NL8701914A - Adsorbents, esp. for blood clotting factors - comprising, amino-butyl or amino-pentyl polymer derivs. - Google Patents
Adsorbents, esp. for blood clotting factors - comprising, amino-butyl or amino-pentyl polymer derivs. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8701914A NL8701914A NL8701914A NL8701914A NL8701914A NL 8701914 A NL8701914 A NL 8701914A NL 8701914 A NL8701914 A NL 8701914A NL 8701914 A NL8701914 A NL 8701914A NL 8701914 A NL8701914 A NL 8701914A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- gel
- plasma
- adsorption
- fviii
- cdi
- Prior art date
Links
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
- B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
- B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
- B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
- B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
- B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
- B01J20/3219—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond involving a particular spacer or linking group, e.g. for attaching an active group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
•è -1- VO 9196• è -1- VO 9196
Adsorbensmateriaal en toepassing daarvan voor het isoleren van stollingsfaktoren.Adsorbent material and use thereof for the isolation of coagulation factors.
De uitvinding heeft betrekking op een adsorbensmateriaal, dat hierin ook wel aangeduid zal worden met de termen affiniteitsmatrix, hydrogel of gel, welk adsorbensmateriaal een polymeer dragermateriaal omvat 5 waaraan via spacers liganden zijn gebonden die bestaan uit eindstandige primaire, secundaire , tertiaire of quaternaire aminogroepen.The invention relates to an adsorbent material, which will also be referred to herein by the terms affinity matrix, hydrogel or gel, which adsorbent material comprises a polymeric support material to which ligands are bonded consisting of terminal primary, secondary, tertiary or quaternary amino groups.
Tevens heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het isoleren van stollingsfaktoren, 10 zoals met name de bloedcoagulatiefaktoren FII, FVII, FVIII, FIX, FX en de Von Willebrand faktor (vWF, in de literatuur ook wel aangeduid met FVIIIR) uit een vloeibaar uitgangsmateriaal zoals bloedplasma, plasmapro-dukten, cellysaten en fermentatie- of kweekmedia met 15 behulp van vloeistofchromatografie.The invention also relates to a method for isolating coagulation factors, such as in particular the blood coagulation factors FII, FVII, FVIII, FIX, FX and the Von Willebrand factor (vWF, also referred to in the literature as FVIIIR) from a liquid starting material. such as blood plasma, plasma products, cell lysates and fermentation or culture media by liquid chromatography.
In het bloed van mensen en dieren bevinden zich kleine hoeveelheden van verschillende stoffen die bij het proces van bloedcoagulatie of bloedstolling zijn betrokken. Om diverse redenen bestaat behoefte 20 aan methoden waarmee deze stoffen in een zo hoog mogelijke opbrengst en een zo hoog mogelijke zuiverheid uit het bloed (of een ander geschikt uitgangsmateriaal) kunnen worden geïsoleerd. Zo is b.v. het in bloedplasma voorkomende eiwit faktor VIII (in de literatuur ook 25 wel aangeduid als FVIII) één van de dertien stollingsfaktoren die noodzakelijk zijn voor een goed functioneren van de bloedstolling. Bij ca. 1000 mensen (hemofilie A-patiënten) in Nederland is deze stollingsfaktor geheel of gedeeltelijk afwezig of niet functioneel, 30 waardoor hun bloed niet normaal kan stollen. Behandeling van deze bloederziekte is mogelijk met faktor VlII-prepa- 8701914 -2- raten, die bereid kunnen worden uit menselijk donorbloed. Omdat de opbrengsten van de bestaande bereidingsmethoden zeer laag zijn (<^40%) en de vraag naar preparaten steeds groter wordt, is er over de gehele wereld een 5 tekort aan faktor VIII.The blood of humans and animals contains small amounts of various substances that are involved in the process of blood coagulation or blood clotting. For various reasons, there is a need for methods by which these substances can be isolated from the blood (or other suitable starting material) in the highest possible yield and highest purity. For example, e.g. the protein plasma VIII occurring in blood plasma (also referred to in the literature as FVIII), one of the thirteen clotting factors necessary for the proper functioning of blood clotting. In about 1000 people (haemophilia A patients) in the Netherlands, this coagulation factor is completely or partially absent or not functional, so that their blood cannot clot normally. Treatment of this bleeding disorder is possible with factor VlII preparations 8701914-2-formates, which can be prepared from human donor blood. Because the yields of the existing preparation methods are very low (<^ 40%) and the demand for preparations is increasing, there is a shortage of factor VIII all over the world.
Er zijn reeds diverse methoden bekend waarmee FVIII en/of andere stollingsfaktoren en eiwitten door middel van vloeistofchromatografie uit een op bloed gebaseerd uitgangsmateriaal kunnen worden geïsoleerd.Various methods are already known by which FVIII and / or other clotting factors and proteins can be isolated from a blood-based starting material by liquid chromatography.
10 Sommige van deze bekende methoden maken daartoe gebruik van gebruikelijke anionenwisselaars, zoals DEAE-cellulose en DEAE-Sephadex, andere maken gebruik van bepaalde polyelektrolieten en weer andere maken gebruik van gemodificeerde Sepharoses. Onderstaand zal nader op 15 deze verschillende bekende methoden worden ingegaan. Gebruikelijke anionenwisselaarsSome of these known methods use conventional anion exchangers for this purpose, such as DEAE cellulose and DEAE-Sephadex, others use certain polyelectrolytes and still others use modified Sepharoses. These various known methods will be discussed in more detail below. Usual anion exchangers
De gebruikelijke anionenwisselaars zoals DEAE-cel-lulose en DEAE-Sephadex werden in de jaren zestig enige malen toegepast bij de opzuivering van faktor 20 VIII concentraten. Het gaat hierbij om (min of meer verouderde) matrices waaraan met bekende, veel gebruikte koppelingsmethoden een gesubstitueerd diamine (diethyl-amino-ethylamine) is gekoppeld. Het gebruik van deze materialen voor de faktor VIII zuivering en isolering 25 heeft zich door een aantal nadelen van deze gelen echter niet doorgezet, waardoor ze de laatste jaren slechts weinig gebruikt werden.Conventional anion exchangers such as DEAE-cell-lulose and DEAE-Sephadex were used several times in the purification of factor 20 VIII concentrates. These are (more or less outdated) matrices to which a substituted diamine (diethyl-aminoethylamine) is coupled using known, frequently used coupling methods. However, the use of these materials for factor VIII purification and isolation has not continued due to a number of disadvantages of these gels, so that they have been used little in recent years.
literatuur: Thromb. Diath. Haemorrh. 3 (1959) 572; 4(1960) 211; 6 (1961) 282; 16 (1966) 738-751.literature: Thromb. Diath. Haemorrh. 3 (1959) 572; 4 (1960) 211; 6 (1961) 282; 16 (1966) 738-751.
30 Polyelektrolieten EMA PE-5 en PE-10030 Polyelectrolytes EMA PE-5 and PE-100
De in de zeventiger jaren door Johnson geïntroduceerde EMA polyelektrolieten bestaan eveneens uit een polymeer materiaal waaraan een diamine (dimethylamino-propylamine) is gekoppeld en behoren daardoor ook 35 tot de anionenwisselaars. De liganddichtheid is vrij hoog en verschilt per polyelektroliet. De gekozen 8701914 « ·» -3- matrix (een copolymeer van etheen en maleinezuuranhydride) is vrij ongebruikelijk. Essentieel in de chemische structuur is de N,N-dimethylaminopropylamide-groep die door zijn zwak basisch karakter (pKa=5,4) bij 5 pH 6-7 gedeeltelijk positief geladen is. Twee verschillende polyelektrolieten worden gebruikt: 1) PE-100 - waarin nagenoeg 100% van de maleinezuuranhydride eenheden met het amine gesubstitueerd zijn.The EMA polyelectrolytes introduced by Johnson in the 1970s also consist of a polymeric material to which a diamine (dimethylamino-propylamine) is coupled and therefore also belong to the anion exchangers. The ligand density is quite high and differs per polyelectrolyte. The chosen 8701914 «·» -3- matrix (a copolymer of ethylene and maleic anhydride) is quite unusual. Essential in the chemical structure is the N, N-dimethylaminopropylamide group, which is partially positively charged at 5 pH 6-7 due to its weak basic character (pKa = 5.4). Two different polyelectrolytes are used: 1) PE-100 - in which substantially 100% of the maleic anhydride units are substituted with the amine.
Bij pH 8,0 kunnen hiermee de stollingsfaktoren 10 II, VII, IX en X uit plasma worden geadsorbeerd en na wassen van de polyelektroliet bij pH 6 met 1,5 M natriumchloride worden geëlueerd. De supernatant wordt met PE-5 in contact gebracht.At pH 8.0 the clotting factors 10 II, VII, IX and X can hereby be adsorbed from plasma and eluted after washing the polyelectrolyte at pH 6 with 1.5 M sodium chloride. The supernatant is contacted with PE-5.
2) PE-5 - waarin 5% gesubstitueerd is.2) PE-5 - wherein 5% is substituted.
15 Bij pH 6 wordt het FVIII:C geadsorbeerd terwijl vWF in oplossing blijft. FVIII:C kan na wassen van de PE-5 bij pH 7,4 met 1,0 M lysine/1,5 M natriumchloride worden geëlueerd met een opbrengst van 43% en een 52-voudige opzuivering. Door de supernatant 20 opnieuw (andere condities) met PE-100 in contact te brengen (pH 6,0) kan ook vWF worden geïsoleerd met 43% opbrengst en 71-voudïge opzuivering.At pH 6, the FVIII: C is adsorbed while vWF remains in solution. FVIII: C can be eluted after washing the PE-5 at pH 7.4 with 1.0 M lysine / 1.5 M sodium chloride in 43% yield and 52-fold purification. By re-contacting the supernatant (other conditions) with PE-100 (pH 6.0), vWF can also be isolated with 43% yield and 71-fold purification.
Uit de experimenten werd de conclusie getrokken dat FVIII aanvankelijk door elektrostatische interactie 25 aan de MA PE bindt, waarna hydrofobe interactie de binding versterkt. Hierdoor wordt de elutie bemoeilijkt, zodat de opbrengst relatief laag is. Verder blijkt dat lysine een stabiliserende werking heeft, dat door toevoeging van heparine de opbrengst kan 30 worden verhoogd en dat tijdens het proces de Hepatitis B virus titer wordt verlaagd.From the experiments it was concluded that FVIII initially binds to the MA PE by electrostatic interaction, after which hydrophobic interaction enhances the binding. This makes elution more difficult, so that the yield is relatively low. Furthermore, it appears that lysine has a stabilizing effect, that the yield can be increased by adding heparin and that the Hepatitis B virus titer is lowered during the process.
Doordat noch de bloedcontacteigenschappen, noch de mechanische eigenschappen van deze EMA polyelektrolieten goed zijn (stollingsactivering, hoge aspecifieke 35 adsorptie, slechte doorstroming en moeilijk suspenderen) zijn zij voornamelijk toegepast voor de isolering 8701914 Λ * -4- uit varkensplasma of de opzuivering van cryoprecipitaten. literatuur: J.Lab. Clin. Med. 92(1978) 194-210; US-A-4.397.841; US-A-4.471.112.Since neither the blood contact properties nor the mechanical properties of these EMA polyelectrolytes are good (coagulation activation, high nonspecific adsorption, poor flow and difficult suspension), they have mainly been used for the isolation 8701914 19 * -4- from pig plasma or the purification of cryoprecipitates. literature: J. Lab. Clin. Med. 92 (1978) 194-210; US-A-4,397,841; US-A-4,471,112.
Gemodificeerde Sepharoses 5 Het AH-Sepharose (aminohexyl-Sepharose) met de algemene formule Sepharose-0-C(=NH)-NH-(CH2)6"NH2 werd door Pharmacia aanvankelijk geïntroduceerd voor de immobilisatie van eiwitten door covalente binding van het amine met carboxyl-groepen van het eiwit. Door 10 het sterk basische karakter van dit primaire amine (pKa=9,9) kan de gel echter ook bij de anionenwisselaars worden ingedeeld en zich tevens als zodanig gedragen.Modified Sepharoses 5 The AH-Sepharose (aminohexyl-Sepharose) of the general formula Sepharose-0-C (= NH) -NH- (CH2) 6 "NH2 was initially introduced by Pharmacia for the immobilization of proteins by covalent bonding of the amine with carboxyl groups of the protein Due to the strongly basic nature of this primary amine (pKa = 9.9), the gel can also be classified among the anion exchangers and behave as such.
Voor de scheiding van faktor VIII blijkt dit laatste uit een onderzoek dat door Austen werd gepubli-15 ceerd. Met 8,6 ml AH-Sepharose 4B kan vanuit FVIII-concen-traat (600 IU) het FVIII 70 maal worden opgezuiverd (1,8 IU/mg) met ca. 35% opbrengst. Adsorptie vindt plaats in 0,1 M acetaat/lysine pH 5,5 en elutie in deze buffer met 0-5% natriumchloride. Een scheiding 20 tussen FVIII:C en vWF kan worden bereikt. Het AH-For the separation of factor VIII, the latter is apparent from a study published by Austen. With 8.6 ml of AH-Sepharose 4B, the FVIII can be purified from FVIII concentrate (600 IU) 70 times (1.8 IU / mg) in about 35% yield. Adsorption takes place in 0.1 M acetate / lysine pH 5.5 and elution in this buffer with 0-5% sodium chloride. A separation between FVIII: C and vWF can be achieved. The AH-
Sepharose werd bereid door koppeling van 1,6-hexaandiamine aan CNBr-geactiveerd Sepharose 4B met de methode van Axen, waardoor een liganddichtheid van ca. 7 umol/ml werd bereikt. De binding van FVIII aan de gel lijkt 25 elektrostatisch te zijn, hoewel additionele hydrofobe interactie en sterische effecten niet kunnen worden uitgesloten. Tevens bleek dat de Hepatitis B virus titer na zuivering 1/60 van de beginwaarde was.Sepharose was prepared by coupling 1,6-hexanediamine to CNBr-activated Sepharose 4B by the Axen method to achieve a ligand density of about 7 µmol / ml. The binding of FVIII to the gel appears to be electrostatic, although additional hydrophobic interaction and steric effects cannot be excluded. It was also found that the Hepatitis B virus titer after purification was 1/60 of the initial value.
Gelijktijdig werd door Vukovich et al. butyl-30 Sepharose onderzocht met de algemene formuleSimultaneously, butyl 30 Sepharose was tested by Vukovich et al. With the general formula
Sepharose-0-C(=NH)-NH-(CH2)4-H. Dit werd bereid door koppeling van 1-butaanamine aan CNBr-geactiveerd Sepharose 4B. Plasma (10 ml) werd 5-maal verdund in 20 mM tris/1 mM citraat buffer, pH 7,4 en op de butyl-Sepharose kolom 35 (20 ml) gebracht. Hierdoor werden de stollingsfaktoren II, V, VII, VIII, IX en X kwantitatief gebonden. Elutie 8701914 -5- % vond plaats*in de buffer met 0-2 M natriumchloride.Sepharose-0-C (= NH) -NH- (CH 2) 4 -H. This was prepared by coupling 1-butanamine to CNBr-activated Sepharose 4B. Plasma (10 ml) was diluted 5 times in 20 mM tris / 1 mM citrate buffer, pH 7.4 and applied to the butyl Sepharose column 35 (20 ml). The clotting factors II, V, VII, VIII, IX and X were hereby bound quantitatively. Elution 8701914-5% took place * in the buffer with 0-2 M sodium chloride.
