NL8501916A - PROCESS FOR PREPARING AMINO ACIDS BY TRANSAMINATION. - Google Patents
PROCESS FOR PREPARING AMINO ACIDS BY TRANSAMINATION. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8501916A NL8501916A NL8501916A NL8501916A NL8501916A NL 8501916 A NL8501916 A NL 8501916A NL 8501916 A NL8501916 A NL 8501916A NL 8501916 A NL8501916 A NL 8501916A NL 8501916 A NL8501916 A NL 8501916A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- acid
- transamination
- metal ions
- process according
- amino acid
- Prior art date
Links
- 238000005891 transamination reaction Methods 0.000 title claims description 75
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 title claims description 39
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 7
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical group OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 55
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 49
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 40
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 claims description 39
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 38
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 38
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 37
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 34
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 32
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 29
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 21
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 17
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 claims description 17
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 16
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 15
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims description 14
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 14
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 12
- BTNMPGBKDVTSJY-UHFFFAOYSA-N keto-phenylpyruvic acid Chemical group OC(=O)C(=O)CC1=CC=CC=C1 BTNMPGBKDVTSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 12
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 claims description 8
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 claims description 8
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 7
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 claims description 7
- 239000001903 2-oxo-3-phenylpropanoic acid Substances 0.000 claims description 6
- DEDGUGJNLNLJSR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxycinnamic acid Natural products OC(=O)C(O)=CC1=CC=CC=C1 DEDGUGJNLNLJSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 6
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 claims description 5
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 claims description 5
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims description 5
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 4
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxyphenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- GQYBCIHRWMPOOF-UHFFFAOYSA-N p-hydroxyphenylpyruvic acid Natural products OC(=O)C(O)=CC1=CC=C(O)C=C1 GQYBCIHRWMPOOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 3
- RSTKLPZEZYGQPY-UHFFFAOYSA-N 3-(indol-3-yl)pyruvic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)C(=O)O)=CNC2=C1 RSTKLPZEZYGQPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 claims description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 claims description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 claims description 2
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 2
- 229910052745 lead Inorganic materials 0.000 claims 3
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 claims 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000003421 catalytic decomposition reaction Methods 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 13
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 8
- 241000589630 Pseudomonas pseudoalcaligenes Species 0.000 description 7
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 5
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 5
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 150000004682 monohydrates Chemical class 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 4
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 4
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M potassium hydroxide Substances [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 3
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003798 L-tyrosyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H aluminium sulfate (anhydrous) Chemical compound [Al+3].[Al+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 150000004715 keto acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 2
- AELCINSCMGFISI-DTWKUNHWSA-N (1R,2S)-tranylcypromine Chemical compound N[C@@H]1C[C@H]1C1=CC=CC=C1 AELCINSCMGFISI-DTWKUNHWSA-N 0.000 description 1
- UZVNBCKXIIHMIH-UHFFFAOYSA-N 2-oxo-3-phenylpropanoic acid;sodium Chemical compound [Na].OC(=O)C(=O)CC1=CC=CC=C1 UZVNBCKXIIHMIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(=O)C(O)=O BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000270272 Coluber Species 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 1
- 101001000676 Homo sapiens Polyamine-modulated factor 1 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 125000002435 L-phenylalanyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100035922 Polyamine-modulated factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 229920005830 Polyurethane Foam Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 150000003841 chloride salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001640 fractional crystallisation Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- -1 iron (III) ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 150000002696 manganese Chemical class 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000011496 polyurethane foam Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 1
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 1
- ZMJGSOSNSPKHNH-UHFFFAOYSA-N pyridoxamine 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(CN)=C1O ZMJGSOSNSPKHNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000010944 silver (metal) Substances 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Substances [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- MQGYVGKMCRDEAF-UHFFFAOYSA-M sodium;2-oxo-3-phenylpropanoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C(=O)CC1=CC=CC=C1 MQGYVGKMCRDEAF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 101150042775 tyr1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
$ . ·' * 4 - Werkwijze voor het bereiden van aminozuren door transaminering -$. · '* 4 - Method for preparing amino acids by transamination -
De uitvinding heeft in het algemeen betrekking op een verbeterde werkwijze voor het bereidenvan L-aminozuren (hierna "aminozuren"1 uit hun ol-ketozuurvoorlopers door biologische transaminering met behulp van asparaginezuur als ^ de aminodonor . In het bijzonder wordt de hier beschreven werkwijze bedoeld ter verbetering van de snelheid en opbrengst van de transaminering door de ontledingssnelheid van oxaal-azijnzuur , één van de bijprodukten van de reaktie, te verhogen.The invention generally relates to an improved method of preparing L-amino acids (hereinafter "amino acids" 1 from their ol-keto acid precursors by biological transamination using aspartic acid as the amino donor. In particular, the method described herein is intended to improving the rate and yield of the transamination by increasing the rate of decomposition of oxal acetic acid, one of the by-products of the reaction.
Dit resulteert in een belangrijke verhoging van de reaktie-^ snelheid zodat nagenoeg alle voorloper bij de transaminering verbruikt wordt. Door de evenwichtsvoorwaarde van de transaminering uit te schakelen en door toe te staan dat meer voorloper omgezet wordt, kan men aminozuuropbrengsten van meer dan 90% bereiken. De reaktie wordt op deze wijze gekatalyseerd door 15 het toevoegen van metaalionen aan het transamineringsreaktie-systeem.This results in a significant increase in the reaction rate so that virtually all of the precursor is consumed in the transamination. By eliminating the equilibrium condition of the transamination and allowing more precursor to be converted, amino acid yields of more than 90% can be achieved. The reaction is catalyzed in this way by adding metal ions to the transamination reaction system.
Het is bekend, dat men aminozuurvoorlopers enzymatisch kan omzetten tot de overeenkomstige L-aminozuren.It is known that amino acid precursors can be enzymatically converted to the corresponding L-amino acids.
U.S.-A-3.183.170 beschrijft bijvoorbeeld de transaminering van 20 fenylpyrodruivezuur in aanwezigheid van een multienzymsysteem dat uit verschillende bronnen verkregen is , waaronder bacte-riencellen , gedroogde cellen , celraaceraten of enzymoplos- r, · «7 £For example, U.S.-A-3,183,170 describes the transamination of phenylpyruvic acid in the presence of a multi-enzyme system obtained from various sources, including bacterial cells, dried cells, cell racers, or enzyme solutions.
O O' Si' i «éi SO O 'Si' i «éi S
ψ « - 2 - singen. De Amerikaanse octrooiaanvraag volgnummer 520.632 beschrijft de microbiele transaminering van =L-ketozuren tot aminozuren in ladingsgewijs gevoede fermentaties met behulp van gebruikelijke voorlopers voor het omzetten van bijvoorbeeld cr fenylpyrodruivezuur tot L-fenylalanine, -ketoisocapronzuur tot L-leucine, sC-ketoisovaleriaanzuur tot L-valine, enz.2 «- 2 - singen. U.S. Patent Application Number 520,632 describes the microbial transamination of = L-keto acids into amino acids in batch fed fermentations using conventional precursors to convert, for example, cr phenylpyruvic acid to L-phenylalanine, ketoisocaproic acid to L-leucine, sC-ketoisovaleric acid to L- valine, etc.
De biotransformatie van c^-ketozuur tot aminozuur is een enzymatische transaminering die in de uitwisseling van de aminogroep van de aminodonor en de ketogroep van de voor-loper resulteert. Algemeen wordt aangenomen , dat enzymatische transaminering een evenwichtsreaktie is. Oishi merkt bijvoor— beeld in hoofdstuk 16 van The Microbial Production of Amino Acids, (Yamada et al., Ed-), "Production from Precursor KetoThe biotransformation of C 1 -ketoic acid to amino acid is an enzymatic transamination that results in the exchange of the amino group of the amino donor and the keto group of the precursor. It is generally believed that enzymatic transamination is an equilibrium reaction. For example, Oishi notes in Chapter 16 of The Microbial Production of Amino Acids, (Yamada et al., Ed-), "Production from Precursor Keto
Acids", biz. 440-46 (19721op, dat het gebruik van aminotrans- 15 ferases een grote concentratie van de aminodonor noodzakelijk heeft gemaakt voor een grote produktppbrengst. U.S--A3.183.170 vermeldt dat "bij een transamineringsreaktie met L-glutaminezuur als de aminodonor , het evenwicht gunstig naar rechts verschoven wordt door het ct -ketoglutaarzuur dat bij de transaminering 20 ontstaat, even snel als het gevormd wordt, weer door reductie- ve aminering tot L-glutaminezuur om te zetten.Acids ", biz. 440-46 (19721), that the use of amino transferases has necessitated a large concentration of the amino donor for a high product yield. US-A3.183.170 mentions that" in a transamination reaction with L-glutamic acid as the amino donor, the equilibrium is favorably shifted to the right by converting the ct-ketoglutaric acid formed in the transamination 20 as quickly as it is formed, again by reducing amination to L-glutamic acid.
Bij gebruikelijke transamineringswerkwijzen heeft men een aantal verbindingen als de aminodonor gebruikt.In conventional transamination processes, a number of compounds have been used as the amino donor.
Oishi stelt, op blz. 435-52 van het boek van Yamada et al., 25 dat de beste aminodonoren L-asparaginezuur , L-leucine, L-isoleucine en L-glutaminezuur zijn en dat men betere resultaten verkrijgt wanneer men deze aminozuren in combinatie gebruikt dan wanneer men ze afzonderlijk gebruikt. De Amerikaanse aanvraag volgnummer 568.300 beschrijft een werkwijze voor het volledig ^ laten verlopen\an een microbiele transamineringsreaktie door een oplossing te gebruiken die ongeveer equimolaire hoeveelheden asparaginezuur en fenylalaninevoorloper bevat, de micro-organismen te voren in aanwezigheid van de voorloper te kweken, de biologische katalysator in de vorm van gedroogde cellen js n f· 1 o 1 §Oishi states, on pages 435-52 of the book by Yamada et al., 25 that the best amino donors are L-aspartic acid, L-leucine, L-isoleucine and L-glutamic acid and that better results are obtained when these amino acids are combination when using them separately. United States Application Serial No. 568,300 describes a method for completing a microbial transamination reaction by using a solution containing approximately equimolar amounts of aspartic acid and phenylalanine precursor, pre-culturing the microorganisms in the presence of the precursor, the biological catalyst in the form of dried cells js nf · 1 o 1 §
V V / J w . UV F / Y w. YOU
r · e - 3 - te gebruiken, en/of de biologische katalysatorlading van het systeem te vergroten.r · e - 3 - and / or increase the biological catalyst loading of the system.
Oxaalazijnzuur is een bijprodukt van de enzymatische transaminering wanneer men asparaginezuur als de 5 aminodonor gebruikt. Men heeft oxaalazijnzuur in andere verbanden bestudeerd en gevonden dat het door verschillende mechanismen ontleedt.Bessman vermeld: in "Preparation and Assay of Oxalacetic Acid", Arch. Biochem., Vol. 26, biz. 418-21 (1950} spontane ontleding van oxaalazijnzuur, die door een aantal 10 stoffen gekatalyseerd wordt. Krebs vermeldt in "The Effect ofOxalacetic acid is a by-product of the enzymatic transamination when using aspartic acid as the amino donor. Oxalacetic acid has been studied in other dressings and found to decompose by several mechanisms. Bessman reports in "Preparation and Assay of Oxalacetic Acid", Arch. Biochem., Vol. 26, biz. 418-21 (1950} spontaneous decomposition of oxalacetic acid, which is catalyzed by a number of 10 substances. Krebs mentions in "The Effect of
Inorganic Salts on the Ketone Decomposition of Oxaloacetic Acid", J.Biochem., Vol 36, biz. 303-05 (1942) dat verschillende anorganische zouten de ontledingssnelheid van oxaalazijnzuur in pyrodruivezuur en kooldioxyde vergroten.Inorganic Salts on the Ketone Decomposition of Oxaloacetic Acid ", J. Biochem., Vol 36, biz. 303-05 (1942) that various inorganic salts increase the rate of decomposition of oxalacetic acid into pyruvic acid and carbon dioxide.
15 Gevonden is, dat ,onder omstandigheden zoals hier beschre ven worden , de transaminering van een aminozuurvoorloper tot het overeenkomstige aminozuur, als asparaginezuur gekozen wordt als de primaire aminodonor en de voorloper een oC-keto-zuur is, belangrijk verbeterd kan worden door de ontleding 20 van het oxaalazijnzuur, dat als bijprodukt van de transaminering ontstaat, te katalyseren. De ontleding wordt gekatalyseerd door het toevoegen van bepaalde veelwaardige metaalionen of zouten daarvan aan het reaktiesysteem. Het L-aminozuur kan worden opgehoopt en verzameld. Door oxaalazijnzuur op deze 25 wijze te ontleden, wordt het evenwicht van het systeem geweldig naar rechts verschoven, waardoor de reaktie nagenoeg volledig verloopt. Het resultaat van deze metaalionkatalyse is dat de transamineringssnelheden vergroot worden tot meer dein 7,0 mol per liter per uur en de aminozuuropbrengsten tot 30 90-100%.It has been found that, under conditions as described herein, the transamination of an amino acid precursor to the corresponding amino acid, if aspartic acid is selected as the primary amino donor and the precursor is an oC-keto acid, can be significantly improved by the decomposition 20 of the oxalacetic acid, which is formed as a by-product of the transamination. The decomposition is catalyzed by adding certain polyvalent metal ions or salts thereof to the reaction system. The L-amino acid can be accumulated and collected. By decomposing oxalacetic acid in this way, the balance of the system is shifted tremendously to the right, so that the reaction proceeds almost completely. The result of this metal ion catalysis is that the transamination rates are increased to more than 7.0 moles per liter per hour and the amino acid yields to 90-100%.
