NL8004406A - NEW GLYCOPROTEINS OF KLEBSIELLA PNEUMONIAE, METHOD FOR THEIR PREPARATION, THEIR USE AS MEDICINES AND COMPOSITIONS CONTAINING THESE GLYCOPROTEINS. - Google Patents
NEW GLYCOPROTEINS OF KLEBSIELLA PNEUMONIAE, METHOD FOR THEIR PREPARATION, THEIR USE AS MEDICINES AND COMPOSITIONS CONTAINING THESE GLYCOPROTEINS. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8004406A NL8004406A NL8004406A NL8004406A NL8004406A NL 8004406 A NL8004406 A NL 8004406A NL 8004406 A NL8004406 A NL 8004406A NL 8004406 A NL8004406 A NL 8004406A NL 8004406 A NL8004406 A NL 8004406A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- glycoproteins
- molecular weight
- polysaccharide
- water
- medicaments
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/26—Klebsiella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/22—Klebsiella
Description
\ 803239/vdV/Ar ^\ 803239 / vdV / Ar ^
Korte aanduiding: Nieuwe glycoproteinen van Klebsiella pneumoniae, werkwijze voor hun bereiding, hun toepassing als geneesmiddelen en samenstellingen, die deze glycoproteinen bevatten·Short designation: New glycoproteins of Klebsiella pneumoniae, process for their preparation, their use as medicines and compositions containing these glycoproteins
De uitvinding heeft betrekking op nieuwe glycoproteinen van Klebsiella pneumoniae, een werkwijze voor hun bereiding, hun toepassing als geneesmiddelen en samenstellingen, die deze glycoproteinen bevatten· 5 In een aantal Franse octrooischriften zijn reeds uit Klebsiella pneumoniae geextraheerde glycoproteinen beschreven, bijvoorbeeld de Franse octrooischriften 2.043.475, 2.088.112 en 2.171.907.The invention relates to new glycoproteins of Klebsiella pneumoniae, a process for their preparation, their use as medicines and compositions containing these glycoproteins. 5 A number of French patents have already described glycoproteins extracted from Klebsiella pneumoniae, for example French patents 2,043. 475, 2,088,112 and 2,171,907.
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nauwkeuriger gedefinieerde glycoproteinen, in het bijzonder nieuwe, uit Klebsiella 10 pneumoniae geextraheerde, in water oplosbare glycoproteinen, die daardoor gekenmerkt zijn, dat ze 10-20^ proteinen, 50-70% neutrale osen, 15-25JÉ glucuronzuur en 1-2% osaminen bevatten en een molecuul-gevicht tussen 80.000 en 350.000 dalton bezitten.The present invention relates to more precisely defined glycoproteins, in particular new water-soluble glycoproteins extracted from Klebsiella 10 pneumoniae, which are characterized in that they contain 10-20% proteins, 50-70% neutral oxes, 15-25% glucuronic acid. and contain 1-2% osamines and have a molecular weight between 80,000 and 350,000 daltons.
Onder neutrale osen worden in het bijzonder neutrale hexosen, 15 zoals glucose, mannose of galactose verstaan.Neutral oxes are especially understood to mean neutral hexoses, such as glucose, mannose or galactose.
Van deze glycoproteinen wordt de voorkeur gegeven aan degene, waarvan het door ultracentrifugeren bepaalde molecuulgewicht ongeveer 100.000 dalton bedraagt.Of these glycoproteins, preference is given to those whose molecular weight determined by ultracentrifugation is about 100,000 daltons.
De glycoproteinen volgens de uitvinding kunnen geextraheerd 20 worden uit verschillende stammen van Klebsiella pneumoniae, in het bijzonder de bij het Instituut Pasteur onder nummer 52.145 gedeponeerde stam.The glycoproteins of the invention can be extracted from various strains of Klebsiella pneumoniae, in particular the strain deposited with Institute Pasteur under number 52,145.
Het onderzoek van de struktuur van deze glycoproteinen met behulp van verschillende chemische methoden, in het bijzonder de reduc-25 tie van de uronzuurresten door carbodiimide, de permethylering, de uronzuurafbraak, de periodieke oxydatie of oxydatie met behulp van chroomoxyde, heeft het mogelijk gemaakt om de samenstelling en de struktuur van de verbindingen volgens de uitvinding te bepalen.The examination of the structure of these glycoproteins using various chemical methods, in particular the reduction of uronic acid residues by carbodiimide, permethylation, uronic acid degradation, periodic oxidation or oxidation using chromium oxide, has made it possible to determine the composition and structure of the compounds of the invention.
De glycoproteinen volgens de uitvinding bevatten een proteine-30 keten, waarop het polysaccharidegedeelte is geënt.The glycoproteins of the invention contain a protein chain on which the polysaccharide moiety is grafted.