FVIII elueerde bij 0,3-0,6 M natriumchloride met ca. 60% opbrengst en 23-voudige opzuivering, gescheiden van de andere stollingsfaktoren. Op basis van de resultaten 5 werd hydrofobe interactie van FVIII met butyl-Sepharose geconcludeerd en elektrostatische interactie geheel uitgesloten.FVIII eluted at 0.3-0.6 M sodium chloride in about 60% yield and 23-fold purification, separated from the other clotting factors. Based on the results 5, hydrophobic interaction of FVIII with butyl-Sepharose was concluded and electrostatic interaction was completely excluded.
Aansluitend werd door Morgenthaler systematisch onderzoek gedaan ter opheldering van het bindingskarakter 10 van FVIII met diverse gesubstitueerde Sepharoses.Subsequently, Morgenthaler conducted systematic investigations to elucidate the binding character of FVIII with various substituted Sepharoses.
Een homologe reeks aminoalkyl-Sepharoses werd gemaakt en uitgetest onder dezelfde condities (pH 5,5) als die van Aüsten. Tevens werd een reeks van alkyl-Sepharoses bereid, die zowel onder deze als ook onder voor hydrofobe 15 interactie geschikte condities werd onderzocht. Beide reeksen werden bereid door koppeling van het betreffende amine aan CNBr-geactiveerd Sepharose 4B.A homologous series of aminoalkyl Sepharoses was made and tested under the same conditions (pH 5.5) as those of Asten. A series of alkyl Sepharoses was also prepared, which was tested under both these and hydrophobic interaction conditions. Both series were prepared by coupling the respective amine to CNBr-activated Sepharose 4B.
Aan de aminoalkyl-Sepharoses werd bij toenemende ketenlengte meer FVIII:C en eiwit gebonden en werden 20 deze bij hogere natriumchloride concentraties geëlueerd.More FVIII: C and protein were bound to the aminoalkyl Sepharoses with increasing chain length and eluted at higher sodium chloride concentrations.
Van aminoheptaan- en aminononaan-Sepharose kon geen FVIII:C worden geëlueerd. De adsorptie aan de alkyl-Sepharoses verschilde niet significant van die aan de aminoalkyl-Sepharoses. Met een ethyleenglycol gradiënt 25 (0-50%) kon slechts weinig eiwit, maar geen FVIÏI:CNo FVIII: C could be eluted from aminoheptane and aminononane Sepharose. The adsorption on the alkyl Sepharoses did not differ significantly from that on the aminoalkyl Sepharoses. With an ethylene glycol gradient 25 (0-50%), only little protein, but no FVII: C
worden geëlueerd. Door verhogen van de zoutconcentratie kon daarna van de kortere ketens enig eiwit met FVIII:C worden geëlueerd, terwijl dit van de langere ketens niet lukte. Hydrofobe interactie werd verantwoordelijk 30 geacht voor de adsorptie, terwijl bij de reeks alkyl-Sepharoses de elektrostatische interactie zelfs geheel werd uitgesloten.are eluted. By increasing the salt concentration, some protein could be eluted from the shorter chains with FVIII: C, while the longer chains failed. Hydrophobic interaction was thought to be responsible for the adsorption, while the series of alkyl-Sepharoses even completely excluded the electrostatic interaction.
Zowel Vukovich als Morgenthaler namen aan dat de interactie van FVIII met de gebruikte alkyl-Sepharoses 35 berust op hydrofobe interactie. Dit is in strijd met het feit dat zij elutie konden bewerkstelligen bij verhoogde natriumchloride concentratie.Both Vukovich and Morgenthaler assumed that the interaction of FVIII with the alkyl Sepharoses used is based on hydrophobic interaction. This is in contradiction with the fact that they could effect elution at elevated sodium chloride concentration.
87 01914 « o -6-87 01 914 «o -6-
Tevens is inmiddels zowel uit de literatuur als ook uit eigen onderzoek gebleken, dat elektrostatische interactie met de via CNBr-activatie bereide alkyl-Sepharoses niet mag worden uitgesloten, omdat door 5 de koppeling van het amine aan de CNBr-geactiveerde Sepharose een isoureum binding ontstaat, die zwak basisch is (pKa=8).In the meantime, both literature and our own research have shown that electrostatic interaction with the alkyl Sepharoses prepared via CNBr activation cannot be ruled out, because the coupling of the amine to the CNBr activated Sepharose results in an isourea bond. , which is weakly basic (pKa = 8).
Samenvattend kan gesteld worden, dat FVIII:C interactie vertoont met (amino)alkyl-liganden, maar 10 dat het karakter van deze interactie niet geheel duidelijk is. Verder is onbekend of de sterkere binding aan langere ketens wordt veroorzaakt door het feit dat deze ketens behalve langer ook hydrofober zijn, of slechts omdat zij beter bereikbaar zijn voor het 15 grote FVIII:C molecuul door minder sterische hindering.In summary, it can be stated that FVIII: C interacts with (amino) alkyl ligands, but that the character of this interaction is not entirely clear. Furthermore, it is unknown whether the stronger binding to longer chains is caused by the fact that these chains are not only longer hydrophobic, but only because they are more accessible to the large FVIII: C molecule due to less steric hindrance.
Tevens is nooit onderzocht welke invloed de "ligand-dicht-heid" heeft op de binding van FVIII:C en andere plasma-eiwitten.It has also never been investigated what influence the "ligand density" has on the binding of FVIII: C and other plasma proteins.
Naast het belang van de kennis omtrent het bindings-20 karakter, die mogelijk zou kunnen leiden tot de ontwikkeling van "betere" binders, staat het belang van de praktische bruikbaarheid. Hierover is inmiddels enige literatuur verschenen , vnl. gericht op AH-Sepharose.In addition to the importance of the knowledge of the binding character, which could possibly lead to the development of "better" binders, there is the importance of practical utility. Some literature has since been published on this, mainly aimed at AH-Sepharose.
Algemeen kan gezegd worden, dat de pH van de 25 gebruikte buffer zowel invloed heeft op de opbrengst, als op de zuiverheid. Het meest gebruikt werd pH 5,5.In general, it can be said that the pH of the buffer used influences both the yield and the purity. Most commonly used was pH 5.5.
Omdat bij lage pH de eiwitten in het algemeen minder negatieve lading hebben, terwijl de positieve lading op de gel niet verandert, zal minder eiwit adsorberen 30 dan bij hogere pH. Omdat dit voor FVIII in mindere mate schijnt te gelden (lage pi) kan hierdoor de specificiteit van de gel worden verhoogd (grotere opzuivering). Echter is het FVIII:C bij lage pH minder stabiel, waardoor de opbrengst geringer wordt.Because at low pH the proteins generally have less negative charge, while the positive charge on the gel does not change, less protein will adsorb than at higher pH. Because this appears to be less true for FVIII (low pi), the specificity of the gel can be increased (greater purification). However, the FVIII: C is less stable at low pH, which reduces the yield.
35 Faure et al. heeft de oplossing voor dit probleem gezocht in het toevoegen van stabilisatoren. Saccharose werd toegevoegd om de komplexvorming van 8701 9 1..4 * -7- FVIII met FIXa en FX en daarmee proteolyse te voorkomen.Faure et al. Has sought the solution to this problem by adding stabilizers. Sucrose was added to prevent complexation of 8701 9 1..4 * -7-FVIII with FIXa and FX and thus proteolysis.
In plasma had dit echter weinig effekt. Uit 224 ml plasma op 30 ml AH-Sepharose was de opbrengst ca. 407e met een 9-voudige opzuivering.However, this had little effect in plasma. The yield from 224 ml plasma to 30 ml AH-Sepharose was approx. 407th with a 9-fold purification.
5 Amphlett heeft een isolatie uit plasma bij pH 6,8 beschreven. Zonder stabilisatortoevoeging was de opbrengst 39% met een 32-voudige opzuivering. Geadsorbeerd werd in 20 mM tris/0,1 M lysine met 0,3 M natriumchloride, pH 6,8 en geëlueerd werd in deze buffer met 0,5 M 10 calciumchloride. Wanneer 0,5 M benzamidine/0,1% trasylol werd toegevoegd - waardoor mogelijk minder proteólytische hydrolyse optreedt - was de opbrengst 90% met een 48-voudige opzuivering.5 Amphlett has described an isolation from plasma at pH 6.8. Without stabilizer addition, the yield was 39% with a 32-fold purification. It was adsorbed in 20 mM tris / 0.1 M lysine with 0.3 M sodium chloride, pH 6.8 and eluted in this buffer with 0.5 M calcium chloride. When 0.5 M benzamidine / 0.1% trasylol was added - potentially resulting in less proteolytic hydrolysis - the yield was 90% with a 48-fold purification.
literatuur: Brit. J.Haematol. 43(1979) 669-674; Thromb.literature: Brit. J. Haematol. 43 (1979) 669-674; Thromb.
15 Haemost. 48(1982) 46-48; Folia Haematol., Leipzig 107 (1979) 148-151; Thromb. Haemostas. 47(1982) 124-127; J. Chromat. 257(1983) 387-391; US-A-4.508.709.15 Haemost. 48 (1982) 46-48; Folia Haematol., Leipzig 107 (1979) 148-151; Thromb. Haemostas. 47 124-127 (1982); J. Chromat. 257 (1983) 387-391; US-A-4,508,709.
Zoals uit de bovenstaande bespreking van de bekende methoden blijkt, hebben alle bekende werkwijzen 20 een of meerdere nadelen, zoals b.v. een teleurstellende opbrengst, een geringe zuiverheid en/of een lage stabiliteit van de geisoleerde produkten.As appears from the discussion of the known methods above, all known methods have one or more disadvantages, such as e.g. disappointing yield, low purity and / or low stability of the isolated products.
De uitvinding verschaft nu een nieuwe adsorbensma-teriaal waarmee significante verbeteringen bij de 25 isolering van stollingsfaktoren kunnen worden gerealiseerd, met name verbetering van de opbrengst, zuiverheid, en/of stabiliteit, en verschaft tevens een nieuwe werkwijze voor het isoleren van stollingsfaktoren uit een geschikt vloeibaar uitgangsmateriaal waarbij 30 het nieuwe adsorbensmateriaal wordt toegepast.The invention now provides a new adsorbent material capable of achieving significant improvements in the isolation of coagulation factors, in particular improvement in yield, purity, and / or stability, and also provides a new method of isolating coagulation factors from a suitable liquid starting material using the new adsorbent material.
Het nieuwe adsorbensmateriaal volgens de uitvinding omvat een polymeer dragermateriaal waaraan via spacers liganden zijn gebonden die bestaan uit eindstandige primaire, secundaire, tertiaire of quaternaire aminogroepen en 35 wordt gekenmerkt doordat de spacers bestaan uit 4 of 5 aaneengeschakelde methyleengroepen volgens de 8701914 * -8- algemene formule 1:The novel adsorbent material according to the invention comprises a polymeric support material to which ligands of terminal primary, secondary, tertiary or quaternary amino groups are bound via spacers and characterized in that the spacers consist of 4 or 5 linked methylene groups according to the 8701914 * -8- general formula 1:
-(CH2)n- (D- (CH2) n- (D
waarin n een geheel getal voorstelt met een waarde van 4 of 5.where n represents an integer with a value of 4 or 5.
5 Verder heeft het volgens de uitvinding de voorkeur dat het dragermateriaal een hydroxylgroepen bevattend polymeer materiaal is, waaraan de spacers zijn gebonden via koppelingsgroepen met de formule 2: -CO-NH- (2) 10 Het meest geprefereerde adsorbensmateriaal volgens de uitvinding kan worden weergegeven met de algemene formule 3: drager-0-C0-NH-(CH2)n-NR1R2 (3), waarin n gelijk is aan 4 of 5 en en R2 elk, onafhan-15 kelijk van elkaar, een waterstofatoom of een al dan niet gesubstitueerde koolwaterstofgroep, zoals alkyl, cycloalkyl, aryl, aralkyl enz. voorstellen.Furthermore, according to the invention it is preferred that the support material is a hydroxyl-containing polymeric material to which the spacers are bonded via coupling groups of the formula 2: -CO-NH- (2). The most preferred adsorbent material according to the invention can be represented of the general formula 3: carrier -O-CO-NH- (CH2) n-NR1R2 (3), wherein n is equal to 4 or 5 and and R2 each, independently of one another, a hydrogen atom or an unsubstituted hydrocarbon group such as alkyl, cycloalkyl, aryl, aralkyl, etc.
Voorkeur heeft dat het dragermateriaal een agarose is, zoals b.v. Sepharose CL 4B.It is preferred that the support material is an agarose, such as e.g. Sepharose CL 4B.
20 Eveneens heeft het de voorkeur dat de liganden bestaan uit primaire aminogroepen, d.w.z. dat R^ en R2 in de bovenstaande algemene formule 3 waterstofatomen voorstellen.It is also preferred that the ligands consist of primary amino groups, i.e., that R 1 and R 2 in the above general formula 3 represent hydrogen atoms.
Verder heeft het volgens de uitvinding de voorkeur 25 dat de liganddichtheid groter is dan 30 umol/ml gezwollen matrix, liefst 60-80 umol/ml gezwollen matrix.Furthermore, according to the invention it is preferred that the ligand density is greater than 30 µmol / ml swollen matrix, most preferably 60-80 µmol / ml swollen matrix.
De nieuwe werkwijze volgens de uitvinding voor het isoleren van stollingsfaktoren, zoals FII, FVII, FVIII, FIX, FX en vWF, uit een vloeibaar uitgangsmate-30 riaal zoals bloedplasma, plasmaprodukten, cellysaten en fermentatie- of kweekmedia met behulp van vloeistof-chromatografie wordt gekenmerkt doordat het nieuwe adsorbensmateriaal wordt toegepast.The novel method of the invention for isolating clotting factors, such as FII, FVII, FVIII, FIX, FX, and vWF, from a starting liquid material such as blood plasma, plasma products, cell lysates, and fermentation or culture media using liquid chromatography. characterized in that the new adsorbent material is used.
Het heeft in deze werkwijze de voorkeur dat 35 in de adsorptiestap een equilibratiebuffer en vloeibaar uitgangsmateriaal met een specifiek geleidingsvermogen beneden 20 mS/cm, liefst 13-16 mS/cm worden toegepast.It is preferred in this method that an equilibration buffer and liquid starting material with a specific conductivity below 20 mS / cm, most preferably 13-16 mS / cm, be used in the adsorption step.
8701914 * -9-8701914 * -9-
Verder heeft het de voorkeur dat een volurneverhouding matrix:uitgangsmateriaal kleiner dan 1:8, liefst ongeveer 1:10 wordt toegepast.It is further preferred that a matrix: starting material volume ratio of less than 1: 8, most preferably about 1:10, is used.
Ook wordt geprefereerd dat elutie wordt gerealiseerd 5 door het geleidingsvermogen van de buffer te verhogen, liefst met behulp van natriumchloride.It is also preferred that elution is achieved by increasing the conductivity of the buffer, preferably using sodium chloride.
Wat de pH betreft, heeft het de voorkeur dat een pH in het bereik van 6-8, liefst ca. 7 wordt aangehouden .Regarding the pH, it is preferred that a pH in the range of 6-8, preferably about 7, is maintained.
10 De voordelen die de uitvinding biedt bij de isolering van stollingsfaktoren zijn het onverwachte gevolg van het gebruik van spacers tussen de als ligande fungerende aminogroepen en het dragermateriaal, welke spacers iets korter zijn dan die van het bekende amino- 15 hexyl— Sepharose en daardoor minder hydrofoob zijn.The advantages of the invention in the isolation of coagulation factors are the unexpected consequence of the use of spacers between the amino groups acting as ligands and the support material, which spacers are slightly shorter than those of the known aminohexyl-Sepharose and therefore less be hydrophobic.
Door gebruik te maken van een relatief lange spacer, vergeleken met de bekende materialen zoals DEAE-Sephadex en DMAP-EMA (Johnson), is bij eenzelfde liganddichtheid de adsorptiecapaciteit van het FVIII-vWFBy using a relatively long spacer, compared to the known materials such as DEAE-Sephadex and DMAP-EMA (Johnson), the adsorption capacity of the FVIII-vWF is at the same ligand density.
