NL1034267C2

NL1034267C2 - Method for measuring seed quality.

Info

Publication number: NL1034267C2
Application number: NL1034267A
Authority: NL
Inventors: Hendrikus Wilhelmus Maria Hilhorst; Jan Willem Ligterink; Jan Kodde; Michiel Lammers
Original assignee: Stichting Tech Wetenschapp
Priority date: 2007-08-17
Filing date: 2007-08-17
Publication date: 2009-02-18
Also published as: WO2009025550A1

Description

Titel: Werkwijze voor het meten van zaadkwaliteitTitle: Method for measuring seed quality

GEBIED VAN DE UITVINDINGFIELD OF THE INVENTION

De uitvinding betreft een werkwijze voor het meten van de zaadkwaliteit van een monster van zaad van een plant. De uitvinding heeft voorts betrekking op de toepassing van ten minste één gen dat differentieel 5 tot expressie komt tussen priming en kieming van zaad van een plant als een indicator van zaadkwaliteit, en op een werkwijze voor het selecteren van een plant in een zaadveredelingsprogramma op basis van zaadkwaliteit.The invention relates to a method for measuring the seed quality of a sample of seed from a plant. The invention furthermore relates to the use of at least one gene that is differentially expressed between priming and seed germination of a plant as an indicator of seed quality, and to a method for selecting a plant in a seed breeding program based on seed quality.

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING 10 De kwaliteit van plantenzaad wordt bepaald door een samenstel van eigenschappen en factoren. Behalve intrinsieke eigenschappen als kiemkracht, stressbestendigheid en de bruikbaarheid van de uiteindelijk uit het zaad voortkomende plant, zijn bijvoorbeeld ook factoren als de hoeveelheid aanwezig ongewenst materiaal, zoals schadelijk onkruidzaad, 15 zaad van ongewenste gewassen of inerte materialen, en de aanwezigheid van zaad-gedragen ziekten van belang. Immers, ook deze factoren kunnen de kwaliteit en opbrengst van het gewas wezenlijk beïnvloeden en bepalen daarom mede de uiteindelijke waarde van een hoeveelheid zaad.BACKGROUND OF THE INVENTION 10 The quality of plant seed is determined by an assembly of properties and factors. In addition to intrinsic properties such as germination, resistance to stress and the usability of the plant ultimately resulting from the seed, factors such as the amount of unwanted material present, such as harmful weed seed, seed of unwanted crops or inert materials, and the presence of seed-borne seeds are also included diseases of interest. After all, these factors can also have a significant effect on the quality and yield of the crop and therefore partly determine the final value of a quantity of seed.

Desondanks zijn de intrinsieke eigenschappen van het zaad zeer wezenlijk 20 voor de zaadkwaliteit.Nevertheless, the intrinsic properties of the seed are very essential for seed quality.

Een van de belangrijkste eigenschappen van het zaad die bijdragen aan de zaadkwaliteit is de kiemkracht van het zaad. Met de term kiemkracht wordt verwezen naar het vermogen van het zaad om onder gunstige of optimale groeiomstandigheden uit te groeien tot een gezonde 25 plant. De kiemkracht wordt doorgaans getest onder gecontroleerde en optimale condities van vocht, temperatuur en licht. Dergelijke optimale omstandigheden worden in het veld echter zelden aangetroffen, en een 1 0342 67 2 kiemtest geeft daarom vaak een overschatting van de werkelijke kiemkracht die onder veldomstandigheden zal worden ervaren, en dus van de reële zaadkwaliteit. Onder veldomstandigheden zal van het zaad worden verwacht dat het tevens onder minder gunstige omstandigheden zal 5 ontkiemen en zal uitgroeien tot een gezonde plant. Dit vermogen komt tot uiting in de vigour en in de stressbestendigheid van het zaad. De meting van de bovenstaande parameters van zaadkwaliteit omvatten doorgaans een uitgebreide testprocedure waarbij de snelheid en de kwaliteit van het gehele ontwikkelingsproces van zaad tot gewas wordt gevolgd en beoordeeld. Een 10 resultaat daarvan is dat het geteste zaad niet meer als zaad beschikbaar is omdat het is ontkiemd.One of the most important properties of the seed that contribute to the seed quality is the germination power of the seed. The term germination refers to the ability of the seed to grow into a healthy plant under favorable or optimal growing conditions. Germination is usually tested under controlled and optimal conditions of moisture, temperature and light. However, such optimum conditions are rarely found in the field, and therefore a germination test often overestimates the actual germination force that will be experienced under field conditions, and therefore the real seed quality. Under field conditions, the seed will also be expected to germinate under less favorable conditions and to grow into a healthy plant. This ability is reflected in the vigor and stress resistance of the seed. The measurement of the above seed quality parameters generally include an extensive test procedure in which the speed and quality of the entire seed-to-crop development process is monitored and assessed. A result thereof is that the tested seed is no longer available as seed because it has germinated.

Terwijl de bovenstaande eigenschappen voor ieder zaadje individueel bepaald kunnen worden en bijgevolg intrinsiek voor het individuele zaadje zijn, voor een goede agronomische prestatie is het ook 15 van belang dat een uitgezaaide partij zaad als geheel (‘overall’) goed presteert. Een andere belangrijke eigenschap van zaad die met kieming samenhangt, is dan ook het moment van ontkieming van het zaad. Bij voorkeur ontkiemen alle zaden ongeveer op hetzelfde moment, zodat alle zaailingen zich in hetzelfde groeistadium bevinden. Dit laatste kan worden 20 bewerkstelligd door een proces dat bekend staat als “priming”. Priming omvat een gedeeltelijke hydratatie van het zaad waarbij wordt toegestaan dat een aantal metabole processen betrokken bij kieming in gang wordt gezet, echter, zonder de wortelpunt door de zaadhuid te laten breken. De behandeling van zaden op deze wijze resulteert na droging en eventuele 25 bewaring over het algemeen in een uniformere en snellere kieming. Priming wordt algemeen door zaadbedrijven toegepast om de zaadkwaliteit - zowel intrinsiek als overall - te verbeteren.While the above properties can be determined individually for each seed and are therefore intrinsic to the individual seed, it is also important for a good agronomic performance that a seeded batch as a whole ("overall") performs well. Another important characteristic of seed that is associated with germination is therefore the moment of germination of the seed. Preferably all seeds germinate at about the same time, so that all seedlings are at the same growth stage. The latter can be achieved by a process known as "priming". Priming involves partial hydration of the seed allowing a number of metabolic processes involved in germination to be initiated, however, without allowing the root tip to break through the seed skin. The treatment of seeds in this way generally results in a more uniform and faster germination after drying and possible storage. Priming is generally used by seed companies to improve seed quality - both intrinsically and overall.