De voorkeursglycoproteinen volgens de uitvinding zijn diegene, waarbij het proteinegedeelte bestaat uit ongeveer 30^ zure aminozuren. Onder zure aminozuren verstaat men aminozuren zoals asparaginezuur, of glutaroinezuur, d.w.z. aminozuren met een zijketen, die een C00H-35 groep bevat.The preferred glycoproteins of the invention are those in which the protein portion is comprised of about 30 ^ acidic amino acids. Acid amino acids are understood to mean amino acids such as aspartic acid, or glutaric acid, i.e. amino acids with a side chain, containing a C00H-35 group.
80044068004406
' V"V
-2--2-
De giycoproteinen, waarin het N-eindstandige aminozuur van de proteinefractie asparaginezuur is, verdienen eveneens de voorkeur.The glycoproteins, wherein the N-terminal amino acid of the protein fraction is aspartic acid, are also preferred.
Voorts wordt de voorkeur gegeven aan giycoproteinen, waarin het polysaccharidegedeelte ongeveer 9,5-10,5 moleculei^lucose, 4-5 5 moleculen mannose en 3-3,5 moleculen glucuronzuur op één molecuul galactose bevat.Also preferred are glycoproteins, wherein the polysaccharide portion contains about 9.5-10.5 molecules of lucose, 4-5 molecules of mannose and 3-3.5 molecules of glucuronic acid on one molecule of galactose.
Hiervan wordt zeer in het bijzonder de voorkeur gegeven aan degene, waarin het polysaccharidegedeelte in hoofdzaak bestaat uit een herhaling van de tetrasaccharide-eenheid met de onderstaande 10 struktuur: Γη i A ΛΑ ll |— glucose 1 ' mannose > glucose I » glucuronzuur 15 Van de nieuwe giycoproteinen volgens de uitvinding kunnen even-, eens in het bijzonder diegene genoemd worden, waarin het polysaccharidegedeelte bestaat uit twee polysaccharideketens, die elk met de proteinefraktie verbonden zijn door een N-glycosidebinding tussen een molecuul glucosamine van één uiteinde van de polysaccharideketen en 20 één molecuul asparagine van de proteineketen.Of these, particular preference is given to the one in which the polysaccharide moiety mainly consists of a repeat of the tetrasaccharide unit having the following structure: Γη i A ΛΑ ll | - glucose 1 'mannose> glucose I »glucuronic acid 15 the novel glycoproteins of the invention may also be mentioned in particular those in which the polysaccharide portion consists of two polysaccharide chains, each linked to the protein fraction by an N-glycoside bond between a molecule of glucosamine from one end of the polysaccharide chain and 20 one molecule of asparagine from the protein chain.
De uitvinding heeft tevens betrekking op een werkwijze voor de bereiding van de nieuwe, in water oplosbare giycoproteinen, welke werkwijze daardoor gekenmerkt is, dat men met behulp van een quater-nair ammoniumzout een oplossing van giycoproteinen behandelt, die 25 verkregen is door diafiltratie van een lysaat-extract van kweken van Klebsiella pneumoniae, het verkregen neerslag afscheidt en vervolgens oplost met behulp van een waterige natriumchloride-oplossing, de aldus verkregen zoutoplossing van giycoproteinen koud behandelt met een alkanol met een laag molecuulgewicht, waardoor men een nieuw 30 neerslag verkrijgt, dat men oplost in water, dialyseert en vervolgens lyofiliseert.The invention also relates to a process for the preparation of the new water-soluble glycoproteins, which method is characterized in that a solution of glycoproteins obtained by diafiltration of a glyceroprotein is treated with the aid of a quaternary ammonium salt. lysate extract from Klebsiella pneumoniae cultures, separates the resulting precipitate and then dissolves it with an aqueous sodium chloride solution, cold treatment of the glycoprotein salt solution thus obtained, with a low molecular weight alkanol, yielding a new precipitate, which it is dissolved in water, dialyzed and then lyophilized.
Bij de werkwijze kan men uitgaan van verschillende oplossingen van giycoproteinen, die verkregen worden door diafiltratie van ly-saten van kweken van Klebsiella pneumoniae door gekalibreerde po-35 reuze membranen, die in staat zijn om de moleculen met eenzelfde molecuulgewicht of een groter molecuulgewicht dan een bepaald molecuulgewicht, dat een constante voor deze membranen is, tegen te houden.The process can be based on various solutions of giycoproteins, which are obtained by diafiltration of lysates from cultures of Klebsiella pneumoniae through calibrated porous membranes capable of producing molecules of the same molecular weight or higher molecular weight than certain molecular weight, which is a constant for these membranes.