Eén van de doelen van de uitvinding is een biologische transamineringsreaktie te verbeteren door de reaktiesnelheid en de algehele zowel op asparaginezuur als voorloper gebaseerde '850 1 fl i 8 * % - 4 - opbrengst aan aminozuur geweldig te vergroten. Het is dan ook mogelijk om de evenredige hoeveelheden voorloper te verminderen, die nodig zijn om de gewenste produktopbrengt te bereiken.One of the objects of the invention is to improve a biological transamination reaction by dramatically increasing the rate of reaction and overall aspartic acid and precursor-based '850 1 fl 8 *% - 4 yield of amino acid. It is therefore possible to reduce the proportional amounts of precursor required to achieve the desired product yield.
Door de transamineringssnelheid aanzienlijk te 5 vergroten , wordt de tijd die het systeem nodig heeft om een gegeven hoeveelheid voorloper om te zetten korter. Bovendien wordt opbrengstverlies door ontleding van de voorloper aanzienlijk verminderd door de vergrote reaktiesnelheid. Bovendien leidt dit tot minder verontreiniging met onomgezette ^ voorloper, wat de zuivering en terugwinning van het produkt minder lastig maakt.By significantly increasing the transamination rate, the time required for the system to convert a given amount of precursor is shorter. In addition, yield loss by precursor decomposition is significantly reduced by the increased reaction rate. Moreover, this leads to less contamination with unreacted precursor, which makes the purification and recovery of the product less troublesome.
Een ander doel is een reaktie te verschaffen waarbij de lL-ketozuurvoorloper niet zuiver hoeft te zijn en welke reaktie de remmende werking van de verontreinigingen die aan-^ wezig kunnen zijn , overwint .Another object is to provide a reaction in which the 11-keto acid precursor need not be pure and which overcomes the inhibitory effect of the impurities which may be present.
Een algeheel doel van de uitvinding is het aanzienlijk verminderen van de kosten die verbonden zijn aan de bereiding van aminozuren door transaminering.An overall object of the invention is to significantly reduce the costs associated with the preparation of amino acids by transamination.
De hier beschreven uitvinding verschaft een uniek 20 middel voor het laten verlopen van de transaminering van een aminozuurvoorloper tot het overeenkomstige L-aminozuur , door asparaginezuur als de aminodonor en een geschikte ketozuur- voorloper te gebruiken, een geschikt intra- of extracellulair transaminase te kiezen , en de transamineringsreaktie te 25 koppelen aan de gekatalyseerde ontleding van het oxaalazijnzuur, dat als bijprodukt bij de transaminering ontstaat , onder voor transaminase-aktiviteit gunstige omstandigheden. De gekatalyseerde ontleding wordt teweeggebracht door het toevoegen van meewaardige metaalionen , of zouten daarvan, aan het reak-30 tresysteem en door de transaminering aanzienlijk voorbij het evenwicht te laten gaan . Men kan de transaminering uitvoeren door een oplossing die de o(,-ketozuurvoorloper en asparagine- 850 1 S ti * % - 5 - zuur omvat, in kontakt te brengen met het intra- of extracellulaire transaminase , dat wil zeggen, met een cel-of enzympreparaat dat bij de transaminering kan bemiddelen.The invention described herein provides a unique means for progressing the transamination of an amino acid precursor to the corresponding L-amino acid, by using aspartic acid as the amino donor and a suitable keto acid precursor, choosing a suitable intra- or extracellular transaminase, and coupling the transamination reaction to the catalyzed decomposition of the oxalacetic acid, which is formed as a by-product in the transamination, under conditions favorable for transaminase activity. The catalyzed decomposition is accomplished by adding valuable metal ions, or salts thereof, to the reaction system and by allowing the transamination to pass significantly beyond equilibrium. Transamination can be carried out by contacting a solution comprising the o (- keto acid precursor and aspartic 850 1 S ti *% - 5 - acid with the intra- or extracellular transaminase, i.e., with a cell or enzyme preparation that can mediate in the transamination.
De hier gebruikte uitdrukking "transaminase" heeft betrekking ^ op een enzym of enzymsysteem dat bij de zojuist beschreven omzetting van voorloper tot aminozuur kan bemiddelen.The term "transaminase" as used herein refers to an enzyme or enzyme system that can mediate the precursor to amino acid conversion just described.
Microorganismen die reeds bruikbaar zijn gebleken bij dit type transamineringswerkwijze, zijn Pseudomonas pseudoalcaligenes, Brevibacterium thiogenitalis, Pseudomonas 10 aeriginosa, Bacillus subtillus en Escherichia coli , die elk bij de transaminering van fenylalanine - voorloper tot L-fenylalanine bemiddelen. Bovendien heeft men van de laatste vier species bacteriën aangetoond , dat ze werkzaam zijn wat betreft de bereiding van andere aminozuren (L-tyrosine *** (voorbeeld XV) , L-leucine, L-isoleucine en L-valine werden aangetoond) door transaminering met asparaginezuur als de donor. De groep van microorganismen die bij deze uitvinding toegepast kunnen worden, is natuurlijk veel uitgebreider.Microorganisms that have already proved useful in this type of transamination method are Pseudomonas pseudoalcaligenes, Brevibacterium thiogenitalis, Pseudomonas aeriginosa, Bacillus subtillus and Escherichia coli, each of which mediates in the transamination of phenylalanine precursor to L-phenylalanine. In addition, the last four species of bacteria have been shown to be effective in the preparation of other amino acids (L-tyrosine *** (example XV), L-leucine, L-isoleucine and L-valine have been demonstrated) by transamination with aspartic acid as the donor. The group of microorganisms that can be used in this invention is, of course, much more extensive.
//
Gebleken is, dat organismen die behoren tothet genus Aerobacter, 20 * halofiele organismen, en gisten,zoals gisten die behoren tot het genus Candida , alle geschikt zijn. Verwacht wordt, dat elk microorganisme, waarvan bekend is dat het transaminase- aktiviteit vertoont wat betreft de bereiding van aminozuren en dat asparaginezuur als de aminodonor kan gebruiken, 25 bij deze werkwijze toegepast kan worden. Bovendien veronderstelt men dat gemengde culturen van geschikte stammen gebruikt kunnen worden.It has been found that organisms belonging to the genus Aerobacter, 20 * halophilic organisms, and yeasts, such as yeasts belonging to the genus Candida, are all suitable. It is expected that any microorganism known to exhibit transaminase activity in the preparation of amino acids and which can use aspartic acid as the amino donor can be used in this method. In addition, it is believed that mixed cultures of suitable strains can be used.
De kweekomstandigheden moeten op basis van het bepaalde gebruikte microorganisme gekozen worden en zijn 30 aan deskundigen op dit gebied bekend. Bij voorkeur begunstigen de omstandigheden de snelle groei van gezonde cellen.The culture conditions should be selected based on the particular microorganism used and are known to those skilled in the art. Preferably, the conditions favor the rapid growth of healthy cells.
Als men bijvoorbeeld Pseudomonas pseudoalcaligenes gebruikt, P' Λ J Λ ^ Ά, s . -3 * i - 6 - handhaaft men de temperatuur bij voorkeur op 35-39°C en de pH op 7,5. Men roert en/of belucht om een aerobe omgeving te verschaffen. Daarnaast moet men geschikte energie- en voedingsbronnen verschaffen.For example, if one uses Pseudomonas pseudoalcaligenes, P 'Λ J Λ ^ Ά, s. The temperature is preferably maintained at 35-39 ° C and the pH at 7.5. It is stirred and / or aerated to provide an aerobic environment. In addition, one must provide suitable energy and food sources.
5 Men kweekt de microorganismen tot een van te voren bepaalde celdichtheid of kweekfase. De preciese kweek-periode en celdichtheid is niet kritiek, omdat men de dichtheid na de kweek zonodig kan vergroten met behulp van gebruikelijke middelen zoals centrifugeren of filtreren. Een kweek-periode van 12-48 uur verschaft gewoonlijk een aantal cellen waarmee men kan werken. De cellen worden vervolgens verzameld en kunnen worden behandeld om de celmembraan te permeëren.The microorganisms are grown to a predetermined cell density or culture phase. The exact culture period and cell density is not critical, since the density after culture can be increased, if necessary, by conventional means such as centrifugation or filtration. A culture period of 12-48 hours usually provides a number of cells to work with. The cells are then collected and can be treated to permeate the cell membrane.
Deze behandeling kan bestaan uit drogen , soniceren of broeden met tolueen of nietionogene oppervlakte aktieve stof- 15 . fen , enz. Het kan ook wenselijk zijn om de cellen op een geschikt substraat te immobiliseren. Als men levensvatbare microorganismen bij de werkwijze van de uitvinding gebruikt, verdient het de voorkeur dat ze het aminozuurprodukt in het 20 medium kunnen afscheiden voor een doelmatige en economisch haalbare terugwinning. In de hier boven beschreven celprepa-raten zijn voldoende hoeveelheden transaminase aanwezig in combinatie met de cellen of het cellulaire materiaal voor het uitvoeren van de reaktie .This treatment may consist of drying, sonication or incubation with toluene or nonionic surfactant. fen, etc. It may also be desirable to immobilize the cells on a suitable substrate. When using viable microorganisms in the process of the invention, it is preferable that they can separate the amino acid product into the medium for efficient and economically feasible recovery. In the cell preparations described above, sufficient amounts of transaminase are present in combination with the cells or cellular material to carry out the reaction.
2Π2Π
Men gebruikt tenminste 2,0-200,0 g cellen (droog gewicht) per liter substraatoplossing, bij voorkeut tenminste 4,0-80,0 g per liter. Ongeacht de vorm waarin de cellen feitelijk bij de werkwijze gebruikt worden, zijn de hier gebruikte aangegeven gewichten celkatalysator berekend op droge 25 basis. Bij gebruik van lagere gehalten katalysator kunnen belangrijke hoeveelheden voorloper ontleden voor ze transamine-ring kunnen ondergaan. De omvang van het probleem van ontleden van de voorloper bij gebruikelijke transamineringen hangt af 30 85 0 1 9 t β φ · - 7 - van de cl-ketozuurvoorloper en de reaktieomstandigheden. Ontleding wordt bijvoorbeeld iets versneld door de aanwezigheid van zouten van meerwaardige metalen, alsook door zure pH omstandigheden, ultraviolet licht of de aanwezigheid van zuur-5 stof .At least 2.0-200.0 g of cells (dry weight) per liter of substrate solution are used, preferably at least 4.0-80.0 g per liter. Regardless of the form in which the cells are actually used in the method, the indicated cell catalyst weights used herein are calculated on a dry basis. When using lower levels of catalyst, significant amounts of precursor can decompose before they can undergo transamine ringing. The magnitude of the problem of precursor decomposition in conventional transaminations depends on the cl-ketoacid precursor and the reaction conditions. For example, decomposition is somewhat accelerated by the presence of polyvalent metal salts, as well as by acidic pH conditions, ultraviolet light, or the presence of oxygen.
Aan de andere kant kan men een celvrij systeem gebruiken. De transaminering is enzymatisch en kan in een oplossing van de geschikte enzymen of transaminases optreden.On the other hand, one can use a cell-free system. The transamination is enzymatic and can occur in a solution of the appropriate enzymes or transaminases.
Het is dan ook mogelijk een enzympreparaat, dat is een ruw extract of een geïsoleerd en gezuiverd enzym, voor de trans-amineringsreaktie te gebruiken. In nog een andere uitvoeringsvorm kan het enzym op een geschikt substraat geïmmobiliseerd worden»·It is therefore possible to use an enzyme preparation, which is a crude extract or an isolated and purified enzyme, for the trans-amination reaction. In yet another embodiment, the enzyme can be immobilized on a suitable substrate »·
De aminozuurvoorloper is een iC-ketocarbonzuur of een zout ervan. Het Ot-ketozuur dat men uitkiest voor deze werkwijze hangt af van het gewenste aminozuur dat na transaminering ontstaat.Fenylpyrodruivezuur wordt bijvoorbeeld omgezet tot L-fenylalanine, oL-ketoisocapronzuur tot L-leucine , oL-ketoisovaleriaanzuur tot L-valine , pyrodruivezuur tot L-20 alanine, f?- hydroxy--ketoboterzuur tot L-threonine, p- hydroxyfenylpyrodruivezuur tot L- tyrosine, indoolpyrodruive-zuur tot L-tryptofaan , -keto- ^-methylvaleriaanzuur tot L-isoleucine, cC-ketohistidinalzuur (p> - imidazolylpyrodruive-zuur) tot L-histidine, enz. Zoals men ziet, gebruikt men bij 2^ de werkwijze van de uitvinding gebruikelijke aminozuurvoorlo-pers. Men kan de voorloper zuiveren, of men kan hem in niet-gezuiverde vorm zoals een natrium-, calcium-, kalium- of ammoniumhydroxydehydrolysaat of een zwavelzuurprecipitaat gebruiken.The amino acid precursor is an iC-ketocarboxylic acid or a salt thereof. The Ot-keto acid selected for this method depends on the desired amino acid formed after transamination. Phenylpyruvic acid is converted, for example, into L-phenylalanine, ol-ketoisocaproic acid to L-leucine, ol-ketoisovaleric acid to L-valine, pyruvic acid to L- 20 alanine, f-hydroxy-ketobutyric acid to L-threonine, p-hydroxyphenylpyruvic acid to L-tyrosine, indole pyruvic acid to L-tryptophan, -keto-methyl-valeric acid to L-isoleucine, cC-ketohistidinal acid (p> -imidazolylpyro-grape -acid) to L-histidine, etc. As can be seen, conventional amino acid precursors are used in the process of the invention. The precursor can be purified, or it can be used in a non-purified form such as a sodium, calcium, potassium or ammonium hydroxide hydrolyzate or a sulfuric acid precipitate.
