NL8300699A - METHOD FOR BUILDING FOREIGN DNA INTO THE NAME OF DIABIC LOBAL PLANTS; METHOD FOR PRODUCING AGROBACTERIUM TUMEFACIENS BACTERIEN; STABLE COINTEGRATE PLASMIDS; PLANTS AND PLANT CELLS WITH CHANGED GENETIC PROPERTIES; PROCESS FOR PREPARING CHEMICAL AND / OR PHARMACEUTICAL PRODUCTS. - Google Patents
METHOD FOR BUILDING FOREIGN DNA INTO THE NAME OF DIABIC LOBAL PLANTS; METHOD FOR PRODUCING AGROBACTERIUM TUMEFACIENS BACTERIEN; STABLE COINTEGRATE PLASMIDS; PLANTS AND PLANT CELLS WITH CHANGED GENETIC PROPERTIES; PROCESS FOR PREPARING CHEMICAL AND / OR PHARMACEUTICAL PRODUCTS. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8300699A NL8300699A NL8300699A NL8300699A NL8300699A NL 8300699 A NL8300699 A NL 8300699A NL 8300699 A NL8300699 A NL 8300699A NL 8300699 A NL8300699 A NL 8300699A NL 8300699 A NL8300699 A NL 8300699A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- plasmid
- plants
- foreign dna
- dna
- plasmids
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 167
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 title claims abstract description 29
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims description 5
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title claims description 3
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 title claims description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title abstract description 30
- 108091027551 Cointegrate Proteins 0.000 title abstract description 18
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 64
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 39
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 18
- IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N D-Octopin Natural products OC(=O)C(C)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N D-octopine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H](C)[NH2+][C@H](C([O-])=O)CCCNC(N)=[NH2+] IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N 0.000 description 12
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- ZZYYVZYAZCMNPG-RQJHMYQMSA-N D-lysopine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H](C)[NH2+][C@H](C([O-])=O)CCCC[NH3+] ZZYYVZYAZCMNPG-RQJHMYQMSA-N 0.000 description 1
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- ZZYYVZYAZCMNPG-UHFFFAOYSA-N Lysopine Natural products OC(=O)C(C)NC(C(O)=O)CCCCN ZZYYVZYAZCMNPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241001633102 Rhizobiaceae Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 210000000273 spinal nerve root Anatomy 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
Abstract
Description
' 'Ί A. « VO 4053'' A. «VO 4053
Werkwijze voor het inbouwen van vreemd DNA in het genoom van tweezaad-lobbige planten; werkwijze voor het produceren van Agrobacterium tumefaciens bacteriën; stabiele colntegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.Method for incorporating foreign DNA into the genome of dicotyledonous plants; method for producing Agrobacterium tumefaciens bacteria; stable colntegrate plasmids; plants and plant cells with altered genetic properties; method for preparing chemical and / or pharmaceutical products.
De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het inbouwen van vreemd DNA in het genoom van tweezaadlobbige planten door de planten te infecteren of planteprotoplasten te incuberen met Agrobacterium tumefaciens bacteriën, die één of meer Ti-(tumör-5 inducerende)plasmiden bevatten.The invention relates to a method for incorporating foreign DNA into the genome of dicotyledonous plants by infecting the plants or incubating plant protoplasts with Agrobacterium tumefaciens bacteria containing one or more Ti (tumor-5-inducing) plasmids.
Het is bekend, dat het Ti-plasmide van A. tumefaciens essentieel is voor het vermogen van deze bacterie om de vorming van zogenaamde "Crown gall" tumoren (wortelknobbelziekte) op tweezaadlobbige planten te veroorzaken (van Larebeke et al, Nature (London) 252, 169-170 (1974); 10 Watson et al, J. Bacteriol. 123, 255-264 (1975); Zaenen et al, J. Mol. Biol. 86, 109-127 (1974)). Een deel van dit plasmide, aangeduid als het T-DNA, wordt bij de tumorinductie in het plantengenoom (het chromosomale DNA) geïntegreerd (Chilton et al, Cell 11, 263-271 (1977); Chilton et al, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4060-4064 (1980); 15 Thomashow et al, Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 77, 6448-6452 (1980);It is known that the Ti plasmid of A. tumefaciens is essential for the ability of this bacterium to cause the formation of so-called "Crown gall" tumors (dorsal root disease) on dicotyledonous plants (van Larebeke et al, Nature (London) 252 169-170 (1974) Watson et al, J. Bacteriol 123, 255-264 (1975) Zaenen et al, J. Mol Biol 86, 109-127 (1974)). Part of this plasmid, referred to as the T-DNA, is integrated into the plant genome (the chromosomal DNA) upon tumor induction (Chilton et al, Cell 11, 263-271 (1977); Chilton et al, Proc. Nat. Acad Sci USA 77, 4060-4064 (1980) Thomashow et al, Proc Nat Acad Sci USA 77, 6448-6452 (1980);
Willmitzer et al. Nature (London) 287, 359-361 (1980)) en ondervindt tenminste gedeeltelijk transcriptie tot RNA (Drummond et al, Nature (London) 269, 535-536 (1977); Ledeboer, proefschrift Rijks Qniversiteit Leiden (1978); Gurley et al, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 76, 2828-2832 20 (1979); Willmitzer et al, Mol. Gen. Genet. 182, 255-262 (1981)).Willmitzer et al. Nature (London) 287, 359-361 (1980)) and experiences at least partial transcription to RNA (Drummond et al, Nature (London) 269, 535-536 (1977); Ledeboer, dissertation Rijks Qniversiteit Leiden (1978) Gurley et al, Proc Nat Acad Sci USA 76, 2828-2832 (1979) Willmitzer et al, Mol Gen Gen 182, 255-262 (1981).
De tumorcellen vertonen een fytohormoon onafhankelijke groei en bevatten één of meer ongewone aminozuurderivaten, bekend als opines, waarvan octopine en nopaline de meest bekende zijn. Het T-DNA van een octopine Ti-plasmide omvat een gen, dat codeert voor het enzym lysopine-25 dehydrogenase (LpDH), dat de tumorcel nodig heeft voor de synthese van octopine (Schroder et al, FEBS Lett. 129, 166-168 (1981)). Het plasmide bevat verder genen voor het gebruik van deze opines door de bacterie (Bomhoff et al. Mol. Gen. Genet. 145, 177-181 (1976);The tumor cells exhibit phytohormone independent growth and contain one or more unusual amino acid derivatives known as opines, of which octopine and nopaline are the best known. The T-DNA of an octopine Ti plasmid includes a gene encoding the enzyme lysopine dehydrogenase (LpDH), which the tumor cell needs for the synthesis of octopine (Schroder et al, FEBS Lett. 129, 166-168 (1981)). The plasmid further contains genes for the use of these opines by the bacterium (Bomhoff et al. Mol. Gen. Genet. 145, 177-181 (1976);
Montoya et al, J. Bacteriol. 129, 101-107 (1977)). Indien het T-gebied 30 op het plasmide ontbreekt, worden geen tumoren geïnduceerd (Koekman et al, Plasmid 2, 347-357 (1979)). Behalve het T-gebied, blijkt nog een ander gebied op het Ti-plasmide essentieel te zijn voor het tumor-inducerend vermogen van de bacterie (Garfinkel et al, J. Bacteriol.Montoya et al, J. Bacteriol. 129, 101-107 (1977)). If the T region 30 on the plasmid is missing, no tumors are induced (Koekman et al, Plasmid 2, 347-357 (1979)). In addition to the T region, yet another region on the Ti plasmid appears to be essential for the tumor-inducing ability of the bacterium (Garfinkel et al, J. Bacteriol.
144, 732-743 (1980); Ooms et al, J. Bacteriol. 144, 82-91 (1980)), 8 3 0 0 69 § -2- * . % welk deel echter niet in de plantetumorcellen is aangetroffen. Dit ongeveer 20 Md lange gebied, waarin mutaties complementeerbaar in trans blijken te zijn, wordt het vir-(virulentie)-gebied genoemd (Hille et al, Plasmid 6, 151-154 (1981); Hille et al, Plasmid 7, 5 107-118 (1982); Klee et al, J. Bacteriol. 150, 327-331 (1982)).144, 732-743 (1980); Ooms et al, J. Bacteriol. 144, 82-91 (1980)), 8 3 0 0 69 § -2- *. % which part, however, was not found in the plant tumor cells. This approximately 20 Md long region, in which mutations appear to be complementable in trans, is called the vir (virulence) region (Hille et al, Plasmid 6, 151-154 (1981); Hille et al, Plasmid 7, 5 107 -118 (1982); Klee et al, J. Bacteriol. 150, 327-331 (1982)).
Uit het bovenstaande zal duidelijk zijn, dat de prokaryotische bacterie A. tumefaciens een in de natuur voorkomend systeem voor genetische manipulaties van eukaryotische planten heeft. Het T-DNA-gebied van het Ti-plasmide lijkt zich te lenen voor het inbouwen van vreemd 10 DNA, in het bijzonder genen die voor bepaalde gewenste eigenschappen coderen, in het genoom van plantecellen, te meer omdat het in beginsel mogelijk is om de genen die de tumor doen ontstaan, uit te schakelen zonder tegelijk de inbouw van de nieuwe genen te blokkeren. Een eerste mogelijkheid lijkt om plantecellen te transformeren door planten 15 te infecteren met A. tumefaciens bacteriën die één of meer Ti-plasmiden bevatten, waarvan het T-gebied op de gewenste wijze is gemanipuleerd. Nog beter is het om planteprotoplasten te incuberen met dergelijke A. tumefaciens bacteriën.From the above, it will be apparent that the prokaryotic bacterium A. tumefaciens has a naturally occurring system for genetic manipulations of eukaryotic plants. The T-DNA region of the Ti plasmid seems to lend itself to the incorporation of foreign DNA, in particular genes encoding certain desired properties, into the genome of plant cells, the more so because it is in principle possible to switch off genes that create the tumor without simultaneously blocking the insertion of the new genes. A first possibility appears to transform plant cells by infecting plants with A. tumefaciens bacteria containing one or more Ti plasmids, the T region of which has been manipulated in the desired manner. It is even better to incubate plant protoplasts with such A. tumefaciens bacteria.
Nu zal het introduceren van nieuwe genen in het T-DNA met behulp 20 van recombinant-DNA technieken om praktische redenen bij voorkeur in Escherichia coli worden uitgevoerd. Het Ti-plasmide is echter normaliter niet te handhaven in 13. coli (het repliceert niet in deze gastheer) . Dus wordt in de bestaande procedures een zogenaamde "shuttle" • vector gebruikt die in E. coli en A. tumefaciens repliceert en waarin 25 het T-DNA wordt ingebracht. Vervolgens worden in dit T-DNA nieuwe genen ingebouwd. Het complete Ti-plasmide is echter noodzakelijk om via A. tumefaciens cellen te transformeren. Dit komt doordat het Ti-plasmide het essentiële vir-gebied bevat waarop genen liggen die zorgen voor selectie van T-DNA (vermoedelijk door herkenning van base-30 sequenties aan de uiteinden van dit DNA) en de overdracht naar de plant.Now, the introduction of new genes into the T-DNA using recombinant DNA techniques will preferably be carried out in Escherichia coli for practical reasons. However, the Ti plasmid cannot normally be maintained in 13. coli (it does not replicate in this host). Thus, in the existing procedures, a so-called "shuttle" vector is used which replicates in E. coli and A. tumefaciens and into which the T-DNA is introduced. New genes are then built into this T-DNA. However, the complete Ti plasmid is necessary to transform cells via A. tumefaciens. This is because the Ti plasmid contains the essential vir region on which genes are responsible for selection of T-DNA (presumably by recognition of base-30 sequences at the ends of this DNA) and transfer to the plant.
Aangezien het Ti-plasmide zich niet handhaaft in J3. coli wordt bij de bestaande procedures de shuttle-vector met het gemanipuleerde T-DNA overgebracht naar een A. tumefaciens die een compleet Ti-plasmide bevat dat kan voortbestaan naast de shuttle-vector. Aangezien de 35 shuttle-vector T-DNA delen 'bevat die ook aanwezig zijn in het T-DNA van het Ti-plasmide wordt dubbele "crossing-over" tussen de homologe 83 0 0 69 9 -3- m·:..........: m * delen van beide T-DNA's geforceerd. Daarmee worden nu de nieuwe genen ingebouwd in het complete Ti-plasmide.Since the Ti plasmid does not maintain in J3. coli, in the existing procedures, the shuttle vector with the engineered T-DNA is transferred to an A. tumefaciens containing a complete Ti plasmid that can survive alongside the shuttle vector. Since the shuttle vector contains T-DNA parts which are also present in the T-DNA of the Ti plasmid, double crossing-over between the homologous 83 0 0 69 9-3 m ...: ... .......: parts of both T-DNAs forced. The new genes are now incorporated into the complete Ti plasmid.
