NL2000008C2 - Samenstelling en doseereenheid als voedingssupplement en voor de behandeling van retinis pigmentosa. - Google Patents

Description

Samenstelling en doseer eenheid als voedingssupplement en voor de behandeling van retinis pigmentosa

De uitvinding betreft een samenstelling. De uitvinding betreft tevens een doseereenheid. 5 De uitvinding betreft tevens de samenstelling als voedingssupplement en als medicament voor de behandeling van retinis pigmentosa.

Retinitis Pigmentosa (RP) is een heterogene groep erfelijke degeneratieve retinale ziekten die uiteindelijk tot blindheid leiden. Voorbeelden van ziekten die tot de groep 10 van RP vallen zijn autosomaal dominant retinis pigmentosa (adRP), autosomaal recessief retinis pigmentosa (adRP) en X-gerelateerde retinis pigmentosa (XLRP). Naar schatting 1 op 3000 personen in de geïndustrialiseerde wereld leiden aan een vorm van RP (Kalloniatis M, Fletcher EL (2004) Retinitis pigmentosa: understanding the clinical presentation, mechanisms and treatment options. Clin. Exp. Optom. 87: 65-80). Als 15 gemeenschappelijk kenmerk vertoont deze groep van ziekten een voortschrijdend verlies van staafvormige fotoreceptoren in het oog, dat leidt tot een slechter aanpassingsvermogen aan de lichtsterkte, nachtblindheid en de ontwikkeling van kokervisie. Op langere termijn wordt ook degeneratie van de kegelvormige fotoreceptoren merkbaar, hetgeen een verminderd contrast en kleurweergave tot gevolg 20 heeft. Uiteindelijk kan de toenemende degeneratie van de fotoreceptoren tot blindheid leiden. Het afsterven van de fotoreceptor-cellen vindt bij RP normaliter plaats via apoptose. Op dit ogenblik zijn geen effectieve behandelingen van RP bekend.

Het doel van de uitvinding is het verschaffen van een middel voor de behandeling van 25 Retinis Pigmentosa.

De uitvinding verschaft daartoe een samenstelling omvattende werkzame hoeveelheden lutheïne, zeaxanthine, glutathion en alfa-liponzuur. De combinatie van deze actieve componenten geeft een remming van de degeneratie van de fotoreceptoren van RP-30 patiënten. Hiertoe dienen deze stoffen in actieve hoeveelheden dagelijks te worden toegediend, bijvoorbeeld als voedingssupplement. De positieve invloed van de carotenoïden lutheïne en zeaxanthine op sommige oogaandoeningen is op zichzelf bekend. De combinatie van deze twee stoffen samen met glutathion en alfa-liponzuur blijkt een synergetisch effect te geven. Glutathion is de gangbare naam voor L- 2 glutathion, afgekort als GSH. Zowel de geoxideerde als gereduceerde vorm van glutathion is bruikbaar. Alfa-liponzuur staat tevens bekend als tioctinezuur. De systematische naam van zeaxanthine is (3R, 3’R)-p,p-caroteen-3,3’-diol, die van luteïne is.: (3R, 3’R, 6’R)-P,e-caroteen-3,3’-diol. Naast de actieve ingrediënten kan de 5 samenstelling tevens een geschikte farmaceutisch acceptabele excipient omvatten. Hierbij kan gedacht worden aan vaste vulstoffen zoals magnesiumstearaat, talk, of vloeibare verdunningsmiddelen zoals water en/of alcohol. Tevens kan de samenstelling farmaceutisch acceptabele hulpstoffen omvatten, zoals emulgatoren, surfactanten en/of conserveermiddelen.

10

Het is voordelig indien de samenstelling ten minste 1 mg lutheïne, ten minste 1 mg zeaxanthine, ten minste 20 mg glutathion, en ten minste 5 mg alfa-liponzuur omvat. Dergelijke hoeveelheden zijn werkzaam, hoewel het vaak nodig is een meervoud van deze hoeveelheden te gebruiken om het gewenste effect te bereiken. De benodigde 15 dagelijkse dosering kan in meerdere eenheden zijn opgesplitst, die bijvoorbeeld op verschillende tijdstippen op een dag ingenomen kunnen worden.