Priming procedures worden ontwikkeld op basis van ‘trial and error’, waarbij de uiteindelijke uniformiteit en snelheid van ontkieming en 30 de groeikracht voor iedere afzonderlijke partij zaad wordt bepaald. Dit is 3 een tijdrovende activiteit. Er bestaan op dit moment geen werkwijzen om de doelmatigheid van de primingprocedure gedurende het primingsproces te bepalen of te controleren. Belangrijker nog, er bestaat op dit moment weinig inzicht in de invloeden die het primingsproces op het zaad zelf uitoefent, en 5 met name de invloed van priming op de verschillende intrinsieke parameters van zaadkwaliteit.Priming procedures are developed on the basis of "trial and error", whereby the final uniformity and speed of germination and the vigor is determined for each individual batch of seed. This is 3 a time-consuming activity. There are currently no methods for determining or checking the effectiveness of the priming procedure during the priming process. More importantly, there is currently little insight into the influences that the priming process exerts on the seed itself, and in particular the influence of priming on the various intrinsic parameters of seed quality.

De onderhavige uitvinding heeft ten doel om te voorzien in een werkwijze om de zaadkwaliteit te meten zonder het zaad te laten ontkiemen.The present invention has for its object to provide a method for measuring the seed quality without allowing the seed to germinate.

10 De onderhavige uitvinding heeft tevens ten doel om te voorzien in een werkwijze waarbij de zaadkwaliteit gedurende het primingsproces kan worden gecontroleerd en zonodig aangepast.The present invention also has for its object to provide a method in which the seed quality can be checked and adjusted as necessary during the priming process.

De onderhavige uitvinding heeft tevens ten doel om te voorzien in een werkwijze voor het selecteren van planten in een veredelingsproces op 15 basis van de kwaliteit van het zaad dat dergelijke planten (kunnen) voortbrengen.The present invention also has for its object to provide a method for selecting plants in a breeding process on the basis of the quality of the seed that such plants (can) produce.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDINGSUMMARY OF THE INVENTION

De onderhavige uitvinders hebben nu gevonden dat de kwaliteit 20 van plantenzaad zeer geschikt met behulp van moleculair biologische meettechnieken kan worden vastgesteld. In het bijzonder is nu gevonden dat het expressieniveau van een aantal specifieke genen voorspellend is voor afzonderlijke en veelal zeer uiteenlopende parameters van zaadkwaliteit. Metingen aan het genexpressiepatroon in zaden tijdens priming en kieming 25 hebben aangetoond dat de expressie van specifieke genen tijdens priming voorspellend is voor de uniformiteit en de snelheid van kieming. Dit is des te verrassender omdat deze specifieke genen differentieel tot expressie komen tussen priming en kieming, d.w.z. genen vertegenwoordigen op basis waarvan kieming en priming als verschillende processen moeten worden 30 aangemerkt.The present inventors have now found that the quality of plant seed can very suitably be determined with the aid of molecular biological measurement techniques. In particular, it has now been found that the expression level of a number of specific genes is predictive of individual and often very different parameters of seed quality. Measurements of the gene expression pattern in seeds during priming and germination have shown that the expression of specific genes during priming is predictive of uniformity and the rate of germination. This is all the more surprising because these specific genes are differentially expressed between priming and germination, i.e. represent genes on the basis of which germination and priming are to be considered as different processes.

44

Er is nu dus gevonden dat genen die differentieel tot expressie komen tussen kieming en priming kunnen worden toegepast om het primingsproces met betrekking tot kiemsnelheid en uniformiteit te controleren en te optimaliseren, en dat het expressieniveau in zaad van deze 5 genen een merker is voor de zaadkwaliteit.Thus, it has now been found that genes expressing differently between germination and priming can be used to control and optimize the priming process with respect to germination rate and uniformity, and that the seed expression level of these 5 genes is a marker for seed quality .

Verrassenderwijs is tevens gevonden dat ook stressbestendigheid van geprimede zaden kan worden voorspeld aan de hand van een specifiek genexpressiepatroon of genexpressieniveau van een specifiek gen.It has also surprisingly been found that stress resistance of primed seeds can also be predicted on the basis of a specific gene expression pattern or gene expression level of a specific gene.

In een eerste aspect verschaft de onderhavige uitvinding een 10 werkwijze voor het meten van de zaadkwaliteit van (of in) een monster van zaad van een plant, welke werkwijze de volgende stappen omvat: - het verschaffen van een ijklijn voor zaad van genoemde plant waarin het genormaliseerd expressieniveau van ten minste één gen dat differentieel tot expressie komt tussen priming en kieming van zaad van 15 genoemde plant is uitgezet tegen de zaadkwaliteit van zaad van genoemde plant - het meten van het genormaliseerd expressieniveau van genoemd ten minste één gen in genoemd monster, en - het aflezen van de zaadkwaliteit van genoemd monster uit 20 genoemde ijklijn.In a first aspect, the present invention provides a method for measuring the seed quality of (or in) a sample of seed from a plant, which method comprises the following steps: - providing a seed calibration line of said plant wherein normalized expression level of at least one gene that is differentially expressed between priming and germination of seed of said plant is plotted against seed quality of seed of said plant - measuring the normalized expression level of said at least one gene in said sample, and - reading the seed quality of said sample from said calibration line.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van een werkwijze volgens de uitvinding omvat de genoemde zaadkwaliteit ten minste twee parameters van zaadkwaliteit gekozen uit de groep bestaande uit de vitaliteit, kiemsnelheid, kiemenergie, en kiemkracht, onder optimale en onder 25 suboptimale (stress) condities.In a preferred embodiment of a method according to the invention, said seed quality comprises at least two parameters of seed quality selected from the group consisting of the vitality, germination rate, germination energy, and germination force, under optimum and under suboptimal (stress) conditions.

In een andere voorkeursuitvoeringsvorm van een werkwijze volgens de uitvinding omvat de genoemde zaadkwaliteit ten minste twee parameters gekozen uit vitaliteit, stressbestendigheid en vigour.In another preferred embodiment of a method according to the invention, the said seed quality comprises at least two parameters selected from vitality, stress resistance and vigor.

De onderhavige uitvinding verschaft dus werkwijzen voor de 30 gelijktijdige bepaling van het samenstel van diverse parameters die alleen 5 of in combinatie de zaadkwaliteit bepalen onder toepassing van een moleculair biologische meettechniek.The present invention thus provides methods for the simultaneous determination of the assembly of various parameters which alone or in combination determine the seed quality using a molecular biological measurement technique.

Een dergelijke werkwijze heft o.a. het probleem op dat kiemtests geen goede weergave zijn van het kiemvermogen onder 5 veldomstandigheden. Immers, de uitvinding maakt het mogelijk om het kiemvermogen onder veldomstandigheden (stressbestendigheid, vigour en vitaliteit onder stress) direct te bepalen.Such a method eliminates, inter alia, the problem that germination tests are not a good representation of the germination capacity under field conditions. After all, the invention makes it possible to directly determine the germination capacity under field conditions (stress resistance, vigor and vitality under stress).

In een ander aspect verschaft de onderhavige uitvinding de toepassing van ten minste één gen dat differentieel tot expressie komt 10 tussen priming en kieming van zaad van een plant als een indicator van zaadkwaliteit of als een marker voor de (verbetering van) zaadkwaliteit in een zaadveredelingsprogramma.In another aspect, the present invention provides for the use of at least one gene that is differentially expressed between seed priming and germination of a plant as an indicator of seed quality or as a marker for (improvement of) seed quality in a seed breeding program.

