NL8120190A - - Google Patents

Description

812 01BQ

Biologisch actieve peptiden v

Enige tijd geleden werd gevonden, dat de hypofyse-hormonen corticotrophine (ACTH) en β-lipotropine (β-LPH) ontstaan zijn uit een groot gemeenschappelijk: pro-eiwit. De voorgestelde structuur van dit precursor-5 molecuul bevat verschillende paren van basische aminozuren, die door proteolytische enzymen kunnen worden gesplitst, zodat diverse kleinere peptiden ontstaan.

Op deze wijze kunnen ACTH en β-LPH en vervolgens 10 onder meer a-MSH, γ-LPH, β-MSH en β-endorfine ontstaan.

Buiten het gebied met de ACTH- en β-LPH-amino-zuursequenties in het precursor molecuul is nog een fragment aanwezig met een aminozuur samenstelling die 15 opvallend veel lijkt op die van α-MSH en β-MSH.

Vanwege deze structurele verwantschap met MSH werd dat deel van het precursor molecuul γ-MSH genoemd.

Ling et al., Life Science 25, 1773 (1979) hebben 20 dit hypothetische hormoon, γ-MSH, gesynthetiseerd, alsook enige zeer verwante derivaten hiervan. Zij ontdekten, dat geen van deze peptiden - vergeleken met α-MSH - een noemenswaardige MSH-aktiviteit bezat, en dat zij ook niet in vitro de vrijgifte stimuleren 25 van andere hormonen, zoals LH, FSH, prolactinë, groeihormoon en TSH.

Op grond van zijn structurele verwantschap met ACTH/MSH-achtige peptiden, waarvan bekend is dat zij 30 ook invloed hebben op bepaalde hersenfuncties, werd γ-MSH onderzocht in die gedragstesten waarin ACTH/MSH verwante neuropeptiden effectief gebleken zijn.

8120190 - 2 -

Het nieuwe peptide en derivaten daarvan vertoonden echter geen soortgelijke effecten in deze testsystemen.

5 Verrassenderwijze bleek echter, dat γ-MSH

derivaten met de algemene formule: R^-L-Tyr-L-Val-L-Met-Gly-L-His-L-Phe-L-Arg-L-Trp-L-Asp-L-Arg-L-Phe-R2 I

waarin 10 R^ waterstof of een lagere alifatische acyl (1-6 C) groep voorstelt, en R2 een hydroxygroep of de groep -Gly-OH voorstelt, en zouten, esters en amiden hiervan, veranderingen in het gedrag te weeg brengen, die 15 juist het tegengestelde zijn van die welke bijvoorbeeld bij α-MSH, ACTH (1-24) en β-endorfine gevonden werden.

Het is algemeen bekend, dat a-MSH, β-endorfine 20 en ACTH fragmenten zoals ACTH (1-24), ACTH (1-10) en ACTH (4-10) invloed hebben op het voorwaardelijke vluchtgedrag (avoidance behavior) zoals kan worden waargenomen in de zogenaamde paalklim- en shuttle-box testen. Genoemde peptiden vertragen de uitdoving 25 van het (paalklim) vluchtgedrag aanzienlijk; terwijl in tegenstelling hiermee γ-endorfine, bepaalde chemisch gewijzigde ACTH fragmenten en ook de welbekende opiaat-antagonisten zoals naloxon en nal-trexon, de tegenover gestelde werking veroorzaken, 30 namelijk een versnelde uitdoving van het (paalklim) vluchtgedrag.

De peptiden met formule I bleken eveneens de uitdoving van dit vluchtgedrag te versnellen.

35 8120190 - 3 -

Een ander type vluchtgedrag, dat door ACTH (1-24) wordt beïnvloed, is het aanleren van shuttle- * box vluchtgedrag. In deze test werd waargenomen dat bij subcutane injectie met het peptide volgens de 5 uitvinding de snelheid waarmee ratten een bepaald vluchtgedrag aanleerden aanzienlijk werd vertraagd.

Deze testresultaten verkregen met de onderhavige peptiden lopen in dit opzicht paralel met 10 die welke verkregen worden bij gebruik van de opiaat-antagonist naloxon.

Het is voorts bekend, dat ACTH (1-24) en verwante peptiden een buitensporig verzorgingsgedrag 15 ("grooming response") in ratten teweeg brengen wanneer deze verbindingen intracerebroventriculair (i.c.v.) worden geinjicieerd. a-MSH, β-MSH en ACTH (1-24) zijn in dit opzicht ongevèer even aktief.