Bestaande procedures voor de plaatsgerichte mutatie van Ti-plasmiden worden beschreven door Leemans et al, The Embo Journal 1, 5 147-152 (1982); Matzke et al, J. Mol. Appl. Genet. 1, 39-49 (1981); 2ie voor het algemene principe, waarop deze technieken zijn gebaseerd,Existing procedures for the site-directed mutation of Ti plasmids are described by Leemans et al, The Embo Journal 1, 5 147-152 (1982); Matzke et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, 39-49 (1981); 2ie for the general principle on which these techniques are based,
Ruvkun et al, Nature (London) 289, 85-88 (1981). Steeds wordt de laatste trap van de Ti-plasmide mutatie in Agrobacterium zelf uitgevoerd, omdat het gastheerbereik van Ti-plasmiden tot Rhizobiaceae beperkt is.Ruvkun et al, Nature (London) 289, 85-88 (1981). The last stage of the Ti plasmid mutation in Agrobacterium itself is always performed, because the host range of Ti plasmids is limited to Rhizobiaceae.
10 Nadat een gekloneerd fragment van het Ti-plasmide in E. coli is gemuteerd door bijvoorbeeld invoeging (insertie) van een transposon, wordt het gemuteerde fragment gesubkloneerd op een vector met breed gastheerbereik en overgebracht in een Ti-plasmide bevattende Agrobacterium stam. Hierin wordt het ingevoegde DNA door homologe 15 recombinatie via dubbele crossing-over in het Ti-plasmide opgenomen, waarna hetzij het plasmide met breed gastheerbereik met behulp van een onverenigbaar plasmide wordt vernietigd, hetzij het Ti-plasmide door conjugatie wordt overgebracht naar een andere Agrobacterium ontvanger-bacterie. Door onderzoek van de transconjuganten wordt gecontroleerd 20 of de juiste mutatie van het Ti-plasmide heeft plaatsgevonden.After a cloned fragment of the Ti plasmid in E. coli is mutated by, for example, insertion (insertion) of a transposon, the mutated fragment is subcloned onto a broad host range vector and transferred into a Ti plasmid containing Agrobacterium strain. Herein, the inserted DNA is incorporated into the Ti plasmid by homologous recombination via double crossing-over, after which either the broad host range plasmid is destroyed by an incompatible plasmid or the Ti plasmid is transferred by conjugation to another Agrobacterium recipient bacteria. Examination of the transconjugants checks whether the correct mutation of the Ti plasmid has occurred.
Deze bekende procedures zijn nogal omslachtig en geven technische problemen, hetgeen voorkomen zou worden indien de plaatsgerichte mutatie van het Ti-plasmide zelf direkt in E. coli kon worden uitgevoerd.These known procedures are rather cumbersome and pose technical problems, which would be avoided if the site-directed mutation of the Ti plasmid itself could be performed directly in E. coli.
Het Ti-plasmide mist echter een replicator die in E. coli kan functio-25 neren.However, the Ti plasmid lacks a replicator that can function in E. coli.
De uitvinding is nu gelegen in het gebruik van een stabiel cointegraat plasmide, verkregen uit een Ti-plasmide (pTiB6) en een antibioticumresistentie plasmide met breed gastheerbereik (R772).The invention now lies in the use of a stable cointegrate plasmid obtained from a Ti plasmid (pTiB6) and an antibiotic resistance plasmid with a wide host range (R772).
Cointegraat plasmiden worden verkregen door mobilisatie van het octopine 30 Ti-plasmide pTiBö met het Inc.P-1 type plasmide R772, zoals beschreven door Hooykaas et al, Plasmid 4, 64-75 (1980). Dankzij het brede gastheerbereik van de R772 component kunnen de coïntegraten zowel in A. tumefaciens als in E. coli repliceren, maar meestal zijn ze niet stabiel: bij overbrenging van A. tumefaciens naar E. coli treedt disso-35 ciatie op, waarna de Ti-cozriponent van het cointegraat verloren gaat.Cointegrate plasmids are obtained by mobilization of the octopine 30 Ti plasmid pTiBö with the Inc.P-1 type plasmid R772, as described by Hooykaas et al, Plasmid 4, 64-75 (1980). The broad host range of the R772 component allows the co-integrates to replicate in both A. tumefaciens and E. coli, but are usually unstable: dissociation of A. tumefaciens to E. coli occurs after which the Ti -cozriponent of the cointegrate is lost.
8300699 * % -4-8300699 *% -4-
Het is echter gelukt om een coïntegraat plasmide te isoleren, dat stabiel is voor beide soorten bacteriën: het R772 pTiB6 coïntegraat plasmide pAL969, waarvan het bestaan door Hille et al, Plasmid 7, 107-118 (1982) is geopenbaard.However, it has been successful to isolate a cointegrate plasmid, which is stable for both types of bacteria: the R772 pTiB6 cointegrate plasmid pAL969, the existence of which is disclosed by Hille et al, Plasmid 7, 107-118 (1982).
'5 Dit stabiele coïntegraat plasmide opent de mogelijkheid om alle stappen die nodig zijn om nieuwe genen in het T-DNA van het complete Ti-plasmide in te bouwen, in E. coli uit te voeren en daarna het coïntegraat plasmide met het gemanipuleerde T-DNA naar A. tumefaciens zonder eigen Ti-plasmide over te brengen. Aqrobacterium stammen, die 10 een dergelijk coïntegraat plasmide bevatten, zijn in staat om tumoren te induceren op verscheidene soorten planten of, meer algemeen, vreemd DNA in het genoom van planten in te bouwen, in het bijzonder twee-zaadlobbige planten, zoals tomaat, tabak, petunia, aardappel, peulvruchten, e.d.This stable co-integrated plasmid opens the possibility to carry out in E. coli all steps required to build in new genes in the T-DNA of the complete Ti plasmid, and then the co-integrated plasmid with the engineered T- DNA to A. tumefaciens without transferring own Ti plasmid. Aqrobacterium strains containing such a co-integrated plasmid are capable of inducing tumors on various types of plants or, more generally, incorporating foreign DNA into the genome of plants, in particular two-cotyledonous plants, such as tomato, tobacco , petunia, potato, legumes, etc.
15 De uitvinding verschaft derhalve een werkwijze van de in de aanhef vermelde soort, die gekenmerkt wordt doordat als Ti-plasmide een stabiel coïntegraat plasmide uit een plasmide R772 en een plasmide pTiB6 met vreemd DNA ingebouwd in het T-gebied van de Ti-component van het coïntegraat plasmide wordt toegepast.The invention therefore provides a method of the type mentioned in the opening paragraph, characterized in that as a Ti plasmid a stable co-integrated plasmid from a plasmid R772 and a plasmid pTiB6 with foreign DNA built into the T region of the Ti component of the coordinate plasmid is used.
20 Tevens verschaft de uitvinding een coïntegraat plasmide pAL969 en daaruit door inbouwen van vreemd DNA in het T-gebied van de Ti-component van het coïntegraat plasmide afgeleide coïntegraat plasmiden.The invention also provides a co-integrated plasmid pAL969 and co-integrated plasmids derived therefrom by incorporation of foreign DNA into the T region of the Ti component of the co-integrated plasmid.
De uitvinding verschaft tevens een werkwijze voor het produceren van Agrobacterium tumefaciens bacteriën, die een of meer Ti-25 plasmiden bevatten, welke gekenmerkt wordt doordat een op zichzelf voor gebruik in Escherichia coli bekende vector, voorzien van T-DNA waarin vreemd DNA is ingebouwd, in E. coli wordt samengebracht met het coïntegraat plasmide pAL969 of daaruit door inbouwen van vreemd DNA in het T-gebied van de Ti-component van het coïntegraat plasmide af-30 geleide coïntegraat plasmiden en het coïntegraat plasmide met door dubbele "crossing-over" in het T-gebied van de Ti-component van het coïntegraat plasmide ingebouwd vreemd DNA wordt overgebracht naar A. tumefaciens. Ook verschaft de uitvinding planten en plantecellen, die verkregen zijn nadat onder toepassing van de werkwijze volgens 35 de uitvinding de genetische eigenschappen van de oorspronkelijke planten c.q. plantecellen zijn gewijzigd.The invention also provides a method for producing Agrobacterium tumefaciens bacteria containing one or more Ti-25 plasmids, characterized in that a vector known per se for use in Escherichia coli, comprising T-DNA incorporating foreign DNA, in E. coli is combined with the co-integrated plasmid pAL969 or therefrom by incorporation of foreign DNA into the T region of the Ti component of the co-integrated plasmid-derived co-integrated plasmids and the co-integrated plasmid with double crossing-over foreign DNA built into the T region of the Ti component of the co-integrated plasmid is transferred to A. tumefaciens. The invention also provides plants and plant cells which have been obtained after the genetic properties of the original plants or plant cells have been changed using the method according to the invention.
8300699 -5- - ' —» * ^8300699 -5- - '- »* ^
Het nut van de werkwijze volgens de uitvinding, waarbij planten of plantecellen met gewijzigde genetische informatie worden verkregen, kan gelegen zijn in het veredelen van de planten (kweken van een veredeld ras, dat bijvoorbeeld beter bestand is tegen herbiciden), alsmede 5 in het realiseren van een bioreactor, bestaande uit gefermenteerde en eventueel daarna geïmmobiliseerde plantecellen die in grote hoeveelheden een bepaald gewenst translatieprodukt, bijvoorbeeld enzym, of een secundair metaboliet van de plantecel produceren.The utility of the method according to the invention, in which plants or plant cells with modified genetic information are obtained, can lie in the breeding of the plants (cultivation of a bred variety, which is, for example, more resistant to herbicides), as well as in the realization of a bioreactor, consisting of fermented and optionally immobilized plant cells which in large quantities produce a certain desired translation product, for example enzyme, or a secondary metabolite of the plant cell.
De werkwijze volgens de uitvinding biedt dus de mogelijkheid, 10 mutanten van hogere planten met genetisch verbeterde respectievelijk veranderde eigenschappen te vervaardigen. Dit is - zoals eerder opgemerkt - van groot belang voor de plantenveredelingsindustrie, te meer daar uit de weefsellijnen welke onder toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding worden verkregen, in een vroeg stadium na de 15 DNA-transformatie regeneraten verkregen kunnen worden. Verder hebben de cellen met autotrofe groei welke onder toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding worden verkregen, bijvoorbeeld de Crown gall cellen, voor een goede groei in een fermentator slechts een zeer eenvoudig synthetisch medium nodig, waaraan o.a. geen fytohormonen 20 behoeven te worden toegevoegd. Aldus verkregen cellen, waarbij vreemd DNA is ingebracht, kunnen op grote schaal worden gekweekt voor de bereiding van die stoffen, waarvoor het vreemde DNA codeert, zoals alkaloïden, aminozuren, koolwaterstoffen, eiwitten, enzymen, sterolden enz. (vergelijk Impract of Applied Genetics, Micro Organisms, Plants 25 and Animals. OTA Report, Congress of the United States Office of Technology Assessment, Washington, 1981).The method according to the invention thus offers the possibility of producing mutants of higher plants with genetically improved or altered properties. As noted previously, this is of great importance for the plant breeding industry, especially since regenerates can be obtained from the tissue lines obtained using the method according to the invention at an early stage after the DNA transformation. Furthermore, the cells with autotrophic growth obtained by the method according to the invention, for example the Crown gall cells, require only a very simple synthetic medium for good growth in a fermenter, to which, inter alia, no phytohormones need be added. Cells thus obtained, in which foreign DNA has been introduced, can be widely cultivated for the preparation of those substances encoded by the foreign DNA, such as alkaloids, amino acids, hydrocarbons, proteins, enzymes, steroids, etc. (compare Impract of Applied Genetics, Micro Organisms, Plants 25 and Animals, OTA Report, Congress of the United States Office of Technology Assessment, Washington, 1981).