De onderhavige uitvinding verschaft dan ook tevens een werkwijze voor het selecteren van een plant in een zaadveredelingsprogramma, 15 omvattende het meten van de zaadkwaliteit van een monster van zaad van genoemde plant met een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding, en het selecteren van genoemde plant als een kandidaat ouderplant binnen het zaadveredelingsprogramma ingeval het resultaat van de meting uitwijst dat de zaadkwaliteit een gewenst niveau heeft.The present invention therefore also provides a method for selecting a plant in a seed breeding program, comprising measuring the seed quality of a sample of seed from said plant with a method according to the present invention, and selecting said plant as a candidate parent plant within the seed breeding program in case the result of the measurement shows that the seed quality has a desired level.

2020

BESCHRIJVING VAN DE FIGURENDESCRIPTION OF THE FIGURES

Figuur 1 toont een gecombineerde blok-lijn grafiek van de relatieve expressie (blok, linker y-as) van het betreffende gen (FBA) in zaad geprimed volgens één van 8 verschillende (niet-publieke) procedures ten 25 opzichte van de controles (Cl en C2) en de relatie met de geteste fysiologische parameter, in dit geval de kiemkracht bij 35 °C uitgedrukt als een percentage (lijn, rechter y-as). De Pearson correlatie is -0.88 (zie Tabel 2; FBA / KK 35).Figure 1 shows a combined block-line graph of the relative expression (block, left y-axis) of the relevant gene (FBA) in seed primed according to one of 8 different (non-public) procedures relative to the controls (C1 and C2) and the relationship with the physiological parameter tested, in this case the germination force at 35 ° C expressed as a percentage (line, right y-axis). The Pearson correlation is -0.88 (see Table 2; FBA / KK 35).

Figuur 2 toont een gecombineerde blok-lijn grafiek van de 30 relatieve expressie van FBA in zaad geprimed volgens één van 8 6 verschillende (niet-publieke) procedures ten opzichte van de controles (Cl en C2) en het percentage abnormale planten bij 15°C. De Pearson correlatie is 0.85 (zie Tabel 2; FBA / AB 15).Figure 2 shows a combined block-line graph of the relative expression of FBA in seed primed according to one of 8 different (non-public) procedures relative to the controls (C1 and C2) and the percentage of abnormal plants at 15 ° C . The Pearson correlation is 0.85 (see Table 2; FBA / AB 15).

Figuur 3 toont een gecombineerde blok-lijn grafiek van de 5 relatieve expressie van FBA in zaad geprimed volgens één van 8 verschillende (niet-publieke) procedures ten opzichte van de controles (Cl en C2) en de kiemkracht bij 25°C. De Pearson correlatie is -0.42 (zie Tabel 2; FBA / KK 25).Figure 3 shows a combined block-line graph of the relative expression of FBA in seed primed according to one of 8 different (non-public) procedures relative to the controls (C1 and C2) and the germination force at 25 ° C. The Pearson correlation is -0.42 (see Table 2; FBA / KK 25).

Figuren 4-11 tonen de Unigene sequenties van genen die 10 differentieel tot expressie komen tussen priming en kieming van tomatenzaad.Figures 4-11 show the Unigene sequences of genes that are differentially expressed between priming and germination of tomato seed.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDINGDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

De term “kiem” zoals hierin gebruikt kan verwijzen naar het 15 embryo in het rijpe zaad.The term "germ" as used herein may refer to the embryo in the mature seed.

De term “kiemplant” verwijst naar de jonge zaailing.The term "seedling" refers to the young seedling.

De termen “kiemen”, “kieming” en “ontkiemen” zoals hierin gebruikt zijn onderling uitwisselbaar en verwijzen naar het eerste stadium in de ontwikkeling van een plant uit zaad, met name het moment waarop 20 het kiemworteltje door de zaadhuid en/of pericarp breekt.The terms "germination", "germination" and "germinate" as used herein are interchangeable and refer to the first stage in the development of a seed plant, in particular the moment when the germ root breaks through the seed skin and / or pericarp .

De term “priming” verwijst naar het proces van osmoconditionering van zaad, waarbij het zaad voorafgaand aan het zaaien een (gedeeltelijke) hydratatie ondergaat waarbij wordt toegestaan dat een aantal metabole processen dat betrokken is bij de ontwikkeling van zaad tot 25 plant in gang wordt gezet, maar waarbij het proces wordt gestopt voordat de wortelpunt door de zaadhuid breekt. Het proces wordt doorgaans gestopt door droging.The term "priming" refers to the process of seed osmoconditioning, in which the seed undergoes a (partial) hydration prior to sowing, allowing a number of metabolic processes involved in the development of seed to plant to be initiated , but where the process is stopped before the root tip breaks through the seed skin. The process is usually stopped by drying.

De term “geprimed” verwijst naar zaad dat een primingsprocedure heeft ondergaan.The term "primed" refers to seed that has undergone a priming procedure.

77

De term “kiemkracht” zoals hierin gebruikt, verwijst naar het percentage zaden dat na een bepaalde periode (bijv. 7 dagen) onder optimale omstandigheden een volwaardige kiemplant geeft. Voor het bepalen van de kiemkracht is een representatief monster nodig. De monstername en de 5 bepalingsmethode voor de kiemkracht wordt in het handboek voor monstername van de International Seed Testing Association (ISTA) beschreven. De optimale temperatuur voor ontkieming van tomatenzaad is 23° C. Een hoge kiemkracht van het zaad betekent niet per definitie een hoge veldopkomst. Een betere maat daarvoor is de vigour. Onderzoek naar 10 de kiemkracht bij ongunstige omgevingscondities (bijv. een verhoogde of verlaagde temperatuur) kan informatie opleveren over de vigour van het zaad.The term "germinating power" as used herein refers to the percentage of seeds that yield a fully-fledged seedling plant under optimum conditions after a certain period (eg 7 days). A representative sample is required to determine the germination force. The sampling and the method for determining germination is described in the International Seed Testing Association's (ISTA) sampling manual. The optimum temperature for tomato seed germination is 23 ° C. A high germination force of the seed does not necessarily mean a high field emergence. A better size for that is the vigour. Research into the germination force in unfavorable environmental conditions (eg an elevated or reduced temperature) can provide information about the vigor of the seed.