20 Bij de voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding bereidt men een sübstraatoplossing met een molaire verhouding van asparaginezuur en aminozuurvoorloper van 1:2 tot 2:1 in een bioverenigbare buffer. Elk bioverenigbaar oplosmiddel of buffer die niet bij de reaktie stoort en die het reaktie- 853? §18 j # % - 8 - systeem in het pH voorkeursgebied van 6,5-10,0 houdt , kan gebruikt worden. Gevonden is,dat bijvoorbeeld 0,1-0,5 M fos- faatbuffer geschikt is. Eventueel kan de pH geregeld worden door een pH regelaar aan het systeem toe te voegen die zonodig 5 base toevoegt. De pH heeft de neiging te dalen wanneer de transaminering vordert .In the preferred embodiment of the invention, a substrate solution having a molar ratio of aspartic acid and amino acid precursor from 1: 2 to 2: 1 is prepared in a biocompatible buffer. Any biocompatible solvent or buffer that does not interfere with the reaction and which reacts the reaction. §18 j #% - 8 system in the preferred pH range of 6.5-10.0 can be used. It has been found that, for example, 0.1-0.5 M phosphate buffer is suitable. Optionally, the pH can be controlled by adding a pH controller to the system that adds 5 base if necessary. The pH tends to drop as transamination progresses.
De aminodonor voor de verbeterde transaminering van., de uitvinding moet asparaginezuur zijn of moet in aanzienlijke mate asparaginezuur bevatten. Gevonden is,dat de grootste jq aminozuuropbrengst bereikt wordt , wanneer asparaginezuur de enige in het reaktiesysteem aanwezige aminodonor is. Door asparaginezuur als de aminodonor te gebruiken, wordt oxaalazijn-zuur als een bijprodukt van de transaminering gevormd. Het oxaalazijnzuur ontleedt, zowel spontaan als katalytisch onder vorming van kooldioxyde en pyrodruivezuur.The amino donor for the improved transamination of the invention must be aspartic acid or must contain substantially aspartic acid. It has been found that the greatest amino acid yield is achieved when aspartic acid is the only amino donor present in the reaction system. By using aspartic acid as the amino donor, oxalacetic acid is formed as a by-product of the transamination. The oxalacetic acid decomposes, both spontaneously and catalytically, to form carbon dioxide and pyruvic acid.
Natuurlijk mogen andere aminodonoren inhet systeem aanwezig zijn en mogen deze door het transaminase gebruikt worden. De werkwijze werkt echter niet voor zover andere aminodonoren dan asparaginezuur aan de transaminering deel nemen, 20 daar er dan geen oxaalazijnzuur ontstaat om te ontleden.Of course, other amino donors may be present in the system and may be used by the transaminase. However, the process does not work insofar as amino donors other than aspartic acid participate in the transamination, since no oxalacetic acid is formed to decompose.
De aanwezigheid van de cofaktor pyridoxaal-5-fosfaat (P-5-Fl wordt vereist om de transaminering te vergemakkelijken. Deze cofaktor vormt een complex met het enzym , wordt kortstondig tot pyridoxaminefosfaat (PMFl omgezet en wordt in de 25 totaal-reaktie geregenereerd . Het kan gewenst zijn om kleine hoeveelheden P—5-F toe te voegen om de transaminering te bevorderen. Toevoegen van P-5-F tot een concentratie van 0,l^uM kan bijvoorbeeld gewenst zijn, hoewel kleine hoeveelheden cofaktor in cellulair materiaal dat aan het reaktiesysteem 30 toegevoegd wordt , aanwezig zijn.The presence of the cofactor pyridoxal-5-phosphate (P-5-Fl is required to facilitate transamination. This cofactor complexes with the enzyme, is briefly converted to pyridoxamine phosphate (PMF1 and regenerated in the total reaction. It may be desirable to add small amounts of P-5-F to aid transamination, For example, adding P-5-F to a concentration of 0.1 µM may be desirable, although small amounts of co-factor in cellular material containing be added to the reaction system 30.
Er zijn drie mogelijke snelheidsbepalende reakties bij deze transamineringswerkwijze : (1) bioomzetting van de voorloper tot aminozuur, (21 ontleding van de GL-ketozuurvoorlo- ΰ ΰ Q 1 9 1 6 * * - 9 - per tot waardeloze produkten en (31 ontleding van het bijpro-dukt oxaalazijnzuur. De eerste reaktie, de bioomzetting, kan men gemakkelijk laten verlopen door de lading van de trans-amineringskatalysator te vergroten , welke katalysator in 5 het cellulaire materiaal aanwezig is. Door de eerste reaktie te laten verlopen, neemt de ontleding van de voorloper (de tweede reaktie) af. De snelheidsbepalende stap wordt dan ook de ontleding van oxaalazijnzuur . Men kan begrijpen, dat het vergroten van de beschikbaarheid van transamineringskatalysator 10 slechts het meest voordelig is, als tegelijkertijd de ont- ledingssnelheid van oxaalazijnzuur vergroot wordt.There are three possible rate-determining reactions in this transamination process: (1) bioconversion of the precursor to amino acid, (21 decomposition of the GL-keto acid precursor 1 ΰ Q 1 9 1 6 * * - 9 - per to worthless products, and (31 decomposition of the by-product oxalacetic acid The first reaction, the bioconversion, can be easily proceeded by increasing the charge of the trans-amination catalyst, which catalyst is present in the cellular material. By allowing the first reaction to proceed, the decomposition takes place. from the precursor (the second reaction) The rate determining step therefore becomes the decomposition of oxalacetic acid It can be understood that increasing the availability of transamination catalyst 10 is only most advantageous if at the same time the rate of decomposition of oxalacetic acid is increased .
De ontleding van oxaalazijnzuur is een eerste orde-reaktie, dat wil zeggen, de ontledingssnelheid is evenredig met de concentratie oxaalazijnzuur in het systeem. Bij grote concentraties is de ontledingssnelheid groot, maar de snelheid wordt kleiner wanneer de ontleding de concentratie verkleint.The decomposition of oxalacetic acid is a first order reaction, that is, the decomposition rate is proportional to the concentration of oxalacetic acid in the system. At large concentrations, the decomposition rate is high, but the rate decreases as the decomposition decreases the concentration.
De snelheid voor spontane ontleding voor een concentratie van _3 0,1 mol per liter is ongeveer 6,7 x 10 mol per liter per uur. Door verwijdering van oxaalazijnzuur uit het reaktiesysteem 20 door spontane ontleding gaat de omzetting van voorloper tot aminozuur volledig verlopen. In het beginstadium van biologisch gekatalyseerde transaminering kan oxaalazijnzuur echter geproduceerd worden met een snelheid die 5 tot 10 keer groter is , of zelfs nog groter als het transamineringssysteem het 25 toelaat, dan de snelheid voor spontane ontleding. Oxaalazijn zuur vertoont aldus , zelfs met spontane ontleding , de neiging in het systeem op te zamelen, vooral in het beginstadium van de reaktie , aangezien de snelheid van spontane ontleding niet groot genoeg is om de evenwichtseffekten van 5® de transamineringsreaktie uit te schakelen.The spontaneous decomposition rate for a concentration of 0.1 moles per liter is about 6.7 x 10 moles per liter per hour. By removing oxalacetic acid from the reaction system 20 by spontaneous decomposition, the conversion from precursor to amino acid proceeds completely. However, in the initial stage of biologically catalyzed transamination, oxalacetic acid can be produced at a rate 5 to 10 times greater, or even greater if the transamination system allows, than the rate for spontaneous decomposition. Thus, even with spontaneous decomposition, oxalacetic acid tends to accumulate in the system, especially at the initial stage of the reaction, since the rate of spontaneous decomposition is not high enough to eliminate the equilibrium effects of the transamination reaction.
De ontleding van oxaalazijnzuur kan door de aanwezigheid van anorganische meerwaardige metaalionen gekatalyseerd worden, zoals door ,.3+ .4 ...2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 3+ 2+ 2+The decomposition of oxalacetic acid can be catalyzed by the presence of inorganic polyvalent metal ions, such as, .3 + .4 ... 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 3+ 2+ 2+
Al , Al +, Ni , Mn , Mg , Pb , Ag , Fe , Fe , Zn , Λ S 4 ft * £ -? *? : - “ & - ^ * * - 10 - _ 2+ 3+ 2+ 3+ _,2+ 3+ _ ,Al, Al +, Ni, Mn, Mg, Pb, Ag, Fe, Fe, Zn, Λ S 4 ft * £ -? *? : - “& - ^ * * - 10 - _ 2+ 3+ 2+ 3+ _, 2 + 3+ _,
Cr , Cr /Co /Co /Pd , Au , enz., of zouten daarvan.Cr, Cr / Co / Co / Pd, Au, etc., or salts thereof.
De metaalionen kunnen bijvoorbeeld opgelost toegevoegd worden, bijvoorbeeld als het sulfaat-, sulfide of chloridezout van deze metalen. Aan de andere kant kunnen metaaldeeltjes, zoals 5 aluminium, lood of ijzer, als de katalysator toegevoegd worden. Vaste stukjes metaal zijn voor de werkwijze voordelig, aangezien men de katalysator dan niet met de produktstroom verliest. De meerwaardige metaalionen die gebruikt worden voor het katalyseren van ontleding van oxaalazijnzuur, zijn ook ver- 10 antwoordelijk voor enige ontleding van de K.-ketozuurvoorloper. De snelheid van de gekatalyseerde ontleding van oxaalazijnzuur is echter voldoende hoog , zodat de relatieve hoeveelheden voorloper die ontleed worden, in de totale reaktie niet belangrijk zijn. Dat wil zeggen, de transaminering verloopt met 15 een zodanig tempo dat betrekkelijk weinig voorloper kan ontleden .For example, the metal ions can be added dissolved, for example, as the sulfate, sulfide or chloride salt of these metals. On the other hand, metal particles, such as aluminum, lead or iron, can be added as the catalyst. Solid pieces of metal are advantageous for the process since the catalyst is then not lost with the product stream. The polyvalent metal ions used to catalyze decomposition of oxalacetic acid are also responsible for some decomposition of the K. keto acid precursor. However, the rate of catalyzed decomposition of oxalacetic acid is sufficiently high that the relative amounts of precursor decomposed are not important in the overall reaction. That is, transamination proceeds at such a rate that relatively little precursor can decompose.
De keuze van de metaalionen , of zouten daarvan, zijn systeemspecifiek . Gewoonlijk heeft het de voorkeur , voor het gemak en om economische redenen,die metaalionen of zouten 20 daarvan tie kiezen die reeds in de bij de transaminering gebruikte voorloper- of asparaginezuurstromen aanwezig zijn. De metaalionen die de grootste voorkeur hebben, zijn die van magnesium, ijzer, aluminium en zink. Ijzer, aluminium en zink ^ geven in het algemeen grotere snelheden en opbrengsten.The choice of metal ions, or salts thereof, are system specific. It is usually preferred, for convenience and economic reasons, to choose metal ions or their salts which are already present in the precursor or aspartic acid streams used in the transamination. The most preferred metal ions are those of magnesium, iron, aluminum and zinc. Iron, aluminum and zinc generally give higher speeds and yields.
Hoewel magnesium een wat kleinere snelheid en opbrengst geeft, is het niettemin êén van de metaalkatalysatoren die de voorkeur heeft, wegens zijn oplosbaarheid en lage prijs.Although magnesium gives a somewhat slower rate and yield, it is nevertheless one of the preferred metal catalysts because of its solubility and low cost.
Prijsoverwegingen kunnen een rol spelen, waarbij zilver en lood meer , en ijzer en nikkel minder duur zijn.Price considerations can play a role, with silver and lead being more expensive, and iron and nickel being less expensive.
3030
Koper kan kleurvorming veroorzaken, wat bij bepaalde toepassingen niet gewenst wordt, en men gelooft dat koper het transaminase denatureert en de aminozuren chelateert. Bepaalde metaalionen, van koper en ijzer bijvoorbeeld, kunnen cofaktoren 8591916 * * - 11 - of bevorderaars zijn van andere enzymaktiviteit die produkten levert, die verwijderd moeten worden. Calciumionen zijn bij deze werkwijze niet gewenst door imn neiging de voorloper uit oplossing te precipiteren. Mangaan is toxisch voer mensen 2 en wordt niet bij voorkeur gekozen wegens problemen bij het vermijden van blootstelling van mensen aan werkwijze en afvalstromen, hoewel men aangetoond heeft, dat mangaanzouten toegepast kunnen worden bij deze werkwijze.Copper can cause coloration, which is not desired in certain applications, and it is believed that copper denatures the transaminase and chelates the amino acids. Certain metal ions, such as copper and iron, may be cofactors or promoters of other enzyme activity that yield products to be removed. Calcium ions are not desired in this process because of a tendency to precipitate the precursor from solution. Manganese is toxic to humans 2 and is not preferred because of difficulties in avoiding human exposure to process and waste streams, although it has been shown that manganese salts can be used in this process.
