren in hoofdzaak zoals beschreven in Molecular Cloning, A laboratory manual (Maniatis, 1982) . Gelyofiliseerd groot fragment (Klenow) van DNA polymerase I werd verkregen van BEL (Gaithersburg, MD, VS).Construction of plasmids DNA manipulation and transformation techniques were essentially as described in Molecular Cloning, A laboratory manual (Maniatis, 1982). Lyophilized large fragment (Klenow) of DNA polymerase I was obtained from BEL (Gaithersburg, MD, USA).

Het plasmide pMP600 werd geconstrueerd door insertie van een SacI-HindlII-fragment afkomstig van pRmSL26 (Nature, 298, 485-488 , 1982) en een KpnI-SphI-fragment afkomstig van pRt308 (Plant Mol. Biol., 6, 389-401 , 1986) , die respectievelijk de nodD genen van R.meliloti en R.trifolii bevatten, in de vector pMP92 (Plant Mol.Biol., 9, 27-39, 1987) , een derivaat van pTJS75 (J. Bacteriol., 164, 446-455, 1985). Het plasmide pMP800 werd op anabgpwLjza geconstrueerd door insertie van een KpnI-Clal fragment uit pRt308 en een SacI-BclI fragment uit pRmSL26 in de vector pMP92. Zowel pMP600 als pMP800 bevatten, het cat gen uit pMP190 (Plant Mol.The plasmid pMP600 was constructed by insertion of a SacI-HindIII fragment from pRmSL26 (Nature, 298, 485-488, 1982) and a KpnI-SphI fragment from pRt308 (Plant Mol. Biol., 6, 389-401 , 1986), containing the nodD genes of R.meliloti and R.trifolii, respectively, in the vector pMP92 (Plant Mol. Biol., 9, 27-39, 1987), a derivative of pTJS75 (J. Bacteriol., 164 446-455, 1985). The plasmid pMP800 was constructed on anabgpwLjza by insertion of a KpnI-Clal fragment from pRt308 and a SacI-BclI fragment from pRmSL26 into the vector pMP92. Both pMP600 and pMP800 contain the cat gene from pMP190 (Plant Mol.

Biol. , 9, 27-39, 1987) , gedoneerd als een HindlII-EcoRI-fragment. Bij de constructie van het plasmide werden verscheidene 'polylinker'-fragmenten afkomstig van plasmide pIC20H (Gene, 32, 481-485 , 1984)gebruikt, welke niet in fig. 1 zijn aangegeven.Biol. , 9, 27-39, 1987), donated as a HindIII-EcoRI fragment. Several "polylinker" fragments from plasmid pIC20H (Gene, 32, 481-485, 1984) were used in the construction of the plasmid, which are not shown in Figure 1.

In fig. 1 zijn aangegeven de restrictieplaatsen die werden gebruikt voor de karakterisering van de hybride nodD genen afkomstig vai pMP6CD en pMPSOO. De gebruikte symbolen zijn: Al, Aval; A2, Avall; B,Figure 1 shows the restriction sites used to characterize the hybrid nodD genes from pMP6CD and pMPSOO. The symbols used are: Al, Aval; A2, Avall; B,

BamHI; Bc, Bell; Bg, BglII; C, Clal; E. EcoRI;H, HindlII; Hc,BamHI; Bc, Bell; Bg, BglII; C, Clal; E. EcoRI: H, HindIII; Hc,

HincII; Hf, Hinfl; K, KpnI;P, PstI ; Pv, PvuII; S, Smal; Sc,HincII; Hf, Hinfl; K, KpnI; P, PstI; Pv, PvuII; S, Narrow; Sc,

SacI; Sp, Sphl.SacI; Sp, Sphl.