De “kiemenergie” is een maat voor de snelheid van kiemen en de vitaliteit van het zaad. De kiemenergie wordt doorgaans op dezelfde manier 15 bepaald als de kiemkracht, maar dan in een kortere periode (bijv. 3 dagen). Zaad heeft een hoge kiemenergie als uit een hoog percentage van de zaden een kiemworteltje voortkomt. Kiemenergie betreft dus louter het vermogen van het zaad om te ontkiemen terwijl kiemkracht verwijst naar het vermogen van het zaad om na ontkieming goed door te groeien tot een klein 20 kiemplantje. Onderzoek naar de kiemenergie bij ongunstige of sub-optimale omgevingsomstandigheden (bijv. een verhoogde of verlaagde temperatuur) kan informatie opleveren over de stressbestendigheid van het zaad.The "germ energy" is a measure of the speed of germination and the vitality of the seed. The germinating energy is usually determined in the same way as the germinating power, but in a shorter period of time (eg 3 days). Seed has a high seed energy if a seed root emerges from a high percentage of the seeds. Germination energy therefore relates solely to the ability of the seed to germinate, while germination refers to the ability of the seed to grow well after germination into a small seedling. Research into the germ energy under unfavorable or sub-optimal environmental conditions (for example, an increased or decreased temperature) can provide information about the stress resistance of the seed.

De term “stressbestendigheid" of “stresstolerantie” zoals hierin gebruikt, verwijst naar het vermogen van zaad om tot ontkieming te komen 25 onder sub-optimale omstandigheden of na kortere of langere periodes van ongunstige omstandigheden. Meting van de stressbestendigheid van zaad kan plaatsvinden door de kiemenergie te bepalen onder sub-optimale omstandigheden.The term "stress resistance" or "stress tolerance" as used herein refers to the ability of seed to germinate under sub-optimal conditions or after shorter or longer periods of adverse conditions. Measurement of stress resistance of seed can be done by the to determine seed energy under sub-optimal conditions.

De term “kiemsnelheid” verwijst naar de periode (in dagen of 30 uren) waarbinnen tot 50% van de zaden tot ontkieming komt.The term "germination rate" refers to the period (in days or 30 hours) within which up to 50% of the seeds germinate.

88

De term ‘vigour’ wordt doorgaans gebruikt om te verwijzen naar zowel het vermogen van het zaad om te ontkiemen onder sub-optimale (stress) omstandigheden, als ook naar het vermogen van het zaad om te ontkiemen en uit te groeien tot een autotrofe zaailing onder sub-optimale 5 omstandigheden. Als zodanig omvat de term dus zowel de kiemenergie als kiemkracht onder sub-optimale omstandigheden. Er wordt met nadruk op gewezen dat de term “vigour” zoals hierin gebruikt, verwijst naar het vermogen van zaad om onder sub-optimale omstandigheden toch een goede kieming te vertonen en uit te groeien tot een autotrofe zaailing en gewas, 10 d.w.z. kiemkracht onder sub-optimale omstandigheden. Zoals hierin gebruikt verhoudt de term zich tot kiemkracht, zoals stressbestendigheid zich verhoudt tot kiemenergie.The term "vigor" is generally used to refer to both the ability of the seed to germinate under sub-optimal (stress) conditions, as well as to the ability of the seed to germinate and grow into an autotrophic seedling under suboptimal conditions. As such, the term encompasses both the germ energy and germ force under sub-optimal conditions. It is emphasized that the term "vigor" as used herein refers to the ability of seed to show good germination under sub-optimal conditions and to grow into an autotrophic seedling and crop, ie germination force below sub optimal conditions. As used herein, the term relates to germination power, as stress resistance relates to germination energy.

De term “bruikbare plant” verwijst naar een plant die geen abnormale plant is en om die reden bruikbaar is voor de commerciële teelt. 15 Een abnormale (tomaten)plant kenmerkt zich door een zaailing die zeer klein (<50% in lengte) is ten opzichte van de gemiddelde grootte, met zware schade aan enig plantendeel of zonder een zichtbaar apicaal groeipunt of enig ander kenmerk zoals vermeld in ISTA Handbook on Seedling Evaluation, Section 15, Seedling Type E - Seedling Group A-2-1-1-1.The term "usable plant" refers to a plant that is not an abnormal plant and therefore usable for commercial cultivation. An abnormal (tomato) plant is characterized by a seedling that is very small (<50% in length) relative to the average size, with severe damage to any part of the plant or without a visible apical growing point or any other characteristic as stated in ISTA Handbook on Seedling Evaluation, Section 15, Seedling Type E - Seedling Group A-2-1-1-1.

20 De term “priming” zoals hierin gebruikt verwijst naar het proces van voorkieming, en omvat een gedeeltelijke hydratatie van het zaad waarbij wordt toegestaan dat een aantal cellulaire processen betrokken bij kieming wordt gestart, echter, zonder het kiemworteltje door de zaadhuid te laten breken. Deze waterbehandeling van zaden resulteert over het 25 algemeen in een uniformere en snellere kieming. Priming kan bijvoorbeeld plaatsvinden door osmopriming, trommel-priming of matrix-priming. Osmopriming is een vorm van zaadpriming waarbij zaden worden geweekt in een beluchte oplossing met een lage waterpotentiaal. Gewoonlijk wordt een polyethyleenglycol- (PEG) of een zoutoplossing gebruikt om de 30 waterpotentiaal te verlagen en de wateropname te controleren. Hierdoor 9 kan worteldoorbraak (kieming) worden voorkomen. Trommel-priming is een methode waarbij de zaden in een draaiende trommel in beweging worden gehouden waarbij zij in contact worden gebracht met water in de vloeibare vorm of in de vorm van waterdamp. Zie bijvoorbeeld US5,119,589 en 5 US6,421,956. Doorgaans wordt na of als onderdeel van het primingsproces het zaad teruggedroogd. Matrix-priming is een methode waarbij het zaad wordt geprimed terwijl het is vermengd met een vast materiaal dat het vermogen heeft om veel water vast te houden (bijv. een slurrie van PEG en vermiculiet). Voorbeelden van deze methode worden o.a. beschreven in US 10 4,912,874 en US 5,974,734.The term "priming" as used herein refers to the pre-germination process, and includes a partial hydration of the seed allowing a number of cellular processes involved in germination to be started, however, without allowing the germ root to break through the seed skin. This water treatment of seeds generally results in a more uniform and faster germination. Priming can be done, for example, by osmopriming, drum priming or matrix priming. Osmopriming is a form of seed priming where seeds are soaked in an aerated solution with a low water potential. Usually a polyethylene glycol (PEG) or saline solution is used to lower the water potential and control the water uptake. This allows 9 root breakthrough (germination) to be prevented. Drum priming is a method in which the seeds are kept moving in a rotating drum whereby they are brought into contact with water in the liquid form or in the form of water vapor. See, for example, US 5,119,589 and US6,421,956. The seed is usually dried back after or as part of the priming process. Matrix priming is a method in which the seed is primed while being mixed with a solid material that has the capacity to retain a lot of water (eg a slurry of PEG and vermiculite). Examples of this method are described, inter alia, in US 4,912,874 and US 5,974,734.

“Genexpressie” is hierin gedefinieerd als het proces waarbij de genetische informatie die is gecodeerd in het DNA wordt omgezet in een uiteindelijk genproduct (d.w.z., een eiwit of een van verschillende vormen van RNA)."Gene expression" is defined herein as the process by which the genetic information encoded in the DNA is converted into a final gene product (i.e., a protein or one of various forms of RNA).