De toegepaste membranen zijn bijvoorbeeld onder de namen AM1C0N XM 50, PM 30 en U12 in de handel gebrachtjinembranen, doch men 800 4 4 06 «τ' -3- gebruikt bij voorkeur membranen, waarvan de vasthouddrempel 100.000 dalton bedraagt, zoals de onder de namen XM 100 of HI P100 door AMI-C0N in de handel gebrachte membranen. De membranen, waaraan zeer in het bijzonder de voorkeur wordt gegeven, maken het mogelijk om de mo-5 leculen tegen te houden, waarvan het molecuulgewicht groter is dan 300.000 dalton. Deze membranen bestaan met voordeel uit de onder de naam XM300 door AMICON en R0MIC0N verkochte membranen.The membranes used are, for example, membranes marketed under the names AM1C0N XM 50, PM 30 and U12, but membranes of which the retention threshold is 100,000 daltons are preferably used, such as those under the names XM 100 or HI P100 membranes marketed by AMI-C0N. The very particularly preferred membranes make it possible to retain the molecules whose molecular weight is greater than 300,000 daltons. These membranes advantageously consist of the membranes sold under the name XM300 by AMICON and R0MIC0N.
De diafiltratie maakt het mogelijk om in oplossing moleculen met een groter molecuulgewicht dan een bepaald molecuulgewicht, af 10 te zonderen, zoals gezegd door de keuze van het membraan afhankelijk van de gewenste vasthouddrempel. Het spreekt vanzelf, dat de toepassing van andere oplossingen met dezelfde kenmerken, verkregen met behulp van andere middelen, zoals bijvoorbeeld chromatografie op een hydrofiel gepolymeriseerd gel, eveneens mogelijk is.The diafiltration makes it possible to separate molecules in solution with a molecular weight greater than a given molecular weight, as stated by the choice of the membrane depending on the desired retention threshold. It goes without saying that the use of other solutions with the same characteristics obtained by other means, such as, for example, chromatography on a hydrophilic polymerized gel, is also possible.
15 Voor deze selectiebewerking kan het lysaat met voordeel van lipiden en nucleinezuren bevrijd worden.For this selection operation, the lysate can advantageously be liberated from lipids and nucleic acids.
Volgens een bijzondere voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding, wordt de als uitgangsmateriaal toegepaste oplossing van glycoproteinen verkregen volgens de in de tweede 20 aanvulling, nr. 2 171 907 van het Franse octrooischrift 2 043 475 beschreven werkwijze. In deze aanvulling wordt het molecuulgewicht van de glycoproteinen bepaald door de methode van uitsluiting van gels.According to a particularly preferred embodiment of the method according to the invention, the glycoprotein solution used as starting material is obtained according to the method described in the second supplement, no. 2 171 907 of the French patent 2 043 475. In this supplement, the molecular weight of the glycoproteins is determined by the gels exclusion method.
Het quaternaire ammoniumzout, dat men gebruikt voor de behan-25 deling van de uitgangsoplossing van glycoproteinen, kan bijvoorbeeld pyridyl-cetyl-ammoniumchloride, en in het bijzonder trimethyl-cetyl-ammoniumbromide of Cetavlon zijn.The quaternary ammonium salt used to treat the glycoprotein starting solution may be, for example, pyridyl-cetyl ammonium chloride, and in particular trimethyl-cetyl ammonium bromide or Cetavlon.
Na de behandeling met ^quaternaire ammoniumzout, kan het verkregen neerslag afgescheiden worden van de bovendrijvende vloeistof 30 door gebruikelijke methoden, zoals decanteren of filtreren, doch de voorkeur wordt gegeven aan centrifugeren.After treatment with quaternary ammonium salt, the resulting precipitate can be separated from the supernatant by conventional methods such as decanting or filtering, but centrifugation is preferred.
Het neerslag wordt dan met voordeel opgelost met behulp van een 0,2M natriumchloride-oplossing.The precipitate is then advantageously dissolved using a 0.2M sodium chloride solution.
De verkregen oplossing wordt dan bij een lage temperatuur van 35 ongeveer 4°C behandeld met een alkanol met een laag molecuulgewicht, zoals methanol, ethanol, N-propanol of iso-propanol, bij voorkeur ethanol.The resulting solution is then treated at a low temperature of about 4 ° C with a low molecular weight alkanol such as methanol, ethanol, N-propanol or isopropanol, preferably ethanol.