De metaalionen vergroten de snelheid van de ontledings-reaktie tenminste 100 keer ten opzichte van de snelheid van _3 de spontane reaktie van 6,7 x 10 mol per liter per uur, zelfs bij zeer lage concentraties. Bij een hoge concentratie oxaalazijnzuur van 0,1 mol per liter kan de snelheid van de gekatalyseerde ontleding bijvoorbeeld 0,1-2,0 mol per liter per uur bedragen. Bij een lagere concentratie oxaalazijnzuur van 0,02 mol per liter kan de snelheid van de gekatalyseerde ontleding 0,01 - 0,2 mol per liter per uur bedragen. Deze variatie in de snelheid is toe te schrijven aan variaties in de werkzaamheid en concentratie van de gebruikte metaal-2Q katalysator , als ook de temperatuur en pH van de reaktie.The metal ions increase the rate of the decomposition reaction at least 100 times over the rate of 3 the spontaneous reaction of 6.7 x 10 moles per liter per hour, even at very low concentrations. For example, at a high oxalacetic acid concentration of 0.1 mole per liter, the rate of the catalyzed decomposition can be 0.1-2.0 mole per liter per hour. At a lower oxalacetic acid concentration of 0.02 mol per liter, the rate of the catalyzed decomposition can be 0.01 - 0.2 mol per liter per hour. This variation in speed is due to variations in the activity and concentration of the metal-2Q catalyst used, as well as the temperature and pH of the reaction.
In deze gebieden wordt de remming van de snelheid van transaminering door de aanwezigheid van oxaalazijnzuur in het systeem doelmatig uitgeschakeld. In aanwezigheid van deze meerwaardige metaalionen kan een volumetrische transamineringssnelheid 25 tot 10,0 mol per liter per uur in het beginstadium van de om zetting en een totaalsnelheid van 0,05-0,2 mol per liter per uur bereikt worden, waarbij er geen aanwijzingen zijn dat het oxaalazijnzuur remt.In these regions, the inhibition of the rate of transamination due to the presence of oxalacetic acid in the system is effectively disabled. In the presence of these polyvalent metal ions, a volumetric transamination rate of 25 to 10.0 moles per liter per hour can be achieved at the initial stage of the conversion and a total rate of 0.05-0.2 moles per liter per hour, with no indications that it inhibits oxalacetic acid.
De concentratie metaalionen die men gebruikt voor 3Q het katalyseren van de ontleding wordt bij voorkeur in over eenstemming gebracht met de transamineringssnelheid , dat wil zeggen met de snelheid waarmee oxaalazijnzuur via transaminering -4 gevormd wordt. De aanwezigheid van tenminste 1,0 x 10 mol per liter van het ion begint de ontleding van oxaalazijnzuur waards λ Λ * Λ 4 * *' -« - ^ * - - 12 - neembaar te katalyseren. Bij metaalionconcentraties boven -1 1/0 x 10 neemt de ontledingssnelheid weinig of niet belang- -3 rijk meer toe. De concentratie bedraagt kenmerkend 1,0 x 10 -1 1,0 x 10 mol per liter. Men moet bedenken bij het bepalen 5 van de hoeveelheid zout die aan het systeem toegevoegd moet worden, dat de oplosbaarheid van de verschillende zouten varieert. Wat betreft het gebruik van onoplosbare metalen voor deze katalyse kan men hoeveelheden van tenhoogste 20 g/1 gebruiken.The concentration of metal ions used to catalyze the decomposition is preferably reconciled with the rate of transamination, that is, with the rate at which oxalacetic acid is formed via transamination-4. The presence of at least 1.0 x 10 moles per liter of the ion begins to catalyze the decomposition of oxalacetic acid, λ Λ * Λ 4 * * - - - - * - - 12 -. At metal ion concentrations above -1 1/0 x 10, the decomposition rate increases little or not -3 more. The concentration is typically 1.0 x 10 -1 1.0 x 10 mol per liter. When determining the amount of salt to be added to the system, it should be remembered that the solubility of the different salts varies. As for the use of insoluble metals for this catalysis, amounts of up to 20 g / l can be used.
^ Het cel- of enzympreparaat wordt met de oplossing van asparaginezuur en voorloper in een geschikt reaktievat in kontakt gebracht. De reaktieomstandigheden voor de werkwijze van de uitvinding moeten gekozen worden ter vergroting van de enzymstahiliteit en worden in overeenstemming met het ^ gekozen algehele transamineringsreaktiesysteem bepaald. De temperatuur bedraagt 20-50°C, bij voorkeur 30-40°C. De pH bedraagt 6,5-10,0, bij voorkeur 7,5-8,5. Men kan de pH regelen met elke met hetenzym systeem verenigbare base , bij voorkeur met ammonia of kaliumhydroxyde , die beide de aminozuur- 20 voorloper en het asparaginezuur helpen oplossen. De reaktie heeft geen beluchting nodig, tenzij levende, groeiende cellen gebruikt worden, maar de cellen moeten wat geschud of bewogen worden ten opzichte van het substraat om een maximale wisselwerking te verkrijgen tussen biokatalysator en substraat.The cell or enzyme preparation is contacted with the solution of aspartic acid and precursor in a suitable reaction vessel. The reaction conditions for the process of the invention must be selected to enhance enzyme stability and are determined in accordance with the selected overall transamination reaction system. The temperature is 20-50 ° C, preferably 30-40 ° C. The pH is 6.5-10.0, preferably 7.5-8.5. The pH can be adjusted with any base compatible with the enzyme system, preferably with ammonia or potassium hydroxide, both of which help dissolve the amino acid precursor and the aspartic acid. The reaction does not require aeration unless live, growing cells are used, but the cells need to be shaken or agitated relative to the substrate to obtain maximum interaction between biocatalyst and substrate.
2 ς2 ς
Men kan verwachten dat de transaminering voltooid is in minder dan 40 uur, bij voorkeur minder dan 4 uur wanneer men grote concentraties biokatalysator gebruikt. Een andere indicator is de specifieke reaktiesnelheid, dat wil zeggen het geproduceerde aantal mol aminozuur per gram droog cel-gewicht per uur..Bij de werkwijze van de uitvinding bedraagt deze indicator 0,0001-0,1, bij voorkeur 0,002-0,05 mol aminozuur geproduceerd per gram droog celgewicht per uur. De specifieke snelheid bedraagt echter kenmerkend 0,0005-0,01 mol 8501918 - 13- 4 · aminozuur per gram droog celgewicht per uur.Transamination can be expected to be completed in less than 40 hours, preferably less than 4 hours when using large concentrations of biocatalyst. Another indicator is the specific reaction rate, i.e. the number of moles of amino acid produced per gram of dry cell weight per hour. In the method of the invention, this indicator is 0.0001-0.1, preferably 0.002-0.05 moles of amino acid produced per gram of dry cell weight per hour. However, the specific rate is typically 0.0005-0.01 mol 8501918 - 13-4 amino acid per gram of dry cell weight per hour.
De ontledingsprodukten van oxaalazijnzuur zijn kool-dioxyde en pyrodruivezuur. Het kooldioxyde verdwijnt als men de reaktie in een open vat uitvoert en de pH bijna neutraal 5 is , of het kan verzameld worden hetzij om afgevoerd te worden hetzij om bij andere werkwijzen gebruikt te worden. Als de pH groter dan 7,5 is , blijft het kooldioxyde in de oplossing opgelost. Men gelooft dat tenminste een gering gedeelte van het pyrodruivezuur omgezet wordt tot alanine door transaminering 10 of door decarboxylatie met asparaginezuur. De gevormde relatieve hoeveettidd alanine varieert met de bij de transaminering gebruikte biokatalysator. Aldus zijn zowel pyrodruivezuur als kleine hoeveelheden alanine aanwezig, maar beide kunnen door gebruikelijke scheidingsmethoden gemakkelijk verwijderd worden.The decomposition products of oxalacetic acid are carbon dioxide and pyruvic acid. The carbon dioxide disappears when the reaction is run in an open vessel and the pH is nearly neutral, or it can be collected either for disposal or for use in other processes. If the pH is greater than 7.5, the carbon dioxide remains dissolved in the solution. It is believed that at least a minor portion of the pyruvic acid is converted to alanine by transamination or by decarboxylation with aspartic acid. The relative amount of aliphatic alanine formed varies with the biocatalyst used in the transamination. Thus, both pyruvic acid and small amounts of alanine are present, but both can be easily removed by conventional separation methods.
15 Met de verbeterde biologische transaminering van de uitvinding kunnen uiterst hoge aminozuuropbrengsten verkregen worden zowel ten opzichte van asparaginezuur als ten opzichte van de aminozuurvoorloper . Dat wil zeggen dat 90% of meer van het asparaginezuur in de reaktie getransamineerd kan worden 20 en dat 90% of meer van de voorloper tot aminozuur omgezet kan worden. Bovendien wordt de transamineringssnelheid enorm vergroot, wat zowel tot grotere opbrengsten als kortere reaktie-tijden leidt. Nadat de reaktie voltooid is, kan het aminozuur-produkt door middel van gebruikelijke methoden teruggewonnen 25 worden. Kenmerkende methoden om het gewenste produkt terug te winnen kunnen ionenuitwisseling en/of gefraktioneerde kristallisatie omvatten.With the improved biological transamination of the invention, extremely high amino acid yields can be obtained both with respect to aspartic acid and with respect to the amino acid precursor. That is, 90% or more of the aspartic acid can be transaminated in the reaction and 90% or more of the precursor can be converted to amino acid. In addition, the transamination rate is greatly increased, leading to both higher yields and shorter reaction times. After the reaction is complete, the amino acid product can be recovered by conventional methods. Typical methods of recovering the desired product may include ion exchange and / or fractional crystallization.
De volgende voorbeelden worden ter toelichting gegeven en worden niet bedoeld om de hier beschreven uitvinding 3Q te beperken.The following examples are given for illustrative purposes and are not intended to limit the invention 3Q described herein.
In de tabellen die de in de voorbeelden verkregen resultaten weergeven , worden specifieke snelheid, volumetrische snelheid en opbrengst als volgt berekend: 35 0 1 9 1 6 - 14 - ψ .In the tables showing the results obtained in the examples, specific velocity, volumetric velocity and yield are calculated as follows: 35 0 1 9 1 6 - 14 - ψ.
I ' geproduceerd aantalI 'produced number
Specifieke snelheid = -- gram cellen.uur geproduceerd aantal mol 5 Volumetrische snelheid = - liter.uur geproduceerd aantal molSpecific rate = - gram cells.hours number of moles produced 5 Volumetric rate = - liter.hours number of moles produced
Opbrengst = _______ theoretisch aantal mol 10Yield = _______ theoretical number of moles 10
Het theoretische aantal mol wordt gebaseerd op het beschikbare aantal mol voorloper of asparaginezuur.The theoretical number of moles is based on the available number of moles of precursor or aspartic acid.
Voorbeeld I 15 (Effekt van mangaanionen op transaminaseaktiviteit)Example I 15 (Effect of manganese ions on transaminase activity)
Men bereidde een synthetische oplossing die 17,4 g/1 natriumfenylpyrodruivezuur (Na-FPZ) (monohydraat) (SigmaA synthetic solution containing 17.4 g / l sodium phenylpyruvic acid (Na-FPZ) (monohydrate) (Sigma) was prepared.
Chemical Co.) en 11,09 g/1 asparaginezuur (Sigma ChemicalChemical Co.) and 11.09 g / l aspartic acid (Sigma Chemical
Co.) in een 0,1 M. fosfaatbuffer met 0,1 ^uM pyridoxaal-5- 20 fosfaat (P—5t*F) bevatte, en stelde de pH in op 7,5 met ammonia en zwavelzuur. Men bereidde 6 monders vm 1CD nL. Aan drie monsters voegde men MnSO^ toe tot een concentratie van 1,0 xlO ^ M; de overige monsters gebruikte men als controle. De oplossingen werden aan 150 ml ommantelde roerbekers toegevoegd , die oe o op 37 c gehouden werden en zacht geschud werden.Co.) in a 0.1 M phosphate buffer containing 0.1 µM pyridoxal-5-20 phosphate (P-5t * F), and adjusted the pH to 7.5 with ammonia and sulfuric acid. 6 mouthers of 1CD nL were prepared. MnSO 2 was added to three samples to a concentration of 1.0 x 10 2 M; the other samples were used as a control. The solutions were added to 150 ml jacketed stirring cups, which were kept at 37 ° C and shaken gently.
Een preparaat van gedroogde cellen werd op de volgende wijze gemaakt: Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 werd gedurende 24 uur bij 35°C in 14 liter Trypticase soja.broedvloei-stof gekweekt. De cellen werden door centrifugeren verzameld en ^ gedurende 12 uur in een vacuumoven bij 37°C gedroogd.A dried cell preparation was prepared in the following manner: Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 was grown in 14 liters of Trypticase soy broth for 24 hours at 35 ° C. The cells were collected by centrifugation and dried in a vacuum oven at 37 ° C for 12 hours.
tt
Men voegde gedroogde cellen in hoeveelheden van 10,5 en 2 g per liter toe aan de proef- en controleoplossingen.Dried cells were added in aliquots of 10.5 and 2 g per liter to the test and control solutions.
Men hield de oplossingen onder zacht schudden bij 37°C.The solutions were kept under gentle shaking at 37 ° C.
850 1.9 16 - 15 - 10* « %850 1.9 16 - 15 - 10 * «%
Men nam monsters na 5 en 24 uur voor analyse , door colori-metrische bepaling met ijzer (III) chloride op FPZ (methode wordt hier onder beschreven ) en door HPLC op. fenylalanine en asparaginezuur . De resultaten worden in tabel A getoond.Samples were taken after 5 and 24 hours before analysis, by colorimetric determination with iron (III) chloride on FPZ (method described below) and by HPLC. phenylalanine and aspartic acid. The results are shown in Table A.
5 Het is duidelijk, dat voor de controlemonsters, dat wil zeggen zonder de toevoeging van· het metaalzout, de volumetrische trans-amineringssnelheid constant blijft ondanks een zwaardere kata-lysatorlading. Het toevoegen van MnSO^ leidde tot aai geweldige toeneming van de volumetrische en specifieke transaminerings-10 snelheid vergeleken met de controle, naast grotere opbrengsten van L-fenylalanine.It is clear that for the control samples, ie without the addition of the metal salt, the volumetric transamination rate remains constant despite a heavier catalyst loading. The addition of MnSO4 led to a tremendous increase in the volumetric and specific transamination rate compared to the control, in addition to greater yields of L-phenylalanine.