In een voorkeursuitvoering omvat de samenstelling van 1 tot 40 mg lutheïne, van 1 tot 40 mg zeaxanthine, van 20 tot 800 mg glutathion, en van S tot 300 mg alfa-20 liponzuur. Samenstellingen binnen deze gewichtsverhoudingen van de ingrediënten hebben een bijzonder goede werkzaamheid. De bovenwaarden komen overeen de aanbevolen dagelijkse dosis voor een gemiddeld persoon. De dagelijkse dosis kan in meerdere eenheden zijn opgesplitst, zoals pillen of capsules.

25 Het heeft de voorkeur indien de samenstelling van 10 tot 40 mg lutheïne, van 10 tot 40 mg zeaxanthine, van 200 tot 800 mg glutathion, en van 50 tot 300 mg alfa-liponzuur. Gebruik van deze relatief hoge hoeveelheden blijkt een bijzonder goede werkzaamheid te geven. Hogere hoeveelheden dan de aangegeven bovengrenzen kunnen in principe een nog betere werkzaamheid geven, maar deze verbetering is in de meeste gevallen 30 niet significant meer. Bij voorkeur is tussen 400 en 800 mg glutathion aanwezig: dit blijkt een bijzonder goede werkzaamheid te geven.

Meer bij voorkeur omvat de samenstelling van 15 tot 25 mg lutheïne, van 15 tot 25 mg zeaxanthine, van 180 tot 220 mg glutathion, en van 90 tot 110 mg alfa-liponzuur. Bij 3 een dergelijke samenstelling wordt een bijzonder goede werkzaamheid gecombineerd met economisch gebruik van de ingrediënten.

Het is voordelig indien lutheïne, zeaxanthine, glutathion en alfa-liponzuur in de 5 onderlinge gewichtsverhouding aanwezig zijn van 1 tot 4 gewichtseenheden lutheïne, van 1 tot 4 gewichtseenheden zeaxanthine, van 16 tot 80 gewichtseenheden glutathion, en van 5 tot 30 gewichtseenheden alfa-liponzuur. In deze gewichtverhoudingen wordt het optimale synergetische effect van de ingrediënten bewerkstelligd. Bij voorkeur zijn luteïne en zeaxanthine hierbij aanwezig in een onderlinge gewichtsverhouding tussen 10 1:2 en 1:2. Het is tevens voordelig indien glutathion aanwezig is in een gewichtsverhouding tussen 40 en 80 gewichtseenheden. Een dergelijke verhouding blijkt een bijzonder goede werking te geven.

In een voorkeursuitvoering omvat de samenstelling tevens een werkzame hoeveelheid 1S Lucium Barbarum Lynn extract. Toevoeging van een dergelijk extract geeft een onverwachte verbetering van de werkzaamheid van de combinatie. Lucium Barbarum Lynn extract (LBL-extract) is een extract van het fruit van Lucium Barbarum Lynn, dat tevens bekend staat onder de naam ‘Wolfberry’. Dergelijke extracten zijn commercieel verkrijgbaar. De beste werkzaamheid wordt verkregen indien een extract gebruikt wordt 20 dat ten minste 90 gewichtsprocent polysacchariden omvat. Het polysaccharidegehalte van een LBL-extract is bijvoorbeeld vast te stellen door UV spectrofotometrie.

Het is voordelig indien de samenstelling ten minste 20 mg Lucium Barbarum Lynn extract omvat. Meer bij voorkeur omvat de samenstelling ten minste 1 mg lutheïne, 23 ten minste 1 mg zeaxanthine, ten minste 20 mg glutathion, ten minste S mg alfa-liponzuur en ten minste 20 mg Lucium Barbarum Lynn extract.

Bij voorkeur omvat de samenstelling van 20 tot 1000 mg Lucium Barbarum Lynn extract. Meer bij voorkeur omvat de samenstelling van 10 tot 40 mg lutheïne, 30 van 10 tot 40 mg zeaxanthine, van 200 tot 800 mg glutathion, van 50 tot 300 mg alfa-liponzuur en van 20 tot 1000 mg Lucium Barbarum Lynn extract.