20 complex groter. Hierdoor is de adsorptie van de gewenste eiwitten specifieker en kan een zuiverder produkt worden verkregen.20 complex bigger. As a result, the adsorption of the desired proteins is more specific and a purer product can be obtained.
Door gebruik te maken van een relatief hydrofiele spacer, vergeleken met b.v. AH-Sepharose, is bij eenzelfde 25 adsorptiecapaciteit (d.w.z. een hogere liganddichtheid) de adsorptie specifieker, terwijl tevens de elutie van FVIII-vWF beter (hogere opbrengst, beter reproduceerbaar) is. Hierdoor kan een zuiverder produkt en tevens een hogere opbrengst worden verkregen.By using a relatively hydrophilic spacer, compared to e.g. AH-Sepharose, at the same adsorption capacity (i.e., a higher ligand density), the adsorption is more specific, while also the elution of FVIII-vWF is better (higher yield, more reproducible). As a result, a purer product and also a higher yield can be obtained.
30 De drager in het adsorbensmateriaal volgens de uitvinding is bij voorkeur een agarose zoals Sepharose CL 4B, maar is niet tot een dergelijk polymeer materiaal beperkt. Bij voorkeur voldoet de drager aan de volgende verlangens: 35 1. de drager veroorzaakt in het algemeen slechts minimale interactie met de plasma eiwitten. Dit geldt zowel 8701914 • * -10- tijdens de adsorptie ter bevordering van de specifi-teit van de affiniteitsmatrix, als tijdens elutie ter verhoging van de opbrengst; 2. de drager bezit een zeer wijdmazige poriestructuur 5 met een groot inwendig oppervlak. Dit is bevorderlijk voor een hoge adsorptiecapaciteit; 3. de drager is zowel chemisch als fysisch zeer stabiel.The carrier in the adsorbent material according to the invention is preferably an agarose such as Sepharose CL 4B, but is not limited to such a polymeric material. Preferably, the carrier satisfies the following desires: 1. The carrier generally causes only minimal interaction with the plasma proteins. This applies both during the adsorption to promote the affinity matrix specificity, and during elution to increase the yield; 2. the carrier has a very wide-pore pore structure 5 with a large internal surface. This is conducive to a high adsorption capacity; 3. the support is very stable both chemically and physically.
Dit is gewenst in verband met de koppeling van het ligand, de mogelijkheid ter regeneratie voor 10 hergebruik, sterilisatie, kolomelutie, opslag, enz.; 4. de drager is niet te duur om economisch aanvaardbaar te kunnen zijn.This is desirable because of the ligand coupling, the potential for regeneration for reuse, sterilization, column elution, storage, etc .; 4. the carrier is not too expensive to be economically acceptable.
Omdat er op dit moment geen dragermateriaal 15 bekend is dat aan alle gestelde verlangens optimaal voldoet, zal een keuze gemaakt moeten worden uit een aantal minder ideale materialen. In principe zijn voor het FVIII isoleringsproces alle wateronoplosbare dragermaterialen in meer of mindere mate geschikt.Since no carrier material 15 is currently known that optimally meets all the stated requirements, a choice will have to be made from a number of less ideal materials. In principle, all water-insoluble carrier materials are suitable to a greater or lesser extent for the FVIII isolation process.
20 Een aantal voorbeelden hiervan kan worden genoemd.Some examples of this can be mentioned.
Dit aantal is niet uitputtend: 1. gecrosslinkte agaroses; 2. gecrosslinkte etheen/maleinezuuranhydride (EMA) copolymeren; 25 3. cellulose; 4. trisacryl; 5. fractogel TSK; 6. polystyreen; 7. gecrosslinkte polyvinylalcohol; 30 8. polyacrylamide; 9. silicagel; 10. gecrosslinkte polymeren gebaseerd op acrylzuur als monomeer (PMMA, poly-HEMA, enz.); 11. gecrosslinkte dextranen (Sephadex).This number is not exhaustive: 1. cross-linked agaroses; 2. cross-linked ethylene / maleic anhydride (EMA) copolymers; 3. cellulose; 4. trisacryl; 5. fractogel TSK; 6. polystyrene; 7. cross-linked polyvinyl alcohol; 8. polyacrylamide; 9. silica gel; 10. Cross-linked polymers based on acrylic acid as a monomer (PMMA, poly-HEMA, etc.); 11. cross-linked dextrans (Sephadex).
8701314 -11-8701314 -11-
Voor de in de voorbeelden toegelichte FVIII isolering werd gekozen voor gecrosslinkte agaroses als dragermateriaal in de vorm van Sepharose CL 4B.For the FVIII isolation illustrated in the examples, cross-linked agaroses were chosen as the carrier material in the form of Sepharose CL 4B.
Het ligand in het adsorbensmateriaal volgens 5 de uitvinding is bij voorkeur de primaire aminogroep-NH2, dat een relatief hoge pK-waarde heeft zodat bij een relatief hoge pH van 6-8 een grotere fractie van de liganden positief geladen is dan b.v. het geval is bij DEAE-Sephadex, DEAE-cellulose en DMAP-EMA (Johnson). 10 Om eenzelfde ladingsdichtheid (adsorptiecapaciteit) te realiseren is daardoor een lagere liganddichtheid nodig. Hierdoor is de adsorptie van de gewenste eiwitten specifieker en kan een zuiverder produkt worden verkregen. Het ligand is echter niet tot de primaire aminogroep 15 beperkt. In het algemeen zullen alle amines in meerdere of mindere mate geschikt zijn voor het beoogde doel, zodat de liganden ook uit secundaire, tertiaire of quaternaire aminogroepen kunnen bestaan.The ligand in the adsorbent material according to the invention is preferably the primary amino group NH2, which has a relatively high pK value, so that at a relatively high pH of 6-8 a larger fraction of the ligands is positively charged than e.g. this is the case with DEAE-Sephadex, DEAE cellulose and DMAP-EMA (Johnson). Therefore, to achieve the same charge density (adsorption capacity), a lower ligand density is required. As a result, the adsorption of the desired proteins is more specific and a purer product can be obtained. However, the ligand is not limited to the primary amino group 15. In general, all amines will be more or less suitable for the intended purpose, so that the ligands can also consist of secondary, tertiary or quaternary amino groups.
De wijze waarop het ligand via de spacer aan 20 het dragermateriaal is gekoppeld is evenmin tot één bepaalde koppelingsgroep en -methodiek beperkt. In beginsel komt iedere methode in aanmerking waarmee een aminogroep via een spacer aan een dragermateriaal kan worden geïmmobiliseerd. Bij voorkeur voldoet de 25 koppelingsmethode echter aan de volgende verlangens: 1. de koppeling kan eenvoudig, snel en reproduceerbaar uitgevoerd worden; 2. een hoge graad van substitutie (liganddichtheid) is haalbaar zonder het optreden van crosslinking; 30 3. de reactieomstandigheden mogen uiteraard niet destruc tief voor de matrix zijn; 4. de ontstane binding is zeer stabiel, zodat geen ligandaflek zal gaan optreden.The manner in which the ligand is coupled to the support material via the spacer is also not limited to one specific coupling group and method. In principle, any method with which an amino group can be immobilized to a carrier material via a spacer is eligible. Preferably, however, the coupling method meets the following requirements: 1. the coupling can be carried out in a simple, fast and reproducible manner; 2. a high degree of substitution (ligand density) is achievable without crosslinking; 3. the reaction conditions must of course not be destructive to the matrix; 4. The resulting bond is very stable, so that no ligand leakage will occur.
870 1 91 4 -12-870 1 91 4 -12-
Wanneer het dragermateriaal een polymeer materiaal met vrije hydroxylgroepen is, zoals b.v. bij agaroses het geval is, kan een koppeling b.v. tot stand worden gebracht met behulp van de volgende koppelingsreagentia: 5 a. cyanogeen halogeniden; b. triazines; c. perjodaat; d. (bis-)epoxydes; e. carboxyalkylhalogeniden; 10 f. divinylsulfon; g. tresyl- en tosylchloride; h. carboxydiimidazool.When the support material is a polymeric material with free hydroxyl groups, such as e.g. in case of agaroses, a coupling e.g. Established using the following coupling reagents: 5 a. Cyanogen halides; b. triazines; c. periodate; d. (bis-) epoxides; e. carboxyalkyl halides; 10 f. divinyl sulfone; g. tresyl and tosyl chloride; h. carboxydiimidazole.
Eén van de meest gebruikte koppelingsmethoden maakt gebruik van cyanogeenbromide. Hiermee werden 15 ook de reeds genoemde alkyl- en aminoalkyl-Sepharoses bereid. Deze methode voldoet echter niet aan de gestelde eisen ten aanzien van de substitutiegraad en de afwezigheid van extra lading en is daarom minder geschikt.One of the most commonly used coupling methods uses cyanogen bromide. The aforementioned alkyl and aminoalkyl Sepharoses were also prepared with this. However, this method does not meet the requirements with regard to the degree of substitution and the absence of extra cargo and is therefore less suitable.
Ook de stabiliteit is niet groot. Recentelijk werd 20 door Bethell et al (J. Biol. Chem. 254(8) (1979) 2572-2574; J. Chrom. 185(1979) 463-470; J.Chrom. 218(1981) 509-518) een methode ontwikkeld die wel aan de gestelde eisen lijkt te voldoen. Gebruik wordt gemaakt van 1,1'-carbonyl-diimidazool (CDI) als koppelingsreagens. In een eerste 25 reactiestap wordt de matrix geactiveerd en in een tweede stap kan dan b.v. een amine worden gekoppeld.The stability is also not great. Recently, Bethell et al (J. Biol. Chem. 254 (8) (1979) 2572-2574; J. Chrom. 185 (1979) 463-470; J. Chrom. 218 (1981) 509-518) developed a method that seems to meet the requirements. 1,1'-Carbonyl-diimidazole (CDI) is used as the coupling reagent. In a first reaction step the matrix is activated and in a second step e.g. an amine.
De activatie vindt plaats in watervrij organisch oplosmiddel zoals aceton, dioxaan of dimethylformamide (DMF). De hydrogel moet door oplosmiddeluitwisseling 30 hierin worden overgebracht. Door hydrolyse van de geactiveerde gel met natronloog ontstaan imidazool en koolstofdioxyde, waardoor de mate van activatie eenvoudig kan worden bepaald. De geactiveerde gel reageert zowel in organisch oplosmiddel als in water 35 met o.a. amines· in hoog rendement, zodat eenvoudig allerlei aminehoudende liganden gekoppeld kunnen worden.The activation takes place in anhydrous organic solvent such as acetone, dioxane or dimethylformamide (DMF). The hydrogel must be transferred herein by solvent exchange. Hydrolysis of the activated gel with sodium hydroxide produces imidazole and carbon dioxide, which makes it easy to determine the degree of activation. The activated gel reacts both in organic solvent and in water with, among other things, amines · in high efficiency, so that all kinds of amine-containing ligands can be easily linked.
8701914 -13-8701914 -13-
De koppeling is goed reproduceerbaar en maakt een hoge liganddichtheid mogelijk. De carbamaat (urethaan) binding die hierbij ontstaat is zeer stabiel tegen hydrolyse en bij pH hoger dan 4 ongeladen.The coupling is easily reproducible and allows a high ligand density. The resulting carbamate (urethane) bond is very stable against hydrolysis and uncharged at a pH higher than 4.
5 Deze koppelingsmethode met CDI als koppelingsreagens en de resulterende koppelingsgroep -CO-NH- hebben derhalve volgens de uitvinding de voorkeur.Accordingly, this coupling method with CDI as coupling reagent and the resulting coupling group -CO-NH- is preferred according to the invention.
Affiniteitsmatrices volgens de uitvinding met de algemene formule 3 kunnen worden bereid door een 10 diamine met behulp van CDI activering aan de drager te koppelen.Affinity matrices according to the invention of the general formula 3 can be prepared by coupling a diamine to the support by CDI activation.
De liganddichtheid van de affiniteitsmatrices volgens de uitvinding is bij voorkeur groter dan 30 umol/ml, b.v. 50-100 umol/ml gezwollen gel, liefst 50-70 umol/ml 15 gezwollen gel. Met behulp van de CDI-activeringsmethode kan gemakkelijk en reproduceerbaar een hoge liganddichtheid, zelfs wel tot ca. 200 umol/ml worden gerealiseerd.The ligand density of the affinity matrices of the invention is preferably greater than 30 µmol / ml, e.g. 50-100 µmol / ml swollen gel, most preferably 50-70 µmol / ml swollen gel. Using the CDI activation method, a high ligand density, even up to about 200 µmol / ml, can be easily and reproducibly achieved.
Een hoge liganddichtheid leidt tot een hoge adsorptieca-paciteit. Hierdoor is een lagere gel/plasmaverhouding 20 mogelijk, hetgeen lagere kosten verzekert.A high ligand density leads to a high adsorption capacity. This allows a lower gel / plasma ratio 20, which ensures lower costs.
Het vloeibare uitgangsmateriaal dat de te isoleren stollingsfaktor of -faktoren bevat en bij de werkwijze volgens de uitvinding kan worden toegepast, zal bij voorkeur bestaan uit bloedplasma, liefst vers of vers 25 ingevroren humaan bloedplasma. Voorzuiveringen en aanpassingen aan de isoleringsmethode zijn niet nodig.The liquid starting material containing the clotting factor or factors to be isolated and which can be used in the method according to the invention will preferably consist of blood plasma, most preferably fresh or freshly frozen human blood plasma. No pre-purification and adjustments to the isolation method are required.
De uitvinding is echter niet tot gebruik bij bloedplasma beperkt en kan met name ook worden toegepast voor het isoleren van de gewenste stoffen uit plasmaprodukten, 30 zoals FVIII concentraat en cryoprecipitaat, of uit cellysaten en fermentatie- of kweekmedia die bij een biotechnologische produktie van FVIII of andere stollingsfak-toren worden verkregen.However, the invention is not limited to use in blood plasma and may in particular also be used to isolate the desired substances from plasma products, such as FVIII concentrate and cryoprecipitate, or from cell lysates and fermentation or culture media used in a biotechnological production of FVIII or other clotting factors are obtained.
De isoleringsmethode volgens de uitvinding, 35 die een adsorptiestap en een elutiestap omvat, wordt 8701914 -14- bij voorkeur uitgevoerd bij normale druk en temperatuur, hoewel variaties toelaatbaar zijn. Zo kan de temperatuur zonder ernstig bezwaar in het bereik van 0-60°C worden gekozen, maar om praktische redenen heeft kamertempera-5 tuur de voorkeur. Zowel de adsorptiestap als de elutie-stap kunnen ladingsgewijs of in een kolom worden uitgevoerd. Kolomsgewijze behandeling heeft, vooral wat de elutiestap betreft, echter de voorkeur. Wat de adsorptiestap betreft, zou ladingsgewijze behandeling 10 de voorkeur kunnen hebben.The isolation method of the invention, which comprises an adsorption step and an elution step, is preferably performed at normal pressure and temperature, although variations are allowable. Thus, the temperature can be selected in the range of 0-60 ° C without serious objection, but for practical reasons room temperature is preferred. Both the adsorption step and the elution step can be carried out batchwise or in a column. Column treatment, however, is preferred, especially with regard to the elution step. As for the adsorption step, batch treatment 10 may be preferred.
Ook ten aanzien van de tijdsduur bestaan geen bijzondere beperkingen. De adsorptiestap zal b.v. van 10 min. tot 4 uur in beslag kunnen nemen, maar gewoonlijk zal de adsorptiestap 45-60 min. duren.There are also no special restrictions with regard to the duration. The adsorption step will e.g. may take from 10 min to 4 hours, but usually the adsorption step will take 45-60 min.