De meest belangwekkende resultaten zijn verkregen bij toepassing van 6 volumedelen ethanol op 1 volurnedeel zoutoplossing, gedurende 800 4 4 06 % -4- één nacht bij een temperatuur van +4°C,The most interesting results have been obtained by applying 6 parts by volume of ethanol to 1 part by volume of saline for 800 4 4 06% -4 overnight at a temperature of + 4 ° C,
Het neerslag wordt opnieuw opgelost in water en gezuiverd door dialyse. De dialyse wordt uitgevoerd met behulp van cellen van een gebruikelijk type, die afgesloten zijn met membranen, bijvoorbeeld 5 van collodion of cellulose. Men gebruikt bij voorkeur cellen, waarvan het membraan bestaat uit geregenereerde cellulose met een gemiddelde porieëndiameter van ongeveer 24 dat de stoffen tegenhoudt, waarvan het molecuulgewicht groter is dan een waarde van 12-14.000 dalton. Als dialysecellen kunnen in het bijzonder genoemd worden 10 de VISKING-buizen.The precipitate is redissolved in water and purified by dialysis. The dialysis is carried out using cells of a conventional type, which are closed with membranes, for example of collodion or cellulose. Preferably cells are used whose membrane consists of regenerated cellulose with an average pore diameter of about 24 which retains the substances whose molecular weight exceeds a value of 12-14,000 daltons. Specifically mentioned dialysis cells are the VISKING tubes.
Deze dialyse maakt het mogelijk om uit de oplossing van glyco-proteinen de achtergebleven verontreinigingen met een gering molecuulgewicht, zoals sporen alkanol, te verwijderen ·This dialysis makes it possible to remove residues of low molecular weight, such as traces of alkanol, from the solution of glycoproteins.
Men kan vanzelfsprekend de glycoproteinen volgens de uitvinding 15 wat minder zuiver verkrijgen door de dialyse niet uit te voeren.Obviously, the glycoproteins according to the invention can be obtained somewhat less pure by not carrying out the dialysis.
Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze der uitvinding is het toegepaste quaternaire ammoniumzout cetyl-triraethyl-ammoniumbromide, scheidt men het eerste neerslag af door centrifugeren, en is de alkanol met laag molecuulgewicht ethanol.In a preferred embodiment of the method of the invention, the quaternary ammonium salt used is cetyl-triraethyl ammonium bromide, the first precipitate is separated by centrifugation, and the low molecular weight alkanol is ethanol.
20 De uitvinding heeft tevens betrekking op de volgens de werkwijze der uitvinding verkregen glycoproteinen.The invention also relates to the glycoproteins obtained according to the method of the invention.
Deze glycoproteinen bezitten zeer belangwekkende pharmacolo-gische eigenschappen, in het bijzonder opmerkelijke antibacteriële, immuniteit-bevorderende eigenschappen, alsmede een zeer goede ver-25 draagbaarheid.These glycoproteins have very interesting pharmacological properties, in particular remarkable antibacterial, immunity-promoting properties, as well as very good portability.
Deze eigenschappen worden hierna in het experimentele gedeelte toegelicht.These properties are explained in the experimental section below.
Deze eigenschappen maken de toepassing van de glycoproteinen volgens de uitvinding als geneesmiddelen mogelijk· De uitvinding 30 heeft derhalve tevens betrekking op de eerder beschreven glycoproteinen als'geneesmiddelen.These properties allow the use of the glycoproteins of the invention as drugs. The invention therefore also relates to the previously described glycoproteins as drugs.
De uitvinding heeft tevens betrekking op de volgens de werkwijze der uitvinding verkregen glycoproteinen als geneesmiddelen.The invention also relates to the glycoproteins obtained according to the method of the invention as medicines.
Deze geneesmiddelen vinden bijvoorbeeld toepassing bij de be-35 handeling of het voorkomen bij mensen en dieren van door bacterieën of virussen veroorzaakte infectieziekten, de behandeling van door parasieten veroorzaakte ziekten, infecties door vergiften en de behandeling van infecties na een verblijf in het ziekjsnhuis of na een operatie.These medicines find use, for example, in the treatment or prevention in humans and animals of infectious diseases caused by bacteria or viruses, the treatment of parasite-caused diseases, poisonous infections and the treatment of infections after a stay in the hospital or after an operation.
800 4 4 06 -5-800 4 4 06 -5-
De gebruikelijke dosis, die afhangt van het toegepaste produkt, de behandelde patient en de betreffende aandoening, kan bijvoorbeeld bij mensen 0,5-10 mg per dag bij orale toediening, 2-10 mg per dag bij rectale toediening en 0,25-5 mg per dag bij parenterale toedie-5 ning bedragen.For example, the usual dose, depending on the product used, the treated patient and the condition concerned, may be 0.5-10 mg per day in humans for oral administration, 2-10 mg per day in rectal administration and 0.25-5 mg per day for parenteral administration.
De uitvinding heeft tenslotte betrekking op pbarmaceutische preparaten, die de glycoproteinen volgens de uitvinding als werkzaam bestanddeel bevatten.The invention finally relates to pharmaceutical preparations containing the glycoproteins according to the invention as active ingredient.