Constructie van hybride nodD genen door in vivo recombinatieConstruction of hybrid nodD genes by in vivo recombination

Om hybriden van de in vivo homologe recombinatie te isoleren werd 5 jig plasmide DNA behandeld met 80 units EcoRI gedurende 3 uur en vervolgens getransformeerd in E.coli KMBL1164 De insertie van het cat-gen in het gebruikte plasmide is een verbetering van de methode zoals beschreven doo Tommassen et al, EMBO J., 4, 1583-1587 , 1985), aangezien de aanwezigheid van deze extra marker kan worden gebruikt voor het detecteren van transformanten welke het gevolg zijn van een (onvermijdelijke ) onvolledige restric-tie-endonuclease behandeling . Otn het voorkomen van clonen die het gevolg zijn van dezelfde cross-over tot een minimum te beperken, zijn verschillende pMP600 en pMP800 DNA-preparaten gebruikt, geïsoleerd uit onafhankelijke cultures welke bij afwezigheid van chlooramfenicol zijn gekweekt. Deze cultures werden genomen uit een bacteriecultuur die continu in aanwezigheid van chlooramfenicol werd gekweekt , en waarin dan ook geen hybride nodD bevattende plasmiden aanwezig waren. De frequentie waarmee chlooramfenicol gevoelige colonies werden verkregen met de gebruikte DNA-preparaten varieerde tussen 5 en 20% . Alle plasmiden van chloor-amfenicol-gevoelige colonies werden geanalyseerd met behulp van HindlII en BamHI restrictieplaatsen, waarvan de posities in figuur 1 zijn aangegeven. Bij dit onderzoek werd gevonden dat 90% van de plasmiden blijkbaar het gevolg was van homologe recombinatie.To isolate hybrids from in vivo homologous recombination, 5 µg of plasmid DNA was treated with 80 units of EcoRI for 3 hours and then transformed into E.coli KMBL1164 The insertion of the cat gene into the plasmid used is an improvement of the method as described doo Tommassen et al, EMBO J., 4, 1583-1587, 1985), since the presence of this additional marker can be used to detect transformants resulting from (inevitably) incomplete restriction endonuclease treatment. To minimize the occurrence of clones resulting from the same crossover, various pMP600 and pMP800 DNA preparations have been used, isolated from independent cultures grown in the absence of chloramphenicol. These cultures were taken from a bacterial culture that was continuously grown in the presence of chloramphenicol, and therefore did not contain any hybrid nodD containing plasmids. The frequency with which chloramphenicol sensitive colonies were obtained with the DNA preparations used varied between 5 and 20%. All plasmids from chloramphenicol-sensitive colonies were analyzed using HindIII and BamHI restriction sites, positions of which are indicated in Figure 1. In this study, it was found that 90% of the plasmids apparently resulted from homologous recombination.

Bepaling van de nucleotidesequentieDetermination of the nucleotide sequence

Het bepalen van de DNA-sequentie werd uitgevoerd met behulp van de dideoxyketenterminatiemethode (Proc. Natl.DNA sequencing was performed using the dideoxy chain termination method (Proc. Natl.

Acad. Sci . USA, 74, 5463-5467 (1977)) met de M13 vectoren tg130 of tg 131 (Gene , 26, 91-99 (1983)). De restrictieplaatsen die werden gebruikt voor het doneren in de M13-vectoren waren BglII,Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)) with the M13 vectors tg130 or tg 131 (Gene, 26, 91-99 (1983)). The restriction sites used for donating in the M13 vectors were BglII,

BamHI, PvuII, Avall en Smal.BamHI, PvuII, Avall and Smal.