E. coli heeft een veel hogere groeisnelheid dan A. tumefaciens, terwijl veel mutanten beschikbaar zijn en speciale kloneringsdragers .· zoals cosmiden en door insertie activeerbare vectoren zijn ontwikkeld.E. coli has a much faster growth rate than A. tumefaciens, while many mutants are available and special cloning vehicles such as cosmids and insert-activatable vectors have been developed.
30 De procedure volgens de uitvinding vereist geen shuttle- vectoren met een wijd gastheerbereik, die vaak te groot zijn voor recombinant DNA werkzaamheden en vaak niet de juiste restrictie-enzym-plaatsen hebben voor insertie van T-DNA. In de procedure volgens de uitvinding worden in J2. coli de goed bekende en bruikbare, kleine 35 (voor E. coli specifieke) vectoren gebruikt. Zo'n vector met T-DNA, waarin nieuwe genen zijn ingebouwd, wordt in E. coli samengebracht 8300899 £ > -6- met het R :: Ti cointegraat om de 'dubbele "crossing-over" te doen plaatsvinden, waardoor de nieuw genen in het T-DNA van de Ti-compo-nent van het cointegraat worden ingebouwd. Zoals eerder gezegd wordt dan vervolgens het gemanipuleerde R :: Ti naar A. tumefaciens overge-5 bracht, hetgeen met een hoge frequentie plaatsvindt.The procedure of the invention does not require shuttle vectors with a wide host range, which are often too large for recombinant DNA activities and often do not have the correct restriction enzyme sites for T-DNA insertion. In the procedure of the invention, in J2. coli used the well known and useful small (E. coli specific) vectors. Such a vector with T-DNA, in which new genes have been incorporated, is brought together in E. coli 8300899 £> -6- with the R :: Ti cointegrate to effect the 'double crossing-over', whereby the new genes are incorporated into the T-DNA of the Ti component of the cointegrate. As said before, the manipulated R :: Ti is then transferred to A. tumefaciens, which takes place at a high frequency.
De procedure lijkt te kunnen worden vereenvoudigd door gebruik te maken van polAts stammen (ts = temperatuurgevoelig). In dergelijke stammen kunnen de meeste voor E. coli ontwikkelde vectoren (plasmiden), die van het colEl plasmide zijn afgeleid, wel bij 32°C, maar niet 10 bij 42°C repliceren, hoewel andere plasmiden zoals het cointegraat plasmide pAL969 bij beide temperaturen in stand blijven. Door eenvoudige selectie op bijvoorbeeld een marker voor antibioticum resistentie bij 42°C zou men direkt de stammen verkrijgen, die alleen de plaatsgerichte mutatie in het cointegraat plasmide dragen.The procedure seems to be simplified by using polAts strains (ts = temperature sensitive). In such strains, most of the E. coli-developed vectors (plasmids) derived from the colEl plasmid can replicate at 32 ° C but not at 42 ° C, although other plasmids such as the cointegrate plasmid pAL969 can be used at both temperatures. keep going. By simple selection, for example, on a marker for antibiotic resistance at 42 ° C, one would immediately obtain the strains bearing only the site-directed mutation in the cointegrate plasmid.
15 Een 13. coli stam met daarin het stabiele cointegraat plasmide pAL969 is gedeponeerd en verkrijgbaar bij het Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) te Baam, Nederland.A 13. coli strain containing the stable cointegrate plasmid pAL969 has been deposited and is available from the Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) in Baam, the Netherlands.
De uitvinding wordt onderstaand aan de hand van de tekening, waarin.: 20 fig. 1 een fysische kaart van het plasmide R772 toont; fig. 2 een fysische kaart van het plasmide pRL246 toont; fig. 3 een fysische kaart van het cointegraat plasmide pAL969 toont; fig. 4 schematisch een model experiment voor plaatsgerichte 25 mutaties van R772 illustreert; fig. 5 schematisch de procedure volgens de uitvinding voor de inbouw van een vreemd gen in het T-DNA van het Ti-plasmide van A. tumefaciens en in het genoom van tweezaadlobbige planten toont; fig. 6 een schematisch beeld van een octopine Ti-plasmide toont; 30 en fig. 7 schematisch de structuur van normaal T-DNA en van gemanipuleerd, "kunstmatig" T-DNA, zoals ingebouwd in het plantengenoom, weergeeft; alsmede aan een beschrijving van uitgevoerde experimenten nader toege-35 licht. De toelichting is onderverdeeld in: 83 0 0 69 9 V ♦ ”"'ΐ -ΊΑ. constructie van een fysische kaart van het stabiele coïntegraat plasmide pAL969; B. model experiment voor plaatsgerichte mutatie van R772.The invention is explained below with reference to the drawing, in which: Fig. 1 shows a physical map of the plasmid R772; Figure 2 shows a physical map of the plasmid pRL246; Figure 3 shows a physical map of the cointegrate plasmid pAL969; Figure 4 schematically illustrates a model experiment for site-directed mutations of R772; Fig. 5 schematically shows the procedure according to the invention for the incorporation of a foreign gene into the T-DNA of the Ti plasmid of A. tumefaciens and into the genome of dicotyledonous plants; Figure 6 shows a schematic view of an octopine Ti plasmid; 30 and FIG. 7 schematically depicts the structure of normal T-DNA and of engineered "artificial" T-DNA, as incorporated into the plant genome; as well as a description of the experiments performed. The explanation is divided into: 83 0 0 69 9 V ♦ ”" 'ΐ -ΊΑ. Construction of a physical map of the stable co-integrated plasmid pAL969; B. model experiment for site-directed mutation of R772.
Tenslotte volgt een voorbeeld van de werkwijze volgens de uit-5 vinding, waarbij een plaatsgerichte mutatie van het T-gebied in de Ti-component van het coïntegraat plasmide pM.969 werd uitgevoerd en het fenotype van de mutatie bij diverse plantesoorten werd onderzocht.Finally, an example of the method according to the invention follows, in which a site-directed mutation of the T region in the Ti component of the co-integrated plasmid pM.969 was performed and the phenotype of the mutation was examined in various plant species.
De gebruikte stammen en plasmiden zijn in onderstaande tabel A samengevat.The strains and plasmids used are summarized in Table A below.
t 8300699t 8300699
* V* V
-8- T A ,B E L A.-8- T A, B E L A.
gebruikte bacteriestammen en plasmiden.bacterial strains and plasmids used.
E. coli bron stammen relevant fenotype KMBL1164 pro , thi van de Putte KMBL1001 - van de Putte 5 A. tumefaciens plasmiden LBA937 Rifr, Narr R772, pTiB6 Hooykaas et al. Plasmid 4, 64-75 (1980) LBA973 Genr, ΝονΓ pAL969 Hooykaas 10 LBA1831 Rifr, Nair pALl831 hierin beschrevenE. coli source strains relevant phenotype KMBL1164 pro, thi van de Putte KMBL1001 - van de Putte 5 A. tumefaciens plasmids LBA937 Rifr, Narr R772, pTiB6 Hooykaas et al. Plasmid 4, 64-75 (1980) LBA973 Genr, ΝονΓ pAL969 Hooykaas LBA1831 Rifr, Nair pAL1831 described herein
Plasmiden relevant fenotype R772 Kmr Hedges pAL969 Kmr Hooykaas 15 pALl831 Kmr, Apr, Cmr hierin beschreven PRAL3501 Tcr# Cmr " " pRL220 Tc , Cm , Ap ,Sm Hille en Schilperoort,Plasmids relevant phenotype R772 Kmr Hedges pAL969 Kmr Hooykaas 15 pALl831 Kmr, Apr, Cmr described herein PRAL3501 Tcr # Cmr "" pRL220 Tc, Cm, Ap, Sm Hille and Schilperoort,
Plasmid 6, 360 - 362 (1981) 3Γ 2Γ 3Γ 20 pRL234 Tc , Ap , Cm hierin beschreven van R772 afgeleide klonen plasmide restrictie-fragment vector relevant fenotype bron pRL231 HindIII-4 pTR262 Tc* hierin beschreven 25 pRL232 HindIII-3 pTR262 Tcr " pRL233 HindIII-3+4 pTR262 Tcr, Kmr " " pRL236 EcoRI-1+2 - Kmr, Inc-P " " PRL237 EcoRI-2 pBR322 Apr, Tcr, Kmr " pRL238 HindiII-1+2 pTR262 Tcrf Inc-P " 30 pRL247 PstI-6 pBR325 Cmr, Tcr pRL248 Pst 1-3 pBR325 Cl/, Tcr " " pRL246 pBR322::IS70 - ΑρΓ, Tc° " " pRL239 - - Kmr, Apr, Cmr,Inc-P" " 83 0 0 69 9 * ’* -9-Plasmid 6, 360 - 362 (1981) 3Γ 2Γ 3Γ 20 pRL234 Tc, Ap, Cm described herein from R772-derived clones plasmid restriction fragment vector relevant phenotype source pRL231 HindIII-4 pTR262 Tc * described herein pRL232 HindIII-3 pTR262 Tcr " pRL233 HindIII-3 + 4 pTR262 Tcr, Kmr "" pRL236 EcoRI-1 + 2 - Kmr, Inc-P "" PRL237 EcoRI-2 pBR322 Apr, Tcr, Kmr "pRL238 HindiII-1 + 2 pTR262 Tcrf Inc-P" 30 pRL247 PstI-6 pBR325 Cmr, Tcr pRL248 Pst 1-3 pBR325 Cl /, Tcr "" pRL246 pBR322 :: IS70 - ΑρΓ, Tc ° "" pRL239 - - Kmr, Apr, Cmr, Inc-P "" 83 0 0 69 9 * '* -9-
De conjugaties werden uitgevoerd conform de beschrijving door Hille et al, Plasmide 7, 107-118 (1982).The conjugations were performed as described by Hille et al, Plasmid 7, 107-118 (1982).
De plasmide-isolatie geschiedde voor E. coli zoals beschreven door Birnboim en Doly, Nucl. Ac. Res. 7, 1513-1523 (1979) en voor 5 A. tumefaciens zoals beschreven door Koekman et al. Plasmid 4, 184-195 (1980).The plasmid isolation was done for E. coli as described by Birnboim and Doly, Nucl. Ac. Res. 7, 1513-1523 (1979) and for 5 A. tumefaciens as described by Koekman et al. Plasmid 4, 184-195 (1980).
Ontsluiting met restrictie endonucleases, agarose gel elektro-forese, Southern blotting en DNA-DNA filter hybridisatie werden uitgevoerd zoals beschreven door Prakash et al, J. Bacteriol. 145, 10 1129-1136 (1981).Digestion with restriction endonucleases, agarose gel electrophoresis, Southern blotting and DNA-DNA filter hybridization were performed as described by Prakash et al, J. Bacteriol. 145, 10291-1136 (1981).
De ligatie van restrictiefragmenten werd uitgevoerd in 6,5 mM MgC^; 60 mM Tris-HCl pH7,6; 10 mM dithiothreitol en 0,4 mM ATP gedurende 20 uur bij 14°C. De DNA concentratie in het ligatiemengsel was gewoonlijk ongeveer 100 ^tgr per ml, met een vijfvoudige overmaat van 15 het te kloneren DNA ten opzichte van het vector DNA. Na ligatie werd het mengsel direkt voor transformatie gebruikt.The restriction fragment ligation was performed in 6.5 mM MgCl 3; 60 mM Tris-HCl pH7.6; 10 mM dithiothreitol and 0.4 mM ATP for 20 hours at 14 ° C. The DNA concentration in the ligation mixture was usually about 100 µg per ml, with a fivefold excess of the DNA to be cloned relative to the vector DNA. After ligation, the mixture was used directly for transformation.
Transformatie van E. coli. cellen geschiedde met behulp van de CaCl^-siethode, beschreven door Cohen et al, Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 2110-2114 (1972).Transformation of E. coli. cells were performed using the CaCl 2 -site method described by Cohen et al, Proc. Wet. Acad. Sci. 69, 2110-2114 (1972).