4

Het is voordelig indien de samenstelling luthéïne, zeaxanthine, glutathion, alfa-liponzunr en LBL-extract in de volgende onderlinge gewichtsverhouding omvat: van 1 tot 4 gewichtseenheden lutheïne, van 1 tot 4 gewichtseenheden zeaxanthine, van 16 tot 80 gewichtseenheden glutathion, van 5 tot 30 gewichtseenheden alfa-S liponzuur, en van 20 tot 100 gewichtseenheden Lucium Barbarum Lynn extract

De uitvinding verschaft tevens samenstelling volgens de uitvinding als voedingssupplement Gebruik van de samenstelling volgens de uitvinding kan de degeneratie van fotoreceptorcellen van het oog voorkomen en/of remmen. Bij voorkeur 10 wordt het voedingssupplement dagelijks ingenomen. Gébruik van een dergelijk voedingssupplement is in het bijzonder voordelig voor personen met genetische aanleg voor de ontwikkeling van retinis pigmentosa. De werking is preventief en voorkomt of vertraagt het optreden van degeneratie van het gezichtsvermogen.

IS De uitvinding verschaft tevens het gebruik van een samenstelling volgens de uitvinding voor de behandeling van retinis pigmentosa. Gebruik van de samenstelling volgens de uitvinding kan de degeneratie van fotoreceptorcellen van het oog voorkomen en/of remmen. De samenstelling volgens de uitvinding heeft een gunstige invloed op de ontwikkeling van het ziektebeeld bij verschillende vormen die onder de verzamelnaam 20 retinis pigmentosa vallen. Hierbij horen de genetisch classificeerbare ziekten autosomaal dominant retinis pigmentosa (adRP), autosomaal recessief retinis pigmentosa (adRP) en X-gerelateerde retinis pigmentosa (XLRP), maar genetisch meer complexe ziekten die niet onder deze classificaties vallen behoren tot de groep ziekten die met een samenstelling volgens de uitvinding behandeld kunnen worden. De 25 samenstelling vertraagt de degeneratie van het gezichtsvermogen.

De uitvinding verschaft tevens een doseringseenheid omvattende een samenstelling volgens één der voorgaande conclusies. De doseringseenheid kan elke geschikte bekende toedieningsvorm hebben, waarbij in het bijzonder aan orale toedieningsvormen 30 zoals pillen en capsules gedacht wordt.

De uitvinding zal nu worden toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden.

5

Figuur 1 toont de ontwikkeling van RP in TUNEL-gekleurde retina’s van CH3H wild type en rd/rd muizen.

De figuren 2a, 2b en 2c tonen een niet-behandelde controle retina van een rdl muis (2a), een retina van een volgens de uitvinding behandelde rdl muis (2b), en de 5 gekwantificeerde resultaten in een staafdiagram (2c).

Figuren 3a en 3b vertonen verschillende gebieden van een niet-behandelde retina van een niet-behandelde rdl muis.

Figuur 4a toont een gebied van een behandelde retina, figuur 4b laat een kwantitatieve vergelijking zien van behandelde en niet-behandelde retina’s.

10 Figuren Sa en Sb toont in vitro onbehandelde en behandelde retina’s.

Figuren 6a en 6b laten een niet-behandelde retina en een alleen met glutathion behandelde retina zien.

Voorbeeld 1: In vivo experimenten IS De werkzaamheid van de combinatie van lutheïne, zeaxanthine, glutathion en alfa-liponzuur wordt navolgend aangetoond in een diermodel. Het hier gebruikte diermodel is de rd-1 muis, dat een mutatie heeft in het gen voor cGMP a-fosfodiesterase, gelocaliseerd in de staaf fotoreceptorcellen in het oog. Doordat a-fosfodiesterase-gerelateerde mutaties bij RP-patienten een belangrijke rol spelen bij de degeneratie, is 20 de rd-1 muis een relevant en bruikbaar model. Een verschil is dat bij rdl muizen het degeneratieproces in het centrum van de retina begint en van daar doorzet naar de rand, terwijl dit bij mensen in omgekeerde richting plaatsvindt. De mutatie zorgt in onbehandelde rd-1 muizen voor apoptose van staaffbtoceptorcellen die begint omstreeks postnatale dag 10 (PN 10), en uiteindelijk tot nachtblindheid leidt omstreeks PN18. Op 2S FN18 blijven alleen kegelfotoceptorcellen over, die echter uiteindelijk ook afsterven. Ter vergelijking worden normale wild-type muizen gébruikt, die genetisch gelijk zijn aan de rd-1 muis, maar waarbij de mutatie afwezig is en de degeneratie van het gezichtsvermogen niet optreedt 30 Stockoplossingen

Stockoplossingen zeaxanthine (Exrasynthese, France) en luteïne (Exrasynthese, France) warden op dezelfde wijze gemaakt. 0,1-1 mg zeaxanthine of luteïne werd opgelost in 20 μΐ chloroform, aangevuld met 100 μΐ dimethylsulföxide (DMSO) onder vortexen.