Screening van nodD hybridenScreening of nodD hybrids

Rhizobium stammen met een hybride nodD gen en een pMP154 plasmide werden voor hun inducerende eigenschappen gescreend met een kwalitatieve test. De Rhizobium-stammen yerden opgekweekt op YMB-medium tot een ODg20 van Op repen Whatman 3 MM papier werden druppels -van de Ie testen verbindingen gebracht en na drogen werden de repen in de te testen Rhizobium stam gedrenkt,Rhizobium strains with a hybrid nodD gene and a pMP154 plasmid were screened for a qualitative test for their inducing properties. The Rhizobium strains were grown on YMB medium to an ODg20 of Op strips Whatman 3 MM paper, droplets of the 1st test compounds were introduced and after drying the strips were soaked in the Rhizobium strain to be tested,

De gedrenkte repen werden minimaal 6 uur bij 28°C in een met waterdamp verzadigde omgeving geincubeerd, 30 minuten boven tolueen geincubeerd, 15 minuten aan de lucht blootgesteld en met -1 een oplossing van 5 mg,ml ortho-nitro-fenol-p-D-galactoside (ONPG) besproeid om ft-galactosidase activiteit te ontdekken.The soaked bars were incubated for a minimum of 6 hours at 28 ° C in a water vapor saturated environment, incubated over toluene for 30 minutes, exposed to air for 15 minutes and with -1 solution of 5 mg, ml ortho-nitro-phenol-pD- galactoside (ONPG) sprayed to detect ft-galactosidase activity.

Sterke geelkleuring duidt op goede inductie op de plaats van de betreffende verbinding. De verbindingen , waarmee alle nodD hybriden werden getest, waren : naringine, eriodyctiol, hesperitine, luteoline, 7-0H-f lavon , pinocembrine, daidzeine en genisteine. Alle in een hoeveelheid van 100 ng per spot.Strong yellow coloring indicates good induction at the location of the respective compound. The compounds with which all nodD hybrids were tested were naringine, eriodyctiol, hesperitin, luteoline, 7-0H-f lavon, pinocembrine, daidzeine and genistein. All in the amount of 100 ng per spot.

Activeringsvermogen nodD604 (zie tabel A)Activation power nodD604 (see table A)

Stroomopwaartse gebieden van induceerbare nod-genen van R.leguminosarum, R. trifolii en R. meliloti werden gedoneerd in de indicator voor de transcriptie IncQ plasmide pMP190, waarmee detectie van promotoractiviteit als 15 -galactosidaseactiviteit mogelijk is. De promotor - gebieden van de nodABC(IJ) operons zijn aanwezig in de plasmiden pMP154, pMP193 en pMP194 voor respectievelijk R, leguminosarum, R. trifolii en R.meliloti.Upstream regions of inducible nodes of R. leguminosarum, R. trifolii and R. meliloti were donated in the indicator for the transcription IncQ plasmid pMP190, allowing detection of promoter activity as galactosidase activity. The promoter regions of the nodABC (IJ) operons are present in the plasmids pMP154, pMP193 and pMP194 for R, leguminosarum, R. trifolii and R.meliloti, respectively.

De stroomopwaartse gebieden van de nodFE operons zijn aanwezig in pMP168 en pMP299 (gedoneerd als een BamHI-Clal-fragment ) voor respectievelijk R.leguminosarum en R.trifolii, en het stroomopwaartse gebied van nodM van R.leguminosarum is aanwezig in pMP250.The upstream regions of the nodFE operons are present in pMP168 and pMP299 (donated as a BamHI-Clal fragment) for R.leguminosarum and R.trifolii, respectively, and the upstream region of nodM of R.leguminosarum is contained in pMP250.