15 Een “expressiepatroon” is een weergave van het niveau van de expressie van één of meer genen, meestal een pluraliteit van genen, doorgaans verkregen met behulp van PCR en/of microarray-gebaseerde detectiemethoden. Het expressieniveau van één of meer genen weerspiegelt de constitutie en het functioneren van de cel onder bepaalde 20 omstandigheden en verandert wanneer de cel structurele veranderingen moet ondergaan om ander cellulaire processen te kunnen ondersteunen waarbij de producten van deze genen in potentie betrokken zijn.An "expression pattern" is a representation of the level of expression of one or more genes, usually a plurality of genes, usually obtained by PCR and / or microarray-based detection methods. The level of expression of one or more genes reflects the constitution and functioning of the cell under certain conditions and changes when the cell must undergo structural changes to support other cellular processes involving the products of these genes potentially.

In principe kan ieder willekeurig plantenzaad worden toegepast in een werkwijze volgens de uitvinding. Zeer geschikt zijn gewas en 25 groentezaden, waaronder zaden van tarwe, haver, gerst, maïs, rogge, gierst, rijst, soja, raapzaad, lijnzaad (vlas), koolzaad, zonnebloem, wortel, schorseneer, pronkboon, stamboon, stokboon, sperzieboon, slaboon, tuinboon, (dop)erwt, lupine, tomaat, paprika, peper, (water)meloen, pompoen, komkommer, aubergine, courgette, ui, prei, sla, andijvie, spinazie, 30 veldsla, augurk, witte kool, rode kool, savooie kool, spitskool, Chinese kool, 10 paksoi, sluitkool, bloemkool, spruitkool, suikerbiet, biet, kohlrabi, cichorei, witlof, artisjok, asperge, broccoli, knolselderij, bleekselderij, radijs, gras en kruiden. Een plantenzaad is bij voorkeur een zaad van tomaat (Solarium lycopersicum) of paprika (Capsicum spp.).In principle, any plant seed can be used in a method according to the invention. Very suitable are crop and vegetable seeds, including seeds of wheat, oats, barley, maize, rye, millet, rice, soy, rapeseed, linseed (flax), rapeseed, sunflower, carrot, salsify, runner bean, stud bean, French bean, green bean, green bean, broad bean, (cap) pea, lupine, tomato, pepper, pepper, watermelon, pumpkin, cucumber, eggplant, zucchini, onion, leek, lettuce, endive, spinach, lamb's lettuce, gherkin, white cabbage, red cabbage , savoy cabbage, pointed cabbage, Chinese cabbage, bok choy, head cabbage, cauliflower, Brussels sprouts, sugar beet, beetroot, kohlrabi, chicory, chicory, artichoke, asparagus, broccoli, celeriac, celery, radish, grass and herbs. A plant seed is preferably a seed of tomato (Solarium lycopersicum) or bell pepper (Capsicum spp.).

5 Een werkwijze volgens de uitvinding omvat de meting aan een monster zaad van een gen dat differentieel tot expressie komt tussen priming en kieming. Een dergelijk gen kan geschikt worden gevonden door het expressieprofiel tijdens priming (bijv. aan zaden die priming ondergaan of aan geprimede zaden) en het genexpressieprofiel tijdens kieming (bijv.A method according to the invention comprises the measurement on a sample seed of a gene that is differentially expressed between priming and germination. Such a gene can be found suitably by the expression profile during priming (e.g. to seeds undergoing priming or to primed seeds) and the gene expression profile during germination (e.g.

10 aan ontkiem(en)de zaden) te meten. Genen die wel tijdens kieming en niet tijdens priming, of vice versa, tot expressie komen, worden differentieel tot expressie gebracht volgens de definities van de onderhavige uitvinding.10 to measure germination (s). Genes that are expressed during germination and not during priming, or vice versa, are differentially expressed according to the definitions of the present invention.

In tomaat zijn diverse genen gevonden die differentieel tot expressie komen tussen priming en kieming van zaad. Een groot aantal 15 hiervan is zeer goed toepasbaar in een werkwijze volgens de uitvinding omdat zij een bewezen correlatie vertonen met één of meer parameters van zaadkwaliteit. Bij voorkeur omvat een gen waarvan de expressie wordt bepaald een sequentie gekozen uit één van SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 en 15, of een homoloog daarvan. Een homoloog heeft een identiteit met de 20 gensequentie van meer dan 80%, bij voorkeur meer dan 85%, met grotere voorkeur meer dan 90%, met de sequentie van één van SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 en 15.Various genes have been found in tomato that are differentially expressed between priming and seed germination. A large number of these are very well applicable in a method according to the invention because they show a proven correlation with one or more parameters of seed quality. Preferably, a gene whose expression is determined comprises a sequence selected from one of SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 15, or a homologue thereof. A homologue has an identity with the gene sequence of more than 80%, preferably more than 85%, more preferably more than 90%, with the sequence of one of SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 15.

De sequenties van SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 en 15 zijn ieder afzonderlijk zogenaamde Unigene sequenties, hetgeen inhoudt dat deze 25 afzonderlijke sequenties in een pluraliteit van gensequenties van verschillende origine (bij voorkeur wel hetzelfde soort organisme, bijv. tomaat) voorkomen, welke gensequenties gemeenschappelijk hebben dat zij coderen voor een specifiek genproduct. Unigene sequenties zijn cDNA sequenties afkomstig van mRNA, hetgeen betekent dat hierin slechts een 30 deel van het gen wordt weerspiegeld.The sequences of SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 15 are each individually so-called Unigene sequences, which means that these separate sequences occur in a plurality of gene sequences of different origins (preferably the same type of organism, e.g. tomato) , which gene sequences have in common that they encode a specific gene product. Unigene sequences are cDNA sequences from mRNA, which means that only part of the gene is reflected herein.

11 SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 en 15 staan voor de volgende eiwitten: histone Hl.41 (HIST; vertegenwoordigd door SEQ ID NO. 1); metallothionein-like protein (MTLP; vertegenwoordigd door SEQ ID NO. 3); fructose-bisphosphate aldolase (FBA; vertegenwoordigd door SEQ ID 5 NO. 5); Acidic 26 kDa endochitinase precursor (AEP; vertegenwoordigd door SEQ ID NO. 7); putative glutathione S-transferase (PGST; vertegenwoordigd door SEQ ID NO. 9); late-embryogenesis protein homolog (LEA; vertegenwoordigd door SEQ ID NO. 11); Protein NP24 precursor (Pathogenesis-related protein PR P23) (NP24; vertegenwoordigd door SEQ 10 ID NO. 13) en unknown protein (UP; vertegenwoordigd door SEQ ID NO.11 SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 15 represent the following proteins: histone H.14 (HIST; represented by SEQ ID NO. 1); metallothionein-like protein (MTLP; represented by SEQ ID NO. 3); fructose bisphosphate aldolase (FBA; represented by SEQ ID 5 NO. 5); Acidic 26 kDa endochitinase precursor (AEP; represented by SEQ ID NO. 7); putative glutathione S-transferase (PGST; represented by SEQ ID NO. 9); late embryogenesis protein homolog (LEA; represented by SEQ ID NO. 11); Protein NP24 precursor (Pathogenesis-related protein PR P23) (NP24; represented by SEQ 10 ID NO. 13) and unknown protein (UP; represented by SEQ ID NO.