Als geneesmiddelen kunnen de glycoproteinen volgens de uitvinding 10 oraal, parenteraal of plaatselijk toegediend worden.As drugs, the glycoproteins of the invention can be administered orally, parenterally or topically.
De overeenkomstige pharmaceutische preparaten kunnen bijvoor, beeld vast of vloeibaar zijn en de gebruikelijke vormen bezitten, zoals bijvoorbeeld al dan niet beklede tabletten, geleien, korrels, oplossingen, siropen, suppositoria, injecteerbaxe preparaten, cap-15 sules, cremes, zalven, lotions, druppels, uitwendige oogmiddelen, en worden bereid volgens gebruikelijke methoden. Het werkzame bestanddeel of de werkzame bestanddelen kunnen er in worden opgenomen met gebruikelijke excipienten, zoals talk, arabische gom, lactose, zetmeel, magnesiumstearaat, cacaoboter, al dan niet waterige dragers, 20 vetten van dierlijke of plantaardige oorsprong, paraffinederivaten, glycolen, verschillende bevochtigingsmiddelen, dispergeermiddelen of emulgatoren en conserveermiddelen.The corresponding pharmaceutical preparations can be, for example, solid or liquid and have the usual forms, such as, for example, coated or uncoated tablets, jellies, granules, solutions, syrups, suppositories, injectable preparations, cap-capsules, creams, lotions, drops, external eye preparations, and are prepared by conventional methods. The active ingredient or ingredients can be incorporated therein with conventional excipients, such as talc, gum arabic, lactose, starch, magnesium stearate, cocoa butter, aqueous or non-aqueous carriers, animal or vegetable fats, paraffin derivatives, glycols, various humectants , dispersants or emulsifiers and preservatives.
De uitvinding zal hierna toegelicht worden aan de hand van een aantal niet beperkende voorbeelden.The invention will be elucidated below on the basis of a number of non-limiting examples.
25 VOORBEELD IEXAMPLE I
Men lost 20 g produkt, zoals verkregen in voorbeeld 1 van het Franse octrooischrift 2.171.907 op in 2 1 gedeioniseerd water.20 g of the product as obtained in Example 1 of French patent 2,171,907 are dissolved in 2 l of deionized water.
Men voegt langzaam ongeveer 1,6 1 3^'s Cetavlon toe, roert het geheel één uur en centrifugeert vervolgens 15 minuten bij een snel-30 heid van 10.000 toeren/minuut.About 1.6 liters of Cetavlon is slowly added, the whole is stirred for one hour and then centrifuged at a speed of 10,000 rpm for 15 minutes.
Men neemt het neerslag op in 0,5 liter van een 0,2M natrium-chlorideoplossing. Men voegt vervolgens in 15 minuien 3 liter 95#s ethanol toe. Na één uur loeren centrifugeert men 15 minuten met een snelheid van 10.000 toeren/minuut, verwijdert de aldus verkregen bo-35 venstaande vloeistof, lost het neerslag op in 1 liter water en onderwerpt het vervolgens 48 uur aan dialyse in Visking-buizen met gedeioniseerd water bij +4°C. Na afloop van deze dialyse wordt de oplossing gelyofiliseerd. Men verkrijgt 18,6 g van de gewenste glycoproteinen.The precipitate is taken up in 0.5 liters of a 0.2M sodium chloride solution. Then 3 liters of 95 # ethanol are added in 15 minutes onions. After one hour of lurking, the centrifuge is centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes, the supernatant thus obtained is removed, the precipitate is dissolved in 1 liter of water and then dialyzed in Visking tubes with deionized water for 48 hours. at + 4 ° C. After this dialysis, the solution is lyophilized. 18.6 g of the desired glycoproteins are obtained.
8004405 ·.*8004405. *
VOORBEELD IIEXAMPLE II
Men lost 20 g produkt zoals verkregen in voorbeeld 1 van het Franse octrooischrift 2.171.907 op in 1 liter gedeioniseerd water.20 g of the product as obtained in Example 1 of French Pat. No. 2,171,907 are dissolved in 1 liter of deionized water.