20 A. Constructie van een fysische kaart van het stabiele coïntegraat plasmide pAL969._20 A. Construction of a physical map of the stable co-integrated plasmid pAL969._
Bij door Hooykaas et al, Plasmid 4, 64-75 (1980) beschreven experimenten, waarbij een octopine Ti-plasmide (pTiB6) werd gemobiliseerd met het Inc.P-1 type plasmide R772 met breed gastheerbereik, 25 werd een bepaald R772 :: Ti coïntegraat plasmide (pAL969) verkregen.In experiments described by Hooykaas et al, Plasmid 4, 64-75 (1980), in which an octopine Ti plasmid (pTiB6) was mobilized with the Inc.P-1 type plasmid R772 with broad host range, a particular R772: Ti cointegrate plasmid (pAL969) obtained.
Wanneer stammen, die dit plasmide bevatten, als donor werden gebruikt in verdere kruisingen, kon 100% cotransfer van R772 en Ti-plasmide kenmerken (markers) worden aangetoond, dat wil zeggen 100% cotransfer bij overdracht van E_. coli naar A. tumefaciens en vice versa; het 30 R :: Ti coïntegraat handhaafde zich stabiel in zowel E. coli als A. tumefaciens en viel dus niet uiteen in de samenstellende plasmiden. Teneinde inzicht te .verkrijgen.in de waargenomen stabiliteit van dit-conïntegraat plasmide werd een fysische kaart van het plasmide geconstrueerd. Daartoe werd eerst een kaart van het Inc.P-1 type plasmide 35 R772 samengesteld (fig. 1). Daarna werd een transpositie-element ge ïdentificeerd en uit R7.72 geïsoleerd (fig. 2). Tenslotte werd een fy- 8300699 * ψ -10- si sche kaart voor het plasmide pAL969 samengesteld, waarin kopieën van het transpositie-element zijn aangegeven (fig. 3).When strains containing this plasmid were used as donors in further crosses, 100% co-transfer of R772 and Ti plasmid traits (markers) could be demonstrated, i.e. 100% co-transfer on transfer of E_. coli to A. tumefaciens and vice versa; the R :: Ti coordinate remained stable in both E. coli and A. tumefaciens and thus did not disintegrate in the constituent plasmids. A physical map of the plasmid was constructed in order to gain insight into the observed stability of this concomitant plasmid. To this end, a map of the Inc.P-1 type plasmid R772 was first assembled (Fig. 1). A transposition element was then identified and isolated from R7.72 (Fig. 2). Finally, a physical map for the plasmid pAL969 was assembled showing copies of the transposition element (Fig. 3).
Men probeerde· 10 verschillende restrictie endonucleases uit bij R772 DNA. Het bleek dat een drietal, namelijk BglII, Kpnl en Xbal, 5 dit plasmide niet konden openknippen, terwijl de restrictie endonuclease BamHl het plasmide op één plaats openknipte. De overige restrictie-enzymen, te weten Hpal, Sail, Smal, HindlII, EcoRI en PstI knipten het plasmide op meerdere plaatsen door Uit onderstaande tabel B kunnen het aantal herkenningsplaatsen en de fragmentlengtes worden gelezen.- TABEL· B.10 different restriction endonucleases were tested on R772 DNA. It turned out that three, namely BglII, Kpnl and Xbal, could not cut open this plasmid, while the restriction endonuclease BamHl cut open the plasmid in one place. The other restriction enzymes, namely Hpal, Sail, Smal, HindlII, EcoRI and PstI, cut the plasmid in several places. From the table B below, the number of recognition sites and the fragment lengths can be read.
lengte van de restrictie endonuclease fragmenten van R772 (in Mdalton), Enzym BamHl Hpal Sail Smal HindlII EcoRI PstIlength of the restriction endonuclease fragments of R772 (in Mdalton), Enzyme BamHl Hpal Sail Narrow HindlII EcoRI PstI
fragment 1 40,5 23,0 13,0 20,4 19,8 19,1 18,3 2 16,1 11,6 12,5 10,7 6,4 9,0 3 1,4 8,9 4,4 6,0 6,4. 4,7 4 7,0 2,7 4,0 5,8 4,4 5 0,5 1,8 2,4 6 1,0 1,7 10 De grootte van het R772 DNA bleek 40,5 Mdalton te zijn. De unieke BamHl plaats werd op de kaart als oorsprong (referentiepunt) gekozen. De volgorde van de fragmenten kon na dubbele ontsluitingen nog niet ondubbelzinnig worden vastgesteld. Daarom werden individuelefragment 1 40.5 23.0 13.0 20.4 19.8 19.1 18.3 2 16.1 11.6 12.5 10.7 6.4 9.0 3 1.4 8.9 4 , 4 6.0 6.4. 4.7 4 7.0 2.7 4.0 5.8 4.4 5 0.5 1.8 2.4 6 1.0 1.7 10 The size of the R772 DNA was found to be 40.5 Mdalton . The unique BamHl site was chosen as the origin (reference point) on the map. The sequence of the fragments could not yet be unambiguously determined after double digestions. Therefore, individual
HindlII en Sail restrictiefragmenten van R772 uit de gel geïsoleerd, 32 15 in vitro gelabelled met P, en gehybridiseerd aan blots, die R772 DNA bevatten, dat met alle onderzochte restrictie-enzymen was ontsloten.HindIII and Sail restriction fragments of R772 isolated from the gel, labeled in vitro with P, and hybridized to blots containing R772 DNA digested with all restriction enzymes tested.
Uit de positie van hybridiserende fragmenten, waargenomen op auto-radiogrammen, kon een voorlopige circulaire kaart van R772 worden geconstrueerd. Omdat veel restrictie endonuclease herkenningsplaatsen 20 zodanig dicht bij elkaar lagen dat de volgorde nog niet eenduidig kon worden vastgesteld, werden bepaalde restrictiefragmenten van R772 gekloneerd op zogenaamde multikopie plasmiden. De PstI fragmenten 6 en 3 werden gekloneerd op pBR325, en de HindlII fragmenten 4, 3, 4+3 en 1+2 werden gekloneerd op de door insertie activeerbare vector 25 pTR262 (beschreven door Roberts et al, Gene 12, 123-127 (1980)).A preliminary circular map of R772 could be constructed from the position of hybridizing fragments observed on auto-radiograms. Because many restriction endonuclease recognition sites were so close together that the sequence could not yet be unambiguously determined, certain restriction fragments of R772 were cloned on so-called multicopy plasmids. The PstI fragments 6 and 3 were cloned on pBR325, and the Hind III fragments 4, 3, 4 + 3 and 1 + 2 were cloned on the insert-activatable vector pTR262 (described by Roberts et al, Gene 12, 123-127 ( 1980)).
83 0 0 69 9 « » -11-83 0 0 69 9 «» -11-
Door deze klonen in restrictie endonuclease analyse te gebruiken konden de meeste herkenningsplaatsen nauwkeurig in kaart worden gebracht. Alleen de EcoRI fragmenten 5 en 6 en de PstI fragmenten 4 en 5 konden niet worden gerangschikt omdat ze buren waren en geen restrictieplaat-5 sen van de andere restrictie-enzymen bevatten (zie fig. 1).By using these clones in restriction endonuclease analysis, most recognition sites could be accurately mapped. Only the EcoRI fragments 5 and 6 and the PstI fragments 4 and 5 could not be ranked because they were neighbors and did not contain restriction sites of the other restriction enzymes (see Figure 1).
De kloneringsexperimenten gaven ook enige informatie over bepaalde genetische eigenschappen. Uit het HindlII kloneringsexperiment op pTR262 bleek, dat noch HindlII fragment 4, noch HindlII fragment 3, een intacte kanamycine-resistentie Kin -locus (de enige marker voor 10 antibioticumresistentie van het plasmide R772) bevatte, terwijl bij gezamenlijke klonering van deze HindlII fragmenten 3+4 als één segment met behoud van de oorspronkelijke oriëntatie kanamycine resistentie tot expressie kwam. Dit leek een indicatie, dat de Kin -locus de HindlII herkenningsplaats in dit uit de fragmenten 3 en 4 bestaande 15 segment overlapt. Dit werd bevestigd door klonering van EcoRI fragmen- 3^ ten van R772 en pBR322, doordat EcoRI fragment 2 de Kin -locus bleek te bevatten. Bij deze EcoRI kloneringsexperimenten werd ook een plasmide gevonden, dat alleen de Km -determinant en geen pBR322 markers bevatte.The cloning experiments also provided some information about certain genetic traits. The HindlII cloning experiment on pTR262 showed that neither HindlII fragment 4 nor HindlII fragment 3 contained an intact kanamycin resistance Kin-locus (the only marker for antibiotic resistance of the plasmid R772), while co-cloning these HindlII fragments 3 +4 was expressed as one segment while maintaining the original orientation kanamycin resistance. This seemed to indicate that the Kin locus overlaps the HindII recognition site in this segment consisting of fragments 3 and 4. This was confirmed by cloning EcoRI fragments of R772 and pBR322 in that EcoRI fragment 2 was found to contain the Kin locus. A plasmid containing only the Km determinant and no pBR322 markers was also found in these EcoRI cloning experiments.
Dit plasmide (pRL236) bleek uit de EcoRI fragmenten 1 en 2 van R772 20 te bestaan, hetwelk een indicatie is dat deze twee fragmenten tezamen alle, voor autonome replicatie benodigde informatie bevatten. Aangezien dit plasmide pRL236 transfer deficiënt bleek te zijn, zouden tra functies in het gebied van de EcoRI fragmenten 3, 4, 5 of 6 moeten ' liggen. Een uit pTR262 en de HindlII fragmenten 1 en 2 van R772 be-25 staande kloon pRL238 bleek tra* te zijn en zich in Agrobacterium te kunnen repliceren. Omdat de pTR262 replicator niet werkt in Agrobacteriën moet derhalve de HindlII fragmenten 1 en 2 van R772 alle voor zelf-transfer en autonome replicatie benodigde informatie bevatten. De replicatie- en incompatibiliteitsfuncties van R772 30 moeten derhalve in HindlII fragment 1 zijn gelegen. (Gebruikte afkortingen: tra voor functies die vereist zijn voor zelf-transfer door conjugatie; ori voor replicatie-oorsprong; inc voor incompatibiliteitsfuncties) .This plasmid (pRL236) was found to consist of the EcoRI fragments 1 and 2 of R772 20, which is an indication that these two fragments together contain all the information necessary for autonomous replication. Since this plasmid was found to be pRL236 transfer deficient, tra functions should lie in the region of the EcoRI fragments 3, 4, 5 or 6. A clone pRL238 consisting of pTR262 and HindIII fragments 1 and 2 of R772 was found to be tra * and able to replicate in Agrobacterium. Therefore, since the pTR262 replicator does not work in Agrobacteria, the HindIII fragments 1 and 2 of R772 must contain all information necessary for self-transfer and autonomous replication. Therefore, the replication and incompatibility functions of R772 30 must be in HindIII fragment 1. (Abbreviations used: tra for functions required for self-transfer by conjugation; ori for replication origin; inc for incompatibility functions).
In het eerder genoemde artikel van Hooykaas et al, Plasmid 4, 35 64-75 (1980) wordt aangegeven, dat gemobiliseerde Ti-plasmiden van A. tumefaciens een insertie sequentie of transposon dragen, dat afkop- 8300899 -12- •t stig is van het mobiliserende plasmide. Indien aangenomen wordt dat mobilisatie verloopt via coïntegraat vorming als gevolg van transpositie, wordt de aanwezigheid van twee direkt herhaalde kopieën van een transpositie-element in een instabiel tussenprodukt verwacht. De in-5 stabiliteit is het gevolg van homologe recombinatie tussen de twee kopieën van het transpositie-element, waardoor het coïntegraat in zijn componenten zou uiteenvallen. Om de stabiliteit van het coïntegraat plasmide pAL969 te begrijpen, is de plaats en structuur van kopieën van het transpositie-element onderzocht.The aforementioned article by Hooykaas et al, Plasmid 4, 35 64-75 (1980) indicates that mobilized Ti plasmids from A. tumefaciens carry an insertion sequence or transposon that is cut-off. of the mobilizing plasmid. If it is assumed that mobilization proceeds via co-integrated formation as a result of transposition, the presence of two directly repeated copies of a transposition element in an unstable intermediate is expected. The in-stability is due to homologous recombination between the two copies of the transposition element, causing the co-integrate to disintegrate into its components. To understand the stability of the co-integrated plasmid pAL969, the location and structure of copies of the transposition element has been examined.