15 De affiniteitsmatrix wordt voor het gebruik met behulp van een buffer geëquilibreerd. Deze buffer heeft bij voorkeur dezelfde pH en hetzelfde geleidings-vermogen als het vloeibare uitgangsmateriaal dat de te isoleren stollingsfaktoren bevat. Het is in de 20 werkwijze volgens de uitvinding gunstig gebleken dat de pH tijdens het proces op een waarde van 6-8, liefst ongeveer 7 wordt gehouden en dat het specifieke gelei-dingsvermogen van zowel de equilibratiebuffer als het vloeibare uitgangsmateriaal kleiner dan 20 mS/cm, 25 liefst 13-16 mS/cm bedraagt. Deze procesomstandigheden maken mogelijk dat als uitgangsmateriaal bloedplasma als zodanig kan worden toegepast en zijn bevorderlijk voor een relatief hoge opbrengst. Ook zijn deze procesomstandigheden, met name het gebruik van een ongeveer 30 fysiologische pH, gunstig voor grootschalige toepassing (instelling van de pH van grote hoeveelheden plasma op een waarde van 5,5 is nogal bezwaarlijk) en voor de stabiliteit van de geïsoleerde stollingsfaktoren zoals FVIII:C.The affinity matrix is equilibrated using a buffer before use. This buffer preferably has the same pH and the same conductivity as the liquid starting material containing the clotting factors to be isolated. It has been found advantageous in the method according to the invention that the pH is kept at a value of 6-8, preferably about 7 during the process, and that the specific conductivity of both the equilibration buffer and the liquid starting material is less than 20 mS / cm, preferably 13-16 mS / cm. These process conditions make it possible to use blood plasma as such as starting material and are conducive to a relatively high yield. Also, these process conditions, especially the use of an approximately 30 physiological pH, are beneficial for large scale application (setting the pH of large amounts of plasma to 5.5 is quite inconvenient) and for the stability of the isolated clotting factors such as FVIII : C.
35 Wat de gel/plasmaverhouding betreft, hebben lagere waarden de voorkeur in verband met geringere 8701914 -15- kosten en een geringere aspecifieke adsorptie. In de werkwijze volgens de uitvinding wordt dan ook bij voorkeur een gel/plasmaverhouding G/P kleiner dan 1/8, liefst ongeveer 1/10 toegepast. Uitgaande van 5 plasma dat ongeveer 1 unit/ml bevat, betekent een G/P-verhouding van 1/10 dat per ml gel ongeveer 10 units stollingsfaktor wordt aangeboden.Regarding the gel / plasma ratio, lower values are preferred because of lower costs and less nonspecific adsorption. In the method according to the invention, therefore, a gel / plasma ratio G / P less than 1/8, most preferably about 1/10, is used. Assuming 5 plasma containing about 1 unit / ml, a G / P ratio of 1/10 means that about 10 units of clotting factor are offered per ml of gel.
De elutie van de geadsorbeerde stollingsfaktoren vindt plaats door het geleidingsvermogen van de buffer 10 te verhogen. Dit wordt bij voorkeur gerealiseerd door aan de buffer natriumchloride toe te voegen (b.v. tot 0,5 of 1,0 M) maar vanzelfsprekend kunnen daartoe ook andere middelen worden aangewend.The elution of the adsorbed clotting factors takes place by increasing the conductivity of the buffer 10. This is preferably achieved by adding sodium chloride to the buffer (e.g. up to 0.5 or 1.0 M), but other means can of course also be used for this purpose.
Door de combinatie van optimale procesomstandig-15 heden en plasma als uitgangsmedium worden de stollingsfaktoren FtI, FVII, FIX en FX alsmede het FVIII-vWF complex in relatief hoge opbrengst en zuiverheid geïsoleerd. Scheiding van het FVIII-VWF complex van de rest kan desgewenst in een andere processtap worden 20 uitgevoerd.Due to the combination of optimal process conditions and plasma as the starting medium, the clotting factors FtI, FVII, FIX and FX as well as the FVIII-vWF complex are isolated in relatively high yield and purity. Separation of the FVIII-VWF complex from the rest can be performed in another process step if desired.
De uitvinding zal hierna aan de hand van voorbeelden nader worden toegelicht.The invention will be explained in more detail below with reference to examples.
Voorbeelden met betrekking tot de bereiding van adsor-bensmaterialen.Examples related to the preparation of adsorbent materials.
25 Volgens de onderstaand beschreven experimenten werden met behulp van verschillende aminen derivaten van Sepharose CL 4B bereid die als adsorbensmateriaal (affiniteitsmatrix) voor de isolatie van coagulatiefak-toren, in het bijzonder uit gecitreerd humaan bloed-30 plasma, konden worden gebruikt.According to the experiments described below, derivatives of Sepharose CL 4B were prepared using various amines which could be used as adsorbent material (affinity matrix) for the isolation of coagulation factors, in particular from citrated human blood plasma.
Sepharose CL 4B werd toegepast in de vorm van een suspensie in water. Voor de syntheses moest het water effectief worden vervangen door een organisch oplosmiddel, zoals Ν,Ν-dimethylformamide (DMF). Dit 35 kon ladingsgewijze worden gerealiseerd bij relatief 8701914 -16- kleine hoeveelheden op een glasfilter, of in een kolom met grotere partijen worden uitgevoerd. Na de oplosmid-deluitwisseling werd de Sepharosematrix geactiveerd met l,l'-carbonyldiimidazool (CDI) volgens de door 5 Bethell beschreven procedure (J. Biol. Chem. 254 (1979), 2572-2574).Sepharose CL 4B was used in the form of an aqueous suspension. For the syntheses, the water had to be effectively replaced with an organic solvent, such as Ν, Ν-dimethylformamide (DMF). This could be accomplished batchwise at relatively small amounts on a glass filter, or carried out in a larger batch column. After the solvent exchange, the Sepharose matrix was activated with 1,1'-carbonyldiimidazole (CDI) according to the procedure described by Bethell (J. Biol. Chem. 254 (1979), 2572-2574).
Daarna kan direkt een alkaandiamine met de geactiveerde gel worden gekoppeld, waarbij een aminoalkyl-Sepharose wordt verkregen.Then an alkanediamine can be directly coupled to the activated gel to yield an aminoalkyl Sepharose.
10 Doordat alle Sepharose-derivaten basische aminogroepen als liganden bezitten, kan de liganddichtheid eenvoudig door zuur-base titratie of door stikstof elementair analyse worden bepaald.Since all Sepharose derivatives have basic amino groups as ligands, the ligand density can be easily determined by acid-base titration or by nitrogen elemental analysis.
De oplosmiddeluitwisseling waarbij water wordt 15 vervangen door dimethylformamide of een ander organisch oplosmiddel werd op twee verschillende wijzen uitgevoerd, afhankelijk van de toegepaste hoeveelheid hydrogel: 1. In het algemeen werd 12 ml gelsuspensie (10 ml vochtige koek) drie keer gewassen op een glasfilter 20 (G3) met gedestilleerd water en nagenoeg droog gezogen, en achtereenvolgens eenmaal gewassen met gedestilleerd water/DMF 70:30 (v/v), eenmaal met 30:70 en driemaal met DMF. Deze procedure bleek effectief te zijn voor de vervanging van water 25 in kleine hoeveelheden hydrogel.The solvent exchange in which water is replaced with dimethylformamide or another organic solvent was carried out in two different ways depending on the amount of hydrogel used: 1. Generally, 12 ml of gel suspension (10 ml of moist cake) was washed three times on a glass filter. (G3) with distilled water and vacuumed nearly dry, and washed successively once with distilled water / DMF 70:30 (v / v), once with 30:70 and three times with DMF. This procedure was found to be effective for replacing water in small amounts of hydrogel.
2. In andere gevallen werd tot 400 ml van de gel (480 ml suspensie) gegoten in een glaskolom (26x750 mm) en werd de kolom met twee kolomvolumes gedestilleerd water gewassen. Daarna werd een lineaire water/DMF 30 gradient (400 ml) van 0-100% DMF aangebracht om het water te vervangen en tenslotte werd de gel gewassen met ongeveer 1 volumehoeveelheid DMF totdat het effluent volledig watervrij was (hetgeen door wateranalyse van het effluent werd gecontroleerd).2. In other cases, up to 400 ml of the gel (480 ml of suspension) was poured into a glass column (26x750 mm) and the column was washed with two column volumes of distilled water. Then a linear water / DMF gradient (400 ml) of 0-100% DMF was applied to replace the water and finally the gel was washed with about 1 volume by volume DMF until the effluent was completely anhydrous (which became by water analysis of the effluent checked).
35 De CDI activering werd uitgevoerd door de gel te suspenderen in een gelijke hoeveelheid DMF (v/v) en een bekende hoeveelheid CDI toe te voegen, gebaseerd 8701914 * -17- op het oorspronkelijke gelvolume in water (b.v. 0,1 mmol/ml gel). De suspensie werd gedurende tenminste 20 min. bij kamertemperatuur zorgvuldig geroerd of geschud en de geactiveerde gel werd drie keer op een glasfilter 5 met dezelfde hoeveelheid DMF gewassen.The CDI activation was performed by suspending the gel in an equal amount of DMF (v / v) and adding a known amount of CDI based on 8701914 * -17- on the original gel volume in water (eg 0.1 mmol / ml gel). The suspension was carefully stirred or shaken at room temperature for at least 20 min and the activated gel was washed three times on a glass filter 5 with the same amount of DMF.
De aminekoppeling werd uitgevoerd in het organische oplosmiddel (DMF, dioxan, aceton) of in waterige oplossing, afhankelijk van de oplosbaarheid van het amine en de eigenschappen van de gel. Daartoe werd een bekende 10 hoeveelheid (in het algemeen tenminste vijf keer de gewenste totale liganddichtheid (TLD)) van het amine opgelost in een volumehoeveelheid van het oplosmiddel en daarna aan dezelfde volumehoeveelheid van geactiveerde gel toegevoegd, waarna gedurende de gewenste tijd 15 zorgvuldig bij kamertemperatuur geroerd of geschud werd.The amine coupling was performed in the organic solvent (DMF, dioxane, acetone) or in aqueous solution, depending on the solubility of the amine and the properties of the gel. To this end, a known amount (generally at least five times the desired total ligand density (TLD)) of the amine was dissolved in a volume amount of the solvent and then added to the same volume amount of activated gel, then carefully at room temperature for the desired time. stirred or shaken.
Om de overmaat amine na de koppeling te verwijderen, werd de gel met het oplosmiddel, 0,1 N zoutzuur, 0,1 N natriumhydroxide en gedestilleerd water gewassen.To remove the excess amine after coupling, the gel was washed with the solvent, 0.1 N hydrochloric acid, 0.1 N sodium hydroxide and distilled water.
20 De hydrogels werden bij 4°C bewaard in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die 0,01% thimerosal bevatte, of ook wel in adsorptiebuffer in plaats van PBS.The hydrogels were stored at 4 ° C in phosphate buffered saline (PBS) containing 0.01% thimerosal, or in adsorption buffer instead of PBS.
De titratie werd normaal uitgevoerd met 4-8 ml 25 van de hydrogel. Het gelvolume werd bepaald na 10 min. centrifugeren bij 1500 x g en 30 min. wachttijd. De gel werd geëquilibreerd met 0,05 N natriumhydroxyde door daarmee drie keer te wassen, werd drooggezogen op een glasfilter, werd gesuspendeerd in 50 ml gedestil-30 leerd water en werd geroerd. Daarna werd 0,100 N zoutzuur toegevoegd met een stroomsnelheid van 0,125 ml/min. en de pH en het geleidingsvermogen werden gemeten en geregistreerd. De ionenuitwisselingscapaciteit (voor geladen liganden is deze gelijk aan de totale 8701914 -18- liganddichtheid (TLD)) kon uit de kromme van het gelei-dings-vermogen (die duidelijk het beginpunt en het eindpunt van de titratie toont) en het gelvolume worden berekend; de schijnbare pK-waarde werd uit de pH-kromme 5 op de helft van de titratie verkregen bij een geleidings-vermogen van 5 mS/cm. Voor een bekend gelvolume kan de liganddichtheid (LD) worden berekend.Titration was normally performed with 4-8 ml of the hydrogel. Gel volume was determined after centrifugation at 1500 x g for 10 min and waiting time for 30 min. The gel was equilibrated with 0.05 N sodium hydroxide by washing three times with it, sucked dry on a glass filter, suspended in 50 ml of distilled water and stirred. 0.100 N hydrochloric acid was then added at a flow rate of 0.125 ml / min. and the pH and conductivity were measured and recorded. The ion exchange capacity (for charged ligands this is equal to the total 8701914-18 ligand density (TLD)) could be calculated from the conductivity curve (which clearly shows the start and end points of the titration) and the gel volume ; the apparent pK value was obtained from the pH curve 5 at half the titration at a conductivity of 5 mS / cm. Ligand density (LD) can be calculated for a known gel volume.
Het gelvolume (GV) van de gelderivaten werd normaal in PBS bepaald tenzij anders is aangegeven.The gel volume (GV) of the gel derivatives was normally determined in PBS unless otherwise indicated.
10 In een 15 ml polystyreenbuis met een ml schaalverdeling werd ongeveer 7 ml gelsuspensie gedurende 10 min. bij 2000 omwentelingen per minuut gecentrifugeerd.In a 15 ml polystyrene tube with a ml graduation, about 7 ml of the gel suspension was centrifuged at 2000 revolutions per minute for 10 min.
Daarna liet men de neergeslagen gel gedurende tenminste 15 min. bij kamertemperatuur staan en werd het volume 15 (+ 0,2 ml) afgelezen. Wanneer de gel zich in een orga nisch oplosmiddel (zoals DMF) bevindt, wordt normaal het oorspronkelijke volume in een waterige oplossing gegeven.The precipitated gel was then allowed to stand at room temperature for at least 15 min and the volume 15 (+ 0.2 ml) was read. When the gel is in an organic solvent (such as DMF), the original volume is normally given in an aqueous solution.
Primaire aminoalkyl-Sepharoses met verschillende alkyl-20 ketenlengtenPrimary aminoalkyl Sepharoses with different alkyl-20 chain lengths
Een reeks aminoalkaan-Sepharoses (An-CDI-SEPH) met verschillende alkylketenlengten werd bereid door de activering van 10 ml Sepharose CL 4B met 0,32 g CDI (0,2 mmol/ml) in DMF (activeringsreactietijd (ART) 25 gelijk aan 20 min.) en koppeling met 5 mmol amine in DMF (koppelingsreactietijd (CRT) gelijk aan 40 min.). Oplosmiddeluitwisseling werd op een glasfilter uitgevoerd. De resultaten van deze synthese worden in tabel 1 getoond. Deze reeks gels (met een liganddichtheid 30 van 52 _+ 5 umol/ml) werd gebruikt om de invloed van de alkylketenlengte op de faktor VIII adsorptie en elutie te onderzoeken. De koppelingsopbrengst vergeleken met de toegevoegde hoeveelheid CDI, bedroeg voor deze reeks 17 + 2% (TLD=328 + 43 umol; GV=6,3 + 0,6 ml, 35 uit 8 experimenten).A series of aminoalkane Sepharoses (An-CDI-SEPH) of different alkyl chain lengths was prepared by the activation of 10 ml Sepharose CL 4B with 0.32 g CDI (0.2 mmol / ml) in DMF (activation reaction time (ART) equal to 20 min.) And coupling with 5 mmol amine in DMF (coupling reaction time (CRT) equal to 40 min.). Solvent exchange was performed on a glass filter. The results of this synthesis are shown in Table 1. This series of gels (with a ligand density of 52 + 5 µmol / ml) was used to investigate the influence of the alkyl chain length on factor VIII adsorption and elution. The coupling yield compared to the added amount of CDI for this series was 17 + 2% (TLD = 328 + 43 µmol; GV = 6.3 + 0.6 ml, 35 from 8 experiments).