15) (een onbekend eiwit dat sterke homologie vertoont met oxidase-like-protein).15) (an unknown protein that exhibits strong homology with oxidase-like protein).

Het gen waar van de expressie wordt gemeten in een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding is bij voorkeur het gen coderend voor 15 fructose-bisphosphate aldolase (FBA); putative glutathione S-transferase (PGST); late-embryogenesis protein homolog (LEA); Protein NP24 precursor (Pathogenesis-related protein PR P23) (NP24) en/of unknown protein (UP).The gene whose expression is measured in a method according to the present invention is preferably the gene encoding fructose bisphosphate aldolase (FBA); putative glutathione S-transferase (PGST); late embryogenesis protein homolog (LEA); Protein NP24 precursor (Pathogenesis-related protein PR P23) (NP24) and / or unknown protein (UP).

In een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding kan het expressieniveau in principe met iedere beschikbare methodiek worden 20 gemeten. Bij voorkeur wordt het expressieniveau gemeten met behulp van kwantitatieve RT-PCR, een gene-chip array, of met een in situ kleuringstechniek, met grote voorkeur met behulp van een gene-chip array. Op deze wijze kan een volledig genexpressieprofiel voor het zaad worden verkregen.In a method according to the present invention, the expression level can in principle be measured with any available method. The expression level is preferably measured using quantitative RT-PCR, a gene chip array, or with an in situ staining technique, more preferably using a gene chip array. In this way a complete gene expression profile for the seed can be obtained.

25 Een meting met een gene-chip array omvat zeer geschikt een meting aan cDNA verkregen van mRNA geïsoleerd uit een monster van het te onderzoeken zaad.A measurement with a gene chip array very suitably comprises a measurement of cDNA obtained from mRNA isolated from a sample of the test seed.

De werkwijze volgens de uitvinding omvat het produceren van een ijklijn. De ijklijn wordt geproduceerd door het expressieprofïel van een groot 30 aantal partijen zaad van uiteenlopende zaadkwaliteit aan een 12 expressieanalyse te onderwerpen. Bij voorkeur wordt uiteraard ingezoomd op de differentieel tot expressie gebrachte genen tussen priming en kieming, en behoeft dus geen volledig (genoom-omvattend) genexpressieprofiel te worden bepaald.The method according to the invention comprises producing a calibration line. The calibration line is produced by subjecting the expression profile of a large number of seed lots of varying seed quality to an expression analysis. It is of course preferable to zoom in on the differentially expressed genes between priming and germination, and thus it is not necessary to determine a complete (genome-comprising) gene expression profile.

5 In principe kan op ieder willekeurige wijze een verscheidenheid aan zaad van uiteenlopende zaadkwaliteit worden verkregen. Zeer geschikt is de zaden (uiteraard van overeenkomstige plantensoorten, bij voorkeur nog van overeenkomstige plantenvariëteiten) te onderwerpen aan een groot aantal verschillende procedures van priming. Hierdoor wordt bewerkstelligd 10 dat diverse parameters van de zaadkwaliteit (bijv. kiemenergie, stressbestendigheid, etc.) in verschillende mate in het behandelde zaad tot uiting komen.In principle, a variety of seeds of varying seed quality can be obtained in any arbitrary manner. It is very suitable to subject the seeds (of course from corresponding plant species, preferably still from corresponding plant varieties) to a large number of different priming procedures. This ensures that various seed quality parameters (e.g., germ energy, stress resistance, etc.) are expressed to varying degrees in the treated seed.

Zeer geschikt is het genormaliseerd expressieniveau zoals gebruikt in een werkwijze volgens de uitvinding het verschil in 15 expressieniveau ten opzichte van onbehandeld en niet ontkiemd zaad. Om het opstellen en het aflezen van de ijklijn te vergemakkelijken is een normalisering ten opzichte van onbehandeld (bijv. niet-geprimed) zaad zeer geschikt omdat hierdoor het effect van de behandeling als gevolg waarvan de verscheidenheid aan zaad van uiteenlopende zaadkwaliteit werd 20 verkregen (bijv. verschillen in primingsmethodes) beter kan worden bestudeerd.Very suitable is the normalized expression level as used in a method according to the invention the difference in expression level with respect to untreated and non-germinated seed. To facilitate the preparation and reading of the calibration line, a normalization with respect to untreated (eg non-primed) seed is very suitable because it results in the effect of the treatment as a result of which the variety of seeds of varying seed quality was obtained (e.g. differences in priming methods) can be studied better.

Een ijklijn voor toepassing in een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding, wordt bij voorkeur vooraf geproduceerd, zodat de bepaling van de zaadkwaliteit aan een monster slechts het meten van het 25 expressieniveau van ten minste één gen als boven gedefinieerd in een monster van te onderzoeken zaad omvat. In principe is ieder zaad geschikt om onderworpen te worden aan een werkwijze voor bepaling van de zaadkwaliteit volgens de uitvinding. Bij voorkeur heeft een monster van zaad waarvan de kwaliteit wordt bepaald een primingsbehandeling 13 ondergaan of ondergaat het op het moment van meting een primingsbehandeling.A calibration line for use in a method according to the present invention is preferably produced in advance, so that the determination of the seed quality on a sample only comprises measuring the expression level of at least one gene as defined above in a sample of test seed . In principle, any seed is suitable for being subjected to a method for determining the seed quality according to the invention. Preferably, a seed sample whose quality is determined has undergone a priming treatment 13 or undergoes a priming treatment at the time of measurement.

De werkwijze volgens de uitvinding kan zeer geschikt worden toegepast als onderdeel van een werkwijze voor het selecteren van zaad.The method according to the invention can very suitably be used as part of a method for selecting seed.

5 Een dergelijke werkwijze omvat zeer geschikt de stappen van het optioneel primen van zaad, het meten van de zaadkwaliteit van een monster van het optioneel geprimede zaad met een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding, en het selecteren van zaad met de gewenste zaadkwaliteit.Such a method very suitably comprises the steps of optional seed priming, measuring the seed quality of a sample of the optionally primed seed with a method according to the present invention, and selecting seed with the desired seed quality.