•S óQ 1 Q 1 £ - 16 - »• S óQ 1 Q 1 £ - 16 - »
I . II. I
I II I
I II I
o^piommmdPdp i I h nmri^HOcOrto ^ piommmdPdp i I h nmri ^ HOcOrt
OOO I C\I m o\° dP I "N - -- 'OOCOOOOO I C \ I m o \ ° dP I "N - - 'OOCOO
h w u n I th cm in σι I O' ο «-η <n ο o * *-(h w u n I th cm in σι I O 'ο «-η <n ο o * * - (
v* - - > oot^coi - o Iv * - -> ot ^ coi - o I
ÖIO’-'OOO I ^ O IÖIO "-" OOO I ^ O I
ή * » I Iή * »I I
<M O O 1 I<M O O 1 I
I II I
«Η ςίΡ ςίΡ I«Η ςίΡ ςίΡ I
Η ΟΟΓΌΙΰηΟΙΰ η '^.'ΦΟ-^Γ^οοσι- H O O UI I ΙΛ P* dP -dP O' .·.*.·» Ο O O' \ ooinmiocMiooi _ ο ·<-ι in ο o ' oilΗ ΟΟΓΌΙΰηΟΙΰ η '^.' ΦΟ- ^ Γ ^ οοσι- H O O UI I ΙΛ P * dP -dP O '. ·. *. · »Ο O O' \ ooinmiocMiooi _ ο · <-ι in ο o 'oil
O' -,-- ooescnI , Ό ή -Ο IO '-, - ooescnI, Ό ή -Ο I
o ο ο ο *h ! μ ο Io ο ο ο * h! μ ο I
m <-< >· - 3 u ο o 3m <- <> · - 3 u ο o 3
d I _ Id I _ I
3 i ^ I3 i ^ I
ICN IICN I
" H"H
Η I N ιηο'ΐπ'ίΐίΐιη## \ o co in I η n dp dp I O' οοοΌηπΗΟ iΗ I N ιηο'ΐπ'ίΐίΐιη ## \ o co in I η n dp dp I O 'οοοΌηπΗΟ i
Di t^-cNin I oo^rmi „ - *- *00001Di t ^ -cNin I oo ^ rmi „- * - * 00001
·. >. » ο ο co σ' ι o oocoooO'H'-' I·. >. »Ο ο co σ 'ι o oocoooO'H'-' I
OOCMtM O'. I --1 *-l Ο ' IOOCMtM O '. I --1 * -l Ο 'I
r-4 «Η " Ο * ' Ό Ir-4 «Η" Ο * 'Ό I
ο I ο Iο I ο I
I II I
I II I
I I %I I%
I Hcncor'-llO’-idPdPII Hcncor'l10'-idPdPI
1 'voooioi'tfoc'.r'-l I 0» ·> - ~ ο * m m i1 'voooioi'tfoc'.r'-l I 0 »·> - ~ ο * m m i
lO^HdPdpi ninr-oo I10 ^ HdPdpi ninr-oo I
+ o m co I ^J· o r- r- ι <n ~ I+ o m co I ^ J · o r- r- ι <n ~ I
cn Ηνοσίνοιο-ιηιηΐ ο icn Ηνοσίνοιο-ιηιηΐ ο i
c \ o o 1 Ic \ o o 1 I
a 0> df n t" Ia 0> df n t "I
o a cm S I h mr'M'ioniPiipo a cm S I h mr'M'ioniPiip
r£ I N NMflNNrtOlO] Ir I I N NMflNNrtO10] I
d OOOICM'-idPdPl Ο'-'-.-ΟΟΓ'-Ι^Ιd OOOICM'-idPdPl Ο '-'-.- ΟΟΓ'-Ι ^ Ι
HO) I—I CONNIOONN!‘0,,„'-,NOOO >. IHO) I — I CONNIOONN! "0" "", NOOO>. I
a) (τ' 'v.'··'' O'C0i0|SMin ή -ο Ia) (τ '' v. '··' 'O'C0i0 | SMin ή -ο I
Λ<υ O' O CN CO 'O |f?2 ° 1 (0 o o I 3-Λ <υ O 'O CN CO' O | f? 2 ° 1 (0 o o I 3-
Eh > m 1 ° i dj >-i inEh> m 1 ° i dj> -i in
o Ho H
ch o X Nncoo^HHininich o X Nncoo ^ HHinini
w rj I O'-'.'.'OOO'O'I+Jw rj I O '-'. '.' OOO'O'I + J
d Γ-t O f" —( l^^dPdPlO OM NO o - 13d Γ -t O f "- (l ^^ dPdPlO OM NO o - 13
'v.r^r-ioioocMCNi' o ή »o l O'v.r ^ r-ioioocMCNi' o ή »o l O
m O' * » *· *-ι *η o ιο i ^ ^ o i mm O '* »* · * -ι * η o ιο i ^ ^ o i m
Ί1 fO CO O O I JF1 fO CO O O I J
o o *. i +f ifl) »η >· o ! R i Λ o i +J o i eno o *. i + f ifl) »η> o! R i Λ o i + J o i en
Ό I 'Ö Ό -HΌ I 'Ö Ό -H
rl 0> -H i +Jrl 0> -H i + J
d) <D <D ·-* I >»d) <D <D - - * I> »
~ ΐ( Λ o Π3 — ft ! H~ ΐ (Λ o Π3 - ft! H
+ »»·· -H iH m --ί I κ* ” " Ή H N Ö1 i d cm ό θ' ω <d n ft i <u ό θ' ωω&,ιβίΰ d τη C jd G ft w 1 O' τη d d Ö h \ I <d+ »» ·· -H iH m --ί I κ * ”" Ή HN Ö1 id cm ό θ 'ω <dn ft i <u ό θ' ωω &, ιβίΰ d τη C jd G ft w 1 O 'τη dd Ö h \ I <d
S*HmH H tfl ft <d I O 'H "H Htfl'v.CUIS * HmH H tfl ft <d I O 'H "H Htfl'v.CUI
A ÉH <3 <u \ i q ti -o <u <u λ i <ü d ns ΰαιωα)1·^ _$ d cu λ a i ,¾ 0) h M J2 ί ί , 71 ffld ft ! ·ηA ÉH <3 <u \ i q ti -o <u <u λ i <ü d ns ΰαιωα) 1 · ^ _ $ d cu λ a i, ¾ 0) h M J2 ί ί, 71 ffld ft! Η
(1) M ü ft ft I + 2 O ^ - I -H(1) M ü ft ft I + 2 O ^ - I -H
Οι o φ ra w '-r in O si n , ι hOι o φ ra w '-r in O si n, ι h
—. 4J .—. --x .—* -—. -rl -P 4-1 I O Ή ,-P -P I O-. 4J. --x .— * -—. -rl -P 4-1 I O Ή, -P -P I O
(D (0 ΗΗΗγΗΦΡΒΓΜΙΗ ro HHHHCDPWCOi d i—J m \ \\ \-H+JOiO'l'-' » WW-HU OOI I s 0 >1 Ο'Ο'Ο'Ο'ΉΟΟβ1 >)0'0'0'0'M-l<UGGI<ü u η •ΓΐΗΦαιΐ4-! 'j·—'·Η§<υ <i)i .*4 η nj — w^o-appiai <0 u 3 ρ ρ i d +J Ν0)<ϋίβα)ΗΛΛ!Ρ ^ΝΛΦιβΦΗΛΛίΙ o cd ft μλη ao aaiM tdfttnjdr-iapaai,(D (0 ΗΗΗγΗΦΡΒΓΜΙΗ ro HHHHCDPWCOi di — J m \ \\ \ -H + JOiO'l'- '»WW-HU OOI I s 0> 1 Ο'Ο'Ο'Ο'ΉΟΟβ1>) 0'0'0 '0'Ml <UGGI <ü u η • ΓΐΗΦαιΐ4-!' J · - '· Η§ <υ <i) i. * 4 η nj - w ^ o-appiai <0 h 3 ρ ρ id + J Ν0) <ϋίβα) ΗΛΛ! Ρ ^ ΝΛΦιβΦΗΛΛίΙ o cd ft μλη ao aaiM tdfttnjdr-iapaai,
U M 1¾ (d ftid cn > o oift ^ |i|iiiOiiüiii>OOlHU M 1¾ (d ftid cn> o oift ^ | i | iiiOiiüiii> OOlH
6501916 * * - 17 -6501916 * * - 17 -
Voorbeeld IIExample II
(Effekt van magnesiumionen op transaminaseaktiviteit)(Effect of magnesium ions on transaminase activity)
Men bereidde een synthetische oplossing die 17,71 g/1A synthetic solution containing 17.71 g / l was prepared
Na-FPZ (monohydraat) (Sigma Chemical Co.) en 12,35 g/1 5 asparaginezuur (Sigma Chemical Co.) in 0,05 M fosfaatbuffer met -2 bevatte 1,0 x 10 M MgSO^ en 0,1 ^uM P-5-F/ en stelde de pH in op 7,5 met ammonia en zwavelzuur. Monsters van 100 ml werden in 5 150 ml ommantelde roerbekers gebracht , tot 37°C verwarmd enNa-FPZ (monohydrate) (Sigma Chemical Co.) and 12.35 g / L aspartic acid (Sigma Chemical Co.) in 0.05 M phosphate buffer with -2 contained 1.0 x 10 M MgSO2 and 0.1 ^ µM P-5-F / and adjusted the pH to 7.5 with ammonia and sulfuric acid. 100 ml samples were placed in 150 ml jacketed stirring cups, heated to 37 ° C and
rustig geschud . Gedroogde Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCCshaken gently. Dried Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC
10 12825 cellen werden als in voorbeeld I bereid. Men voegde de cellen in de volgende respectievelijke hoeveelheden aan de bekers toe: 15 , 10 , 5,0 , 2,0 en 1,0 g per liter. Men nam monsters na 1 en 24 uur en analyseerde ze als in voorbeeld I.12825 cells were prepared as in Example I. The cells were added to the beakers in the following proportions: 15, 10, 5.0, 2.0 and 1.0 g per liter. Samples were taken after 1 and 24 hours and analyzed as in Example I.
De in tabel B getoonde resultaten geven aan, dat met het toe- 15 voegen van MgSO^ geen onderdrukking van de transaminering door oxaalazijnzuur wordt waargenomen, en dat de volumetrische reaktiesnelheden als ook de totaalopbrengsten toenamen.The results shown in Table B indicate that with the addition of MgSO4 no suppression of the transamination by oxalacetic acid is observed, and the volumetric reaction rates as well as the total yields increased.