10 Een voor R772 geïdentificeerd transpositie-element werd op pBR322 geïsoleerd. Het desbetreffende plasmide (pRL246) werd geanalyseerd, waarbij bleek dat het transpositie-element niet de enige anti- r bioticum-resistentie marker van R772 (Km ) bevatte, zodat het transpositie-element een insertie-sequentie kan worden genoemd (IS70 genaamd)...A transposition element identified for R772 was isolated on pBR322. The relevant plasmid (pRL246) was analyzed, revealing that the transposition element did not contain the only anti-r biotic resistance marker of R772 (Km), so that the transposition element can be called an insertion sequence (called IS70). ..
15 Homoduplex analyse van plasmide pRL246 openbaarde, dat IS70 korte geïnverteerde herhalingen aan zijn uiteinden droeg met een lengte van ongeveer 50 base-paren (niet getoond). Met behulp van restrictie endonucleases werd het 2,5 Mdalton lange IS70 op pBR322 in kaart gebracht (fig. 2). Met behulp van deze kaart kon de positie van IS70 in R772 20 nauwkeurig worden aangegeven (zie fig. 1).Homoduplex analysis of plasmid pRL246 revealed that IS70 carried short inverted repeats at its ends about 50 base pairs in length (not shown). The 2.5 Mdalton long IS70 on pBR322 was mapped using restriction endonucleases (Fig. 2). Using this map, the position of IS70 in R772 20 could be accurately indicated (see fig. 1).
Voor het R772 :: Ti coïntegraat plasmide pAL969 werd de plaats van coïntegratie tussen R772 en het Ti-plasmide bepaald met behulp van 6 verschillende restrictie endonucleases. De resultaten staan in onderstaande tabel C.For the R772 :: Ti co-integrated plasmid pAL969, the site of co-integration between R772 and the Ti plasmid was determined using 6 different restriction endonucleases. The results are shown in Table C below.
TABEL C.TABLE C.
plaats van coïntegratie in R772 en in pTiBS voor het R772::pTiB6 colnte-_- _graat.site of co-integration in R772 and in pTiBS for the R772 :: pTiB6 colne -_- _bone.
20 coïntegratie vond plaats in enzym fragment R772 fragment pTiB6Co-integration took place in enzyme fragment R772 fragment pTiB6
BamHI 1 15BamHI 1 15
Smal 4 5Narrow 4 5
Hpal 1 10Hpal 1 10
25 HindlII 4 28 A25 HindIII 4 28 A
EcoRI 2 ; 16EcoRI 2; 16
PstI 3 x x = niet bepaald 83 0 0 6 9 8 i'\ ' ' ______ -13- üit deze resultaten kon worden afgeleid, dat de plaats van coïntegratie op R772 in een 1,5 Mdalton fragment (het deel dat Smal fragment 4 en PstI fragment 3 overlapt, zie fig. 1) en op het Ti-plasmide in een 0,8 Mdalton fragment (EcoRI fragment 16 en HindlII frag-5 ment 28 A) was gelocaliseerd. Bij vergelijking van het 1,5 Mdalton fragment op R772, waarin coïntegratie had plaatsgevonden, met de kaart van R772, is duidelijk dat dit fragment een deel van de insertie-seguentie IS70 draagt, hetwelk doet vermoeden dat de coïntegratie inderdaad via IS70 plaatsvond.PstI 3 xx = not determined 83 0 0 6 9 8 i '\' '______ -13- From these results it could be deduced that the site of co-integration at R772 in a 1.5 Mdalton fragment (the part containing Smal fragment 4 and Pst I fragment 3 overlaps, see Figure 1) and was located on the Ti plasmid in a 0.8 M dalton fragment (EcoRI fragment 16 and HindIII fragment 28 A). When comparing the 1.5 Mdalton fragment on R772, in which co-integration had occurred, with the map of R772, it is clear that this fragment carries part of the insertion sequence IS70, which suggests that co-integration indeed took place via IS70.
10 Wanneer men het colntegraat plasmide pAL969 zou doorknippen met een restrictie-enzym, dat geen herkenningsplaats in IS70 heeft, zou men twee fragmenten verwachten te vinden, die sequentie-homologie met IS70 vertonen, namelijk de twee R772 :: Ti fusie-fragmenten; ingeval van knippen met een restrictie-enzym, dat één herkenningsplaats in .If one were to cut the colntegrate plasmid pAL969 with a restriction enzyme, which does not have a recognition site in IS70, one would expect to find two fragments that show sequence homology with IS70, namely the two R772 :: Ti fusion fragments; in the case of cutting with a restriction enzyme, which enters one recognition site.
15 IS70 heeft, zou men vier fragmenten met sequentie-homologie met IS70 verwachten te vinden; dit alles aangenomen dat het colntegraat plasmide twee complete kopieën van IS70 bevat.IS70, one would expect to find four fragments with sequence homology to IS70; all this assuming that the colntegrate plasmid contains two complete copies of IS70.
In de praktijk bleek dit niet juist te zijn. Men labelde het plasmide pBR322 :i IS70 (pRL246) in vitro en hybridiseerde aan blots 20 die afzonderlijk met verschillende restrictie-enzymen ontsloten pAL969 DNA bevatten. In gevallen dat een restrictie-enzym werd gebruikt, dat geen herkenningsplaats in IS70 heeft (EcoRI, Hpal) werden, zoals verwacht, twee verschillende banden op de autoradiogrammen waargenomen.In practice this turned out to be incorrect. Plasmid pBR322: i IS70 (pRL246) was labeled in vitro and hybridized to blots containing pAL969 DNA digested separately with different restriction enzymes. In cases where a restriction enzyme was used, which does not have a recognition site in IS70 (EcoRI, Hpal), two different bands were observed on the autoradiograms, as expected.
Bij gebruik van het restrictie-enzym Smal, dat één herkenningsplaats 25 in IS70 heeft, werden echter geen vier, maar slechts drie banden waargenomen. ·However, using the restriction enzyme Smal, which has one recognition site 25 in IS70, not four but only three bands were observed. ·
Oit deze resultaten blijkt, dat de coïntegratie van R772 en het Ti-plasmide via IS70 plaatsvond, omdat het IS70 in tweevoud aanwezig bleek. Er is echter kennelijk slechts één complete kopie van IS70 aan- i 30 wezig, terwijl het andere fragment een restant van IS70 is. De lengte van het vernietigde IS70 is naar schatting ten hoogste 0,5 Mdalton.These results show that the co-integration of R772 and the Ti plasmid was via IS70, because the IS70 was found to exist in duplicate. However, apparently only one complete copy of IS70 is present, while the other fragment is a remnant of IS70. The length of the destroyed IS70 is estimated to be no more than 0.5 Mdalton.
Verder kan uit de som van de lengten van de fusiefragmenten van het colntegraat worden geconcludeerd, dat een stukje DNA van ten hoogste 0,5 Mdalton in de pTi-component moet zijn vernietigd, hoewel daarbij t 35 geen van de onderzochte restrictieplaatsen verloren is gegaan.Furthermore, it can be concluded from the sum of the lengths of the fusion fragments of the colntegrate that a piece of DNA of at most 0.5 Mdalton in the pTi component must have been destroyed, although none of the restriction sites investigated have been lost.
"i _i 8300699 ' -14-"i _i 8300699 '-14-
De op grond van deze gegevens geconstrueerde kaart van pAL969, met aanduiding van IS70, het vernietigde IS70 en de Kmr-locus, wordt in fig. 3 getoond. Van R772 afkomstige fragmenten zijn van een sterretje voorzien.The map of pAL969 constructed from these data, indicating IS70, the destroyed IS70 and the Kmr locus, is shown in Figure 3. Fragments from R772 are marked with an asterisk.
5 De opmerkelijke stabiliteit van pAL969 kan thans worden verklaard door aan te nemen, dat de lengte van de incomplete tweede kopie van IS70 niet voldoende is om een efficiënte homologe recombinatie, die tot dissociatie van het coïntegraat zou leiden, mogelijk te maken.The remarkable stability of pAL969 can now be explained by assuming that the length of the incomplete second copy of IS70 is not sufficient to allow efficient homologous recombination, which would lead to dissociation of the co-integrate.
B. Model experiment voor plaatsgerichte mutatie van R772.B. Model experiment for site-directed mutation of R772.
10 Er werd een model ezperiment ontworpen om de toepassing van het stabiele coïntegraat pAL969 voor plaatsgerichte mutatie in JE. coli te onderzoeken» Vanwege de betrekkelijk geringe grootte van R772 (40,5 Mdalton), zouden wijzigingen in de restrictiepatronen van een gemuteerd R772 plasmide gemakkelijker te interpreteren zijn dan bij 15 het coïntegraat plasmide, dat een grootte van 162 Mdalton heeft. Daarom werd eerst een plaatsgerichte mutatie in R772 geïntroduceerd, daarin gekarakteriseerd en pas daarna geïntroduceerd in het plasmide pAL969.10 A model experiment was designed to utilize the stable pEG969 co-integrated for site-directed mutation in JE. to investigate coli »Due to the relatively small size of R772 (40.5 Mdalton), changes in the restriction patterns of a mutated R772 plasmid would be easier to interpret than in the co-integrated plasmid, which is 162 Mdalton in size. Therefore, a site-directed mutation in R772 was first introduced, characterized therein, and only then introduced into the plasmid pAL969.
Het HindiII fragment 3 van R772 (lengte 6 Mdalton) werd op de door insertie activeerbare vector pTR262 gekloneerd. Dit fragment bevat 20 geen functies die essentieel zijn voor zelf-transfer of autonome replicatie van R772. Het verkregen plasmide pRI»232 heeft 3 EcoRI her-kenningsplaatsen, die zich alle in het gekloneerde fragment bevinden: het vectordeel (pTR262) heeft geen EcoRI plaatsen. De twee kleine interne EcoRI fragmenten van pRL232 (lengtes respectievelijk 1,8 en 25 1,0 Mdalton) werden verwijderd en vervangen door een EcoRI fragment (totale lengte 5,8 Mdalton) van het plasmide pRL220, welk fragment ampicilline (Ap) en chlooramfenicol (Cm) resistentie determinanten bevatte. Aldus werd een plasmide pRL234 verkregen, dat Ap, Cm en Tc (tetracycline) resistentie loei bezat (zie fig. 4a). Aan beide zijden 2Γ 2ΓThe HindIII fragment 3 of R772 (6 Mdalton length) was cloned onto the insert-activatable vector pTR262. This fragment does not contain features essential for self-transfer or autonomous replication of R772. The resulting plasmid pRI »232 has 3 EcoRI recognition sites, all of which are contained in the cloned fragment: the vector portion (pTR262) has no EcoRI sites. The two small internal EcoRI fragments of pRL232 (lengths 1.8 and 1.0 Mdalton, respectively) were removed and replaced with an EcoRI fragment (total length 5.8 Mdalton) of the plasmid pRL220, which contains ampicillin (Ap) and chloramphenicol. (Cm) resistance determinants. Thus, a plasmid pRL234 was obtained, which had Ap, Cm and Tc (tetracycline) resistance loci (see Fig. 4a). 2Γ 2Γ on both sides
30 van het A Cm fragment bevond zich een segment, ongeveer 1,5 Mdalton P30 of the A Cm fragment contained a segment, approximately 1.5 Mdalton P.
lang, met sequentie-homologie ten opzichte van R772 (dikke lijnen in fig. 4).long, with sequence homology to R772 (thick lines in Figure 4).
R772 en pRL 234 werden in één bacteriecel (KMBL1164) samenge-bracht om transfer van het Ap Cm segment naar R772 via homologe 35 recombinatie tot stand te brengen (zie fig. 4a). Deze stam werd daarna gebruikt als donor in een kruising met KMBL1001 (fig. 4b). De transfer \ \ ..........R772 and pRL 234 were pooled into one bacterial cell (KMBL1164) to effect transfer of the Ap Cm segment to R772 via homologous recombination (see Figure 4a). This strain was then used as a donor in a cross with KMBL1001 (Fig. 4b). The transfer \ \ ..........