6

Stock-oplossingen van L-glutathion (GSH, Sigma USA) werd gemaakt door oplossing van 1 of 10 mg in 2 ml water. Een dosis van 2 μΐ / g lichaamsgewicht van deze stockoplossing komt overeen met een dosis van 1 respectievelijk 10 mg GSH/kg lichaamsgewicht.

5 1 of 10 mg α-liponzuur (ALA, Fluka Germany) werd opgelost in 100 μΐ DMSO.

1 tot 10 mg Lucium Baibarum Lynn (LBL, Wolfberry) extract (90% polysaccharide volgens UV, JF Natural, Tianjin, China) werd opgelost in 2 ml water. Een dosis van 2 μΐ / g lichaamsgewicht van deze stockoplossing komt overeen met een dosis van 1 respectievelijk 10 mg extract/kg lichaamsgewicht.

10 De stockoplossingen werden tot gebruik qpgeslagen bij 4°C. Voor toediening werden afgemeten hoeveelheden van de stockoplossingen met de gewenste hoeveelheid zeaxanthine, luteme, α-liponzuurhomogeen opgelost in olijfolie. Glutathion, en optioneel Lucium Baibarum Lynn extract, werd toegediend als waterige oplossing.

15 Proefdieren

De proefdieren werden behandeld volgens de richtlijn van de Europese gemeenschap (86/609/EEC). Muizen van de CH3 lijn en homozygote retinale degeneratie 1 (rdl/rdl) werden gebruikt. De geboortedag werd aangemerkt als postnatale dag 0 (ΡΝ0). Dieren met de leeftijd PN7 werden geofferd middels decapitatie, terwijl oudere muizen werden 20 geofferd door verstikking met droogijs.

Experimenten

Muizen kregen vanaf de derde dag na geboorte (PN3) behandeld met een oraal infuus luteme, zeaxanthine, α-liponzuur, glutathion en/of Lucium Barbarum Lynn-extract 25 (LBL-exIract) toegediend tot dag 11 of 16 na geboorte, onder verschillende regimes zoals weergegeven in tabel 1. Elke groep bevatte 9 dieren (n=9). De controlegroep (1) kreeg geen luteïne, zeaxanthine, α-liponzuur, glutathion of LBL-extract toegediend, maar slechts een overeenkomstige hoeveelheid drager (olijfolie, water). De experimenten 2-6 zijn experimenten waarbij slechts met één van de componenten 30 luteme, zeaxanthine, α-liponzuur, glutathion of LBL-extract werd behandeld. Elk experiment werd steeds uitgevoerd met zowel een lage dosis (2a-6a) als hoge dosis (2b-6b). De experimenten 7a en 7b zijn experimenten waarbij een combinatie van luteïne, 7 zeaxanthine, α-liponzuur, glutathion en LBL-extract werd toegediend, in lage (7a) en hoge dosering (7b).

Tabel 1: in vivo experimenten (hoeveelheden in mg/kg lichaamsgewicht)

Experiment luteïne zeaxanthine a-liponzuur glutathion LBL extract _ : : : - i 8 ~2a <ü - - - - “2b i - - - ~3a - Ö^ï : : __ - _ - : : 4a - - 1 - ~4b - - ÏÖ - - la - - - ï - 1b - - - ÏÖ - la I I - I ï ~6b - - I I ÏÖ ~7a ÖTl ÖA ï ï ï "7b ï ï ÏÖ ÏÖ 15