S S Π ί Λ 1 i o 3 \J i ϋ ] 0 - 18 - η σι \ λ οο > οι αι ν # θ' σι ο st1 οα ο -. » - ·. Ο Ο 00 r-i Ο CN »-+ Ο Ο - •cH *» Ο οS S Π ί Λ 1 i o 3 \ J i ϋ] 0 - 18 - η σι \ λ οο> οι αι ν # θ 'σι ο st1 οα ο -. »- ·. Ο Ο 00 r-i Ο CN »- + Ο Ο - • cH *» Ο ο
rHrH
ιη ® ν ® m # σ*σι η η ιο η ιο π ιο σ «. * ν * ο ο σι m ο τη η ο ο ο τΗ Ο * CN -Ο οιη ® ν ® m # σ * σι η η ιο η ιο π ιο σ «. * ν * ο ο σι m ο τη η ο ο ο τΗ Ο * CN -Ο ο
rHrH
\ ιη en r~ m m ld di *η σι αο e-o m on ap - - - * ο ο co ο οοηοοοσι I *Ή Ο *» - Ο Ο Η ^\ ιη and r ~ m m ld di * η σι αο e-o m on ap - - - * ο ο co ο οοηοοοσσι I * Ή Ο * »- Ο Ο Η ^
\ Ο CN 00 CN CN tQ dP\ Ο CN 00 CN CN tQ dP
σ> ο σι ld ο η ο - - - >· ο ο οσ> ο σι ld ο η ο - - -> · ο ο ο
If) οο^οοο»-< τ-Ι τΊ · *· Ο οIf) οο ^ οοο »- <τ-Ι τΊ · * · Ο ο
VV
"νΤ in r- I in if) dp h oo r'·· tn i m on «a1 \ - o o ~ Di m *-i o o o -f. «H «* *"νΤ in r- I in if) dp h oo r '·· tn i m on« a1 \ - o o ~ Di m * -i o o o -f. «H« * *
<M t-ι O O<M t-ι O O
diTue
SS
C η σι i to co «> dj η o ^ σι i m ^ -ηC η σι i to co «> dj η o ^ σι i m ^ -η
P3 !> \ ·. » * O O CNP3!> \ ·. »* O O CN
Dl O CM ODl O CM O
H Ö »-) - OH Ö »-) - O
0)0) ifO o Λ dl 3 0) ÊH o > Φ0) 0) ifO o Λ dl 3 0) ÊH o> Φ
0 H tO dl O I CO 00 dP0 H tO dl O I CO 00 dP
ÊH E) \ t" CN tO I CN CN CNEH E) \ t "CN tO I CN CN CN
^ 3d) «..>. OOoo 3 01 o ^ o^ 3d) «..>. OOoo 3 01 o ^ o
O 1-H - OO 1-H - O
*H tH O* H tHO
H *-l tQ I CN 00 dPH * -1 tQ I CN 00 dP
\ 00 CD I 00 CO iH\ 00 CD I 00 CO iH
Dl·»'' OOtf) 3 co σι r- o * 3Dl · »'' OOtf) 3 co σι r- o * 3
If) ^ O NIf) ^ O N
*H O Φ Ό > •Η Ή Φ 3 Ό Λ .·—* Ei .... -H H CO ·σ o d) a) φ (u o n 2 & 3 l£ Ei Η 'H HO) N £h ^ φ φ a 3 3 0) Λ Η η en Λ a >ι Μ U ^ 3 ο « α> μ ,φ 3 φ El en en \ \ v. \ ·η -ε> tn en cd d> en en m φ c η η 3* HO Φ Ό> • Η Ή Φ 3 Ό Λ. · - * Ei .... -HH CO · σ od) a) φ (uon 2 & 3 l £ Ei Η 'H HO) N £ h ^ φ φ a 3 3 0) Λ Η η and Λ a> ι Μ U ^ 3 ο «α> μ, φ 3 φ El en and \ \ v. \ · η -ε> tn and cd d> en and m φ c η η 3
3 'Φ 3 El I3 'Φ 3 El I
-U N a Φ Φ ΦΗΛ 3 a w λ a a o a X k3a<escn>0 ïi 850 1 9 1 δ - 19 --U N a Φ Φ ΦΗΛ 3 a w λ a a o a X k3a <escn> 0 ïi 850 1 9 1 δ - 19 -
Voorbeeld ΓΙΧ (Effekt van de magnesiumionconcentratie op de transaminaseaktiviteitlExample ΓΙΧ (Effect of the magnesium ion concentration on the transaminase activity 1
Men bereidde een synthetische oplossing die 17,0 5 g/1 Na-FPZ (monohydraat) ( Sigma Chemical Co.) (natriumzout) en 11,0 g/1 asparaginezuur (Sigma Chemical Co.) bevatte in -4 een 0,1 M fosfaatbuffer met 1,0 x 10 Μ P-5-F , en stelde de pH in op 7,5 met ammonia en zwavelzuur . Men bracht monsters van 100 ml in ommantelde roerbekers met verschillen- 10 de hoeveelheden magnesiumsulfaat ter verkrijging van de 2+A synthetic solution was prepared containing 17.0 g / l Na-FPZ (monohydrate) (Sigma Chemical Co.) (sodium salt) and 11.0 g / l aspartic acid (Sigma Chemical Co.) in -4 a 0.1 M phosphate buffer with 1.0 x 10 Μ P-5-F, and adjusted the pH to 7.5 with ammonia and sulfuric acid. 100 ml samples were placed in coated stirrers with different amounts of magnesium sulfate to obtain the 2+
Mg concentraties die in tabel C worden aangegeven. De op- o lossingen werden bij 37 C gehouden en rustig geschud . Gedroogde Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 cellen werden als in voorbeeld X bereid. Aan iedere oplossing werd 15 0,5 g gedroogde cellen toegevoegd. Monsters werden als inMg concentrations shown in Table C. The solutions were kept at 37 ° C and shaken gently. Dried Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 cells were prepared as in Example X. 0.5 g of dried cells were added to each solution. Samples were as in
voorbeeld X na 0,2 en 5 uur geanalyseerd. De in tabel CExample X analyzed after 0.2 and 5 hours. The in Table C
getoonde resultaten geven aan, dat grotere concentraties 2+results shown indicate that larger concentrations of 2+
Mg overeenkomen met grotere transamineringssnelheden en totaalopbrengsten.Mg correspond to higher transamination rates and total yields.
20 £ t. s ;i l f* •er V **»- » V 4 4 Ψ f - 20 -20 £ t. s; i l f * • er V ** »-» V 4 4 Ψ f - 20 -
CMCM
I oo T-iinor'cn οοοσιο ο ο νο ο η r-» ο ο n *I oo T-iinor'cn οοοσιο ο ο νο ο η r- »ο ο n *
*—; «.^*.00 ·» >* · O CO* -; «. ^ *. 00 ·»> * · O CO
η* η ο n -h * -· cm -h in ο οί W t-It-I -Η Ο O -“· - " oη * η ο n -h * - · cm -h in ο οί W t-It-I -Η Ο O - “· -" o
COCO
CMCM
I OO CM -¾1 t'· P- •'tf CM Ο Ο <Ti d° o cm co o^fovan ή ο ο η o ^ ^ ·» * * *· O O - · -» o ·* _ r»cn co n --· o cm ο ο n + >d --)--) --) · O -H - 0Ί CM o oI OO CM -¾1 t '· P- •' tf CM Ο Ο <Ti d ° o cm co o ^ fovan ή ο ο η o ^ ^ · »* * * · OO - · -» o · * _ r » cn co n - · o cm ο ο n +> d -) -) -) · O -H - 0Ί CM oo
«HH
SS
co <ΰ 'co <ΰ '
•p co -p I• p co -p I
td o & p ) ^ jJ OO OOCMt^LD η Ο O CO - C5X O'd* dromon vo ο ιο n cm Φ - - ^ - ~ ο ο *-«-^oo on on vo n --) ·» * cm π ίο o β *-)--) --1 Ο O Ή - V 0 0 otd o & p) ^ jJ OO OOCMt ^ LD η Ο O CO - C5X O'd * dromon vo ο ιο n cm Φ - - ^ - ~ ο ο * - «- ^ oo on on n n -) ·» * cm π ίο o β * -) -) --1 Ο O Ή - V 0 0 o
iHiH
<U Q) co<U Q) co
Λ Ό IΛ Ό I
id a o ip m -h oo η ο o co σι -η ο o t·* λ> ,-4 c- cm o w co t·- n cm o p· η o r-1 ** - -- - Ο Ο — - - O - .p von cm cm O - cm th in o cmid ao ip m -h oo η ο o co σι -η ο ot · * λ>, -4 c- cm ow co t · - n cm op · η o r-1 ** - - - Ο Ο - - - O - .p von cm cm O - cm th in o cm
Γ~) t—) »—) tH -—1 — O ' * — OΓ ~) t—) »-) tH -—1 - O '* - O
Ü o o to p Q) > ^ *ο oo cm ο n i> vo ooor^c» r-t on oaor-on -ψ o cm n -3· <b *t ^ s s o o ^ ^ o — « p- η r- n --) - - cM^ninooÜ oo to p Q)> ^ * ο oo cm ο ni> for ooor ^ c »rt on oaor-on -ψ o cm n -3 · <b * t ^ ssoo ^ ^ o -« p- η r- n -) - - cM ^ ninoo
nn --) Ο O --) - COnn -) Ο O -) - CO
η oη o
<& P<& P
-d> η- ooono 3 o I oo vo cm n w cm in r·- o .- 3 cm o ocncnoo - - - 0 m< n-d> η- ooono 3 o I oo vo cm n w cm in r · - o .- 3 cm o ocncnoo - - - 0 m <n
.. * O - VO CM CM - Γ- CD.. * O - VO CM CM - Γ- CD
r- n σι in co - 0 -ho > -H --) ο ·η 85 0 1 S 1 δ f3 .. _ Η λ p <n ϋ HI Φ N Ό •H CU Ö -d Λ pr- n σι in co - 0 -ho> -H -) ο · η 85 0 1 S 1 δ f3 .. _ Η λ p <n ϋ HI Φ N Ό • H CU Ö -d Λ p
P jo CQ jo 1¾ PP jo CQ jo 1¾ P
id 'S ^ >1 P Cg C ÏÏ B1 •p tn jO cn Λ h a -- 0 a >1 <D ρ <D co Φ — ö a a) * * -V -P * % -P ,¾id 'S ^> 1 P Cg C ÏÏ B1 • p tn jO cn Λ h a - 0 a> 1 <D ρ <D co Φ - ö a a) * * -V -P *% -P, ¾
¢3 4J »—\ *—x /—x d) M ^ Φ CQ¢ 3 4J »- \ * —x / —x d) M ^ Φ CQ
0 ·Η rHrH (Hr-I t—) Ή -P <—4 rH r—ί ·Η O0 · Η rHrH (Hr-I t—) Ή -P <—4 rH r — ί · Η O
Or-4 \ \\-\iwctnOr-4 \ \\ - \ iwctn
--. p O O' P O O' Ο -P 6 P Ο Ο Ο -Η Φ H-. p O O 'P O O' Ο -P 6 P Ο Ο Ο -Η Φ H
+ ^· 3 -Ü ci gw^wogra |3w^wop id+ ^ · 3 -Ü ci gw ^ wogra | 3w ^ wop id
CM 0 5 N ft 3ΝΛ<1)(ΰΗ·Η ICM 0 5 N ft 3ΝΛ <1) (ΰΗ · Η I
os aw ft co jo a 0 a) ft co jo a aos aw ft co jo a 0 a) ft co jo a a
g^oftid cM&^ίdaω>J0 infcidawo Kg ^ oftid cM & ^ ίdaω> J0 infcidawo K
- 21 - • J»- 21 - • J »
Voorbeeld IVExample IV
(Effekt van verschillende zouten op de transaminase-aktiviteit)(Effect of different salts on the transaminase activity)
Men bereidde een synthetische oplossing die 20,6 g/1 5 Na-FPZ (monohydraat) (Sigma Chemical Co.) en 13,5 g/1 asparagine-zuur (Sigma Chemical Ca) bevatte in een 0,1 M fosfaatbuffer met 0,1 P-5-F. Men bereidde monsters van 100 ml van deze oplossing en voegde één van de volgende zouten aan ieder monster _3 toe tot een concentratie van 1,0 x 10 mol per liter: 10 magnesiumsulfaat, mangaansulfaat, kopersulfaat, calciumchloride, aluminiumsulfaat en ijzersulfaat. Men hield één monster, waar men geen zout aan toegevoegd had, als controle. De pH van iedere oplossing werd op 8,5 ingesteld en de oplossing werd rustig geschud . Men bereidde gedroogde Pseudomonas pseudoalcaligenes 15 ATCC 12815 cellen als in voorbeeld I. Aan iedere oplossing voegde men 0,5 g gedroogde cellen toe. Men hield de oplossingen . onder rustig schudden bij 37°C. Men nam monsters na 0, 5 en 24 uur en analyseerde ze als in voorbeeld I. De in tabel D ge- 2+ 2+ 3+ 2+ toonde resultaten geven aan dat de Mg Mn -,A1 - en Fe 20 zouten doeltreffend zijn bij het vergroten van de transami-neringssnelheid en opbrengst .A synthetic solution was prepared containing 20.6 g / l of Na-FPZ (monohydrate) (Sigma Chemical Co.) and 13.5 g / l of aspartic acid (Sigma Chemical Ca) in a 0.1 M phosphate buffer with 0 1 P-5-F. 100 ml samples of this solution were prepared and one of the following salts was added to each sample tot3 to a concentration of 1.0 x 10 mol per liter: 10 magnesium sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium chloride, aluminum sulfate and iron sulfate. One sample to which no salt was added was kept as a control. The pH of each solution was adjusted to 8.5 and the solution was gently shaken. Dried Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 cells were prepared as in Example 1. 0.5 g of dried cells were added to each solution. The solutions were kept. with gentle shaking at 37 ° C. Samples were taken at 0, 5 and 24 hours and analyzed as in Example 1. The Table 2 gen 2+ 2+ 3+ 2+ showed results indicate that the Mg Mn, A1 and Fe 20 salts are effective in increasing the transamination rate and yield.