De peptiden volgens de uitvinding zijn echter 20 volkomen inaktief in deze test. Wel werd geconstateerd, dat de door ACTH (1-24) opgewekte "grooming response" zeer duidelijk afnam na subcutane toediening van een peptide volgens formule I.

Omdat al eerder gesuggereerd was dat dit ver-25 zorgingsgedrag geregeld wordt door een opiaat-gevoelig systeem, zouden de peptiden volgens de uitvinding hun remmende aktiviteit op het verzorgingsgedrag kunnen uitoefenen door inwerking op een opiaat gevoelig systeem.

30

De door β-endorfine opgewekte hypothermie op de tijdstippen h uur en 1 uur na injectie, was duidelijk minder bij ratten welke tevoren een i.c.v. injectie met een peptide volgens formule I hadden ontvangen, 35 namelijk 50 μg γ-MSH.

8120190 - 4 -

Deze β-endorfine antagoniserende werking werd voorts aangetoond in een studie waarbij β-endorfine en γ-MSH chronisch worden toegediend.

5 Afgezien van het ontstaan van een zekere tolerantie en verslaafdheid, is het meest opvallende effect van β-endorfine in dit opzicht een "drug-seeking" gedrag dat betrouwbaar kan worden bestudeerd in zogenaamde zelf-toedienings experimenten.

10 β-endorfine induceert, evenals vele narcotica zoals heroine, bij ratten een zelf-toedienings gedrag. Ofschoon γ-MSH dit zelf-toedienings gedrag niet onmiddellijk beïnvloedt kan wel worden aange- de 15 toond dat op de 5 dag van de test-procedure een dosis afhankelijke vermindering van dit gedrag plaatsvond.

De bovengenoemde testen tonen duidelijk aan, dat 20 de onderhavige peptiden aktief zijn als antagonisten van β-endorfine, hetgeen betekent, dat zij de effecten van dit wel bekend endogene neuropeptide β-endorfine tegen werken.

De onderhavige peptiden zijn bovendien aktief 25 in het antagoniseren en tegen werken van effecten van die enkefalines en endorfines, die op de opiaat receptoren in de hersenen werken, zodat zij in het algemeen de effecten van de opiaat achtige endogene peptiden tegenwerken. In dit kader hebben de onder-30 linge peptiden een farmacologische werking die in veel opzichten lijkt op die van de klassieke narcotica antagonisten, zoals naloxon en naltrexon, hetgeen betekent dat zij kunnen worden toegepast bij het antagoniseren van narcotische analgesie en meer 35 in het bijzonder in het tegengaan van door narcotica geïnduceerde ademhalingsproblemen.

8120190 - 5 -

Gezien de resultaten in de vluchtgedragtesten kunnen de onderhavige peptiden voorts hetzij via een werking op eigen receptoren hetzij via een werking op ACTH receptoren in de hersenen, een 5 psychofarmacologische en in het bijzonder een CNS-remmende aktiviteit uitoefenen.

De peptiden volgens de uitvinding kunnen worden opgenomen in gebruikelijke vloeibare of 10 vaste farmaceutische preparaten, bijvoorbeeld in tabletten voor sublinguale of orale toediening, in zetpillen voor rectale toediening of in oplossingen, emulsies of suspensies voor orale doch bij voorkeur intranasale of injectie-doeleinden.

15 De gebruikelijke hulpstoffen worden voor dit doel toegepast.

De peptiden met formule I worden parenteraal bij voorkeur toegediend in een dosering van 0,5 μg tot 20 0,5 mg per kilogram lichaamsgewicht per dag. Voor intranasale toediening wordt de voorkeur gegeven aan een dagelijkse dosering van 10 μς tot 50 mg per kilogram lichaamsgewicht, terwijl voor sublinguale toediening een dosering wordt aangehouden die over-25 eenkomt met ongeveer 10 keer de parenterale dosis.

Bijzonder waardevolle preparaten worden verkregen wanneer de onderhavige peptiden worden verwerkt tot een vorm waarin zij een verlengde werk-30 zaamheid bezitten, bijvoorbeeld door opname van de peptiden in gelatine of door omzetting van de peptiden in peptide-metaalcomplexen. Deze metaal-complexen kunnen op de gebruikelijke wijze verkregen worden door het peptide in contact te brengen 35 met een slecht oplosbaar metaalzout, metaalhydroxide 8120190 - 6 - of metaaloxide. Het metaal-zink is bij uitstek geschikt voor dit doel.