Controledieren (groep 1) werden vergeleken met behandelde dieren uit hetzelfde nest 5 om het effect van de behandeling vast te stellen. Dieren werden gedood 1 dag na voltooien van de voedingsperiode, waarna de ogen werden verwijderd en gefixeerd in ijskoude 4% paraformaldehyde gedurende 2 uur, en vervolgens in coupes gesneden van 8 pm en gekleurd met eosine-hematoxyline. De coupes werden vervolgens geanalyseerd op het aantal fotoreceptoren in 6 doorsneden aan elke zijde van de oogzenuw met 10 behulp van de zogenaamde Terminal dUTP nick-end labelling-assay (TUNEL)’, waarbij retina’s van behandelde rdl muizen werden vergeleken met onbehandelde rdl muizen op PN11. Hierbij werd een commercieel verkrijgbare celdood detectiekit gebruikt met de kleurstof TMR-rood (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland). Controles bestonden uit het weglaten van deoxynucleotidyl transferase uit de 15 labeloplossing (negatieve controle) en voorbehandelen van secties van de coupes gedurende 30 minuten met DNAse I (Roche, 3 U/ml) in 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7,5, met 1 mg/m1 voor het induceren van DNA-schade (positieve controle). De negatieve controle gaf geen kleuring, terwijl bij de positieve controle de gehele retina kleurde.

9

De TUNEL assay levende een zwakke labelling van alle celkernen op, terwijl van sommige cellen de rdl buitenste kemlaag (‘outer nuclear layer’, ONL) sterk gelabeld werd. Een positieve labelling in TUNEL is een aanwijzing voor het optreden van apoptotische celdood in de betreffende cel. Het totale aantal TUNEL-positieve kernen 5 in de ONL werden geteld in de dwarsdoorsnede van de centrale retina (3 coupes aan elke zijde van de optische zenuwbundel), met behulp van Zeiss Axiovision 4.2 software (Zeiss, Jena, Germany). Retina’s van ten minste 6 rdl testdieren werden voor elk experiment gemeten, gekwantificeerd en gemiddeld. Verschillen in de TUNEL-positieve tests in rdl behandelde en onbehandelde retina’s werden statistisch getoetst op 10 relevantie met behulp van een ongepaarde Student’s t-test, waarbij verschillen als significant werden aangemerkt wanneer p <0,05.

Resultaten

De resultaten worden geïllustreerd door de figuren 1-4. In het gebruikte diermodel, de 15 rdl muis, laten de retinale fotoreceptorcellen een snelle degeneratie zien die begint op PN9. Figuur 1 de ontwikkeling van RP in TUNEL-gekleurde retina’s van CH3H wild type en rd/rd muizen, waarbij apototisch afstervende cellen als oplichtende puntlocaties herkenbaar zijn. De bovenste rij afbeeldingen zijn afkomstig van wild-type C3H muis retina’s (PN7-13), waarbij geen degeneratie optreedt, afgezien van normale apoptose 20 van cellen die tijdens het leven van de muis met toenemende leeftijd optreedt. De retina’s van de rd/rd, getoond in de onderste rij afbeeldingen van PN 7-13 van links naar rechts, laten vanaf PN9 een toenemende apototisch afsterven van fotoreceptorcellen zien. De aftervende fotoreceptorcellen zijn in hoofdzaak gelocaliseerd in de buitenste kemlaag (outer nuclear layer, ONL).

25 Vanaf deze leeftijd neemt het aantal TUNEL-positieve cellen in het ONL toe. Behandeling met de combinatie van de antioxidanten luteïne, zeaxanthine, a-liponzuur, glutathion en LBL-extract gaf een duidelijke vermindering van het aantal apoptotische cellen ten opzichte van de dieren behandeld met één van de afzonderlijke componenten en de controlegroep (fig. 2).

30 Figuur 2a toont een representatief voorbeeld van een niet-behandelde controle retina van een rdl muis op PN11. Figuur 2b toont een representatief voorbeeld van een retina van een rdl muis op PN11 behandeld met een samenstelling volgens de uitvinding, zoals hierboven beschreven. De gekwantificeerde resultaten zijn vergeleken in het 10 staafdiagram in figuur 2c. Duidelijk te zien is dat het aantal apototisch afstervende fotoreceptoren in de behandelde cellen significant is afgenomen.

Figuur 3a toont een representatief midden-perifèraal gebied van de retina van een niet-behandelde rdl muis, waarbij slechts één rij fotoreceptoren is overgebleven, 5 aangegeven met de pijl. Figuur 3b toont een representatief periferaal gebied van dezelfde retina, waarbij ongeveer drie rijen fotoreceptoren zijn overgebleven. In figuur 4a is een periferaal gebied van de retina van een met een samenstelling volgens de uitvinding behandelde rdl muis te zien, waarbij ongeveer 6-7 fotoreceptoren. Figuur 4b laat een kwantitatieve vergelijking zien van de gemiddelde dikte van de buitenste 10 kemlaag (ONL) van behandelde en onbehandelde rdl/rdl/muizen bij PN 11 ten opzichte van de controle. De dikte is weergegeven als het gemiddelde aantal resterende rijen fotoreceptoren in de buitenste kemlaag.