870 191 4 -19-870 191 4 -19-
Tafael 1. Eigenschappen van aminoalkyl-Sepharoses (An-CDI-SEPH).Table 1. Properties of Aminoalkyl Sepharoses (An-CDI-SEPH).
GEL CODE TLD GV LD 1 pKa XN DS DSC LD 2 umol ml umol/ml mg/g mol/mol mg/ml umol/ml A2-11.10.85 371 7.0 53 6.0 26.5 0.315 53.2 50 5 A3-09.10.85 290 6.3 46 8.0 23.2 0.276 51.4 43 A4-09.10.85 347 6.3 55 8.4 14.7 0.171 45.2 24 A5-10.10.85 413 7.0 59 8.9 30.0 0.380 52.9 57 A6-10.10.85 318 6.0 53 9.1 7.2 0.082 55.2 14 A7-16.10.85 294 7.0 42 8.7 27.3 0.352 48.6 47 10 A8-11.10.85 275 5.4 51 8.6 22.7 0.288 67.2 55 A9-16.10.85 314 5.6 56 8.0 29.2 0.395 65.5 68 1 afgeleid uit het titratieresultaat 2 afgeleid uit elementanalyseGEL CODE TLD GV LD 1 pKa XN DS DSC LD 2 umol ml umol / ml mg / g mol / mol mg / ml umol / ml A2-11.10.85 371 7.0 53 6.0 26.5 0.315 53.2 50 5 A3-09.10.85 290 6.3 46 8.0 23.2 0.276 51.4 43 A4-09.10.85 347 6.3 55 8.4 14.7 0.171 45.2 24 A5-10.10.85 413 7.0 59 8.9 30.0 0.380 52.9 57 A6-10.10.85 318 6.0 53 9.1 7.2 0.082 55.2 14 A7-16.10.85 294 7.0 42 8.7 27.3 0.352 48.6 47 10 A8-11.10.85 275 5.4 51 8.6 22.7 0.288 67.2 55 A9-16.10.85 314 5.6 56 8.0 29.2 0.395 65.5 68 1 derived from the titration result 2 derived from elemental analysis
Aminobutyl-Sepharoses met verschillende liganddichtheden 15 Om de optimale liganddichtheid voor faktor VIIIAminobutyl-Sepharoses with different ligand densities 15 To get the optimal ligand density for factor VIII
isolatie met aminobutyl-Sepharose (A4-CDI-SEPH) te bepalen, werd een reeks gels bereid waarbij verschillende hoeveelheden CDI werd gebruikt voor de activering van 10 ml Sepharose CL 4B in DMF (ART=20 min.) en 20 koppeling met 1,4-butaandiamine in DMF (CDI/amine=2/5; CRT-40 min.). De oplosmiddeluitwisseling werd uitgevoerd op een glasfilter. De resultaten van deze synthese worden in tabel 2 getoond.to determine isolation with aminobutyl-Sepharose (A4-CDI-SEPH), a series of gels was prepared using different amounts of CDI for the activation of 10 ml Sepharose CL 4B in DMF (ART = 20 min.) and coupling with 1, 4-butanediamine in DMF (CDI / amine = 2/5; CRT-40 min.). The solvent exchange was performed on a glass filter. The results of this synthesis are shown in Table 2.
87019148701914
Tabel 2. Synthese van aminobutyl-Sepharose (A4-CDI-SEPH) met verschillende hoeveelheden CDI: glasfilter-oplosmiddeluitwisseling -20-Table 2. Synthesis of Aminobutyl Sepharose (A4-CDI-SEPH) with Different Amounts of CDI: Glass Filter-Solvent Exchange -20-
GEL CODE CDI TLD OPBRENGST GV LD 1 pKGEL CODE CDI TLD YIELD GV LD 1 pK
umol umol % ml umol/ml 5 A4-14.11.85.1 154 63 41 9.0 7 A4-12.11.85.1 308 93 30 9.3 10 9.3 A4-12.ll.85.2 617 128 21 8.0 16 9.0 A4-01.11.85.1 925 198 21 7.9 25 9.0 A4-11.12.85.1 1230 270 22 7.1 38 8.5 10 A4-11.12.85.2 1540 333 22 6.8 49 8.3 A4-09.10.85 1973 380 19 6.9 55 7.3 A4-13.02.86.1 2160 409 19 6.7 61 A4-13.02.86.2 2470 494 20 6.5 76 A4-01.ll.85.2 3700 557 15 5.3 105 8.9 15 A4-14.ll.85.2 7400 681 9 4.1 166 9.2 1 gemiddelde waarde uit 2 bepalingenumol umol% ml umol / ml 5 A4-14.11.85.1 154 63 41 9.0 7 A4-12.11.85.1 308 93 30 9.3 10 9.3 A4-12.ll.85.2 617 128 21 8.0 16 9.0 A4-01.11.85.1 925 198 21 7.9 25 9.0 A4-11.12.85.1 1230 270 22 7.1 38 8.5 10 A4-11.12.85.2 1540 333 22 6.8 49 8.3 A4-09.10.85 1973 380 19 6.9 55 7.3 A4-13.02.86.1 2160 409 19 6.7 61 A4-13.02 .86.2 2470 494 20 6.5 76 A4-01.ll.85.2 3700 557 15 5.3 105 8.9 15 A4-14.ll.85.2 7400 681 9 4.1 166 9.2 1 mean value from 2 determinations
Ook werden enkele grotere hoeveelheden aminobutyl-Sepharose bereid na oplosmiddeluitwisseling in een kolom. Het watergehalte in het DMF tijdens 20 de activering met CDI bedroeg ongeveer 0,137» (w/w) .Also some larger amounts of aminobutyl Sepharose were prepared after solvent exchange in a column. The water content in the DMF during the activation with CDI was about 0.137% (w / w).
Het 1,4-butaandiamine werd gekoppeld in DMF (CDI/aminea=2/5) . De gegevens staan vermeld in tabel 3.The 1,4-butanediamine was coupled in DMF (CDI / aminea = 2/5). The data are listed in Table 3.
8701914 ί8701914 ί
Tabel 3. Synthese van aminobutyl-Sepharose (A4-CDI-8EPH) met verschillende hoeveelheden CDI: oplosmiddeluitwisseling in een kolom* -21-Table 3. Synthesis of aminobutyl Sepharose (A4-CDI-8EPH) with different amounts of CDI: solvent exchange in a column * -21-
GEL CODE SEPH. CDI ART GV 1 CRT TLD OPBR. GV LDGEL CODE SEPH. CDI ART GV 1 CRT TLD OPBR. GV LD
ml mmol hours ml hours mmol % ml umol/ml 5 A4-06.03.86 100 18.5 0.3 100 0.6 8.7 47 67 130 A4-13.03.86.1 100 8.6 0.3 75 17 3.2 50 47 68 A4-13.03.86.2 12.5 0.6 0.46 43 9.1 50 A4-13.03.86.3 12.5 niet gekoppeld A4-03.06.86.1 350 30.2 16 10 1 0.19 22 5.8 32 10 A4-03.06.86.2 10 4 0.20 23 5.1 39 A4-03.06.86.3 330 17 9.2 32 230 40 A4-23.10.86 2 100 10.9 22 100 7 4.9 45 64 77 A4-15.12.86.2 3 700 84 1.5 440 0.2 28.9 55 390 74 A6-15.12.86.2 3 71 0.2 4.4 52 59 75ml mmol hours ml hours mmol% ml umol / ml 5 A4-06.03.86 100 18.5 0.3 100 0.6 8.7 47 67 130 A4-13.03.86.1 100 8.6 0.3 75 17 3.2 50 47 68 A4-13.03.86.2 12.5 0.6 0.46 43 9.1 50 A4-13.03.86.3 12.5 not linked A4-03.06.86.1 350 30.2 16 10 1 0.19 22 5.8 32 10 A4-03.06.86.2 10 4 0.20 23 5.1 39 A4-03.06.86.3 330 17 9.2 32 230 40 A4-23.10. 86 2 100 10.9 22 100 7 4.9 45 64 77 A4-15.12.86.2 3 700 84 1.5 440 0.2 28.9 55 390 74 A6-15.12.86.2 3 71 0.2 4.4 52 59 75
15 i gecorrigeerd voor gelkrimp in DMF15 i corrected for gel shrinkage in DMF
2 uit SEPH.25.09.86 3 CDl/amine verhouding 1/252 from SEPH.25.09.86 3 CD1 / amine ratio 1/25
Invloed van water op de CDI activering en de aminekoppeling Om de invloed van water tijdens de CDI activering 20 te onderzoeken, werd het water in een partij van 400 mlInfluence of water on the CDI activation and the amine coupling To investigate the influence of water during the CDI activation, the water was mixed in a batch of 400 ml
Sepharose CL 4B in een kolom vervangen door DMF·(SEPH.25.09.86).Sepharose CL 4B in a column replaced with DMF (SEPH.25.09.86).
Het watergehalte in het bovenstaande DMF bedroeg 0,13%.The water content in the above DMF was 0.13%.
Daarna werd aan 10 ml porties van de partij een bekende hoeveelheid water en DMF toegevoegd in een totaal 25 volume van 45 ml, werd het watergehalte in het bovenstaande DMF (35 ml) opnieuw bepaald, werd de gelsuspensie (10 ml) geactiveerd met 2,2 mmol CDI (ART=180 min.) en gekoppeld met 5,5 mmol 1,4-butaandiamine (CRT-60 min.).Then to 10 ml portions of the batch a known amount of water and DMF was added in a total volume of 45 ml, the water content in the above DMF (35 ml) was determined again, the gel suspension (10 ml) was activated with 2, 2 mmol CDI (ART = 180 min.) And coupled with 5.5 mmol 1,4-butanediamine (CRT-60 min.).
De resultaten zijn vermeld in tabel 4.The results are shown in Table 4.
8701914 -22-8701914 -22-
Tabel 4. Synthese van aminobutyl-Sepharose (A4-CDI-SEPH.) met verschillende hoeveelheden water tijdens activering.Table 4. Synthesis of aminobutyl Sepharose (A4-CDI-SEPH.) With different amounts of water during activation.
GEL CODE WATER 1 WATER 2 TLD OPBRENGST GV LDGEL CODE WATER 1 WATER 2 TLD YIELD GV LD
% % umol % ml umol/ml 5 'A4-02.10.86.1 0.00 0.13 869 40 4.8 183 A4-02.10.86.2 0.11 0.26 533 24 5.8 92 A4-02.10.86.3 0.22 0.36 435 20 6.0 72 A4-02.10.86.4 0.67 0.83 285 13 8.0 36 A4-02.10.86.5 1.11 1.33 193 9 8.8 22 10 1 toegevoegde hoeveelheid water 2 vastgestelde hoeveelheid water%% umol% ml umol / ml 5 'A4-02.10.86.1 0.00 0.13 869 40 4.8 183 A4-02.10.86.2 0.11 0.26 533 24 5.8 92 A4-02.10.86.3 0.22 0.36 435 20 6.0 72 A4-02.10.86.4 0.67 0.83 285 13 8.0 36 A4-02.10.86.5 1.11 1.33 193 9 8.8 22 10 1 added amount of water 2 set amount of water
Twee partijen Sepharose CL 4B (SEPH 25.09.86) van elk 50 ml werden geactiveerd met 5,43 mmol GDI (ART=180 min.) en gebruikt voor het bepalen van de 15 invloed van water in DMF tijdens de aminekoppeling.Two batches of Sepharose CL 4B (SEPH 25.09.86) of 50 ml each were activated with 5.43 mmol GDI (ART = 180 min.) And used to determine the influence of water in DMF during the amine coupling.
Aan CDI-SEPH porties van 7,1 ml (gecorrigeerd voor krimp in DMF) werd een bekende hoeveelheid water toegevoegd voorafgaande aan de reactie met 2 mmol 1,4-butaandia-mine (CRT=40 min.). Het effekt van het watergehalte 20 wordt in tabel 5 getoond. Ook werden verschillende CDI/amineverhoudingen gebruikt zoals in tabel 6 wordt getoond.To 7.1 ml CDI-SEPH portions (corrected for DMF shrinkage), a known amount of water was added prior to the reaction with 2 mmole 1,4-butanediamine (CRT = 40 min.). The effect of the water content 20 is shown in Table 5. Different CDI / amine ratios were also used as shown in Table 6.
8701 9 1 4 ί8701 9 1 4 ί
Tabel 5. Synthese van aminobutyl-Sepharose (A4-CDI-SEPH.) met verschillende hoeveelheden water tijdens de aminekop.peling.Table 5. Synthesis of aminobutyl Sepharose (A4-CDI-SEPH.) With different amounts of water during the amine coupling.
-23--23-
GEL CODE WATER 1 WATER 2 TLD OPBRENGST GV LDGEL CODE WATER 1 WATER 2 TLD YIELD GV LD
% % umol % ml umol/ml 5 A4-12.10.86.1 0.0 0.13 303 39 4.3 70 A4-12.10.86.2 0.0 0.13 317 41 4.6 69 A4-12.10.86.3 3.2 313 41 4.9 64 A4-12.10.86.4 6.3 299 39 5.0 60 A4-12.10.86.5 57.0 190 25 6.5 29 10 A4-17.ll.86.1 0.0 0.13 298 39 4.1 73 A4-17.ll.86.2 17.0 3Q5 40 6.4 49 A4-17.ll.86.3 29.0 210 27 5.7 37 A4-17.11.86.4 35.0 230 30 6.1 38 A4-17.ll.86.5 40.0 222 29 6.1 36 15 A4-17.11.86.6 50.0 209 27 6.0 35 1 toegevoegde hoeveelheid water 2 vastgestelde hoeveelheid water%% umol% ml umol / ml 5 A4-12.10.86.1 0.0 0.13 303 39 4.3 70 A4-12.10.86.2 0.0 0.13 317 41 4.6 69 A4-12.10.86.3 3.2 313 41 4.9 64 A4-12.10.86.4 6.3 299 39 5.0 60 A4-12.10.86.5 57.0 190 25 6.5 29 10 A4-17.ll.86.1 0.0 0.13 298 39 4.1 73 A4-17.ll.86.2 17.0 3Q5 40 6.4 49 A4-17.ll.86.3 29.0 210 27 5.7 37 A4 -17.11.86.4 35.0 230 30 6.1 38 A4-17.ll.86.5 40.0 222 29 6.1 36 15 A4-17.11.86.6 50.0 209 27 6.0 35 1 added amount of water 2 set amount of water
Tabel 6. Synthese van aminobutyl-Sepharose (A4-CDI-SEPH.) bij verschillende CDIiamineverhoudingen.Table 6. Synthesis of aminobutyl Sepharose (A4-CDI-SEPH.) At different CDIiamine ratios.
20 GEL CODE TLD GV LD 1 GDI: XN DS DSC LD 2 umol ml umol/ml amine mg/g mol/mol mg/ml umol/ml A4-12.10.86.1 303 4.3 70 2:5 35,4 0.45 53.8 68 A4-12.10.86.6 344 5.0 69 1:10 39.3 0.51 50.5 71 A4-17.ll.86.1 298 4.1 73 2:5 34.6 0.44 59.1 73 25 A4-17.11.86.7 383 5.1 75 1:28 43.1 0.57 46.8 72 1 afgeleid uit het titratieresultaat 2 afgeleid uit elementanalyse 8701914 -24-20 GEL CODE TLD GV LD 1 GDI: XN DS DSC LD 2 umol ml umol / ml amine mg / g mol / mol mg / ml umol / ml A4-12.10.86.1 303 4.3 70 2: 5 35.4 0.45 53.8 68 A4 -12.10.86.6 344 5.0 69 1:10 39.3 0.51 50.5 71 A4-17.ll.86.1 298 4.1 73 2: 5 34.6 0.44 59.1 73 25 A4-17.11.86.7 383 5.1 75 1:28 43.1 0.57 46.8 72 1 derived from the titration result 2 derived from element analysis 8701914 -24-
Secundaire en tertiaire amines als ligande.Secondary and tertiary amines as a ligand.