Met deze plasmiden werden 24 Rhizobium-stammen geconstrueerd, welke de combinaties van induceerbare nod-promotor met elk wild-type nodD-gen of het hybride nodD604 gen vertegenwoordigen. Deze wild-type nodD genen zijn aanwezig op de IncP-plasmiden pMP280, pMP283 en pMP261 voor respectievelijk R.leguminosarum, R. trifolii en R. meliloti (het nodDI-gen), Elke stam werd onderzocht in aanwezigheid oê afwezigheid van 400 nM luteoline volgens eerder beschreven methoden. De hoeveelheden p>-ga1 actosidasa die bet gvnlg waren wi cb onderzochte promotoractiviteit worden uitgedrukt ten opzichte van de expressie in aanwezigheid van hun eigen nodD-gen en de inducer luteoline. De laatstgenoemde hoeveelheden, aangegeven als units {b -galactosidase waren: 20.000 U voor pr. nodABCIJ van R.leguminosarum, 11.000 ü voor pr. nodABC van R. trifolii, 7000 D voor pr. nodABC van R.meliloti, 7500 U voor pr. nodFE van R.leguminosarum, 10.000 U voor pr. nodFE van R. trifolii en 5000 U voor pr. nodM van R.leguminosarum. Elke stam werd in triplo onderzocht en de variatie van de expressieniveau's bleef binnen 10% . Het expressieniveau van de nod-promotoren , veroorzaakt door het nodD604 produkt kon niet worden beïnvloed door toevoeging van 400 nM van de geteste stoffen hesperitine, sakuranetine, scutellareine, 5-hydroxyflavon» taxifoline , galangine, morine en 6,7,4’-trihydroxyisoflavon , isoferulinezur, ferulinezuur, floretine, cumarine, p-cumaarzuur, m-cumaarzuur, genisteine, daidzeine, genistine, umbelliferon, syringinezuur, syringaldehyde, sinapinezuur, acetosyringon, formononetine.24 Rhizobium strains were constructed with these plasmids, representing the combinations of inducible nod promoter with any wild-type nodD gene or the hybrid nodD604 gene. These wild-type nodD genes are present on the IncP plasmids pMP280, pMP283 and pMP261 for R.leguminosarum, R. trifolii and R. meliloti (the nodDI gene), respectively. Each strain was tested in the absence of 400 nM luteolin according to previously described methods. The amounts of β-α1 actosidases which were affected by promoter activity studied are expressed relative to expression in the presence of their own nodD gene and the inducer luteoline. The latter amounts, indicated as units {b -galactosidase, were: 20,000 U for pr. nodABCIJ of R.leguminosarum, 11,000 u for pr. nodABC from R. trifolii, 7000 D for pr. nodABC from R.meliloti, 7500 U for pr. nodFE of R.leguminosarum, 10,000 U for pr. nodFE from R. trifolii and 5000 U for pr. nodM from R.leguminosarum. Each strain was examined in triplicate and the variation of the expression levels remained within 10%. The expression level of the nod promoters caused by the nodD604 product could not be affected by the addition of 400 nM of the tested substances hesperitin, sakuranetine, scutellarein, 5-hydroxyflavone, taxifoline, galangine, morine and 6,7,4'-trihydroxyisoflavone , isoferulinic acid, ferulic acid, phloretin, coumarin, p-cumaric acid, m-cumaric acid, genistein, daidzein, genistin, umbelliferone, syringic acid, syringaldehyde, sinapic acid, acetosyringone, formononetine.

Bepaling gastheerbereik ( tabel B)Host Range Determination (Table B)