Ook op de langere termijn (dieren behandeld tot PN16, en geanalyseerd op PN17) bleek de remmende werking van de behandeling volgens de uitvinding op de degeneratie van 13 de staaf-fotoreceptorcellen merkbaar, hetgeen te zien is in het aantal rijen fotoreceptoren in de periferale retina (figuur 3). Het remmende effect op de degeneratie is ook te zien in het midden-periferale en centrale deel van de retina. Aangezien RP zich bij mensen, in tegenstelling tot de muizen, juist vanaf het centrale deel ontwikkelt, zal de remming van de celsterfte zich bij mensen juist vooral in het centrale deel van de retina merkbaar 20 zijn.

Uit bovenstaande resultaten blijkt de werkzaamheid van de combinatie van de antioxidanten luteïne, zeaxanthine, α-liponzuur, glutathion en LBL-extract voor het remmen van het afsterven van fotoreceptorcellen ten gevolgen van RP. Uit het verschil in activiteit met de afzonderlijke componenten blijkt tevens het onverwachte 25 synergetische effect wat deze componenten hebben. In een hier niet getoond experiment bleek dat de combinatie van luteïne, zeaxanthine, α-liponzuur, glutathion eveneens een effectieve werking en een synergetisch effect geeft. Toevoeging van LBL-extract geeft nog een significante verbetering van dit effect.

30 Voorbeeld 2: In vitro experimenten Orgaancultuur

De in vitro-experimenten werden uitgevoerd op een orgaancultuur van retinaexplantaten onder serumvrije condities, zoals beschreven in Caffe AR, Ahuja P, Holmqvist B, Azadi S, Forsell J, Holmqvist I, Soderpalm AK, van Veen T (2001) “Mouse retina explants 11 after long-term culture in serum free medium.”, J Chem Neuroanat 22: 263-273. De beschreven techniek werd uitgevoerd op retina-explantaten van rdl muizen zoals gebruikt bij de in-vivo experimenten.

Retina’s van rdl muizen werden op PN3 overgebracht in een in vitro cultuur op platte S nitrocellulosemembranen werden in R16 medium gehouden gedurende 8 en 21 dagen, overeenkomend met de leeftijd PN11 respectievelijk FN28 van de dieren. Alle experimenten werden gepaard uitgevoerd, waarbij niet-behandelde retina’s werden vergeleken met retina’s die wél blootgesteld werden aan een behandeling. Voor de behandelde retina’s werden de volgende concentraties per ml cultuurmedium: glutathion 10 3 pg /ml, ALA 2 pg / ml, zeaxanthine 0.3 pg/ml, luteine 0.3 pg/ml. Voor het bereiken van deze concentraties werden de juiste afgemeten hoeveelheden stockoplossing zoals beschreven voor de in vivo experimenten toegevoegd aan het medium. Het medium werd elke tweede dag ververst, waarna de retina’s werden gefixeerd in ijskoude 4% paraformaldehyde gedurende 2 uur, en vervolgens in coupes gesneden van 8 pm en 15 gekleurd met eosine-hematoxyline. De rijen fotoreceptoren in de buitenste kemlaag (ONL) warden geteld in 5 coupes van elke samenstelling, waarbij van elke coupe 6 verschillende secties overeenkomstig de secties bij de in vivo experimenten werden geanalyseerd. De verschillen tussen wel en niet-behandelde retina’s werden statistisch vergeleken met Student’s gepaarde t-test, of Student’s ongepaarde t-test, waarbij 20 verschillen waarin p < 0,05 als significant werden beschouwd.

Resultaten

Representatieve resultaten zijn afgébeeld in de figuren 5 en 6.

Figuur 5a laat H-E gekleurde secties van onbehandelde rdl retinale explantaten zien, in 25 cultuur gehouden gedurende 25 dagen (overeenkomstig PN 28 in de in vivo testen).

Deze explantaten hebben 1-2 rijen fotoreceptoren in de buitenste kemlaag (ONL).

Figuur 5b laat een vergelijkbaar rdl muis explantaat zien, behandeld met de combinatie van antioxidanten volgens de uitvinding, waarin de buitenste kemlaag (ONL) 3-4 rijen fotoreceptoren heeft.