Men voegt onder roeren 0,800 liter 3%*s Cetavlon toe. Na één uur 5 roeren centrifugeert men 15 minuten met een snelheid van 10.000 t/min. Men lost het aldus verkregen neerslag op in 0,250 1 van een 0,2M na-triumchloride-oplossing. Onder roeren voegt men 1,5 liter 95^'s ethanol toe. Na één uur roeren centrifugeert men 15 minuten met een snelheid van 10.000 toeren/minuut. Men verwijdert de bovenstaande vloei-10 staf, neemt het neerslag op in 0,500 liter water en onderwerpt het 48 uur aan dialyse in Visking-buizen met gedeioniseerd water bij 4°C.0.800 liters of 3% Cetavlon are added with stirring. After stirring for one hour, the centrifuge is centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes. The precipitate thus obtained is dissolved in 0.250 L of a 0.2M sodium chloride solution. 1.5 liters of 95% ethanol are added with stirring. After stirring for one hour, the centrifuge is centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes. The supernatant is removed, the precipitate is taken up in 0.500 liters of water and subjected to dialysis in Visking tubes with deionized water at 4 ° C for 48 hours.
Na afloop van deze dialyse lyofiliseert men de oplossing en verkrijgt 9,4 g van de gewenste glycoproteinen.After this dialysis, the solution is lyophilized and 9.4 g of the desired glycoproteins are obtained.
VOORBEELD IIIEXAMPLE III
15 Men bereidt tabletten met de onderstaande samenstelling: - glycoproteinen verkregen volgens voorbeeld 1: 5 mg - excipiens voldoende voor een tablet van 100 mg.Tablets of the following composition are prepared: - glycoproteins obtained according to example 1: 5 mg - excipient sufficient for a 100 mg tablet.
(Excipiens : lactose, zetmeel, talk, magnesiumstearaat).(Excipient: lactose, starch, talc, magnesium stearate).
VOORBEELD IVEXAMPLE IV
20 Men bereidt een zalf met de onderstaande samenstelling: - glycoproteinen verkregen volgens voorbeeld II: 200 mg - excipiens voldoende voor 100 g.An ointment of the following composition is prepared: - glycoproteins obtained according to example II: 200 mg - excipient sufficient for 100 g.
PHARMAC0L0GI5CH ONDERZOEKPHARMAC0L0GI5CH RESEARCH
A. Antibacteriële werkzaamheid van de volgens de werkwijze der uit-25 vinding verkregen glycoproteinen.A. Antibacterial activity of the glycoproteins obtained by the method of the invention.
De glycoproteinen volgens de uitvinding geven een intensieve en duurzame anti-bacteriSle bescherming in zeer geringe doses.The glycoproteins of the invention provide intensive and durable antibacterial protection in very low doses.
Deze werking is veelzijdig en wordt zowel uitgeoefend op Gram-posi-tieve als op Gram-negatieve bacterieën. De werking is meer preventief 30 dan genezend.This action is versatile and is exerted on both Gram-positive and Gram-negative bacteria. The effect is more preventative than curative.
Het produkt wordt toegediend aan muizen vóór de injectie van de ’kiemen.The product is administered to mice before the injection of the germs.
In een dosis van 10T/kg geven de glycoproteinen van de voorbeel-ofen I en II een' percentage bescherming van 100/£ tegen een infectie, 35 overeenkomende met 500 LD 50 van Klebsielle pneumoniae. In dezelfde dosis en voor dezelfde produkten bedraagt de bescherming 85% tegen een infectie overeenkomende met 12.500 LD 50 van Klebsielle pneumoniae. In een dosis van lOOf/kg bedraagt de bescherming 100# tegen 12.500 LD 50 van ditzelfde micro-organisme.At a dose of 10T / kg, the glycoproteins of Examples I and II give a percent protection of 100% against infection corresponding to 500 LD 50 of Klebsielle pneumoniae. At the same dose and for the same products, the protection is 85% against an infection corresponding to 12,500 LD 50 of Klebsielle pneumoniae. At a dose of 100f / kg, the protection is 100 # against 12,500 LD 50 of the same microorganism.
8004406 -7-8004406 -7-
Oe anti-bactetiële werkzaamheid ten opzichte van Klebsiella pneumoniae varieert afhankelijk van het moment van toediening van de glycoproteinen. Afhankelijk van het feit of de glycoproteinen 48 of 96 uur voor de infectie toegediend worden, bedragen de percen-5 tages bescherming respectievelijk 30 en 100$. De glycoproteinen volgens de uitvinding bezitten derhalve een zeer aanzienlijke preventieve anti-bacteriële werking.The anti-bacterial activity against Klebsiella pneumoniae varies depending on the time of administration of the glycoproteins. Depending on whether the glycoproteins are administered 48 or 96 hours before the infection, the percentages of protection are 30 and 100%, respectively. The glycoproteins according to the invention therefore have a very considerable preventive antibacterial action.
B. Stimulering van de niet specifieke af weerB. Encouragement of the nonspecific off
Deze stimulering is onderzocht met behulp van de proef van de 10 "klaring" met koolstof bij muizen onder toepassing van de methode van HALPERN, waarbij men bij de dieren een colloidale koolstofsus-pensie in de oogholte injecteert en als functie van de tijd de kine-tiek van het verdwijnen van de koolstof in het bloed bepaalt door middel van optische dichtheidsmetingen.This stimulation has been investigated by the carbon "clearance" test in mice using the HALPERN method, where the animals are injected with a colloidal carbon suspension into the ocular cavity and, as a function of time, the kin- determines the disappearance of the carbon in the blood by means of optical density measurements.