De IncP-plasmiden die het hybride nodD604 gen of één van de 3 wild-type nodD genen bevatten, zoals hiervoor beschreven, werden gemobiliseerd in de R.Ieguminosarum-stam RBL5561 en de R.trifolii-stam ANU851, die een insertie van Tn5 in het nodD-gen bevatten. De verkregen R. leguminosarumderivaten werden onderzocht op nodulatie op 15 plantesoorten vancle genera Vicia, Lathyrus en Lens. De verkregen 4 R.trifolii-derivaten werden op nodulatie onderzocht op 26 plantesoorten van het genus Trifolium. De resultaten geven aan dat alleen de Rhizobium-derivaten die hun eigen nodD-gen bevatten of nodD6Q4, alle plantesoorten van hun eigen cross-inoculatiegroep konden noduleren. Representatieve resultaten worden getoond met 5 plantesoorten van elke cross-inoculatiegroep. De Rhizobium-derivaten , waarvan het eigen nodD gen geactiveerd was zoals hierboven beschreven, werden voorzien van het nodD604 gen, het nodD807 gen of een van de drie wild-type nodD genen en deze 10 Rhizobium-derivaten werden getest op nodulatie op de tropische vlinderbloemige planten van de geslachten Macroptileum, Lablab en Leucaena, welke gewoonlijk worden genoduleerd door bacteriën van het geslacht Bradyrhizobium, bijvoorbeeld NGR234, maar niet door snel-groeien-de soorten. De positieve controlestam NGR234 noduleerde 50-100% van de geinoculeerde planten. De planteproeven werden uitgevoerd zoals eerder beschreven (Plant Sc. Letters 27, 317-325, (1982)) , Voor elke combinatie van Rhizobium en plantesoort werden tenminste 10 planten gebruikt en de nodulatie werd drie weken na infectie beoordeeld tenzij anders is aangegeven.The IncP plasmids containing the hybrid nodD604 gene or one of the 3 wild-type nodD genes, as described above, were mobilized into the R. Leguminosarum strain RBL5561 and the R.trifolii strain ANU851, which insert Tn5 in contain the nodD gene. The obtained R. leguminosarum derivatives were examined for nodulation on 15 plant species of cle genera Vicia, Lathyrus and Lens. The obtained 4 R.trifolii derivatives were tested for nodulation on 26 plant species of the genus Trifolium. The results indicate that only the Rhizobium derivatives containing their own nodD gene or nodD6Q4 were able to nodulate all plant species from their own cross-inoculation group. Representative results are shown with 5 plant species from each cross-inoculation group. The Rhizobium derivatives, whose own nodD gene was activated as described above, were labeled with the nodD604 gene, the nodD807 gene or one of the three wild-type nodD genes, and these 10 Rhizobium derivatives were tested for nodulation on the tropical leguminous plants of the genera Macroptileum, Lablab and Leucaena, which are usually modulated by bacteria of the genus Bradyrhizobium, for example NGR234, but not by fast-growing species. The positive control strain NGR234 modulated 50-100% of the inoculated plants. The plant tests were performed as previously described (Plant Sc. Letters 27, 317-325, (1982)). At least 10 plants were used for each combination of Rhizobium and plant species and the nodulation was assessed three weeks after infection unless otherwise indicated.

Bepaling van het stikstof fixerend vermogen ( zie fig. 4)Determination of the nitrogen fixing capacity (see fig. 4)

De R. leguminosarum en R.trifolii-derivaten die voor de proeven van tabel B werden gebruikt, werden onderzocht op hun stikstof fixerend vermogen op respectievelijk T.repens (Δ) en V.sativa (B). Voor elke stam werden tenminste 25 planten geïnfecteerd. Acetyleenreductieproeven (Plant Sc. Letters 27, 317-325 (1982)) werden uitgevoerd op de aangegeven tijden na infectie. Bij een controleexperiment werden de acetyleenreductieproeven alleen 32 dagen na infectie uitgevoerd.Soortgelijke resultaten werden verkregen , waaruit blijkt dat de acetyleen-behandeling geen invloed had op de metingen 10 dagen na de infectie. De vermelde gemiddelde acetyleenreductiewaarden voor elke stam werden statistisch vergeleken met de methode van zowel Student als Wilcoxon. De met pijltjes aangegeven resultaten waren significant verschillend bij beide methoden (oi= 0,5%) van de resultaten met de Rhizonium-stammen die de nodD-genen van R. trifolii en R.leguminosarum bevatten voor respectievelijk T.repens en V.sativa. De gebruikte symbolen voor de,Rhizobium-stammen die de verschillende nodD-genen bevatten zijn: (0) gesloten vierkanten, hybride nodD807, (1) open vierkanten., hybride nodD604; (2) gpen cirkels, R.leguminosarum nodD; .(3) gesloten cirkels, R. trifolii nodD; (4) driehoeken, R.meliloti nodD1.The R. leguminosarum and R.trifolii derivatives used for the tests of Table B were tested for their nitrogen fixation capacity on T.repens (Δ) and V.sativa (B), respectively. At least 25 plants were infected for each strain. Acetylene reduction tests (Plant Sc. Letters 27, 317-325 (1982)) were performed at the indicated times after infection. In a control experiment, the acetylene reduction tests were performed only 32 days after infection. Similar results were obtained, showing that the acetylene treatment did not affect the measurements 10 days after the infection. The reported average acetylene reduction values for each strain were statistically compared to the method of both Student and Wilcoxon. The results indicated by arrows were significantly different in both methods (oi = 0.5%) from the results with the Rhizonium strains containing the nodD genes of R. trifolii and R.leguminosarum for T.repens and V.sativa, respectively. . The symbols used for the Rhizobium strains containing the different nodD genes are: (0) closed squares, hybrid nodD807, (1) open squares., Hybrid nodD604; (2) gpen circles, R.leguminosarum nodD; (3) closed circles, R. trifolii nodD; (4) triangles, R.meliloti nodD1.