83 0 0 69 983 0 0 69 9
........... "".......!1H........... "" .......! 1H
-15--15-
Inc.P-1 plasmide R772 was hoog; ongeveer 1% van. de ontvangende bacteriën kreeg dit plasmide. In oudere experimenten was gebleken dat -5 R772 het plasmide pBR322 mobiliseert met een frequentie van 10 per overgebracht R772 (via IS70 van R772). Derhalve werd verwacht dat R772 5 via IS70 ook het plasmide pRL234 zou mobiliseren met een frequentie van ongeveer 10 In feite werd echter een transferwaarde voor de x -2Inc. P-1 plasmid R772 was high; about 1% of. the recipient bacteria received this plasmid. Older experiments had shown that -5 R772 mobilizes the plasmid pBR322 at a frequency of 10 per R772 transferred (via IS70 of R772). Therefore, it was expected that R772 5 would also mobilize the plasmid pRL234 via IS70 with a frequency of approximately 10 In fact, however, a transfer value for the x -2
Ap determinant van 10 per overgebracht R772 waargenomen, veel hoger dan verwacht voor mobilisatie door middel van een transpositie-gebeurtenis. De hoge transfer frequentie is vermoedelijk te danken aan 10 de homologie tussen pRL234 en R772.Ap determinant of 10 per R772 transferred observed, much higher than expected for mobilization by transposition event. The high transfer frequency is probably due to the homology between pRL234 and R772.
££
Voor verdere analyse werden 22 Ap kolonies uitgezocht; daarvan22 Ap colonies were selected for further analysis; thereof
3Γ3ΓΧ3Γ 3TXXS3Γ3ΓΧ3Γ 3TXXS
waren er 14 Ap , Cm , Kin , Tc , en waren er 8 Ap , Cm , Km , Tc .there were 14 Ap, Cm, Kin, Tc, and there were 8 Ap, Cm, Km, Tc.
De set van 14 kolonies toonde expressie van alle markers van zowel R772 als pRL234, waaruit bleek dat het complete pRL234 was gemobili- -3 15 seerd (mobilisatie frequentie 6,5 x 10 per overgebracht R772).The set of 14 colonies showed expression of all markers of both R772 and pRL234, showing that the complete pRL234 was mobilized (mobilization frequency 6.5 x 10 per R772 transferred).
££
De set van 8 kolonies droeg daarentegen wel de R772 marker (Km ) en de r rThe set of 8 colonies, on the other hand, carried the R772 marker (Km) and the r r
Ap en Cm markers van het gemuteerde HindlII fragment 3 van R772, * r maar niet de marker van het vectorplasmide (Tc ). Deze 8 kolonies leken derhalve de plaatsgerichte mutatie te hebben ontvangen (ver- -3 20 vangingsfrequentie 3,5 x 10 per overgebracht R772). Van drie onafhankelijke kolonies werd plasmide DNA geïsoleerd en geanalyseerd op agarose gels: voor alle drie werd slechts één plasmide met dezelfde grootte waargenomen. Het door ontsluiting met HindlII verkregen fragmentenpatroon was voor deze plasmiden identiek: het voor een 25 HindlII ontsluiting van R772 typerende fragment 3 was verdwenen, terwijl twee nieuwe fragmenten zichtbaar waren. Deze twee nieuwe fragmenten waren identiek aan het gemuteerde HindlII fragment 3 van R772 in pRL234. In het van R772 afgeleide plasmide pRI.239 (zie fig. 4c). werd geen band van het vectorplasmide pTR262 gevonden. R772 was dus 30 inderdaad plaatsgericht gemuteerd.Ap and Cm markers of the mutated HindIII fragment 3 of R772, * r but not the marker of the vector plasmid (Tc). These 8 colonies therefore appeared to have received the site-directed mutation (replacement frequency 3.5 x 10 per transferred R772). Plasmid DNA was isolated from three independent colonies and analyzed on agarose gels: for all three, only one plasmid of the same size was observed. The fragment pattern obtained by HindlII digestion was identical for these plasmids: the HindlII digestion of R772 typical fragment 3 had disappeared, while two new fragments were visible. These two new fragments were identical to the mutated HindIII fragment 3 of R772 in pRL234. In the R772-derived plasmid pRI.239 (see Fig. 4c). no band of the vector plasmid pTR262 was found. R772 was thus indeed mutated in a place-oriented manner.
Dezelfde mutatie werd op soortgelijke wijze in het colntegraat plasmide pAL969 geïntroduceerd. De resultaten kwamen in essentie overeen met die bij gebruik van R772, en bij overbrenging van een aldus gemuteerd R772 :: Ti colntegraat plasmide in A. tumefaciens 35 bacteriën en infectie van planten daarmee bleken normale tumoren te worden gevormd. Dit is conform de verwachting, omdat de mutatie niet in de Ti-component van het colntegraat plasmide was gelocaliseerd.The same mutation was similarly introduced into the colntegrate plasmid pAL969. The results were essentially similar to those using R772, and transferring a thus mutated R772 :: Ti colegate plasmid into A. tumefaciens bacteria and plant infection was found to generate normal tumors. This is in line with expectations because the mutation was not localized in the Ti component of the colntegrate plasmid.
83 0 0 59 S83 0 0 59 S
__,_i . -16-__, _ i. -16-
VOORBEELDEXAMPLE
De bruikbaarheid van de beschreven procedure voor plaatsgerichte mutatie van het T-gebied.van de Ti-component van het colntegraat plas-mide pAL969 werd onderzocht door een fragment van het T-gebied (EcoRI 5 fragment 7 , zie fig. 3) te kloneren op de vector pACYC184. Het verkregen plasmide pRAL3501 bevatte twee PstI herkenningsplaatsen op een onderlinge afstand van 0,5 Mdalton binnen het T-gebied fragment; de vector pACYCl84 had geen PstI herkenningsplaatsen. Het 0,5 Mdalton lange PstI fragment werd vervangen door een 2,7 Mdalton lang fragment 10 met een Cmr determinant, welk fragment afkomstig was van het plasmide χ pRL220. Aan beide zijden van het, de Cm determinant bevattende, segment bevonden zich stukken DNA met lengtes van respectievelijk 2,5 en 1,8 Mdalton, die sequentie-homologie hadden met het T-gebied. Deze mutatie werd vervolgens op de eerder beschreven wijze in het colnte-15 graat plasmide pAL969 geïntroduceerd. De mutatie werd met een frequen-The utility of the described procedure for site-directed mutation of the T region of the Ti component of the colntegrate plasmid pAL969 was investigated by cloning a fragment of the T region (EcoRI 5 fragment 7, see Figure 3). on the vector pACYC184. The resulting plasmid pRAL3501 contained two PstI recognition sites spaced 0.5 Mdalton within the T region fragment; the vector pACYCl84 had no PstI recognition sites. The 0.5 Mdalton long PstI fragment was replaced by a 2.7 Mdalton long fragment with a Cmr determinant, which fragment was from the plasmid χ pRL220. On both sides of the segment containing the Cm determinant there were pieces of DNA with lengths of 2.5 and 1.8 Mdalton, respectively, which had sequence homology to the T region. This mutation was then introduced into the colnte-15 bone plasmid pAL969 as previously described. The mutation was carried out with a
XX
tie van één op drie Cm transconjuganten in het pAL969 geïntroduceerd. Eén gemuteerd pAL969 plasmide, pALl831 genoemd, werd geïsoleerd en ontsloten met verscheidene restrictie endonucleases, waarna de fragmentenpatronen door middel van agarose gel elektroforese werden onder-20 zocht. Hierbij werd bevestigd, dat het 0,5 Mdalton PstI fragment'van pAL969 in pALl831 vervangen was door een 2,7 Mdalton PstI fragment.one in three Cm transconjugants were introduced in the pAL969. One mutated pAL969 plasmid, called pAL1831, was isolated and digested with several restriction endonucleases, and the fragment patterns were examined by agarose gel electrophoresis. It was confirmed that the 0.5 Mdalton PstI fragment of pAL969 in pAL1831 was replaced by a 2.7 Mdalton PstI fragment.
iiii
Wanneer de in pALl831 aanwezige PstI vervanging wordt vergeleken met de genetische kaart van het T-gebied (zie Garfinkel et al, Cell 27, 143-153 (1981) en Ooms et al, Gene 14, 33-50 (1981)), blijkt de muta-25 tie te liggen in de locus die een worteltumor-morfologie veroorzaakt. Vergeleken met de transcriptie^kaart van het T-gebied (zie Willmitzer i et al, The Embo Journal 1, 139-146 (1982)) is transcript 4 gemuteerd.When the PstI replacement present in pAL1831 is compared to the genetic map of the T region (see Garfinkel et al, Cell 27, 143-153 (1981) and Ooms et al, Gene 14, 33-50 (1981)), it appears the mutation lies in the locus causing a root tumor morphology. Compared to the transcription map of the T region (see Willmitzer i et al, The Embo Journal 1, 139-146 (1982)), transcript 4 is mutated.
Het colntegraat plasmide pALl831 werd van _E. coli overgebracht in A. tumefaciens, waarna voor één van de transconjuganten het tumor 30 inducerend vermogen bij verscheidene plantensoorten werd bestudeerd. Anders dan door wild-type octopine stammen geïnduceerde tumoren, ontwikkelden de kleine tumoren, die door pALl831 bevattende Agrobacterium bacteriën op tabak worden geïnduceerd, wortels. Ook op kalachoë stengels werd meer dan normale wortelvorming uit tumoren waargenomen.The colntegrate plasmid pAL1831 was from _E. coli transferred into A. tumefaciens, after which the tumor-inducing capacity was studied in several plant species for one of the transconjugants. Unlike tumors induced by wild-type octopine strains, the small tumors induced on tobacco by pAL1831 containing Agrobacterium bacteria developed roots. More than normal root formation from tumors was also observed on kalachoe stems.
35 Op tomaten werden slechts kleine tumoren gevormd. Deze waarnemingen waren volledig in overeenstemming met het bekende fenotype van dergelijke mutaties.Only small tumors were formed on tomatoes. These observations were fully consistent with the known phenotype of such mutations.
83 0 0 69 9 r? -17-83 0 0 69 9 r? -17-
De gevolgde procedure is schematisch weergegeven in fig. 5.The procedure followed is shown schematically in Fig. 5.
Fig. 6 geeft een beeld van een octopine Ti-plasmide, onderverdeeld in een voor tumor-inductie verantwoordelijk deel en een voor de afbraak van octopine (octopine catabolisme gen Occ) en arginine 5 (arginine catabolisme gen Are) verantwoordelijk deel. Tra, Ine en Rep zijn functies voor respectievelijk conjugatie, incompatibiliteit en replicatie. Aux, Cyt en Ocs zijn loei voor respectievelijk auxine- en cytokinine-achtige effecten en voor octopine synthese in de tumorcel.Fig. 6 depicts an octopine Ti plasmid, divided into a part inducing tumor induction and a part responsible for the degradation of octopine (octopine catabolism gene Occ) and arginine 5 (arginine catabolism gene Are). Tra, Ine, and Rep are conjugation, incompatibility, and replication functions, respectively. Aux, Cyt and Ocs are loci for auxin and cytokinin-like effects and for octopine synthesis in the tumor cell, respectively.
Fig. 7 toont in groter detail de structuur van het T-gebied 10 van octopine Ti-plasmiden, na inbouw in het plantegenoom. Aan de uiteinden van het T-gebied bevindt zich een speciale basevolgorde van ongeveer 23 baseparen (bp), die betrokken zijn bij de integratie van het T-DNA in het plantegenoom. Tevens wordt een “kunstmatig" T-gebied, ingebouwd in het plantegenoom, getoond, dat één of meer gewenste genen 15 en een marker gen voor de selectie van transformanten bevat. Om expressie van deze genen in de plantecel mogelijk te maken zijn speciale basevolgorden aanwezig, waaronder een plantepromotor (Pp) als startplaats voor de transcriptie in RNA (-*), die de regulatie van de genexpressie in eukaryoten verzorgen.Fig. 7 shows in more detail the structure of the T region 10 of octopine Ti plasmids, after incorporation into the plant genome. At the ends of the T region is a special base sequence of approximately 23 base pairs (bp) involved in the integration of the T DNA into the plant genome. Also, an "artificial" T region built into the plant genome is shown which contains one or more desired genes and a marker gene for the selection of transformants. Special base sequences are present to allow expression of these genes in the plant cell. , including a plant promoter (Pp) as a starting site for transcription in RNA (- *), which regulate gene expression in eukaryotes.