30 Figuren 6a en 6b laten een voorbeeld zien van een niet-behandelde en een met glutathion behandeld explantaat Het aantal rijen fotoceptorcellen is nagenoeg gelijk, hoewel een verschil in de textuur aanwezig lijkt te zijn.

12

Tabel 2 toont het gemiddelde aantal gemeten aantal rijen fotoreceptorcellen, waarbij het aantal explantaten is waarover gemiddeld werd, en SD de standaarddeviatie is. Uit student’s t-test blijkt dat dit voor de combinatie volgens de uitvinding een relevant verschil is. Hoewel ook de behandeling met de afzonderlijke actieve ingrediënten 5 lutheïne, zeaxanthine, glutathion of alfa-liponzuur volgens de metingen enige positieve invloed lijkt te hebben, blijkt het verschil met de controlegrope statistisch (volgens de Student’s t-test met als grens p<0.05) niet significant te zijn. Hieruit blijkt dat de combinatie van stoffen volgens de uitvinding inderdaad een synergetisch effect heeft dat verrassend is gezien het gebrek aan significante effecten bij behandeling met de 10 afzonderlijke componenten.

Tabel 2: het gemiddelde aantal gemeten aantal rijen fotoreceptorcellen rd/rd behandeling Aantal rijen Verschil met fotoreceptoren controle gemiddeld ± SD, (n) (Student’s t-test)

Controle 1.5 ±0.3 (n-6) lutheïne 2.0 ± 0.8 (n-6) p > 0.05 zeaxanthine 1.9 ±0.7 (n-6) p>0.05 glutathion 2.0 ± 0.9 (n-6) p > 0.05 alfa-liponzuur 1.8 ±0.5 (n-6) p>0.05

Combinatie lutheïne, p < 0.05 zeaxanthine, glutathion en alfa- liponzuur 3.5 ± 0.6 (n-6) 15 Voorbeeld 3: toedieningsvormen

Voor gebruik als voedingssupplement of medicijn bij mensen worden de actieve stoffen middels voor de vakman bekende technieken vermengd en verpakt in gelcapsule. De actieve ingrediënten lutheïne, zeaxanthine, glutathion en alfa-liponzuur en Lucium Barbarum Lynn extract werden onder GMP-omstandigheden gemengd, waarna capsules 20 met het homogene mengsel werden gevuld. Het gebruikte extract van het fruit van 13

Lucium Barbarum Lynn heeft een polysaccharidegehalte van 90%, zoals vastgesteld metUV.

Formulering 1 bevat een relatief kleine hoeveelheid, waarbij meerdere capsules per dag genomen dienen te worden om de aanbevolen minimale dagelijkse dosis te bereiken. De 5 capsules kunnen verspreid over de dag worden genomen, bijvoorbeeld een deel in de ochtend en in de avond. Formulering 2 bevat een hoge dosering, waarbij 1 of 2 capsules per dag voldoende zijn. Afhankelijk van lichaamsgewicht en een eventueel aanvullend dieet kan desgewenst worden gevarieerd in de dagelijkse dosis. De samenstellingen van de capsules volgens formulering 1 en 2, alsmede de aanbevolen dosis en variatie, zijn 10 weergegeven in tabel 3. Als alternatieve uitvoeringsvorm is het tevens denkbaar de afzonderlijke componenten in afzonderlijke toedieningseenheden zoals capsules aan te bieden, waarbij een RP-patiënt een combinatie van capsules toegediend krijgt. Hierbij kunnen de ingrediënten bijvoorbeeld over 2 of meer capsules verdeeld worden. Formulering 3 geeft hiervan een voorbeeld, waarbij lutheïne en zeaxanthine in een 15 eerste capsule 3a zijn opgenomen, en de overige componenten in een andere capsule 3b.