15 De produkten worden aan de dieren intraperitoniaal 24 en 48 uur voor de proef toegediend en de resultaten zijn uitgedrukt in het percentage werkzaamheid ten opzichte van blanco proefdieren, die slechts de injectie van de colloidale koolstofsuspensie hebben gekregen.The products are administered to the animals intraperitoneally 24 and 48 hours before the test and the results are expressed as a percentage of efficacy relative to blank test animals which have received only the injection of the colloidal carbon suspension.
20 blanco n ... werkzaamheid proefdieren voorbeeld Doses 0 minu^en 30 minuten na de injectie na de injectie I 0,25 mg/kg 42$ 65$ 25 II 0,25 mg/kg 43$ 65$20 blank n ... efficacy laboratory animals example Doses 0 minu ^ and 30 minutes after the injection after the injection I 0.25 mg / kg 42 $ 65 $ 25 II 0.25 mg / kg 43 $ 65 $
Uit deze resultaten blijkt de intensieve stimulering van de afweerreacties van het organisme, die door deze twee produkten wordt veroorzaakt.These results demonstrate the intensive stimulation of the immune responses of the organism caused by these two products.
30 C. A-cute giftigheid.30 C. A-cute toxicity.
De letale dosis 50 (LD 50) bij intraperitoniale toediening bij muizen is bepaald volgens de methode van BEHRENS en KARBER.The lethal dose of 50 (LD 50) for intraperitoneal administration in mice has been determined by the method of BEHRENS and KARBER.
De LD 50 bedraagt 100 mg per kg voor de glycoproteinen van de voorbeelden I en II.The LD 50 is 100 mg per kg for the glycoproteins of Examples I and II.
35 D. Verdraagbaarheid.35 D. Tolerability.
De subcutane injectie van 0,2 ml van de glycoproteinen van de voorbeelden I en II in een dosis van 1000 Τ'/kg bij muizen, veroorzaakt geen enkele plaatselijke of algemene intolerantie.The 0.2 ml subcutaneous injection of the glycoproteins of Examples I and II at a dose of 1000 µ / kg in mice does not cause any local or general intolerance.
80044068004406
Claims (16)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR7919652 | 1979-07-31 | ||
| FR7919652A FR2462477A1 (en) | 1979-07-31 | 1979-07-31 | NOVEL KLEBSIELLA PNEUMONIAE GLYCOPROTEINS, PROCESS FOR OBTAINING THEM, APPLICATION AS MEDICAMENTS AND COMPOSITIONS CONTAINING THEM |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8004406A true NL8004406A (en) | 1981-02-03 |
Family
ID=9228477
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8004406A NL8004406A (en) | 1979-07-31 | 1980-07-31 | NEW GLYCOPROTEINS OF KLEBSIELLA PNEUMONIAE, METHOD FOR THEIR PREPARATION, THEIR USE AS MEDICINES AND COMPOSITIONS CONTAINING THESE GLYCOPROTEINS. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5622793A (en) |
| CH (1) | CH645130A5 (en) |
| DE (1) | DE3029111A1 (en) |
| FR (1) | FR2462477A1 (en) |
| GB (1) | GB2060645B (en) |
| NL (1) | NL8004406A (en) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2490496A1 (en) * | 1980-09-19 | 1982-03-26 | Roussel Uclaf | NEW IMMUNOSTIMULANT GLYCOPROTEINS EXTRACTED FROM KLEBSIELLA PNEUMONIAE, PROCESS FOR OBTAINING THEM, THEIR APPLICATION AS MEDICAMENTS AND COMPOSITIONS COMPRISING THE SAME |
| FR2490495A1 (en) * | 1980-09-19 | 1982-03-26 | Roussel Uclaf | NOVEL HYDROSOLUBLE IMMUNOSTIMULANT GLYCOPROTEINS EXTRACTED FROM KLEBSIELLA PNEUMONIAE, PROCESS FOR OBTAINING THEM, USE THEREOF AS MEDICAMENTS AND COMPOSITIONS CONTAINING THEM |
| FR2540136A1 (en) * | 1983-01-28 | 1984-08-03 | Roussel Uclaf | NOVEL PROCESS FOR THE PREPARATION OF IMMUNOSTIMULATING ACYLGLYCOPROTEINS EXTRACTED FROM KLEBSIELLA PNEUMONIAE, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND METHOD FOR CONTROLLING ALLERGIC DISEASES |