Ook werden verschillende secundaire en tertiaire diamines aan Sepharose CL 4B gekoppeld. De oplosmid-deluitwisseling werd uitgevoerd op een glasfilter, 5 Sepharose (250 ml) werd geactiveerd met CDI (44,8 mmol, ART=60 min.) in DMF en 25 ml porties van de geactiveerde gel (CDI-SEPH 08.07.86) werden gekoppeld met 12 mmol amine in DMF (CRT=180 min.). De resultaten van deze synthese worden in tabel 7 getoond. Het watergehalte e 10 in DMF tijdens de activering bedroeg 2,67o (w/w) . De koppelingsopbrengst was 22 +_ 5%; LD=52 +_ 11 umol/ml; GV=19 + 1 ml (9 experimenten).Several secondary and tertiary diamines were also coupled to Sepharose CL 4B. The solvent exchange was performed on a glass filter, 5 Sepharose (250 ml) was activated with CDI (44.8 mmol, ART = 60 min.) In DMF and 25 ml aliquots of the activated gel (CDI-SEPH 08.07.86) were coupled with 12 mmol of amine in DMF (CRT = 180 min.). The results of this synthesis are shown in Table 7. The water content e 10 in DMF during activation was 2.67o (w / w). The coupling yield was 22 ± 5%; LD = 52 + 11 µmol / ml; GV = 19 + 1 ml (9 experiments).
Tabel 7. Eigenschappen van secundaire en tertiaire aminoalkyl-SepharosesTable 7. Properties of secondary and tertiary aminoalkyl Sepharoses
GEL CODE CDI TLD OPBRENGST GV LD pKGEL CODE CDI TLD YIELD GV LD pK
15 mmol mmol % ml umol/ml DBA3-SEPH.15.07.86 4.48 1.18 26 21.4 55 8.5 DEA2-SEPH.15.07.86 4.48 1.05 23 19.1 55 8.1 DEA3-SEPH.15.07.86 4.48 1.01 23 18.0 56 8.9 DEA5-SEPH.15.07.86 4.48 0.50 11 19.2 26 9.7 20 DMA2-SEPH.15.07.86 4.48 1.04 23 18.2 57 6.4 DMA3-SEPH.15.07.86 4.48 1.18 26 19.3 61 8.3 EA2-SEPH.15.07.86 4.48 1.04 23 18.0 58 8.3 DMA6-SEPH.15.07.86 4.48 0.67 15 17.5 38 9.5 MA3-SEPH.15.07.86 4.48 1.27 28 20.1 63 9.1 25 CDI-SEPH.08.07.86 4.48 2.65 59 23.0 11515 mmol mmol% ml umol / ml DBA3-SEPH.15.07.86 4.48 1.18 26 21.4 55 8.5 DEA2-SEPH.15.07.86 4.48 1.05 23 19.1 55 8.1 DEA3-SEPH.15.07.86 4.48 1.01 23 18.0 56 8.9 DEA5-SEPH .15.07.86 4.48 0.50 11 19.2 26 9.7 20 DMA2-SEPH.15.07.86 4.48 1.04 23 18.2 57 6.4 DMA3-SEPH.15.07.86 4.48 1.18 26 19.3 61 8.3 EA2-SEPH.15.07.86 4.48 1.04 23 18.0 58 8.3 DMA6-SEPH.15.07.86 4.48 0.67 15 17.5 38 9.5 MA3-SEPH.15.07.86 4.48 1.27 28 20.1 63 9.1 25 CDI-SEPH.08.07.86 4.48 2.65 59 23.0 115
Dimethylaminopropyl-Sepharoses met verschillende liganddicht-heden.Dimethylaminopropyl Sepharoses with different ligand densities.
Om de optimale liganddichtheid voor faktor VIII isolatie op dimethylaminopropyl-Sepharose (DMA3-CDI-30 SEPH) te bepalen werd een reeks gels bereid waarbij verschillende hoeveelheden CDI voor de activering van 25 ml Sepharose CL 4B in DMF (ART=90 min.) en 8701914 -25- koppeling met 30 mmol N,N-dimethyl-3-aminopropyl-amine in DMF (CRTs90 min.) werden gebruikt. De oplosmid-deluitwisseling werd op een glasfilter uitgevoerd.To determine the optimal ligand density for factor VIII isolation on dimethylaminopropyl-Sepharose (DMA3-CDI-30 SEPH), a series of gels was prepared using different amounts of CDI for the activation of 25 ml Sepharose CL 4B in DMF (ART = 90 min.) And 8701914 -25 coupling with 30 mmol N, N-dimethyl-3-aminopropylamine in DMF (CRTs 90 min.) Were used. The solvent exchange was performed on a glass filter.
Het watergehalte in DMF tijdens de activering bedroeg 5 3,1% (w/w). De resultaten van deze synthese zijn in tabel 8 weergegeven (GV*=20,6 + 7 ml (10 experimenten).The water content in DMF during activation was 3.1% (w / w). The results of this synthesis are shown in Table 8 (GV * = 20.6 + 7 ml (10 experiments).
Tabel 8. Synthese van dimethylaminopropyl-Sepharose (DMA3-CDI-SEPH.) met verschillende hoeveelheden CDI.Table 8. Synthesis of dimethylaminopropyl-Sepharose (DMA3-CDI-SEPH.) With different amounts of CDI.
GEL CODE CDI TLD OPBRENGST GV LDGEL CODE CDI TLD YIELD GV LD
10 mmol mmol % ml umol/ml DMA3-09.07.86.1 0.62 0.27 44 20.5 13 DMA3-09.07.86.2 1.23 0.38 31 20.0 19 DMA3-09.07.86.3 1.85 0.53 29 21.0 25 DMA3-09.07.86.4 2.47 0.53 21 21.0 25 15 DMA3-09.07.86.5 3.08 0.74 24 21.0 35 DMA3-09.07.86.6 3.70 0.84 23 20.5 41 DMA3-Q9.07.86.7 4.62 0.88 19 19.5 45 DMA3-09.07.86.8 6.17 1.21 20 22.0 55 DMA3-09.07.86.9 9.25 1.41 15 21.0 67 20 DMA3-09.07.86.10 12.33 1.50 12 19.5 7710 mmol mmol% ml umol / ml DMA3-09.07.86.1 0.62 0.27 44 20.5 13 DMA3-09.07.86.2 1.23 0.38 31 20.0 19 DMA3-09.07.86.3 1.85 0.53 29 21.0 25 DMA3-09.07.86.4 2.47 0.53 21 21.0 25 15 DMA3 -09.07.86.5 3.08 0.74 24 21.0 35 DMA3-09.07.86.6 3.70 0.84 23 20.5 41 DMA3-Q9.07.86.7 4.62 0.88 19 19.5 45 DMA3-09.07.86.8 6.17 1.21 20 22.0 55 DMA3-09.07.86.9 9.25 1.41 15 21.0 67 20 DMA3-09.07.86.10 12.33 1.50 12 19.5 77
In de gelcodes worden de aard van de gel en zijn bereidingsdatum gespecificeerd. De gebruikte afkortingen hebben de volgende betekenissen: A2 - aminoethyl 25 A3 - aminopropyl A4 - aminobutyl A5 - aminopentyl A6 - aminohexyl A7 - aminoheptyl 30 A8 - aminooctyl A9 - aminononyl 8701914 % -26- DBA3 - Ν,Ν-dibutylaminopropyl DEA2 - Ν,Ν-diethylaminoethyl DEA3 - Ν,Ν-diethylaminopropyl DEA5 - N,N-diethyl-2-aminopentyl 5 DMA2 - Ν,Ν-dimethylaminoethyl DMA3 - Ν,Ν-dimethylaminopropyl EA2 - N-ethylaminoethyl DMA6 - N,N'-dimethyl-1,6-aminohexyl MA3 - N-methylaminopropyl 10 Voorbeelden met betrekking tot de faktor VIII isolering.The gel codes specify the nature of the gel and its preparation date. The abbreviations used have the following meanings: A2 - aminoethyl 25 A3 - aminopropyl A4 - aminobutyl A5 - aminopentyl A6 - aminohexyl A7 - aminoheptyl 30 A8 - aminooctyl A9 - aminononyl 8701914% -26- DBA3 - Ν, Ν-dibutylaminopropyl DEA2 Ν-diethylaminoethyl DEA3 - Ν, Ν-diethylaminopropyl DEA5 - N, N-diethyl-2-aminopentyl 5 DMA2 - Ν, Ν-dimethylaminoethyl DMA3 - Ν, Ν-dimethylaminopropyl EA2 - N-ethylaminoethyl DMA6 - N, N'- 1,6-aminohexyl MA3 - N-methylaminopropyl Examples related to factor VIII isolation.
In de onderstaand beschreven experimenten werd een adsorbensmateriaal (ook wel affiniteitmatrix of gel genoemd) gebruikt dat geëquilibreerd werd met en gesuspendeerd in adsorptiebuffer. Daarna werden 15 in eenvoudige adsorptie-experimenten de gel en een normale plasmavoorraad (NPP) hetzij kolomsgewijze hetzij ladingsgewijze geincubeerd bij verschillende gel/plasmaverhoudingen onder bepaalde condities.In the experiments described below, an adsorbent material (also referred to as an affinity matrix or gel) was used which was equilibrated with and suspended in adsorption buffer. Thereafter, in simple adsorption experiments, the gel and a normal plasma stock (NPP) were incubated either columnwise or batchwise at different gel / plasma ratios under certain conditions.
Gels die een hoge faktor VIII adsorptie (boven 20 75% bij een G/P verhouding van 1:8) vertoonden werden opnieuw geincubeerd en daarna kolomsgewijze geëlueerd met 1 M natriumchloride in buffer. Het faktor VIII gehalte in het eluaat en de totale eiwitconcentratie werden bepaald, waarbij de normale plasmavoorraad 25 als referentie werd genomen. Uit deze gegevens konden gemakkelijk de faktor VIII terugwinning en de zuiveringsfaktor (PUR) worden verkregen. In het geval dat als referentie een standaard werd gebruikt (voor FVIII:C de CLB-PS41 en voor het eiwit humaan serum albumine), kon de specifieke 30 activiteit worden bepaald (tabel 12).Gels exhibiting high factor VIII adsorption (above 75% at a G / P ratio of 1: 8) were incubated again and then eluted columnwise with 1 M sodium chloride in buffer. The factor VIII content in the eluate and the total protein concentration were determined taking the normal plasma stock as reference. From this data, the factor VIII recovery and the purification factor (PUR) could easily be obtained. In case a standard was used as reference (for FVIII: C the CLB-PS41 and for the protein human serum albumin), the specific activity could be determined (Table 12).
Voor gels met veelbelovende resultaten werden ook de terugwinning en specifieke activiteit in het eluaat van faktor II, VII, IX en X bepaald omdat deze coagulatiefaktoren eveneens aan de gel kunnen worden 35 geadsorbeerd en worden geëlueerd.For gels with promising results, the recovery and specific activity in the eluate of factor II, VII, IX and X were also determined because these coagulation factors can also be adsorbed on the gel and eluted.
8701914 τ -27-8701914 τ -27-
De normale plasmavoorraad (NPP) werd verkregen door vers gecitreerd plasma (CPDA-1 plasma) van ten minstel5 donoren samen te voegen (humaan serumalbumine HSA=39,6 1,0 mg/ml; IgG=ll,8 +_ 0,4 mg/ml; 3 voorraden).Normal plasma stock (NPP) was obtained by pooling freshly citrated plasma (CPDA-1 plasma) from at least 5 donors (human serum albumin HSA = 39.6 1.0 mg / ml; IgG = 11.8 + 0.4 mg / ml; 3 stocks).
5 Voorafgaande aan het invriezen werd, indien nodig, de pH met 1 N azijnzuur op 7,4 ingesteld. In het geval van pH 5,5 werd azijnzuur kort voor het gebruik aan het plasma toegevoegd om de gewenste pH te verkrijgen.Before freezing, if necessary, the pH was adjusted to 7.4 with 1 N acetic acid. In the case of pH 5.5, acetic acid was added to the plasma shortly before use to obtain the desired pH.
Ladingsgewijze adsorptie.Batch adsorption.
10 De te testen hydrogel werd geëquilibreerd op een glasfilter met een 0,1 M acetaat/lysinebuffer bij een gewenste pH en gesuspendeerd in 1,2 keer het gelvolume. Een bekende hoeveelheid van deze suspensie werd "end over end" geincubeerd in een kunststofbuis 15 met humaan plasma (NPP) bij dezelfde pH gedurende 5-120 min. bij kamertemperatuur.The hydrogel to be tested was equilibrated on a glass filter with a 0.1 M acetate / lysine buffer at a desired pH and suspended in 1.2 times the gel volume. A known amount of this suspension was incubated "end over end" in a plastic human plasma tube (NPP) at the same pH for 5-120 min at room temperature.
De gebruikte 0,1 M acetaat/lysinebuffer bevatte per liter 8,20 g natriumacetaat, 18,27 g L-lysinemonohy-drochloride, 2,94 g trinatriumcitraat, 1,0 ml calcium-20 chlorideoplossing van 1,0 M, en 1 N natriumhydroxyde of 1 N zoutzuur voor het instellen van de pH.The 0.1 M acetate / lysine buffer used contained 8.20 g of sodium acetate, 18.27 g of L-lysine monohydrochloride, 2.94 g of trisodium citrate, 1.0 ml of calcium M chloride solution of 1.0 M, and 1 N sodium hydroxide or 1 N hydrochloric acid to adjust the pH.
Om de invloed van het geleidingsvermogen op de FVIIIrC adsorptie te onderzoeken, werd een experiment bij verschillende natriumchlorideconcentraties uitgevoerd.To investigate the influence of the conductivity on the FVIIIrC adsorption, an experiment was conducted at different sodium chloride concentrations.
25 om het geleidingsvermogen te verlagen werd 0,6 ml gelsuspensie gemengd met 4,0 ml citraatbuffer (10 mM) die een geschikte hoeveelheid natriumchloride bevatte.To decrease conductivity, 0.6 ml of the gel suspension was mixed with 4.0 ml of citrate buffer (10 mM) containing an appropriate amount of sodium chloride.
Een toename van het geleidingsvermogen werd verkregen door 0,6 ml gelsuspensie te mengen met 4,0 ml acetaat/ 30 lysinebuffer die een gewenste hoeveelheid natriumchloride bevatte. Daarna werd dit mengsel gedurende 30 min. bij kamertemperatuur geincubeerd met 4,0 ml NPP.An increase in conductivity was obtained by mixing 0.6 ml of the gel suspension with 4.0 ml of acetate / 30 lysine buffer containing a desired amount of sodium chloride. This mixture was then incubated with 4.0 ml NPP at room temperature for 30 min.
Om een indruk te krijgen van de invloed van de pH op de FVIII:C adsorptie, werd een incubatie 35 uitgevoerd bij een pH tussen 7,4 en 5,5. Om de pH van plasma en buffer in te stellen, werd langzaam 1,0 M azijnzuur toegevoegd.To get an impression of the influence of the pH on the FVIII: C adsorption, an incubation was carried out at a pH between 7.4 and 5.5. To adjust the pH of plasma and buffer, 1.0 M acetic acid was slowly added.