De lagere alifatische acylgroep in de definitie 5 van (formule I) is bij voorkeur acetyl, doch kan ook onder meer voorstellen propionyl, butyryl of 2-methylpropionyl.

Met zouten van de peptiden volgens formule I 10 worden bij voorkeur bedoeld de farmaceutisch acceptabele zuuradditiezouten, doch ook alkalimetaal-zouten van de peptiden zijn inbegrepen.

De zuuradditiezouten worden verkregen door de peptiden te laten reageren met een geschikt organisch 15 of anorganisch zuur zoals HCl, H^PO^, azijnzuur, maleinezuur, wijnsteenzuur of citroenzuur.

Onder amiden van de onderhavige peptiden worden verstaan, die peptiden volgens formule I waarin de 20 eindstandige carboxylische hydroxygroep vervangen is door een aminogroep of een mono- of di-alkyl (1-4 C) gesubstitueerde aminogroep.

Esters van de onderhavige peptiden zijn afgeleid 25 van alifatische of aralifatische alcoholen met 1-18 C atomen en meer in het bijzonder van lagere (1-6 C) alifatische alcoholen zoals methanol, ethanol of butanol.

30 De bereiding van de peptiden volgens formule I

kan worden uitgevoerd op de wijze als beschreven in Ling et al, Life Science Vol. 25, pagina’s 1773-1780 (1979).

35 8120190 - 7 -

In de hierna volgende beschrijving wordt de term γ-MSH gebruikt voor het peptide met formule I waarin Rj * H en R2 = Gly-OH.

5 De term S.E.M. (die in de voorbeelden wordt gebruikt) betekent: "de standaard-afwijking van het gemiddelde".

Voorbeeld 1 10 Uitdoving van aktief vluchtgedrag (paalklimtest)

Mannelijke Wistar ratten met een gewicht van 120-140 g werden gedurende 4 achtereenvolgende dagen getraind om een bepaald paalklimgedrag aan te leren. Elke dag werden de ratten onderworpen aan een 15 10 minuten durende sessie waarin 10 paalklimexperi- menten werden uitgevoerd.

Op de 5 dag wérden 3 uitdovingssessies gehouden, elk met een tussenpauze van 2 uur. Onmiddellijk na de 1 u i tdov mg s sessie werden de 20 ratten subcutaan behandeld met 3 μg γ-MSH of met placebo (0,5 ml saline).

Gemiddeld aantal (geconditioneerde) vlucht-reakties (+ S.E.M.) gedurende de uitdovingsperiode 25 op de tijdstippen: 0 2 4 uur na injectie placebo 9,0 + 0,4 8,2 + 0,9 6,8 + 0,5 γ-MSH 8,3 + 0,4 4,5 + 1,3 2,3 + 1,6 30 Passief vluchtgedrag

Ratten werden getest door ze in een soort "overstap" situatie te brengen (donkere en lichte ruimte). Zij ontvingen in het aanleer-experiment een eenmalige en niet te vermijden shock. Daarna 35 werd in een 24 uur durend retentie-experiment 812 0 1 - 8 - gekeken hoelang het duurde alvorens de ratten opnieuw het donkere compartiment binnen gingen.

De ratten ontvingen een subcutane injectie met 1,5 pg γ-MSH of met placebo (0,5 ml saline) één uur 5 voor de aanvang van het retentie-experiment.

qem. duur in seconden saline 112,5 Y-MSH 24,5 10 Aanleren van shuttlebox vluchtgedrag

Ratten werden getraind om een geconditioneerd vluchtgedrag (G.A.R.) in een "shuttle-box'· aan te leren tijdens een aanleer-sessie bestaande uit in totaal 30 experimenten. In elk experiment werd een 15 zoemtoon 3 seconden nadien gevolgd door een electrische shock (0,15 mA). De gemiddelde tijdsduur tussen elk experiment bedroeg 60 seconden. Voordat de testperiode begon werden de ratten subcutaan behandeld met 2,0 pg MSH, met placebo (0,5 ml. saline) of met 20 naloxon (80 μς) en wel bij γ-MSH 60 minuten tevoren en bij naloxon 10 minuten voor de test begon.