20 Γ 8300 699 i20 Γ 8300 699 i
Claims (6)
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8300699A NL8300699A (en) | 1983-02-24 | 1983-02-24 | METHOD FOR BUILDING FOREIGN DNA INTO THE NAME OF DIABIC LOBAL PLANTS; METHOD FOR PRODUCING AGROBACTERIUM TUMEFACIENS BACTERIEN; STABLE COINTEGRATE PLASMIDS; PLANTS AND PLANT CELLS WITH CHANGED GENETIC PROPERTIES; PROCESS FOR PREPARING CHEMICAL AND / OR PHARMACEUTICAL PRODUCTS. |
| EP84200238A EP0120515B1 (en) | 1983-02-24 | 1984-02-21 | A process for the incorporation of foreign dna into the genome of dicotyledonous plants; a process for the production of agrobacterium tumefaciens bacteria |
| AT84200238T ATE58557T1 (en) | 1983-02-24 | 1984-02-21 | METHOD OF INTRODUCING FOREIGN DNA INTO THE GENOME OF DICOTYLENE PLANTS; A METHOD OF PRODUCING AGROBACTERIUM TUMEFACIENS BACTERIA. |
| DE8484200238T DE3483621D1 (en) | 1983-02-24 | 1984-02-21 | METHOD FOR INTRODUCING FOREIGN DNA INTO THE GENOM OF DICOTYLENE PLANTS |
| US06/583,024 US4693976A (en) | 1983-02-24 | 1984-02-23 | Process for the incorporation of foreign DNA into the genome of dicotyledonous plants using stable cointegrate plasmids |
| JP59031540A JP2523468B2 (en) | 1983-02-24 | 1984-02-23 | Method for introducing foreign gene into chromosome of dicotyledonous plant |
| JP6213930A JP2528270B2 (en) | 1983-02-24 | 1994-09-07 | Shuttle plasmid containing foreign gene |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8300699 | 1983-02-24 | ||
| NL8300699A NL8300699A (en) | 1983-02-24 | 1983-02-24 | METHOD FOR BUILDING FOREIGN DNA INTO THE NAME OF DIABIC LOBAL PLANTS; METHOD FOR PRODUCING AGROBACTERIUM TUMEFACIENS BACTERIEN; STABLE COINTEGRATE PLASMIDS; PLANTS AND PLANT CELLS WITH CHANGED GENETIC PROPERTIES; PROCESS FOR PREPARING CHEMICAL AND / OR PHARMACEUTICAL PRODUCTS. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8300699A true NL8300699A (en) | 1984-09-17 |
Family
ID=19841472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8300699A NL8300699A (en) | 1983-02-24 | 1983-02-24 | METHOD FOR BUILDING FOREIGN DNA INTO THE NAME OF DIABIC LOBAL PLANTS; METHOD FOR PRODUCING AGROBACTERIUM TUMEFACIENS BACTERIEN; STABLE COINTEGRATE PLASMIDS; PLANTS AND PLANT CELLS WITH CHANGED GENETIC PROPERTIES; PROCESS FOR PREPARING CHEMICAL AND / OR PHARMACEUTICAL PRODUCTS. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4693976A (en) |
| EP (1) | EP0120515B1 (en) |
| JP (2) | JP2523468B2 (en) |
| AT (1) | ATE58557T1 (en) |
| DE (1) | DE3483621D1 (en) |
| NL (1) | NL8300699A (en) |
Families Citing this family (102)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4886937A (en) * | 1985-05-20 | 1989-12-12 | North Carolina State University | Method for transforming pine |
| NL8502948A (en) * | 1985-10-29 | 1987-05-18 | Rijksuniversiteit Leiden En Pr | METHOD FOR INCORPORATING "FOREIGN DNA" INTO THE NAME OF DICOTYLE PLANTS |
| EP0288547A4 (en) * | 1986-11-03 | 1991-03-20 | Biotechnica International, Inc. | Plant transformation |
| US5128460A (en) * | 1989-04-04 | 1992-07-07 | Genelabs Incorporated | Recombinant trichosanthin and coding sequence |
| CA2018884A1 (en) * | 1989-06-22 | 1990-12-22 | Irving Gordon | Plant transformation construct |
| US6350934B1 (en) | 1994-09-02 | 2002-02-26 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid encoding delta-9 desaturase |
| US5733744A (en) * | 1995-01-13 | 1998-03-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Binary BAC vector |
| RU2090613C1 (en) * | 1995-09-01 | 1997-09-20 | Каньчжэн Юрий Владимирович Цзян | Device for communication of natural information supply to biological object |
| US6586661B1 (en) | 1997-06-12 | 2003-07-01 | North Carolina State University | Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid |
| US6183959B1 (en) | 1997-07-03 | 2001-02-06 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method for target site selection and discovery |
| US5929300A (en) | 1997-07-15 | 1999-07-27 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Pollen-based transformation system using solid media |
| US7161064B2 (en) * | 1997-08-12 | 2007-01-09 | North Carolina State University | Method for producing stably transformed duckweed using microprojectile bombardment |
| US6040498A (en) * | 1998-08-11 | 2000-03-21 | North Caroline State University | Genetically engineered duckweed |
| US6518485B1 (en) | 1998-06-04 | 2003-02-11 | Westvaco Corporation | Particle-mediated conifer transformation |
| AR022383A1 (en) | 1998-09-18 | 2002-09-04 | Univ Kentucky Res Found | SYNTHESES |
| DE19926216A1 (en) * | 1999-06-09 | 2001-02-22 | Metallgesellschaft Ag | Process for producing barium sulfate, barium sulfate and use of barium sulfate |
| US7157619B1 (en) | 1999-08-30 | 2007-01-02 | Monsanto Technology, L.L.C. | Plant sterol acyltransferases |
| AU2001279007A1 (en) | 2000-07-25 | 2002-02-05 | Calgene Llc | Nucleic acid sequences encoding beta-ketoacyl-acp synthase and uses thereof |
| CA2386126C (en) | 2000-08-03 | 2010-07-13 | Japan Tobacco Inc. | Method of improving gene transfer efficiency into plant cells |
| DK1306440T3 (en) * | 2000-08-03 | 2007-04-02 | Japan Tobacco Inc | Method for improving gene transfer efficiency into plant cells |
| CN1330753C (en) * | 2000-08-30 | 2007-08-08 | 北卡罗莱纳州立大学 | Transgenic plants containing molecular decoys that alter protein content therein |
| WO2002026028A2 (en) | 2000-09-26 | 2002-04-04 | The Regents Of The University Of California | Characterization of phenylalanine ammonia-lyase (pal) gene in wounded lettuce |
| CN1258593C (en) * | 2000-11-07 | 2006-06-07 | 北卡罗莱纳州立大学 | Putrescine-N-methyl transferase promoter |
| WO2002064814A2 (en) | 2001-02-14 | 2002-08-22 | Ventria Bioscience | Expression of human milk proteins in transgenic plants |
| IL159213A0 (en) | 2001-06-08 | 2004-06-01 | Vector Tobacco Ltd | Modifying nicotine and nitrosamine levels in tobacco |
| US20060157072A1 (en) * | 2001-06-08 | 2006-07-20 | Anthony Albino | Method of reducing the harmful effects of orally or transdermally delivered nicotine |
| US10266836B2 (en) | 2001-11-13 | 2019-04-23 | U.S. Smokeless Tobacco Company Llc | Tobacco nicotine demethylase genomic clone and uses thereof |
| US20040162420A1 (en) * | 2002-10-16 | 2004-08-19 | U.S. Smokeless Tobacco Company | Cloning of cytochrome p450 genes from nicotiana |
| US7700851B2 (en) * | 2001-11-13 | 2010-04-20 | U.S. Smokeless Tobacco Company | Tobacco nicotine demethylase genomic clone and uses thereof |
| US20040117869A1 (en) * | 2002-01-11 | 2004-06-17 | U.S. Smokeless Tobacco Company | Cloning of cytochrome P450 genes from Nicotiana |
| US7812227B2 (en) | 2001-11-13 | 2010-10-12 | U.S. Smokeless Tobacco Company | Cloning of cytochrome p450 genes from nicotiana |
| US8592663B2 (en) * | 2001-11-13 | 2013-11-26 | U.S. Smokeless Tobacco Company Llc | Tobacco nicotine demethylase genomic clone and uses thereof |
| US7700834B2 (en) * | 2001-11-13 | 2010-04-20 | U.S. Smokless Tobacco Company | Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof |
| BRPI0307791B1 (en) * | 2002-02-20 | 2020-08-11 | J.R. Simplot Company | METHODS TO MODIFY CHARACTERISTICS OF SELECTED PLANT |
| WO2003070966A2 (en) * | 2002-02-20 | 2003-08-28 | Sirna Therapeutics, Inc | RNA INTERFERENCE MEDIATED TARGET DISCOVERY AND TARGET VALIDATION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
| US7534934B2 (en) | 2002-02-20 | 2009-05-19 | J.R. Simplot Company | Precise breeding |
| CA2911801A1 (en) | 2002-03-22 | 2003-10-02 | Greta Arnaut | Novel bacillus thuringiensis insecticidal proteins |
| CA2486543A1 (en) | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Dow Agrosciences Llc | Pesticidally active proteins and polynucleotides obtainable from paenibacillus species |
| CA2490781A1 (en) | 2002-06-28 | 2004-01-08 | University Of Guelph | Harvest-inducible genes from alfalfa (medicago sativa) and methods of use thereof |
| US7329798B2 (en) * | 2002-06-28 | 2008-02-12 | University Of Guelph | Harvest-inducible regulatory elements and methods of using same |
| CA2501631A1 (en) | 2002-10-16 | 2004-04-29 | U.S. Smokeless Tobacco Company | Cloning of cytochrome p450 genes from nicotiana |
| US8637731B2 (en) * | 2003-10-16 | 2014-01-28 | U.S. Smokeless Tobacco Company | Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof |
| CN1867674B (en) | 2003-10-16 | 2011-11-09 | 美国无烟烟草有限责任公司 | Cloning of cytochrome P450 genes from nicotiana |
| US8586837B2 (en) | 2004-04-29 | 2013-11-19 | U.S. Smokeless Tobacco Company Llc | Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof |
| EP1751278B1 (en) | 2004-04-29 | 2015-03-18 | U.S. Smokeless Tobacco Company LLC | Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof |
| BRPI0509460B8 (en) | 2004-04-30 | 2022-06-28 | Dow Agrosciences Llc | herbicide resistance genes |
| US20070199097A1 (en) * | 2004-09-03 | 2007-08-23 | U.S. Smokeless Tobacco Company | Tobacco plants having a mutation in a nicotine demethylase gene |
| EP1851317B1 (en) | 2005-02-23 | 2011-10-26 | North Carolina State University | Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes |
| ES2435079T3 (en) | 2005-07-08 | 2013-12-18 | Universidad Nacional Autonoma De Mexico Instituto | New bacterial proteins with pesticide activity |
| ES2843401T3 (en) | 2005-10-28 | 2021-07-16 | Dow Agrosciences Llc | New herbicide resistance genes |
| US11332753B2 (en) | 2006-12-15 | 2022-05-17 | U.S. Smokeless Tobacco Company Llc | Tobacco plants having reduced nicotine demethylase activity |
| US8319011B2 (en) | 2006-12-15 | 2012-11-27 | U.S. Smokeless Tobacco Company Llc | Tobacco plants having reduced nicotine demethylase activity |
| CA2686835C (en) | 2007-05-09 | 2020-04-21 | Dow Agrosciences Llc | Novel herbicide resistance genes |
| ATE528317T1 (en) | 2007-06-08 | 2011-10-15 | Univ Mexico Nacional Autonoma | SUPPRESSING THE RESISTANCE OF INSECTS TO BACILLUS THURINGIENSIS CRY TOXINS USING TOXINS THAT DO NOT REQUIRE THE CADHERIN RECEPTOR |
| BRPI0820042B1 (en) | 2007-11-12 | 2020-05-19 | North Carolina State University | method of obtaining a tobacco plant, or cell or part thereof, having reduced levels of nornicotine, tobacco product, method of making a tobacco product, isolated polynucleotide, expression cassette, isolated polypeptide and method of obtaining a plant, or part of this plant, of the genus nicotiana |
| US8809626B2 (en) | 2007-12-21 | 2014-08-19 | Keygene N.V. | Trichome specific promoters |
| EP2294204B1 (en) | 2008-06-03 | 2013-02-27 | Nordsaat Saatzuchtgesellschaft mbH | Process of producing male sterile monocotyledonous plants |
| US7868688B2 (en) * | 2008-12-30 | 2011-01-11 | Cosmic Circuits Private Limited | Leakage independent very low bandwith current filter |