Een gewenste zaadkwaliteit kan bijvoorbeeld een hoge 10 stressbestendigheid inhouden, dit betekent dat het zaad ook een goede ontkieming vertoont in geografische gebieden met een overheersende temperatuur buiten het bereik van 20-25 °C. Dit kan voor bepaalde plantenvariëteiten, die bijvoorbeeld in mediterrane of (sub)tropische, of juist in koelere (e.g. boreale) gebieden verbouwd gaan worden van voordeel zijn. 15 Andersom kan een gewenste zaadkwaliteit inhouden dat de opbrengst aan bruikbare planten hoog is, zelf zo hoog dat vrijwel ieder uitgezaaid zaadje in een bruikbare plant resulteert. Dit kan ten koste gaan van de kiemenergie, maar zal de monetaire waarde per zaadje significant verhogen.A desired seed quality can for instance entail a high stress resistance, this means that the seed also exhibits good germination in geographical areas with a predominant temperature outside the range of 20-25 ° C. This can be advantageous for certain plant varieties that are to be grown, for example, in Mediterranean or (sub) tropical, or even cooler (e.g. boreal) areas. Conversely, a desired seed quality can mean that the yield of usable plants is high, so high that almost every seed sown results in a usable plant. This can be at the expense of the germ energy, but will significantly increase the monetary value per seed.

De onderhavige uitvinding voorziet voorts in de toepassing van ten 20 minste één gen dat differentieel tot expressie komt tussen priming en kieming van zaad van een plant, zoals hierin gedefinieerd, als een indicator van zaadkwaliteit. Met de term “indicator” wordt hierin de voorspellende waarde op de zaadkwaliteit bedoeld die het expressieniveau van geselecteerde genen kan hebben.The present invention further provides for the use of at least one gene that is differentially expressed between priming and seed germination of a plant, as defined herein, as an indicator of seed quality. The term "indicator" herein refers to the predictive value on seed quality that the expression level of selected genes may have.

25 Zo kan een gen dat differentieel tot expressie komt tussen priming en kieming zelfs worden toegepast als een marker voor de verbetering van zaadkwaliteit in een zaadveredelingsprogramma.Thus, a gene that is differentially expressed between priming and germination can even be used as a marker for improving seed quality in a seed breeding program.

De genen en hun expressieprofielen kunnen worden gebruikt om de primingsprocedure te controleren en te optimaliseren voor bijvoorbeeld 30 verbeterde stress tolerantie. De werkwijze volgens de uitvinding kan dus 14 zeer geschikt worden toegepast als onderdeel van een werkwijze voor het optimaliseren van een primingsproces, waarbij de zaadkwaliteit van zaadmonsters onderworpen aan verschillende primingsprocessen wordt bepaald en het proces dat de gewenste zaadkwaliteit oplevert als optimaal 5 wordt aangewezen. Het optimale primingsregime kan vervolgens worden toegepast in een werkwijze voor het primen van zaad.The genes and their expression profiles can be used to control and optimize the priming procedure for, for example, improved stress tolerance. The method according to the invention can thus be very suitably applied as part of a method for optimizing a priming process, wherein the seed quality of seed samples subjected to different priming processes is determined and the process that yields the desired seed quality is designated as optimal. The optimum priming regime can then be applied in a seed priming method.

Tevens kunnen optimale resultaten van priming gedurende het proces worden voorspeld. De genen die kunnen worden gevonden zoals hierin beschreven en die vervolgens volgens de onderhavige uitvinding met 10 dat doel worden toegepast maken het mogelijk om de groeikracht van zaailingen te voorspellen. Het testen van de doelmatigheid van priming gedurende de primingsprocedure zal ook de mogelijkheid van over-priming (priming voor een te lange periode, waardoor de zaadkwaliteit kan teruglopen) verminderen.Optimal priming results during the process can also be predicted. The genes that can be found as described herein and that are subsequently used in accordance with the present invention for that purpose make it possible to predict the vigor of seedlings. Testing the effectiveness of priming during the priming procedure will also reduce the possibility of over-priming (priming for too long a period that may cause the seed quality to decline).

15 De vakman zal onderkennen dat bijvoorbeeld het selecteren op tomaat met zaden met een laag niveau van fructose bisfosfaat aldolase deze zaden met een hoge kiemenergie, een hoge kiemkracht, en een hoge vitaliteit onder suboptimale (stress) condities verschaft.The person skilled in the art will recognize that, for example, tomato selection with seeds with a low level of fructose bisphosphate aldolase provides these seeds with a high germination energy, a high germination force, and a high vitality under suboptimal (stress) conditions.

Deze en andere varianten op uitvoeringsvormen als hierin 20 beschreven zijn onderdeel van de onderhavige uitvinding.These and other variants of embodiments as described herein are part of the present invention.

VOORBEELDENEXAMPLES

Voorbeeld. Bepaling van de kwaliteit van tomatenzaad.Example. Determination of the quality of tomato seed.

Introductie 25 Met behulp van differentiële genexpressie studies met DNA arrays, hieronder in meer detail beschreven, werd gevonden dat de processen van priming en kieming van tomatenzaad een verschil in 15 genen opleverde. Om de expressiepatronen van deze 15 genen te koppelen aan de zaadkwaliteit, werd zaad van 2 verschillende tomaten cultivars met in 30 totaal 8 verschillende primingmethodes behandeld. Dit zaad werd 15 vervolgens getest op verschillende parameters van zaadkwaliteit. Vergelijking van de expressieniveaus van deze 15 genen in geprimed en niet geprimed zaad met behulp van kwantitatieve RT-PCR resulteerde in 8 genen die een significante correlatie vertoonden met een of meer parameters 5 van zaadkwaliteit.Introduction 25 Using differential gene expression studies with DNA arrays, described in more detail below, it was found that the processes of priming and germination of tomato seed yielded a difference in 15 genes. To link the expression patterns of these 15 genes to seed quality, seed from 2 different tomato cultivars was treated with a total of 8 different priming methods. This seed was then tested for various seed quality parameters. Comparison of the expression levels of these 15 genes in primed and non-primed seed using quantitative RT-PCR resulted in 8 genes that showed a significant correlation with one or more seed quality parameters.

Materialen en Methoden IJklijnMaterials and Methods

Voor de ijklijn van tomatenzaad werden zaden van 2 verschillende 10 rassen Solanum lycopersicum toegepast (Velocity en Rally) en de variëteit Moneyberg.For the calibration line of tomato seed, seeds from 2 different varieties of Solanum lycopersicum (Velocity and Rally) and the Moneyberg variety were used.

MonsternameSampling

Monstername van zaad voor het testen van de zaadkwaliteit werd 15 uitgevoerd zoals beschreven in het handboek voor monstername van de International Seed Testing Association (ISTA).Seed sampling for seed quality testing was performed as described in the International Seed Testing Association's (ISTA) sampling manual.

Verschillende primingsconditiesDifferent priming conditions

Een zestal organisaties met zaad-priming faciliteiten werd 20 gevraagd de tomatenzaden te behandelen volgens interne (niet-publieke) primingsprocedures. In totaal werden één of meer van in totaal 8 verschillende primingsprocedures toegepast door de zes organisatie op 2 verschillende cultivars, hetgeen resulteerde in een totaal van 15 partijen zaad die op verschillende wijze waren geprimed. De 8 primingsprocedures 25 staan in figuren 1-3 vermeld als P1-P8. Hieronder bevonden zich zowel osmopriming- als trommelpriming-methodes. De geprimede zaden werden, als onderdeel van het primingsproces of daarop volgend, gedroogd, en de gedroogde zaden werden aan genexpressieanalyse onderworpen.Six organizations with seed-priming facilities were asked to treat the tomato seeds according to internal (non-public) priming procedures. In total, one or more of a total of 8 different priming procedures were applied by the six organizations to 2 different cultivars, resulting in a total of 15 batches of seed primed in different ways. The 8 priming procedures are listed in Figures 1-3 as P1-P8. This included both osmopriming and drum priming methods. The primed seeds were dried, as part of the priming process or subsequent, and the dried seeds were subjected to gene expression analysis.