25 8301916 0 W» v - 22 -25 8301 916 0 W »v - 22 -
H O CM O O O Γ' [" O O O dP dPH O CM O O O Γ '["O O O dP dP
o <J Π CN CM CM O -'-l O Ή CN O Oo <J Π CN CM CM O -'- l O Ή CN O O
M - - - - - O O - - » * - +J-- co ^ ® 00 li) » O O'vfrOO <· βτ-4τΗ O' rHCOI'' o o üM - - - - - O O - - »* - + J-- co ^ ® 00 li)» O O'vfrOO <· βτ-4τΗ O 'rHCOI' 'o o ü
^ o ^ o ® o σι co o o O a° dP^ o ^ o ® o σι co o o O a ° dP
O οι η ® σι o - <-* o cvj o o o m - - - - - o O -*·* “ -O οι η ® σι o - <- * o cvj o o o m - - - - - o O - * · * “-
0 ld ·Φ 01 CO r- - O O ® *3* CD O0 ld · Φ 01 CO r- - O O ® * 3 * CD O
ft *-i <-< O·· T-ICDC30 oft * -i <- <O ·· T-ICDC30 o
GG
<D<D
-μ 8 N ® 0 "^1*-μ 8 N ® 0 "^ 1 *
röo in^ OOLD^rH O 00 ® dP dPröo in ^ OOLD ^ rH O 00 ® dP dP
(j j] in r- m σι co ·ή cm o co σι o o 0 - . - - - o o - » - ' * Γ-ICN CD CM αο^οο-ο O >-i O ® rH H f) TH O - TH Ol <31 H Pfl I .o Λ o w(yy] in r- m σι co · ή cm o co σι oo 0 -. - - - oo - »- '* Γ-ICN CD CM αο ^ οο-ο O> -i O ® rH H f) TH O - TH Ol <31 H Pfl I .ow
MM
<u ><u>
CM OO O O ® ® Γ~~ O v? ® dP dPCM OO O O ® ® Γ ~~ O v? DP dP
öh cM'i1 *-h co r-· ® co r-- r- cn o o 1ÖO - - - - O O ---- -öh cM'i1 * -h co r- · ® co r-- r- cn o o 1ÖO - - - - O O ---- -
>«3 c0 00 CO CN O O >-t ® ^P O CO> «3 c0 00 CO CN O O> -t ® ^ P O CO
th-o mm ÖI O -th-o mm ÖI O -
Q G OQ G O
•H Η ΰ) ·π Λ ·Η «J Η ft 0)• H Η ΰ) · π Λ · Η «J Η ft 0)
Si-st* O O 01 Γ- ® O O CO dP dPSi-st * O O 01 Γ- ® O O CO dP dP
MO ® r- o o o ® r- cn σι co o o 0 W - - - - - O O - - - - - >p co® σι σι ® o- o cn co co ® oMO ® r- o o o ® r- cn σι co o o 0 W - - - - - O O - - - - -> p co® σι σι ® o- o cn co co ® o
—« CJ *“l *-< -O 'vl'CO- «CJ *“ l * - <-O 'vl'CO
o oo o
•^JI t/P t)P• ^ JI t / P t) P
O -tfo ® r- σι *h t-i o r- o o o cq o® m-vPLnr-icM o cn cn - γη - - -->.00 - - - m co g CO® CD ® CO - O O -<-i 'G* 01 C~- τ-Ί i-l o * v* oO -tfo ® r- σι * h ti o r- ooo cq o® m-vPLnr-icM o cn cn - γη - - ->. 00 - - - m co g CO® CD ® CO - OO - <- i 'G * 01 C ~ - τ-Ί il o * v * o
MM
gg
dP dP GdP dP G
ςρ oo mr'^t-H cm o r- o σι on O m»H m 'S1 'S* ^ o oen®*· » d> ca -- ---oo --->^®> t5i co® oo ^ oo - - o o ® σι σι ·ηςρ oo mr '^ tH cm o r- o σι on O m »H m' S1 'S * ^ o oen® * ·» d> ca - --- oo ---> ^ ®> t5i co® oo ^ oo - - oo ® σι σι · η
g ft ft o o ^ Gg ft ft o o ^ G
Ό oΌ o
MM
>1 P«> 1 P «
0 I-I0 I-I
Λ felΛ fierce
o So S
M0 Φ Μ * -η Λ! !K +J λ +1— iw Μ Φ Φ Ό Μ N CflQi rMH r-Η r-4 H +J ·Μ ·Η ·Μ rM r-l Η 0> ft OTO 01M0 Φ Μ * -η Λ! ! K + J λ + 1— iw Μ Φ Φ Ό Μ N CflQi rMH r-Η r-4 H + J · Μ · Η · Μ rM r-l Η 0> ft OTO 01
\ \ a> a> <H <D M'-s‘'vv-.GftGnJH\ \ a> a> <H <D M'-sv'vv-.GftGnJH
M Cn Cn MOOOiSrG-HO! GÖ>öitriCU\®v.id p —* —3 Ή O H 3 —^ M d) ΜΦM Cn Cn MOOOiSrG-HO! GÖ> öitriCU \ ®v.id p - * —3 Ή O H 3 - ^ M d) ΜΦ
Gtaft GNftd)Hd)(Ud) N ft d) Λ Λ ,ÖG IGtaft GNftd) Hd) (Ud) N ft d) Λ Λ, ÖG I
ft 0 .: ft 0 ,G OG ft C -vSiftul^gift ftft o ft ιβ ®ft«3ft>mmra cNftrtftO'-'O-'ïÏ 85 0 1 3 1 6 , *ft 0.: ft 0, G OG ft C -vSiftul ^ gift ftft o ft ιβ ®ft «3ft> mmra cNftrtftO '-' O -'ïÏ 85 0 1 3 1 6, *
- 23 -Voorbeeld V- 23 - Example V
(Vergelijking van oplosbare en onoplosbare metaal- zouten)(Comparison of soluble and insoluble metal salts)
Men bereidde een synthetische oplossing die 5 30/0 g/1 Na-FPZ( monohydraat) (Sigma Chemical Co.) en 24,0 g/1 asparaginezuur (Sigma Chemical Co.) bevatte in 0,1 M fosfaat-buffer met 0,1 ^uM P-5-F en 100 dpm Barquat MB-SO (TM) (Lonza Ine.) als een desinfecteermiddel. Aan 100 ml monsters van de oplossing werd respectievelijk één van de volgende stoffen 10 toegevoegd: —3 —2 —2 1,0x10 M MgS04, 1,0x10 M MgSO^, 1,0x10 M Al2(S04)3 en 10 g/1 aluminiumoxydepersstukjes (ongeveer 420^um). De pH van de oplossingen werd op 8,5 ingesteld met ammonia en zwa-15 velzuur. Aan iedere oplossing voegde men 5,0 g natteA synthetic solution containing 5 30/0 g / l Na-FPZ (monohydrate) (Sigma Chemical Co.) and 24.0 g / l aspartic acid (Sigma Chemical Co.) in 0.1 M phosphate buffer with 0 was prepared. , 1 µm P-5-F and 100 ppm Barquat MB-SO (TM) (Lonza Ine.) As a disinfectant. One of the following substances was added to 100 ml samples of the solution, respectively: - 3 - 2 - 2 1.0x10 M MgSO4, 1.0x10 M MgSO4, 1.0x10 M Al2 (SO4) 3 and 10 g / l aluminum oxide press pieces (about 420 µm). The pH of the solutions was adjusted to 8.5 with ammonia and sulfuric acid. 5.0 g of wet water was added to each solution
Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 cellen toe (vochtgehalte 72%). De oplossingen werden verwarmd tot 35°C en rustig geschud. Men nam monsters na 0, 1 , 5 en 24 uur en analyseerde ze als in voorbeeld I . De in tabel E getoonde resultaten 2o geven aan dat het gebruik van aluminiumoxydepersstukjes onge veer even doeltreffend is als magnesiumsulfaat of aluminiumsulfaat voor het vergroten van de volumetrische reaktiesnel-heid en totaalopbrengst voor de transaminering.Pseudomonas pseudoalcaligenes ATCC 12815 cells (moisture content 72%). The solutions were heated to 35 ° C and shaken gently. Samples were taken at 0, 1, 5 and 24 hours and analyzed as in Example I. The results 20 shown in Table E indicate that the use of alumina pellets is approximately as effective as magnesium sulfate or aluminum sulfate for increasing the volumetric reaction rate and total yield for the transamination.
25 gK ηίo ïs V «W ‘J - L· i -j25 gK ηίo ïs V «W" J - L · i -j
v/ Vv / V
~ 24 ~ § « •Η Μ Η S φ Μ \ ·η & φ co co > οι w r- οι ιη ο- σι t? g ® ·η co ο <η ο in in co ο ο σι οι *η rjinirf -- - - - Ο Ο ---00 Ο Η >t Ρ CO 'd* If) VO CO - O Ol VQ τ-ι - Ο h lU K 4J 0)0) rH-rg O- 0)0' 0 M O 0 a m S1 ^ ojo 0 0 0 co 03 ο- 00 m co vo 00 coo ·ί 01 ^ ο 01 in Γ" σ 01 *h~ 24 ~ § «• Η Μ Η S φ Μ \ · η & φ co co> οι w r- οι ιη ο- σι t? g ® · η co ο <η ο in in co ο ο σι οι * η rjinirf - - - - Ο Ο --- 00 Ο Η> t Ρ CO 'd * If) VO CO - O Ol VQ τ-ι - Ο h lU K 4J 0) 0) rH-rg O- 0) 0 '0 MO 0 am S1 ^ ojo 0 0 0 co 03 ο- 00 m co vo 00 coo · ί 01 ^ ο 01 in Γ "σ 01 * h
H tn "'-- ---OO - - -OOH tn "'- --- OO - - -OO
„ W o- 0 vo ' 0 τΐ< ο- σι ' 0 C X CM 0)01 tHO] O- T-iO'"W o- 0 vo '0 τΐ <ο- σι' 0 C X CM 0) 01 tHO] O- T-iO '
φ Η Ο Oφ Η Ο O
+j ^ rij+ j ^ row
PP
00
NN
r—1 <d (ö u 0) 6 a meg Is- r·* η ιη ¢0 π co 0 01 ^ d'r — 1 <d (ö u 0) 6 a meg Is- r · * η ιη ¢ 0 π co 0 01 ^ d '
ι- i .di OO CO O' Ή If) CO Ή Ol O' Ο) fHι- i .di OO CO O 'Ή If) CO Ή Ol O' Ο) fH
.00 - - ---OO ---OO.00 - - --- OO --- OO
μ -^it/3 co if) ο- σι - Ο o) co σι - o φ 01 (NO) TH-rHO- rtO'μ - ^ it / 3 co if) ο- σι - Ο o) co σι - o φ 01 (NO) TH-rHO- rtO '
•ro X! a ο O• ro X! a ο O
££
PP
to m u Φ ft Φ ρα >p H $? φ 0 8 ito m u Φ ft Φ ρα> p H $? φ 0 8 i
dj .-1 Sdj.-1 S
^r< rr o eg σι co <d< *-< rr co w 10 vo .,-1 m m 01 in η η co ο ο) ή^ r <rr o eg σι co <d <* - <rr co w 10 vo., - 1 m m 01 in η η co ο ο) ή
a I —. — — — — ο O — — — Ο Oa I -. - - - - ο O - - - Ο O
3 O^1 COCO 0000--0 ο) O' σι - 0 Η O 0)0) ft τ-Ι Ο ' ΉΟ' rij Ui O o a3 O ^ 1 COCO 0000--0 ο) O 'σι - 0 Η O 0) 0) ft τ-Ι Ο' ΉΟ 'row Ui O o a
HH
td Ό •ιΗ Ή φ Φtd Ό • ιΗ Ή φ Φ
Λ tl Λ 'OΛ tl Λ 'O
·« r-ί Ή *·Ρ Ή j-i φ φ Φ Φ ο G Xi α Λ +) W r-Ι ΜΗ η Φ S <2 ö >, § « € " (ö ω Φ μ φ +» * Κ ·η Jjj * -rj ^ id Η Η ι—I Η Η +3 ·Η Η Η Η +> ·Η Η \ \ \ \ \ φ Ή \ V. \ φ m (d PCntn PUiOOB-H ΜΟΟΟΞ-Η <rt 3 3 w — — ·3 ϋ 4J p Ν ft Ρ Ν ft Φ Η Φ Ρ Ν ft Φ Η Φ φ am a ω £ g ft fttn^ Pft § ofcid -η ft <d ft > en in «1 -ft > οι 85 0 1 5 1 :j e Γ» - 25 -· «R-ί Ή * · Ρ Ή ji φ φ Φ Φ ο G Xi α Λ +) W r-Ι ΜΗ η Φ S <2 ö>, §« € "(ö ω Φ μ φ +» * Κ · η Yyy * -rj ^ id Η Η ι — I Η Η +3 · Η Η Η Η +> · Η Η \ \ \ \ \ φ Ή \ V. \ φ m (d PCntn PUiOOB-H ΜΟΟΟΞ-Η <rt 3 3 w - - · 3 ϋ 4J p Ν ft Ρ Ν ft Φ Η Φ Ρ Ν ft Φ Η Φ φ am a ω £ g ft fttn ^ Pft § ofcid -η ft <d ft> and in «1 -ft> οι 85 0 1 5 1: you Γ »- 25 -
Vervolg tabel ETable E continues
-3 -2 -2 me taalkatalysator; lx 10 M 1x10 M 1x10 M 10 g/1-3 -2 -2 me language catalyst; lx 10 M 1x10 M 1x10 M 10 g / 1
MgS04 MgS04 Al2(SO^)^ aluminium- oxydepers- stukjes 24 uur FPZ(g/l)X 0,00 0,00 0,00 0,00 asp(g/1) 4,69 3,47 4,80 3,46 phe(g/1) 23,45 22,79 22,20 22,75 opbrengst 99,6% 98,9% 93,0¾ 95,5% (phe/FPZ) x - als fenylpyrodruivezuurMgS04 MgS04 Al2 (SO ^) ^ alumina press 24 hrs FPZ (g / l) X 0.00 0.00 0.00 0.00 asp (g / 1) 4.69 3.47 4.80 3 .46 phe (g / 1) 23.45 22.79 22.20 22.75 yield 99.6% 98.9% 93.0¾ 95.5% (phe / FPZ) x - as phenylpyruvic acid
Voorbeeld VIExample VI
15 - (Produktie van tyrosine)15 - (Production of tyrosine)
Men bereidde een synthetische oplossing door het oplossen van 1,25 g p-hydroxyfenylpyrodruivezuur (pH-FPZ) (Sigma Chemical Co.) in 50 ml 0,1 M fosfaatbüffer samen met 1,0 g asparaginezuur (Sigma Chemical Co.) ,0,1 ,uM P-5-F -3 en 1,0 x 10 M zinksulfaat. Men stelde de pH van de oplos- 20 sing in op 8,0. E_. coli ATCC 11303 cellen werden geïmmobiliseerd in Hypol (TM)(HFP 3000, K.R. Grace & Co.) polyurethaan-schuim door 50,0 g celpasta met 75% vochtgehalte met 50,0 g Hypol (TM) prepolymeer te mengen. Men liet het mengsel ^ (ongeveer 15 minuten Jharden en sneed het uitgeharde schuim in kleine stukjes met een grootte van ongeveer 0,6 mm. Men voegde in totaal 4,0 g uitgehard schuim aan de bereide pH-FPZ oplossing toe. De oplossing werd onder rustig schudden bij 37°C gehouden.A synthetic solution was prepared by dissolving 1.25 g of p-hydroxyphenylpyruvic acid (pH-FPZ) (Sigma Chemical Co.) in 50 ml of 0.1 M phosphate buffer together with 1.0 g of aspartic acid (Sigma Chemical Co.), 0 ΜM P-5-F-3 and 1.0 x 10 M zinc sulfate. The pH of the solution was adjusted to 8.0. E_. coli ATCC 11303 cells were immobilized in Hypol (TM) (HFP 3000, K.R. Grace & Co.) polyurethane foam by mixing 50.0 g cell paste with 75% moisture content with 50.0 g Hypol (TM) prepolymer. The mixture was allowed to cure for about 15 minutes and the cured foam was cut into small pieces about 0.6 mm in size. A total of 4.0 g of cured foam was added to the prepared pH-FPZ solution. The solution was kept at 37 ° C with gentle shaking.