Claims

A method for activating nodulation promoters of Rhizobium, Bradyrhizobium and related bacteria, characterized in that a DNA fragment is introduced into the bacterium that is identical to, derived from or comprises a hybrid nodD gene which can be obtained by recombination between nodD genes of Rhizobium or related bacteria.

The method according to claim 1, characterized in that the hybrid nodD gene comprises portions of the nodD gene of R. trifolii and of the nodD1 gene of R. meliloti, the portion derived from R. trifolii being at the 5'- end and comprises up to 45% of the nucleotides of the hybrid gene, or the R. meliloti-derived portion is at the 5 'end and comprises 40-80% of the nucleotides of the hybrid gene.

The method according to claim 2, characterized in that one of the hybrids nodD635, 604, 612, 640, 804, 807, 808, 812 as defined in the description is used as the hybrid nodD gene.

The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the recombinant DNA fragment is present on a plasmid with a broad host range or has been applied to Rhizobium DNA via genetic engineering.

DNA fragment that can be used in carrying out the method according to claims 1-4, characterized in that it is identical to, derived from or comprises a hybrid nodD gene which can be obtained by recombination between Rhizobium nodD genes -, Bradyrhizobium or related bacteria.

DNA fragment according to claim 5, characterized in that it is identical to, derived from or comprises a hybrid nodD gene obtainable by recombination between the nodD gene of R, trifolii and the nodD1 gene of R. meliloti .

DNA fragment according to claim 6, characterized in that the part derived from R. meliloti is at the 5 'end and comprises 40-80% of the nucleotides of the hybrid gene.

DNA fragment according to claim 7, characterized in that the hybrid nodD gene is one of the hybrids nodD 635, 604, 612 and 640 as defined in the description.

DNA fragment according to claim 6, characterized in that the part from R.trifolii is at the 5 'end and comprises up to 45% of the nucleotides of the hybrid gene.

DNA fragment according to claim 9, characterized in that the hybrid nodD gene is one of the hybrids nodD 804, 807, 808 and 812 as defined in the description.

Plasmid which can be used in carrying out the method according to claims 1-4, characterized in that it comprises a DNA fragment according to any of claims 5-10.

Manipulated Rhizobium, Bradyrhizobium or related bacterial strain, characterized in that the strain contains a plasmid as defined in claim 11 or a DNA fragment as defined in any of claims 5-10.

A method for improving the ability to bind nitrogen to nodulating plants, wherein the seed or plant is contacted with an engineered Rhizobium, Bradyrhizobium or related bacterial strain, as defined in claim 12, and wherein it is naturally seed or soil-borne Rhizobium, Bradyrhizobium or related bacteria can be excluded from nodulation if desired by using compounds having anti-inducing activity for the latter bacteria.