Tabel 3: formuleringen en aanbevolen doses.

ingrediënt Formulering formulering Formulering Aanbevolen Variatie 1 (mg) 2 (mg) 3 (mg) minimale dagelijkse dagelijkse dosis __ dosis (mg) (mg) 3a 3b

Lutheïne 5 20 20 20 10-40

Zeaxanthine 5 20 20 20 10-40

Glutathion 5Ö 3Ö - 3Ö 2ÖÖ 200-800

Alfa- 2Ö 7Ö - 7Ö ÏÖÖ 50-30Ö

Liponzuur extract 150mg 70 - 70 600 200-1000

Lucium

Barbarum

Lynn

De capsules bestaan uit een capsulehuls zoals gangbaar voor farmaceutische 20 toepassingen en voedingssupplementen, waarin een mengsel van de actieve 14 ingrediënten met de samenstelling zoals hierboven beschreven is opgenomen. Capsules zijn voordelig, omdat de hoeveelheid hulpstoffen beperkt kan blijven. Het is echter mogelijk de samenstelling in elke voor de vakman alternatieve toedieningsvorm te vervaardigen, zoals pillen, poeders en vloeibare toedieningsvormen. In een pilvorm of 5 poedervorm kan bijvoorbeeld een farmaceutisch acceptabele excipiënt of vulstof aan de actieve ingrediënten worden toegevoegd. Eventueel kunnen surfactanten en/of emulgatoren worden toegevoegd om de homogeniteit van het mengsel te waarborgen. In capsulevorm komen de actieve ingrediënten bij innemen niet in aanraking met smaakorganen. In andere toedieningsvormen kan het echter wenselijk zijn om 10 bijvoorbeeld smaakstoffen toe te voegen om de smaak van de ingrediënten te maskeren.

Het moge duidelijk zijn dat voor een deskundige in het vakgebied nog vele uitvoeringsvarianten van de uitvinding naast bovenstaande niet-limitatieve voorkeursvarianten denkbaar zijn.

15

Claims (13)

1. Samenstelling omvattende werkzame hoeveelheden lutheïne, zeaxanthine, glutathion en alfa-liponzuur. 5

2. Samenstelling volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk dat de samenstelling ten minste 1 mg lutheïne, ten minste 1 mg zeaxanthine, 10 ten minste 20 mg glutathion, en ten minste 5 mg alfa-liponzuur omvat

3. Samenstelling volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de samenstelling 15 van 1 tot 40 mg lutheïne, van 1 tot 40 mg zeaxanthine, van 20 tot 800 mg glutathion, en van 5 tot 300 mg alfa-liponzuur omvat.

4. Samenstelling volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de samenstelling van 10 tot 40 mg lutheïne, van 10 tot 40 mg zeaxanthine, van 200 tot 800 mg glutathion, en van 50 tot 300 mg alfa-liponzuur. 25

5. Raman staling volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de samenstelling van 15 tot 25 mg lutheïne, van 15 tot 25 mg zeaxanthine, van 180 tot 220 mg glutathion, en 30 van 90 tot 110 mg alfa-liponzuur omvat

6. Samenstelling volgens één der voorgaande conclusies, omvattende lutheïne, zeaxanthine, glntathirwi en alfa-liponzuur in de onderlinge gewichtsverhouding aanwezig zijn van 1 tot 4 gewichtseenheden lutheïne, van 1 tot 4 gewichtseenheden zeaxanthine, 5 van 16 tot 80 gewichtseenheden glutathion, en van 5 tot 30 gewichtseenheden alfa-liponzuur.

7. Samenstelling volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk dat de samenstelling tevens een werkzame hoeveelheid Lucium Barbarum Lynn extract 10 omvat

8. Samenstelling volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de samenstelling ten minste 20 mg Lucium Barbarum Lynn extract omvat.

9. Samenstelling volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de samenstelling van 20 tot 1000 mg Lucium Barbarum Lynn extract omvat.

10. Samenstelling volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk dat de samenstelling lutheïne, zeaxanthine, glutathion, alfa-liponzuur en LBL-extract in de 20 volgende onderlinge gewichtsverhouding omvat: van 1 tot 4 gewichtseenheden lutheïne, van 1 tot 4 gewichtseenheden zeaxanthine, van 16 tot 80 gewichtseenheden glutathion, van 5 tot 30 gewichtseenheden alfa-liponzuur, en 25 van 20 tot 100 gewichtseenheden Lucium Barbarum Lynn extract.

11. Samenstelling volgens één der voorgaande conclusies als voedingssupplement.

12. Samenstelling volgens één der voorgaande conclusies 1 -10 als geneesmiddel 30 voor de behandeling van retinis pigmentosa.

13. Doseringseenheid omvattende een samenstelling volgens één der voorgaande conclusies 1-10.