8701914 -28-8701914 -28-
Na incubatie werd het mengsel gedurende 2 min. op volle snelheid gecentrifugeerd en in het algemeen werd het bovenstaande plasma (supernatant plasma SUP) op ijs bewaard voor faktor VIII bepaling.After incubation, the mixture was centrifuged at full speed for 2 min and generally the supernatant plasma (supernatant plasma SUP) was kept on ice for factor VIII determination.
5 Wanneer elutie nodig was, werd de hydrogel uitge goten in een kolom (Pharmacia C10/10) en geëlueerd op de hierna nog te beschrijven wijze. Tijdens het wassen werd de buffer in het supernatant plasma verzameld. Aangenomen werd dat deze fractie de niet gebonden 10 eiwitten bevatte (niet geadsorbeerde eiwitfractie NADS).When elution was required, the hydrogel was poured into a column (Pharmacia C10 / 10) and eluted as described below. The buffer was collected in the supernatant plasma during washing. This fraction was believed to contain the unbound proteins (unadsorbed protein fraction NADS).
Kolomsgewijze adsorptie.Columnar adsorption.
Voor kolomsgewijze adsorptie werd ongeveer 5 ml van de hydrogel gebruikt. De gel werd gegoten in een 15 kolom (Pharmacia C10/10) en geëquilibreerd met de 0,1 M acetaat/lysinebuffer bij pH 7,0 of 5,5. Een bekende hoeveelheid (1-30 ml) van humaan plasma (NPP) met dezelfde pH en hetzelfde geleidingsvermogen als de buffer, werd bij kamertemperatuur op de kolom aange-20 bracht, terwijl 1-5 ml NPP op ijs werd bewaard tijdens het experiment (REF). De stroomsnelheid werd constant gehouden op 0,125-1,0 ml/min. met behulp van een peristaltische pomp (Pharmacia P-l). De UV absorptie bij 280 nm werd gevolgd in het kolomeluaat met behulp van een 25 Pharmacia Single Path Monitor UV-1. Zodra eiwit uit de kolom werd geëlueerd (na 2-3 ml, afhankelijk van de hydrogel) werd het eluaat tot een bepaald volume verzameld (plasma + spoelbuffer) (NADS) en op ijs bewaard.About 5 ml of the hydrogel was used for column adsorption. The gel was poured into a 15 column (Pharmacia C10 / 10) and equilibrated with the 0.1 M acetate / lysine buffer at pH 7.0 or 5.5. A known amount (1-30 ml) of human plasma (NPP) with the same pH and conductivity as the buffer was applied to the column at room temperature, while 1-5 ml of NPP was kept on ice during the experiment ( REF). The flow rate was kept constant at 0.125-1.0 ml / min. using a peristaltic pump (Pharmacia P-1). UV absorbance at 280 nm was monitored in the column eluate using a Pharmacia Single Path Monitor UV-1. As soon as protein was eluted from the column (after 2-3 ml, depending on the hydrogel), the eluate was collected to a certain volume (plasma + wash buffer) (NADS) and stored on ice.
30 Kolomsgewijze elutie30 Column Elution
De kolomsgewijze elutie begon nadat met buffer gewassen was (normaal 10-20 ml) totdat geen eiwit meer kon worden gedetecteerd. Elutie van het gebonden eiwit werd daarna uitgevoerd met dezelfde buffer die 35 1,0 M natriumchloride bevatte. Het eluaat dat de eiwit- 8701914 t -29- piek toonde (ongeveer 10 ml) werd verzameld en op ijs bewaard (de geëlueerde eiwitfractie ELU).Columnwise elution started after washing with buffer (normally 10-20 ml) until no more protein could be detected. Elution of the bound protein was then performed with the same buffer containing 1.0 M sodium chloride. The eluate showing the protein 8701914 t -29 peak (about 10 ml) was collected and stored on ice (the eluted protein fraction ELU).
Om de hoge natriumchlorideconcentratie te corrigeren voor FVIII:C APTT-bepaling (de geactiveerde partiële 5 tromboplastinetijd) werd de ELU ontzout op een Sephadex G-10 kolom (Pharmacia C16/20) die geëquilibreerd was met de oorspronkelijke 0,1 M acetaat/lysinebuffer, of werd de ELU in een gepaste mate verdund met APTT-buffer die minder natriumchloride bevatte, wanneer het FVIII:C 10 gehalte voldoende hoog was.To correct the high sodium chloride concentration for FVIII: C APTT assay (the activated partial thromboplastin time), the ELU was desalted on a Sephadex G-10 column (Pharmacia C16 / 20) equilibrated with the original 0.1 M acetate / lysine buffer , or the ELU was diluted appropriately with APTT buffer containing less sodium chloride when the FVIII: C10 content was sufficiently high.
De eiwitconcentraties .werden bepaald met de Bradford Protein Assay, BioRad (ΒΡΑ), gebaseerd op de verschuiving van het absorptiemaximum van Coomassie Brilliant Blue G-250 wanneer binding aan eiwitten 15 optreedt, of werden bepaald met de BCA Protein Assay,Protein concentrations were determined using the Bradford Protein Assay, BioRad (ΒΡΑ), based on the shift of the absorption maximum of Coomassie Brilliant Blue G-250 when binding to proteins occurs, or were determined using the BCA Protein Assay,
Pierce (BCA) bij 60°C, welke gebaseerd is op de biureet-reactie, waarbij in beide gevallen de door de producent beschreven condities werden gebruikt. Duplicaatmonsters werden op een gepaste wijze verdund en volgens de 20 instructies van de producent geanalyseerd tegen een standaardkromme van normaal plasma (de BCA-test gaf iets hogere waarden voor dezelfde monsters dan de ΒΡΑ-test) of humaan serumalbumine (54,1 mg/ml).Pierce (BCA) at 60 ° C, which is based on the biuret reaction, using the conditions described by the manufacturer in both cases. Duplicate samples were diluted appropriately and analyzed according to the manufacturer's instructions against a standard curve of normal plasma (the BCA test gave slightly higher values for the same samples than the ΒΡΑ test) or human serum albumin (54.1 mg / ml ).
De antigeenconcentraties (FVIII:Ag en vWF:Ag) 25 werden bepaald met behulp van een Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) gebaseerd op de monoclonale antilichamen CLB CAg-A en CLB CAg-117 voor FVIII:Ag en CLB RAg-20 en CLB RAg-35 voor vWF:Ag. De gebruikte afkortingen hebben de volgende betekenis: 30 FVIII = de bloedcoagulatiefaktor VIII; VWF = de Von Willebrand faktor die in de literatuur ook wel wordt aangeduid als FVIIIR; FVIII:C = de coagulatieactiviteit van faktor VIII; FVIII:Ag = faktor VIII antigeen; en 35 vWF:Ag = Von Willebrand faktor antigeen, dat in de literatuur ook wel wordt aangeduid als FVIIIR:Ag.Antigen concentrations (FVIII: Ag and vWF: Ag) were determined using an Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) based on the monoclonal antibodies CLB CAg-A and CLB CAg-117 for FVIII: Ag and CLB RAg-20 and CLB RAg-35 for vWF: Ag. The abbreviations used have the following meanings: FVIII = the blood coagulation factor VIII; VWF = the von Willebrand factor which is also referred to in the literature as FVIIIR; FVIII: C = the coagulation activity of factor VIII; FVIII: Ag = factor VIII antigen; and 35 VWF: Ag = von Willebrand factor antigen, which is also referred to in the literature as FVIIIR: Ag.
De stollingsfaktoractiviteiten werden bepaald 8701914 i -30- met een eentraps APTT-test zoals beschreven door Hardisty en McPherson, Thromb. Diath. Haemorr. 7 (1962), 215-229.The clotting factor activities were determined with a single-stage APTT assay as described by Hardisty and McPherson, Thromb. Diath. Haemorr. 7 (1962), 215-229.
De bepaling werd uitgevoerd op een LODE LC 6 Coagulato-meter met kunstmatig substraat voor FII en FX, congeni-5 taal deficient substraat voor FVII en FVIII, en immunodepleted substraat voor FIX. De referentie werd bereid door seriegewijze verdunning (1/10 tot 1/320) van een normale plasmastandaard.The assay was performed on a LODE LC 6 Coagulometer with artificial substrate for FII and FX, congenital deficient substrate for FVII and FVIII, and immunodepleted substrate for FIX. The reference was prepared by serial dilution (1/10 to 1/320) of a normal plasma standard.
De FVIII Coatest voor de meting van FVIII:C 10 activiteit aan een chromogeen substraat werd uitgevoerd volgens de instructies van de producent (Kabi Vitrum).The FVIII Coatest for the measurement of FVIII: C10 activity on a chromogenic substrate was performed according to the manufacturer's instructions (Kabi Vitrum).
De resultaten stemden goed overeen met de FVIII:C APTT. Seriegewijze verdunningen (1/160 tot 1/800) van normaal plasma (CLB-PS41, FVIII:C = 0,78 U/ml) werden als 15 referentie genomen.The results were in good agreement with the FVIII: C APTT. Serial dilutions (1/160 to 1/800) of normal plasma (CLB-PS41, FVIII: C = 0.78 U / ml) were taken as reference.
Albumine en immunoglobuline G werden met een nephelometrische methode gemeten. Fibrinogeen (Fb) en fibronectine (Fn) werden bepaald met radiale immunodiffusie volgens Mancini.Albumin and immunoglobulin G were measured by a fake helometric method. Fibrinogen (Fb) and fibronectin (Fn) were determined by Mancini radial immunodiffusion.
20 Ladingsgewi jze adsorptie-experimenten.20 Charge-type adsorption experiments.
Om informatie te verkrijgen over de adsorptie van FVIII:C onder verschillende condities werden kleinschalige ladingsgewijze adsorptie-experimenten uitgevoerd met vrijwel alle gesynthetiseerde gels. Ongeveer 1 ml 25 plasma werd geïncubeerd met gel bij een bepaalde gel/ plasmaverhouding (pH=7,4; AT=30 min.) en het bovenstaande plasma (supernatant plasma SUP) werd 1:10 verdund en in duplo met APTT geanalyseerd op FVIII:C; dit werd vergeleken met dezelfde proef, uitgevoerd met 30 het matrixuitgangsmateriaal (Sepharose CL 4B) .To obtain information about the adsorption of FVIII: C under different conditions, small-scale batch adsorption experiments were performed with almost all synthesized gels. About 1 ml of plasma was incubated with gel at a given gel / plasma ratio (pH = 7.4; AT = 30 min.) And the supernatant plasma (supernatant plasma SUP) was diluted 1:10 and analyzed in duplicate with APTT for FVIII : C; this was compared to the same experiment performed with the matrix starting material (Sepharose CL 4B).
Invloed van de alkylketenlengte op de adsorptie.Influence of the alkyl chain length on adsorption.
De resultaten voor een reeks aminoalkyl-Sepharoses (LD=52 +_ 5 umol/ml) bij drie verschillende gel/plasmaver-houdingen worden getoond in fig. 1. Sepharose CL 4B 35 werd als referentieadsorbens genomen.The results for a series of aminoalkyl Sepharoses (LD = 52 + 5 µmol / ml) at three different gel / plasma ratios are shown in Figure 1. Sepharose CL 4B 35 was taken as reference adsorbent.
Invloed van de terminale aminogroep op de adsorptie.Influence of the terminal amino group on adsorption.
Een reeks secundaire en tertiaire aminoalkyl- 8701914 > -31-A series of secondary and tertiary aminoalkyl- 8701914> -31-
Sepharoses (An-CDI-SEPH 15.07.86; LD=52 11 umol/ml) werd gebruikt voor FVIII adsorptiemetingen. Bij een gel/plasmaverhouding van 1:10 bedroeg de FVIII:C adsorptie 61 _+ 8% (9 experimenten). Afwijkingen van dit percentage 5 in het geval van twee gels waren in hoofdzaak te wijten aan andere liganddichtheden. Tussen de schijnbare pK en de FVIII adsorptie kon geen rechtstreeks verband worden aangetoond.Sepharoses (An-CDI-SEPH 15.07.86; LD = 52 µmoles / ml) was used for FVIII adsorption measurements. At a gel / plasma ratio of 1:10, the FVIII: C adsorption was 61 + 8% (9 experiments). Deviations from this percentage in the case of two gels were mainly due to other ligand densities. No direct relationship could be established between the apparent pK and the FVIII adsorption.
Kolomsgewijze adsorptie-experimenten.Column-wise adsorption experiments.
10 Invloed van de liganddichtheid op de adsorptie en elutie.10 Influence of the ligand density on adsorption and elution.
Om de invloed van de liganddichtheid op de FVIII adsorptie tijdens kolomsgewijze adsorptie te onderzoeken werd een reeks aminobutyl-Sepharoses getest.A series of aminobutyl Sepharoses was tested to investigate the influence of the ligand density on FVIII adsorption during column adsorption.
15 Plasma (1 ml NPP) werd op de kolom aangebracht (4 ml; G/P=4; stroomsnelheid FR=0,25 ml/min.; pH 7,0), de kolom werd gewassen met buffer (NADS=20 ml) en geëlueerd met 1,0 M natriumchloride (ELU=10 ml). De resultaten van de FVIII:C, FVIII:Ag en vWF:Ag analyse 20 worden in tabel 9 getoond. Gegevens met betrekking tot de eiwitadsorptie worden niet weergegeven, omdat deze in de meeste gevallen te laag waren om te worden bepaald.Plasma (1 ml NPP) was applied to the column (4 ml; G / P = 4; flow rate FR = 0.25 ml / min; pH 7.0), the column was washed with buffer (NADS = 20 ml ) and eluted with 1.0 M sodium chloride (ELU = 10 ml). The results of the FVIII: C, FVIII: Ag and vWF: Ag analysis 20 are shown in Table 9. Protein adsorption data are not presented because in most cases they were too low to be determined.
Tabel 9. Kolomadsorptie en kolomelutie op aminobutyl-Sepharose 25 (A4-CDI-SEPH) met verschillende liganddichtheden.Table 9. Column adsorption and column elution on aminobutyl-Sepharose 25 (A4-CDI-SEPH) with different ligand densities.
GEL CODE LD % VIIIïC % VIII:Ag % vWF:Ag % EIWIT PÜRGEL CODE LD% VIIIïC% VIII: Ag% vWF: Ag% PROTEIN PÜR
umol/ml ADS ELU ADS ELU ADS ELÜ ELUµmol / ml ADS ELU ADS ELU ADS ELÜ ELU
A4-12.11.85.1 911 18 0 70 00 A4-12.11.85.2 16 22 2 21 0 4 16 0 0 30 A4-01.11.85.1 25 46 8 42 0 25 20 0 0 A4-ll.12.85.1 38 61 20 66 12 35 45 0.8 25 A4-11.12.85.2 51 100 60 100 62 100 56 2.7 22 A4-09.10.85 55 98 77 100 70 100 90 4.6 17 A4-01.ll.85.2 105 97 44 100 37 100 60 4.8 9 35 A4-14.ll.85.2 166 99 63 100 51 100 86 11 6 870ΤΠΤ -32-A4-12.11.85.1 911 18 0 70 00 A4-12.11.85.2 16 22 2 21 0 4 16 0 0 30 A4-01.11.85.1 25 46 8 42 0 25 20 0 0 A4-Ll.12.85.1 38 61 20 66 12 35 45 0.8 25 A4-11.12.85.2 51 100 60 100 62 100 56 2.7 22 A4-09.10.85 55 98 77 100 70 100 90 4.6 17 A4-01.ll.85.2 105 97 44 100 37 100 60 4.8 9 35 A4-14.ll.85.2 166 99 63 100 51 100 86 11 6 870ΤΠΤ -32-
Kolomsgewijze elutie.Columnwise elution.
Invloed van de alkylketenlengte op de kolomelutie.Influence of the alkyl chain length on the column elution.