Men nam monsters na 0, 3 en 18 uur en analy-30 seerde ze met behulp van dunnelaagchromatografie (TLC) en HPLC op tyrosine en asparaginezuur. . Na 3 uur werd de oplos- «0 j 1 ΰ I υSamples were taken at 0, 3 and 18 hours and analyzed by thin layer chromatography (TLC) and HPLC on tyrosine and aspartic acid. . After 3 hours, the solution was dissolved
, V, V
- 26 - sing wazig door precipitant daar tyrosine geproduceerd werd. Om het produkt te winnen werden de brij en het schuim met een gelijk volume aceton gewassen en het schuim met behulp van een Buchner-trechter afgefiltreerd. De oplossing 5 die 1,2 g/1 tyrosine in oplossing bevatte, werd met 3000 omw/ min. gecentrifugeerd. Het resulterende aminozuurpersstukje werd verzameld en gedroogd. In totaal werd 1,1 g gedroogd produkt verzameld en met behulp van TLC en HPLC als tyrosine geïdentificeerd. Men vond met behulp van niet-waterige 10 titratie dat het produkt voor meer dan 90% zuiver was. De in tabel F getoonde resultaten geven aan dat de hier beschreven werkwijze geschikt is voor de snelle produktie van > tyrosine in grote opbrengst.- 26 - Blurred by precipitant since tyrosine was produced. To recover the product, the slurry and foam were washed with an equal volume of acetone and the foam filtered using a Buchner funnel. The solution containing 1.2 g / l tyrosine in solution was centrifuged at 3000 rpm. The resulting amino acid pellet was collected and dried. A total of 1.1 g of dried product was collected and identified as tyrosine by TLC and HPLC. The product was found to be more than 90% pure by non-aqueous titration. The results shown in Table F indicate that the process described here is suitable for the rapid production of tyrosine in high yield.
Tabel FTable F
15 (Produktie van tyrosine)15 (Production of tyrosine)
Tijd: 0 uur 3 uur 18 uur pH-FPZ(g/1) 25,0 asp(g/l) 18,5 16,2 1,2 20 tyr1 0,0 1,2 1,2 2 tyr 0,0 — 1,0 opbrengst (tyr/pH-FPZ) ~ — 85% opbrengst — — 80% 25 (tyr/asp) 1 - g/1 tyrosine in oplossing bij monsterneming 2 - g tyrosine als totale opbrengst in gedroogd persstukjeTime: 0 hours 3 hours 18 hours pH-FPZ (g / 1) 25.0 asp (g / l) 18.5 16.2 1.2 20 tyr1 0.0 1.2 1.2 2 tyr 0.0 - 1.0 yield (tyr / pH-FPZ) ~ - 85% yield - - 80% 25 (tyr / asp) 1 - g / 1 tyrosine in solution upon sampling 2 - g tyrosine as total yield in dried pellet
Colorimetrische bepaling met ijzer(III)chloride van fenylpyrodruivezuur, natriumzoutColorimetric determination with iron (III) chloride of phenylpyruvic acid, sodium salt
Principe: Fenylpyrodruivezuur (FPZ) vormt een groen complex met ijzer (III) ionen. De intensiteit van de groene kleur is evenredig met de aanwezige hoeveelheid FPZ.Principle: Phenylpyruvic acid (FPZ) forms a green complex with iron (III) ions. The intensity of the green color is proportional to the amount of FPZ present.
8501916 - 27 -8501916 - 27 -
Reagentia: 1. Ontwikkeloplossing (00) (1000 ml) - Meng de volgende bestanddelen en koel het mengsel in een ijsbad tot kamertemperatuur af. Breng het mengsel over in een 1 1 . 5 maatkolf en val aan tot 1000 ml met gedeioniseerd water.Reagents: 1. Developing solution (00) (1000 ml) - Mix the following ingredients and cool the mixture to room temperature in an ice bath. Transfer the mixture to a 1 1. 5 volumetric flask and attack to 1000 ml with deionized water.
Bestanddelen: 0,5 g FeCl^.ö^O; 20 ml ijsazijnj 600 ml dimethyl-sulfoxyde; 200 ml gedeioniseerd water.Components: 0.5 g FeCl 4. 20 ml glacial acetic acid 600 ml dimethyl sulfoxide; 200 ml of deionized water.
2. Na-FPZ standaardoplossing (10 g/1) - Voeg 500 mg Na-FPZ. H^O (Aldrich Chemical Co., Ine. , 98-100% zuiver) toe aan 40 ml 0,1 M Tris/HCl buffer (pH 8,0) bij 34°C. Roer tot het opgelost is. Breng de oplossing over in een 50 ml maatkolf en vul aan tot 50 ml met Tris/HCl buffer.2. Na-FPZ standard solution (10 g / 1) - Add 500 mg of Na-FPZ. H 2 O (Aldrich Chemical Co., Ine., 98-100% pure) to 40 ml of 0.1 M Tris / HCl buffer (pH 8.0) at 34 ° C. Stir until dissolved. Transfer the solution to a 50 ml volumetric flask and make up to 50 ml with Tris / HCl buffer.
Koel bewaren.Keep cool.
0,1 M Tris/HCl buffer: voeg 900 ml gedeioniseerd ^ water toe aan 12,11 g Tris; stel pH in op 8,0 met HCl ; breng de oplossing over in een maatkolf ; voeg gedeioniseerd water toe tot 1000 ml .0.1 M Tris / HCl buffer: add 900 ml deionized water to 12.11 g Tris; adjust pH to 8.0 with HCl; transfer the solution to a volumetric flask; add deionized water to 1000 ml.
Ukkurve:Ukkurve:
Voeg Na-FPZ standaardoplossing en 4,95 ml ont-wikkeloplossing toe aan glazen spectrofotometerbuizen. Meng op de vortex. Laat ze precies 10 minuten staan (start het opnemen van de' tijd bij het toevoegen van 00 aan de eerste buis). Lees de optische dichtheid (OD) bij 640 nm af. Maak een Na-FPZ.standaardijkkurve (op de vertikale as de absorptie, op de horizontale as het aantal mg Na-FPZ.^O/ml 00 1.Add Na-FPZ standard solution and 4.95 ml of developing solution to glass spectrophotometer tubes. Mix on the vortex. Let them stand for exactly 10 minutes (start recording the 'time when adding 00 to the first tube). Read the optical density (OD) at 640 nm. Make a Na-FPZ standard dike curve (absorbance on the vertical axis, on the horizontal axis the number of mg Na-FPZ. ^ O / ml 00 1.
O Λ u ï -j i y V *r - 28 -O Λ u ï -j i y V * r - 28 -
Na-FPZ standaardoplossing mg Na-FPZ.E^ONa-FPZ standard solution mg Na-FPZ.E ^ O
per ml 00 5 ,ul 0,01 5 / 10 ^,ul 0,02 15 ^ul 0,03 20 ^ul 0,04 25 ^,ul 0,05 30 ,ul 0,06 10 /per ml 00 5, ul 0.01 5/10 ^, ul 0.02 15 ^ ul 0.03 20 ^ ul 0.04 25 ^, ul 0.05 30, ul 0.06 10 /
Berekening; OD x 100 x verdunningCalculation; OD x 100 x dilution
Na-FPZ.H20 = - (mg/ml) helling uit standaardcurve 15 OD x 100 x verdunning .... .Na-FPZ.H20 = - (mg / ml) slope from standard curve 15 OD x 100 x dilution .....
FPZ (g/U = -:- X ±?±Ll helling uit standaardcurve 204,16 0 19 16FPZ (g / U = -: - X ±? ± L1 slope from standard curve 204.16 0 19 16
Claims (33)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62796984A | 1984-07-05 | 1984-07-05 | |
| US62796984 | 1984-07-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8501916A true NL8501916A (en) | 1986-02-03 |
Family
ID=24516862
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8501916A NL8501916A (en) | 1984-07-05 | 1985-07-04 | PROCESS FOR PREPARING AMINO ACIDS BY TRANSAMINATION. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6121091A (en) |
| AU (1) | AU4442085A (en) |
| DE (1) | DE3523161A1 (en) |
| FR (1) | FR2567150A1 (en) |
| GB (1) | GB2161159A (en) |
| IT (1) | IT1188174B (en) |
| NL (1) | NL8501916A (en) |
| SE (1) | SE8502315L (en) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU193902B (en) * | 1983-09-01 | 1987-12-28 | Genetics Inst | Process for preparing l-amino acids by means of transamination |
| GB2152503B (en) * | 1984-01-05 | 1986-03-19 | Grace W R & Co | Process for producing l-phenylalanine |
| US4826766A (en) * | 1985-09-23 | 1989-05-02 | Genetics Institute, Inc. | Production of amino acids using coupled aminotransferases |
| ES2058076T3 (en) * | 1986-06-04 | 1994-11-01 | Hoechst Ag | PROCEDURE FOR THE OBTAINING OF L-PHOSPHINOTRICINE BY TRANSAMINATION. |
| AU599985B2 (en) * | 1986-06-09 | 1990-08-02 | Meiji Seika Kaisha Ltd. | New process for the production of L-2-amino-4- (hydroxymethyl-phosphinyl)-butyric acid |
| WO2000023609A1 (en) * | 1998-10-19 | 2000-04-27 | Nsc Technologies Llc | Transaminase biotransformation process employing glutamic acid |
| EP3330380A1 (en) * | 2016-12-05 | 2018-06-06 | Evonik Degussa GmbH | Process for producing l-methionine from methional |
| CN111778129A (en) * | 2020-06-17 | 2020-10-16 | 方国胜 | Nucleic acid and amino acid health oral liquid and preparation method thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3183170A (en) * | 1961-10-03 | 1965-05-11 | Sanraku Ocean Kabushiki Kaisha | Method of l-amino acid manufacture |
| CH563344A5 (en) * | 1970-09-30 | 1975-06-30 | Nisshin Flour Milling Co | |
| HU193902B (en) * | 1983-09-01 | 1987-12-28 | Genetics Inst | Process for preparing l-amino acids by means of transamination |
-
1985
- 1985-05-09 SE SE8502315A patent/SE8502315L/en not_active Application Discontinuation
- 1985-06-26 GB GB08516133A patent/GB2161159A/en not_active Withdrawn
- 1985-06-28 AU AU44420/85A patent/AU4442085A/en not_active Abandoned
- 1985-06-28 DE DE19853523161 patent/DE3523161A1/en not_active Withdrawn
- 1985-07-02 JP JP60144092A patent/JPS6121091A/en active Pending
- 1985-07-04 NL NL8501916A patent/NL8501916A/en not_active Application Discontinuation
- 1985-07-04 IT IT21428/85A patent/IT1188174B/en active
- 1985-07-04 FR FR8510247A patent/FR2567150A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE8502315L (en) | 1986-01-06 |
| GB2161159A (en) | 1986-01-08 |
| JPS6121091A (en) | 1986-01-29 |
| DE3523161A1 (en) | 1986-04-03 |
| FR2567150A1 (en) | 1986-01-10 |
| AU4442085A (en) | 1986-01-09 |
| IT8521428A0 (en) | 1985-07-04 |
| GB8516133D0 (en) | 1985-07-31 |
| SE8502315D0 (en) | 1985-05-09 |
| IT1188174B (en) | 1988-01-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3018261B2 (en) | Method for producing L-phosphinothricin by a coupled enzyme reaction | |
| JP4197754B2 (en) | Method for producing lactic acid or succinic acid | |
| WO2005005649A1 (en) | Method for producing organic acid | |
| JPH022591B2 (en) | ||
| NL8501916A (en) | PROCESS FOR PREPARING AMINO ACIDS BY TRANSAMINATION. | |
| EP0206460A2 (en) | L-phenylalanine dehydrogenase and use thereof | |
| NL8401049A (en) | PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-AMINO ACIDS FROM ALFA-KETO ACIDS. | |
| DE3307095A1 (en) | MICROBIOLOGICALLY PRODUCED L-PHENYLALANINE DEHYDROGENASE, METHOD FOR THEIR DETERMINATION AND THEIR USE | |
| US5783428A (en) | Method of producing fumaric acid | |
| US5100782A (en) | Process for the preparation of l-amino acids and amino acid amides | |
| IE920299A1 (en) | Microbiological process for the preparation of 6-hydroxypicolinic acid | |
| US4859591A (en) | Transamination process for producing amino acids | |
| EP0140503A1 (en) | An efficient process for preparing L-amino acids in bacteria | |
| FR2518988A1 (en) | PROCESS FOR PREPARING L-THREONINE | |
| KR100433134B1 (en) | Novel thermophilic microorganism and methods for producing l-type aromatic amino acids by using the same | |
| EP0102529B1 (en) | Process for preparation of aspartylphenylalanine alkyl esters | |
| JPH0716428B2 (en) | Method for producing L-amino acid | |
| WO1999032650A1 (en) | Process for producing [s,s]-ethylenediamine-n,n'-disuccinic acid | |
| JP2507406B2 (en) | Method for producing D-(-)-tartaric acid | |
| JPS6121077B2 (en) | ||
| JPS6120274B2 (en) | ||
| NL8702449A (en) | PROCESS FOR THE PREPARATION OF A D-ALFA-AMINOIC ACID FROM THE COMPATIBLE ALFA-KETOIC ACID. | |
| JPH06102027B2 (en) | Method for producing L-2-amino-4-phenylbutyric acid | |
| US5254464A (en) | Process for producing D-alanine | |
| EP0310949A2 (en) | Process for producing D-alanine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BV | The patent application has lapsed |