| EP2408797B1 (en) | 2009-03-19 | 2017-03-15 | DSM IP Assets B.V. | Polyunsaturated fatty acid synthase nucleic acid molecules and polypeptides, compositions, and methods of making and uses thereof |
| CN102459315B (en) | 2009-04-17 | 2016-03-02 | 陶氏益农公司 | DIG-3 insecticidal cry toxins |
| EP2440664B1 (en) | 2009-06-08 | 2021-04-21 | Nunhems B.V. | Drought tolerant plants |
| EA201270107A1 (en) | 2009-07-01 | 2012-07-30 | Байер Байосайенс Н.В. | METHODS AND MEANS FOR OBTAINING PLANTS WITH IMPROVED RESISTANCE TO GLYPHOSATE |
| JP6055311B2 (en) | 2010-01-15 | 2016-12-27 | ノース・キャロライナ・ステイト・ユニヴァーシティ | Compositions and methods for minimizing nornicotine synthesis in tobacco |
| AU2011242578B2 (en) | 2010-04-23 | 2016-04-21 | Dow Agrosciences Llc | Combinations including Cry34Ab/35Ab and Cry3Aa proteins to prevent development of resistance in corn rootworms (Diabrotica spp.) |
| US9234208B1 (en) | 2010-05-10 | 2016-01-12 | Dow Agrosciences Llc | DIG-13 insecticidal cry toxins |
| CN107974457A (en) | 2010-05-28 | 2018-05-01 | 纽海姆有限公司 | The plant of fruit size increase |
| WO2012004013A2 (en) | 2010-07-08 | 2012-01-12 | Bayer Bioscience N.V. | Glucosinolate transporter protein and uses thereof |
| WO2012016222A2 (en) | 2010-07-29 | 2012-02-02 | Dow Agrosciences Llc | Strains of agrobacterium modified to increase plant transformation frequency |
| EP2423316B1 (en) | 2010-08-25 | 2016-11-16 | Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) | Method for determining meiotic recombination frequencies in plants |
| WO2012030714A2 (en) | 2010-08-30 | 2012-03-08 | Agrigenetics, Inc. | Activation tagging platform for maize, and resultant tagged population and plants |
| CA2828484A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | Altria Client Services Inc. | Tobacco inbred plants albex1f and albex1ms |
| RU2013139871A (en) | 2011-02-28 | 2015-04-10 | Норт Каролина Стейт Юниверсити | INBREED TOBACCO PLANTS NCBEX1F, NCBEX1MC AND NC EX90 |
| US9556448B2 (en) | 2011-04-11 | 2017-01-31 | Targeted Growth, Inc. | Identification and the use of KRP mutants in plants |
| UY34014A (en) | 2011-04-15 | 2012-11-30 | Dow Agrosciences Llc | SYNTHETIC GENES TO EXPRESS PROTEINS IN CORN CELLS, CONSTRUCTIONS, TRANSGENIC PLANTS, PEST CONTROL METHODS AND COMPOSITIONS |
| EP2518081B1 (en) | 2011-04-28 | 2017-11-29 | Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) | Method of producing and purifying polymeric proteins in transgenic plants |
| BR112013030724B1 (en) | 2011-05-31 | 2020-10-27 | Keygene N.V | chimeric gene, vector, host cell, use of a nucleic acid molecule and method to produce a transgenic plant having increased resistance to the insect pest |
| US9169489B2 (en) | 2011-09-08 | 2015-10-27 | Nutech Ventures | Transgenic soybean plants expressing a soybean homolog of glycine-rich protein 7 (GRP7) and exhibiting improved innate immunity |
| US20140259223A1 (en) | 2011-10-19 | 2014-09-11 | Keygene N.V. | Methods for producing cinnamolide and/or drimendiol |
| EP2841581B2 (en) | 2012-04-23 | 2023-03-08 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Targeted genome engineering in plants |
| EP2885412B1 (en) | 2012-08-17 | 2019-05-01 | Dow AgroSciences LLC | Use of a maize untranslated region for transgene expression in plants |
| AR092482A1 (en) | 2012-09-07 | 2015-04-22 | Dow Agrosciences Llc | ENRICHMENT OF THE CLASSIFICATION OF FLUORESCENCE ACTIVATED CELLS (FACS) TO GENERATE PLANTS |
| WO2014110363A1 (en) | 2013-01-11 | 2014-07-17 | North Carolina State University | Tobacco inbred plants k326 src, cms k326 src, k346 src, cms k346 src, nc1562-1 src, nctg-61 src, cms nctg-61 src and hybrid nc196 src |
| EP2964016A1 (en) | 2013-03-05 | 2016-01-13 | North Carolina State University | Tobacco inbred and hybrid plants and uses thereof |
| WO2014142647A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Wageningen Universiteit | Fungals strains with improved citric acid and itaconic acid production |
| WO2015065544A1 (en) | 2013-10-29 | 2015-05-07 | Biotech Institute, Llc | Breeding, production, processing and use of specialty cannabis |
| US9596823B2 (en) | 2014-03-03 | 2017-03-21 | North Carolina State University | Tobacco inbred and hybrid plants and tobacco products made thereof |
| WO2015134438A1 (en) | 2014-03-03 | 2015-09-11 | North Carolina State University | Tobacco inbred and hybrid plants and tobacco products made thereof |
| EP3113604A1 (en) | 2014-03-03 | 2017-01-11 | North Carolina State University | Tobacco inbred and hybrid plants and tobacco products made thereof |
| AR099800A1 (en) | 2014-03-21 | 2016-08-17 | Agrigenetics Inc | CRY1D TO CONTROL THE CORN WORM |
| TW201615095A (en) | 2014-10-31 | 2016-05-01 | 陶氏農業科學公司 | DIG-303 insecticidal CRY toxins |
| CN114213511A (en) | 2014-12-30 | 2022-03-22 | 美国陶氏益农公司 | Modified Cry1Ca toxins useful for controlling insect pests |
| CN108026149B (en) | 2015-08-17 | 2022-04-29 | 美国陶氏益农公司 | Engineered CRY6A insecticidal proteins |
| EP3344774A1 (en) | 2015-09-04 | 2018-07-11 | Keygene N.V. | Diplospory gene |
| EP3356392A1 (en) | 2015-10-02 | 2018-08-08 | Keygene N.V. | Method for the production of haploid and subsequent doubled haploid plants |
| CA3000133A1 (en) | 2015-10-02 | 2017-04-06 | Keygene N.V. | Method for the production of haploid and subsequent doubled haploid plants |
| WO2017200386A1 (en) | 2016-05-20 | 2017-11-23 | Keygene N.V. | Method for the production of haploid and subsequent doubled haploid plants |
| US20190225974A1 (en) | 2016-09-23 | 2019-07-25 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Targeted genome optimization in plants |
| US11946057B2 (en) | 2018-12-20 | 2024-04-02 | Benson Hill, Inc. | Pre-conditioning treatments to improve plant transformation |
| BR112021023769A2 (en) | 2019-05-29 | 2022-01-11 | Keygene Nv | gene for parthenogenesis |
| AR122735A1 (en) | 2020-06-24 | 2022-10-05 | Benson Hill Inc | PLANT CELL TREATMENTS TO IMPROVE PLANT TRANSFORMATION |
| IL301700A (en) | 2020-10-13 | 2023-05-01 | Keygene Nv | Modified promoter of a parthenogenesis gene |
| WO2024052856A1 (en) | 2022-09-09 | 2024-03-14 | Friedrich Alexander Universität Erlangen-Nürnberg | Plant regulatory elements and uses thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE255162T1 (en) * | 1983-01-13 | 2003-12-15 | Max Planck Gesellschaft | TRANSGENIC DICOTYLEDONE PLANT CELLS AND PLANTS |
| EP0131620B1 (en) * | 1983-01-17 | 1991-08-21 | Monsanto Company | Genetically transformed plants |
| EP0131624B1 (en) * | 1983-01-17 | 1992-09-16 | Monsanto Company | Plasmids for transforming plant cells |
-
1983
- 1983-02-24 NL NL8300699A patent/NL8300699A/en not_active Application Discontinuation
-
1984
- 1984-02-21 EP EP84200238A patent/EP0120515B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-02-21 DE DE8484200238T patent/DE3483621D1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-02-21 AT AT84200238T patent/ATE58557T1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-02-23 JP JP59031540A patent/JP2523468B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-02-23 US US06/583,024 patent/US4693976A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-09-07 JP JP6213930A patent/JP2528270B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE58557T1 (en) | 1990-12-15 |
| JPS6070081A (en) | 1985-04-20 |
| US4693976A (en) | 1987-09-15 |
| EP0120515A2 (en) | 1984-10-03 |
| DE3483621D1 (en) | 1991-01-03 |
| JP2528270B2 (en) | 1996-08-28 |
| EP0120515B1 (en) | 1990-11-22 |
| EP0120515A3 (en) | 1985-05-15 |
| JPH07163358A (en) | 1995-06-27 |
| JP2523468B2 (en) | 1996-08-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL8300699A (en) | METHOD FOR BUILDING FOREIGN DNA INTO THE NAME OF DIABIC LOBAL PLANTS; METHOD FOR PRODUCING AGROBACTERIUM TUMEFACIENS BACTERIEN; STABLE COINTEGRATE PLASMIDS; PLANTS AND PLANT CELLS WITH CHANGED GENETIC PROPERTIES; PROCESS FOR PREPARING CHEMICAL AND / OR PHARMACEUTICAL PRODUCTS. | |
| Hooykaas et al. | Agrobacterium and plant genetic engineering | |
| NL8300698A (en) | METHOD FOR BUILDING FOREIGN DNA INTO THE NAME OF DIABIC LOBAL PLANTS; AGROBACTERIUM TUMEFACIENS BACTERIA AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF; PLANTS AND PLANT CELLS WITH CHANGED GENETIC PROPERTIES; PROCESS FOR PREPARING CHEMICAL AND / OR PHARMACEUTICAL PRODUCTS. | |
| Klee et al. | Vectors for transformation of higher plants | |
| US5569597A (en) | Methods of inserting viral DNA into plant material | |
| US6822144B1 (en) | Methods for Agrobacterium-mediated transformation | |
| US5731179A (en) | Method for introducing two T-DNAS into plants and vectors therefor | |
| Ooms et al. | Crown gall plant tumors of abnormal morphology, induced by Agrobacterium tumefaciens carrying mutated octopine Ti plasmids; analysis of T-DNA functions | |
| Offringa et al. | Complementation of Agrobacterium tumefaciens tumor-inducing aux mutants by genes from the TR-region of the Ri plasmid of Agrobacterium rhizogenes | |
| US5501967A (en) | Process for the site-directed integration of DNA into the genome of plants | |
| AU611652B2 (en) | Process for the genetic modification of monocotyledonous plants | |
| ES2256856T3 (en) | TRANSGENIC CELL SECTION PROCESS. | |
| Lipp João et al. | Enhanced transformation of tomato co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens C58C1Rif r:: pGSFR1161 in the presence of acetosyringone | |
| US6037526A (en) | Method of inserting viral DNA into plant material | |
| Jen et al. | The right border region of pTiT37 T-DNA is intrinsically more active than the left border region in promoting T-DNA transformation. | |
| JPH0740941B2 (en) | Method for introducing exogenous DNA into plant genome | |
| Baldes et al. | Transformation of soybean protoplasts from permanent suspension cultures by cocultivation with cells of Agrobacterium tumefaciens | |
| CA2095109C (en) | Process for production of exogenous gene or its product in plant cells | |
| WO1992006205A1 (en) | A process for the gene manipulation of plant cells, recombinant plasmids, recombinant bacteria, plants | |
| US5929306A (en) | KYRT1, a disarmed version of a highly tumorigenic Agrobacterium tumefaciens strain identified as Chry5 | |
| NZ209338A (en) | Plasmid for the transformation of a plant cell | |
| US20090075358A1 (en) | Vectors for transformation of plant cells | |
| Hepburn et al. | The effect of right terminal repeat deletion on the oncogenicity of the T-region of pTiT37 | |
| JPS6181793A (en) | Dismantled t-dna | |
| WO2015133652A1 (en) | Plant transformation method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1A | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| A85 | Still pending on 85-01-01 | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BV | The patent application has lapsed |