De invloed van de alkylketenlengte op FVIII interactie na kolomsgewijze en na ladingsgewijze adsorptie 5 werd onderzocht. Plasma (10 ml NPP) werd ladingsgewi jze geincubeerd met gel (pH 7,4; G/P=0,125; adsorptietijd AT=30 min.), gewassen met buffer (FR=1,0 ml/min.; NADS=40 ml) en geëlueerd met 1,0 M natriumchloride (FR=0,5 ml/min.; ELU=10 ml). FVI1I:C (APTT) en vWF:Ag 10 werden in duplo bij drie verdunningen geanalyseerd.The influence of the alkyl chain length on FVIII interaction after column and batch adsorption was investigated. Plasma (10 ml NPP) was incubated batch with gel (pH 7.4; G / P = 0.125; adsorption time AT = 30 min.), Washed with buffer (FR = 1.0 ml / min .; NADS = 40 ml ) and eluted with 1.0 M sodium chloride (FR = 0.5 ml / min; ELU = 10 ml). FVI1I: C (APTT) and vWF: Ag 10 were analyzed in duplicate at three dilutions.
De gegevens staan in tabel 10.The data are shown in Table 10.
Tabel 10. Ladingsgewijze adsorptie en kolomsgewijze elutie aan amino-alkyl-Sepharoses (An-CDI-SEPH) bij een gel/plasmaverhouding van 1:8.Table 10. Batch adsorption and columnar elution to aminoalkyl Sepharoses (An-CDI-SEPH) at a gel / plasma ratio of 1: 8.
GEL CODE LD % FVIII:C % vWF:Ag % EIWIT 1 PURGEL CODE LD% FVIII: C% vWF: Ag% PROTEIN 1 PUR
15 umol/ml ADS ELU ELU/ADS ADS ELU ELU REF/ELU15 µmol / ml ADS ELU ELU / ADS ADS ELU ELU REF / ELU
DMA3-09.07.86.10 77 99 65 65 99 83 1.58 63 41 A4-13.03.86.2 50 75 38 51 80 78 0.27 370 141 A5-10.10.85 59 98 48 49 93 67 0.84 119 57 A6-10.10.85 53 94 43 46 88 36 0.81 123 53 20 --------------------------------------------------------------------DMA3-09.07.86.10 77 99 65 65 99 83 1.58 63 41 A4-13.03.86.2 50 75 38 51 80 78 0.27 370 141 A5-10.10.85 59 98 48 49 93 67 0.84 119 57 A6-10.10.85 53 94 43 46 88 36 0.81 123 53 20 ------------------------------------------- -------------------------
1 bepaald met BPA1 determined with BPA
Invloed van de liganddichtheid op de kolomelutie.Influence of the ligand density on the column elution.
De invloed van de liganddichtheid op de FVIII interactie tijdens de ladingsgewijze adsorptie werd 25 eveneens onder meer praktische condities onderzocht.The influence of the ligand density on the FVIII interaction during batch adsorption was also investigated under more practical conditions.
Plasma (10 ml NPP) werd ladingsgewijze geincubeerd met gel (G/P=0,125; pH=7,4; AT=30 min.), gewassen met buffer (FR^ljO ml/min.; NADS=40 ml) en geëlueerd met 1,0 M natriumchloride (FR=0,3 ml/min.; ELU=10 ml).Plasma (10 ml NPP) was incubated batchwise with gel (G / P = 0.125; pH = 7.4; AT = 30 min.), Washed with buffer (FR1 / 10 ml / min .; NADS = 40 ml) and eluted with 1.0 M sodium chloride (FR = 0.3 ml / min; ELU = 10 ml).
30 FVIII:C (APTT) en VWF:AG werden in duplo bij drie verdunningen geanalyseerd. De gegevens staan in tabel 11.FVIII: C (APTT) and VWF: AG were analyzed in duplicate at three dilutions. The data are shown in Table 11.
¢701914 <5 -33-¢ 701914 <5 -33-
Tabel 11. Ladingsgewijze adsorptie en kolomsgewijze elutie onder toepassing van aminobutyl-Sepharoses (A4-CDI-SEPH) met verschillende liganddichtheden bij een gel/plasmaverhouding van 1:8.Table 11. Batch adsorption and column elution using aminobutyl Sepharoses (A4-CDI-SEPH) with different ligand densities at a gel / plasma ratio of 1: 8.
GEL CODE LD % FVIII:C Z EIWIT 1 PÜRGEL CODE LD% FVIII: C Z PROTEIN 1 PÜR
5 umol/ml ADS ELÜ ELU/ADS ELU REF/ELÜ A4-01.11.85.1 25 000 0.022 4600 0 A4-11.12.85.1 38 13 3 23 0.063 1600 48 A4-13.03.86.2 50 75 38 51 0.275 363 138 A4-13.02.86.1 61 94 53 56 0.43 232 123 10 A4-13.03.86.1 68 93 62 67 0.54 185 115 A4-12.10.86.6 2 69 100 77 77 0.74 136 105 A4-12.10.86.2 69 96 57 59 0.53 189 108 A4-13.02.86.2 76 94 56 60 0.72 139 78 A4-01.ll.85.2 105 99 58 58 2.22 45 26 15 A4-06.03.86 130 94 64 68 2.22 45 29 A4-14.11.85.2 166 97 79 81 3.03 33 265 umol / ml ADS ELÜ ELU / ADS ELU REF / ELÜ A4-01.11.85.1 25 000 0.022 4600 0 A4-11.12.85.1 38 13 3 23 0.063 1600 48 A4-13.03.86.2 50 75 38 51 0.275 363 138 A4-13.02 .86.1 61 94 53 56 0.43 232 123 10 A4-13.03.86.1 68 93 62 67 0.54 185 115 A4-12.10.86.6 2 69 100 77 77 0.74 136 105 A4-12.10.86.2 69 96 57 59 0.53 189 108 A4-13.02 .86.2 76 94 56 60 0.72 139 78 A4-01.ll.85.2 105 99 58 58 2.22 45 26 15 A4-06.03.86 130 94 64 68 2.22 45 29 A4-14.11.85.2 166 97 79 81 3.03 33 26
1 bepaald met BPA1 determined with BPA
2 deze gel werd bereid met grote overmaat amine2 this gel was prepared with a large excess of amine
De FVIIIrC adsorptie en elutie zijn ter verduidelijking 20 in fig. 2 uitgezet als een functie van de liganddichtheid.The FVIIIrC adsorption and elution are plotted in Fig. 2 for clarification as a function of the ligand density.
Verder is in fig. 3 de zuiveringsfaktor (PUR) als functie van de liganddichtheid uitgezet, waarbij blijkt dat een optimum ligt bij een liganddichtheid van 60 umol/ml.Furthermore, in Fig. 3 the purification factor (PUR) is plotted as a function of the ligand density, it being found that an optimum is at a ligand density of 60 µmol / ml.
Soortgelijke experimenten als met aminobutyl-25 Sepharose werden uitgevoerd met enkele dimethylaminopropyl-Sepharoses met verschillende liganddichtheden. De gegevens van deze experimenten waren ongeveer gelijk en worden hier niet getoond.Similar experiments as with aminobutyl-Sepharose were performed with some dimethylaminopropyl Sepharoses with different ligand densities. The data from these experiments were approximately the same and are not shown here.
Reproduceerbaarheid bij veelbelovende matrices.Reproducibility with promising matrices.
^ Om de reproduceerbaarheid van de affiniteitschroma- tografiemethode te onderzoeken, werd een tweetal hydrogels gebruikt voor ladingsgewijze adsorptie en kolomsgewijze elutie-experimenten. Het betreft hier het veelbelovende 8701914 Λ -34- aminobutyl-Sepharose en het welbekende aminohexyl-Sepharose. Plasma (20 ml NPP) werd geïncubeerd met gel (G/P=0,1;To investigate the reproducibility of the affinity chromatography method, two hydrogels were used for batch adsorption and column elution experiments. This concerns the promising 8701914 Λ -34-aminobutyl-Sepharose and the well-known aminohexyl-Sepharose. Plasma (20 ml NPP) was incubated with gel (G / P = 0.1;
AT=45 min.; pH=7,4), gewassen met buffer (FR=1,0 ml/min.; NADS=32 ml) en geëlueerd met 1,0 M natriumchloride 5 (FR=0,5 ml/min.; ELU=20 ml). FVIII:C in NPP, NADSAT = 45 min .; pH = 7.4), washed with buffer (FR = 1.0 ml / min; NADS = 32 ml) and eluted with 1.0 M sodium chloride 5 (FR = 0.5 ml / min; ELU = 20 ml ). FVIII: C in NPP, NADS
en ELU werd bepaald met de FVIII Coatest tegen een plasmastandaard. Het experiment werd n-malen herhaald voor elke gel. De gemiddelde waarden en standaarddeviatie voor FVIII en totaal eiwit worden in tabel 12 getoond.and ELU was determined with the FVIII Coatest against a plasma standard. The experiment was repeated n times for each gel. The mean values and standard deviation for FVIII and total protein are shown in Table 12.
10 Tabel 12. Ladingsgewijze adsorptie en kolomsgewijze elutie van 20 ml NPP op 2 ml affiniteitsgel: FVIII en totaal eiwit. (gem. uit 3 experimenten)Table 12. Batch adsorption and column elution of 20 ml NPP on 2 ml affinity gel: FVIII and total protein. (average from 3 experiments)
GEL CODE LD NPP % FVIII:C OPBRENGST % EIWIT 1 FVIII:CGEL CODE LD NPP% FVIII: C YIELD% PROTEIN 1 FVIII: C
U/ml ADS ELU U/kg NPP ELU E/mg A4-15.12.86.2 77 0.92 95+2 60+13 560+14 1.13 0.61+.16 15 A6-15.12.86.2 79 0.90 94+2 65+11 570+7 1.61 0.36+.17U / ml ADS ELU U / kg NPP ELU E / mg A4-15.12.86.2 77 0.92 95 + 2 60 + 13 560 + 14 1.13 0.61 + .16 15 A6-15.12.86.2 79 0.90 94 + 2 65 + 11 570+ 7 1.61 0.36 +. 17
1 bepaald met BCA1 determined by BCA
De tabellen 13 en 14 tonen de resultaten van de bepaling van coagulatiefaktoren en andere eiwitten voor dezelfde experimenten. De waarden voor albumine 20 in het eluaat lagen beneden 0.47», die voor immunoglobuline G beneden 0.77o.Tables 13 and 14 show the results of the determination of coagulation factors and other proteins for the same experiments. The values for albumin 20 in the eluate were below 0.47, that for immunoglobulin G below 0.77.
Tabel 13. Ladingsgewijze adsorptie en kolomsgewijze elutie van 20 ml NPP op 2 ml affiniteitsgel: stollingsfactoren FII, FVII, FIX en FX.Table 13. Batch adsorption and column elution of 20 ml NPP on 2 ml affinity gel: clotting factors FII, FVII, FIX and FX.
GEL CODE % FII:C % FVII:C % FIX:C % FX:C FIXGEL CODE% FII: C% FVII: C% FIX: C% FX: C FIX
25 ADS ELU ADS ELU ADS ELU ADS ELU E/mg A4-15.12.86.2 99 67 92 90 99 67 99 78 0.65 A6-15.12.86.2 99 56 94 100 98 67 99 67 0.38 8701914 t -35-25 ADS ELU ADS ELU ADS ELU ADS ELU E / mg A4-15.12.86.2 99 67 92 90 99 67 99 78 0.65 A6-15.12.86.2 99 56 94 100 98 67 99 67 0.38 8701914 t -35-
Tabel 14. Ladingsgewijze adsorptie en kolomsgewijze elutie van 20 ml NPP op 2 ml affiniteits gel: vWF, FVIII:Ag, fibrinogeen en fibronectine.Table 14. Batch adsorption and column elution of 20 ml NPP on 2 ml affinity gel: vWF, FVIII: Ag, fibrinogen and fibronectin.
GEL CODE % vWF:Ag FVIIIrC ELU % Fb:Ag % Fn:AgGEL CODE% vWF: Ag FVIIIrC ELU% Fb: Ag% Fn: Ag
ADS ELU REC /VIII:Ag /vWF:Ag ADS ELU REC ADS ELU RECADS ELU REC / VIII: Ag / vWF: Ag ADS ELU REC ADS ELU REC
5 A4-15.12.86.2 96 65 69 0.97 0.93 0 1.4 100 60 57 97 A6-15.12.86.2 93 30 37 0.91 2.53 14 8.4 94 96 77 81 87019145 A4-15.12.86.2 96 65 69 0.97 0.93 0 1.4 100 60 57 97 A6-15.12.86.2 93 30 37 0.91 2.53 14 8.4 94 96 77 81 8701914
Claims (10)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NL8701914A NL8701914A (en) | 1987-08-14 | 1987-08-14 | Adsorbents, esp. for blood clotting factors - comprising, amino-butyl or amino-pentyl polymer derivs. |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NL8701914A NL8701914A (en) | 1987-08-14 | 1987-08-14 | Adsorbents, esp. for blood clotting factors - comprising, amino-butyl or amino-pentyl polymer derivs. |
NL8701914 | 1987-08-14 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NL8701914A true NL8701914A (en) | 1989-03-01 |
Family
ID=19850455
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NL8701914A NL8701914A (en) | 1987-08-14 | 1987-08-14 | Adsorbents, esp. for blood clotting factors - comprising, amino-butyl or amino-pentyl polymer derivs. |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
NL (1) | NL8701914A (en) |
-
1987
- 1987-08-14 NL NL8701914A patent/NL8701914A/en not_active Application Discontinuation
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NL8701915A (en) | ADSORBENS MATERIAL AND USE THEREOF FOR INSULATING CLOTHING FACTORS. | |
US4361509A (en) | Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies | |
EP0012751B1 (en) | Preparation of trichloro-s-triazine activated supports | |
Suzuki et al. | Physicochemical and biological properties of poly (ethylene glycol)-coupled immunoglobuling G | |
US5053133A (en) | Affinity separation with activated polyamide microporous membranes | |
US5304638A (en) | Protein separation medium | |
US20090176293A1 (en) | Removal of plasmin(ogen) from protein solutions | |
AU631471B2 (en) | A method for isolating factor viii | |
KR100201195B1 (en) | Albumin preparation and process for preparing the same | |
JP4250769B2 (en) | Method for obtaining highly purified vWF or factor VIII / vWF complex | |
US3983001A (en) | Isolation of biologically active compounds by affinity chromatography | |
CA1337402C (en) | Carrier for affinity chromatography immobilized antibodies and preparation thereof | |
HU189708B (en) | Process for producing viii:c factor of blood coagulation | |
CA2607851A1 (en) | Affinity adsorbents for plasminogen | |
NL8701914A (en) | Adsorbents, esp. for blood clotting factors - comprising, amino-butyl or amino-pentyl polymer derivs. | |
JPH05340948A (en) | Transovarial antibody fixed carrier and fixing method | |
AU2017218581B2 (en) | Method of separating factor VIII from blood products | |
GB1449471A (en) | Process for the manufacture of activated carriers for fixing amino compounds and carrier-bonded materials derived therefrom | |
JPS5917354A (en) | Adsorbent for affinity chromatography | |
Mohr et al. | Molecular aspects of affinity chromatography | |
DK171394B1 (en) | Support or carrier in solid phase, immobilized enzyme in solid phase on such a support, ligand-linked chromatography affinity matrix and method for separating or removing a substance from solution using the support | |
JPH05345022A (en) | Physiologically active substance immobilized carrier and its preparation | |
JPH05262664A (en) | Adsorbent for blood coagulation factor viii | |
JPH02668B2 (en) | ||
EP0215775A1 (en) | Immunosorbent for removal of rheumatoid factors from whole blood or blood plasma |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A1B | A search report has been drawn up | ||
BV | The patent application has lapsed |