| FR2574429B1 (en) * | 1984-12-06 | 1987-12-11 | Roussel Uclaf | ACYLGLYCANNES EXTRACTED FROM KLEBSIELLA, PROCESS FOR OBTAINING THEM, THEIR APPLICATION AS MEDICAMENTS AND THE COMPOSITIONS CONTAINING THEM |
| JP2522945B2 (en) * | 1987-06-18 | 1996-08-07 | 呉羽化学工業株式会社 | Antiretroviral agent |
| FR2653014B1 (en) * | 1989-10-17 | 1994-09-16 | Roussel Uclaf | USE OF GLYCOPROTEINS EXTRACTED FROM GRAM (-) BACTERIA FOR THE MANUFACTURE OF COSMETIC OR DERMATOLOGICAL COMPOSITIONS AND COMPOSITIONS CONTAINING THEM. |
| CH699786A2 (en) * | 2008-10-31 | 2010-05-14 | Marie-Christine Dr Etienne | Medicament TREATING INFECTIONS. |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL174267B (en) * | 1969-05-20 | Roussel Uclaf | IMPROVEMENT OF THE PROCESS FOR THE PREPARATION OF A SOMATIC ANTIGEN ACCORDING TO DUTCH PATENT 169754 AND PROCESS FOR PREPARING A PHARMACEUTICAL PREPARATION. | |
| BE795417A (en) * | 1972-02-15 | 1973-08-14 | Roussel Uclaf | NEW COMPOUNDS OF BACTERIAL ORIGIN AND PROCESS FOR OBTAINING |
| FR2396020A1 (en) * | 1977-07-01 | 1979-01-26 | Cassenne Lab Sa | Acetylated water soluble gluco-peptide prepn. - from Hafnia, Aerobacter cloacae or Klebsiella pneumoniae, used as antiinflammatories and immunostimulant(s) |
-
1979
- 1979-07-31 FR FR7919652A patent/FR2462477A1/en active Granted
-
1980
- 1980-07-30 GB GB8024949A patent/GB2060645B/en not_active Expired
- 1980-07-30 CH CH581980A patent/CH645130A5/en not_active IP Right Cessation
- 1980-07-30 JP JP10378480A patent/JPS5622793A/en active Granted
- 1980-07-31 NL NL8004406A patent/NL8004406A/en not_active Application Discontinuation
- 1980-07-31 DE DE19803029111 patent/DE3029111A1/en active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3029111C2 (en) | 1990-03-22 |
| JPS6363560B2 (en) | 1988-12-07 |
| JPS5622793A (en) | 1981-03-03 |
| FR2462477A1 (en) | 1981-02-13 |
| DE3029111A1 (en) | 1981-02-19 |
| CH645130A5 (en) | 1984-09-14 |
| GB2060645B (en) | 1983-03-23 |
| GB2060645A (en) | 1981-05-07 |
| FR2462477B1 (en) | 1983-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU650626B2 (en) | Method for producing soluble glucans | |
| US5811542A (en) | Method for producing soluble glucans | |
| US5488040A (en) | Use of neutral soluble glucan preparations to stimulate platelet production | |
| JP2550332B2 (en) | Soluble phosphorylated glucan | |
| CA2098105C (en) | Oligoside derived from an antigen polyoside obtained from a pathogen | |
| JPH08500623A (en) | New glucan preparation | |
| FI74474C (en) | Procedure for the preparation of new glycoproteins extracted from Klebsiella Pneumoniae. | |
| NL8004406A (en) | NEW GLYCOPROTEINS OF KLEBSIELLA PNEUMONIAE, METHOD FOR THEIR PREPARATION, THEIR USE AS MEDICINES AND COMPOSITIONS CONTAINING THESE GLYCOPROTEINS. | |
| JP2005524617A (en) | Negatively charged polysaccharide from aloe vera | |
| CA1151545A (en) | Process for preparing new water soluble glycoproteins extracted from klebsiella pneumoniae | |
| DK150497B (en) | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF WATER SOLUBLE GYCOPROTEIN WITH ANTI-DISABLISHING AND IMMUNOSTIMULATIVE EFFECT | |
| KR19990021926A (en) | Polymyxin conjugate | |
| KR20010040752A (en) | Remedies for aids | |
| JPH07330806A (en) | Neutral polysaccharide and its use | |
| EP3651777A1 (en) | Immunoprophylaxis for general infections | |
| KR20000049546A (en) | Gargle solution and process for preparation thereof | |
| JPS62501499A (en) | Methods of using purified lipopolysaccharides and their derivatives | |
| WO2000023085A1 (en) | Mastitis treatment with particulate glucan |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A85 | Still pending on 85-01-01 | ||
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| BV | The patent application has lapsed |