Gemiddeld aantal C.A.R.'s (+ S.E.M.) placebo 16,8+0,9 25 γ-MSH 6,5 + 1,2 placebo 19,7+1,3 naloxon 10,8 +2,6 30 Voorbeeld 2

Invloed van γ-MSH op het buitensporige verzorqinqs-qedraq veroorzaakt door ACTH (1-24). behandeling verzorgingsscore (+ SEM) s.c. i.c.v.

35 placebo ACTH (1-24) 166 + 10 γ-MSM ACTH (1-24) 99+15 placebo placebo 22+6 8T20190 - 9 -

Mannelijke Wistar ratten met een gewicht van 140-160 g en één week voor aanvang van de experimenten voorzien van een polyethyleen canule in een van de laterale hersen-ventricles werden subcutaan behandeld 5 met 100 pg γ-MSH of met placebo (0,5 ml saline), 15 minuten daarna gevolgd door een i.c.v. injectie met 0,3 pg ACTH (1-24) of met placebo (3 μΐ saline). Onmiddellijk hierna werden de ratten elk afzonderlijk in een glazen kooi geplaatst waarna 15 minuten later 10 de gedrag-studie begon. 50 Minuten lang noteerde de de waarnemer op elke 15 seconde of de rat al dan niet een verzorgingsgedrag vertoonde. Maximaal kan met deze methode dus 200 positieve scores geteld worden.

15 Voorbeeld 3

De invloed van γ-MSH op de door β-endorfine veroorzaakte temperatuursveranderingen wordt aangetoond in Figuur 1.

20 Vóór en op verschillende tijdstippen na i.c.v.

injectie werd de lichaamstemperatuur van mannelijke Wistar ratten met een gewicht van 150-170 g gemeten met behulp van een thermistor sonde, die via het rectum ongeveer 6 cm in de rat was aangebracht en 25 de temperatuur tot op 0,1 °C aangaf.

Een groep ratten werd behandeld hetzij met β-endorfine (20 pg) alleen, hetzij met β-endorfine (20 pg) + γ-MSH (50 pg). Met placebo of γ-MSH be- 30 handelde ratten fungeerden als controle dieren.

In elk experiment werden de temperatuur-veranderingen gecorrigeerd voor de gemiddelde waarde die bij de controle dieren werd waargenomen.

35 8120190 4 - 10 -

De grafiek geeft de gemiddelde temperatuur veranderingen in °C (+ standaard fout) als functie van de tijd na de behandeling.

Het gearceerde gebied geeft de standaard 5 afwijking in de met placebo behandelde ratten.

Het symbool "0" is in de grafiek'gebruikt voor de resultaten met β-endorfine en het symbool n§" voor het mengsel β-endorfine en γ-MSH.

10 Voorbeeld 4

De invloed van γ-MSH op het intraveneus zelf-toedieningsgedrag van heroine bij mannelijke Wistar ratten met een gewicht van 200-220 g wordt weergegeven in Figuur 2.

15 De ratten konden zich zelf intraveneus heroine toedienen (0,3 mg/injectie) tijdens een 5 daags, 6 uur per dag durend continue testprogramma.

Een uur voor de dagelijkse experimentele sessie werden de ratten subcutaan behandeld met 20 5 pg (x - x) γ-MSH of 50 μg (-) of placebo (0,5 ml saline · - ·). Het gemiddelde aantal zelf- toedieningen (+ standaard fout) op de 2 en de de 5 testdag wordt xn de grafiek weergegeven.

25 8120190

Claims (2)

1. Een farmaceutisch preparaat dat een peptide bevat met de formule: R1-L-Tyr-L-Val-LrMe^Gly-L-His-L-Phe-L-Arg-L-Trp-L-Asp-L-Arg-L-Phe-R2 (I) waarin R-^ waterstof of een lagere alifatische acyl (1-6 C) groep voorstelt, en R2 een hydroxy of de groep -Gly-OH voorstelt, of een zout, ester of amide hiervan, in combinatie met de gebruikelijke farmaceutische verdunningsmiddelen of dragers.

2. Een farmaceutisch preparaat volgens conclusie 1, dat een peptide met de formule I bevat, waarin Rj waterstof en R2 Gly-OH voorstelt, of een zout, ester of amide hiervan. 8120190