Als controle zaden werden zaden toegepast die niet aan priming werden 30 onderworpen.As control seeds, seeds were used that were not subjected to priming.

1616

Bepaling genexpressieprofielDetermination of gene expression profile

Voor het bepalen van genexpressie werd van alle partijen zaad (geprimed niet gekiemd en onbehandeld) een genexpressieprofiel opgesteld.To determine gene expression, a gene expression profile was established for all seed lots (primed, not germinated and untreated).

5 Hiertoe werden 50 zaden gehomogeniseerd in 2 ml eppendorf tubes met 2 kwart inch metalen kogeltjes m.b.v. een dismembrator en het mRNA werd als volgt geëxtraheerd: Het homogenaat werd verdund met extractie buffer (0,18 M Tris (pH 8,2), 0,09 M LiCl, 4,5 mM EDTA, 1% SDS) en na centrifugeren (2 min. bij 10.000 x g) werd het supernatant geëxtraheerd met 10 2 ml fenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) en opnieuw gecentrifugeerd.For this purpose, 50 seeds were homogenized in 2 ml eppendorf tubes with 2 quarter inch metal balls by means of a dismbrbrator and the mRNA was extracted as follows: The homogenate was diluted with extraction buffer (0.18 M Tris (pH 8.2), 0.09 M LiCl, 4.5 mM EDTA, 1% SDS) and after centrifugation ( 2 min. At 10,000 xg), the supernatant was extracted with 2 ml of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1) and recentrifuged.

Na hernieuwde extractie met chloroform werd het RNA in het supernatant geprecipiteerd met 1/3 volume 8M LiCl. Na centrifugeren (10.000 xg gedurende 2 min) werd het pellet gewassen met 80% ethanol, opnieuw gecentrifugeerd, gedroogd en opgelost in water.After renewed extraction with chloroform, the RNA was precipitated in the supernatant with 1/3 volume of 8M LiCl. After centrifugation (10,000 xg for 2 minutes), the pellet was washed with 80% ethanol, recentrifuged, dried and dissolved in water.

15 Na DNAse behandeling van het RNA door DNAse I (BioradAfter DNAse treatment of the RNA by DNAse I (Biorad

Laboratories) volgens de voorschriften van de producent werd cDNA geproduceerd met een commerciële kit (iScript cDNA Synthesis Kit, Bio-Rad Laboratories) volgens de voorschriften van de producent en onderworpen aan expressieanalyse.Laboratories) according to the manufacturer's instructions, cDNA was produced with a commercial kit (iScript cDNA Synthesis Kit, Bio-Rad Laboratories) according to the manufacturer's instructions and subjected to expression analysis.

20 Het cDNA werd gebruikt voor het bepalen van genexpressieprofielen met behulp van een DNA chip (Toml microarray, CGEP, Boyce Thompson Institute, Cornell University, USA) en voor het bepalen van genexpressieniveaus met behulp van kwantitatieve RT-PCR (zie hieronder) 25The cDNA was used to determine gene expression profiles using a DNA chip (Toml microarray, CGEP, Boyce Thompson Institute, Cornell University, USA) and to determine gene expression levels using quantitative RT-PCR (see below).

Selectie van differentieel tot expressie gebrachte genen Protocol DNA microarray: Verkrijgen van gelabeld cDNA.Selection of differentially expressed genes Protocol DNA microarray: Obtaining labeled cDNA.

cDNA werd verkregen uit het mRNA, verkregen zoals hier boven beschreven, door binding met oligo-dT na denaturatie, en omgekeerde 30 transcriptie gedurende 2 uur bij 37 °C in een AA-dNTP mix (met daarin 17 aminoallyl-dUTP) en Superscript II Reverse Transcriptase. Na denaturatie en enkele precipitatiestappen werd het cDNA opgenomen in 0.1M Natriumcarbonaatbuffer, pH 9.3. Het cDNA werd gemengd met een oplossing van de Cy3 en Cy5 fluorescente kleurstoffen in DMSO en 30 5 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. Het gelabelde cDNA werd geprecipiteerd in 2.5M natriumacetaat en 100% ethanol bij -20 °C gedurende minimaal 2 uur. Na centrifugering in een microcentrifuge gedurende 20 minuten bij 4 °C werd het pellet gewassen in 80% ethanol en opgelost in water. Dit werd één maal herhaald.cDNA was obtained from the mRNA, obtained as described above, by binding with oligo-dT after denaturation, and reverse transcription for 2 hours at 37 ° C in an AA-dNTP mix (containing 17 aminoallyl-dUTP) and Superscript II Reverse Transcriptase. After denaturation and some precipitation steps, the cDNA was taken up in 0.1M Sodium carbonate buffer, pH 9.3. The cDNA was mixed with a solution of the Cy3 and Cy5 fluorescent dyes in DMSO and incubated for 5 minutes at room temperature. The labeled cDNA was precipitated in 2.5M sodium acetate and 100% ethanol at -20 ° C for a minimum of 2 hours. After centrifugation in a microcentrifuge for 20 minutes at 4 ° C, the pellet was washed in 80% ethanol and dissolved in water. This was repeated once.

1010

Hybridisatie met de Toml microarrayHybridization with the Toml microarray

Prehybridisatie van de microarrays werd uitgevoerd in een mix van 50% formamide, 5x Denhardt’s reagens, 5x SSC, 0.2% SDS en 0.1 mg/ml gedenatureerd zalmsperma DNA gedurende 16 uur bij 42 °C. De 15 glasplaatjes werden vervolgens gewassen in water en isopropanol, en gedroogd middels centrifugatie (5 min bij 200-300 x g). Plaats de glasplaatjes in de frames van de hybridisatietank. Voor hybridisatie werd de Ambion SlideHyb buffer voorverwarmd tot 68 °C en de benodigde waterbaden voor hybridisatie tot 50 °C. De met Cy3 en Cy5 gelabelde cDNA 20 monsters werden gemengd, gedenatureerd gedurende 10 minuten bij 95 °C en gekoeld op ijs. De warme Ambion SlideHyb buffer werd toegevoegd aan het cDNA, gecentrifugeerd (1 min bij 14000 x g) en bij 68 °C geplaatst.Prehybridization of the microarrays was performed in a mix of 50% formamide, 5x Denhardt's reagent, 5x SSC, 0.2% SDS and 0.1 mg / ml denatured salmon sperm DNA for 16 hours at 42 ° C. The 15 glass plates were then washed in water and isopropanol, and dried by centrifugation (5 min at 200-300 x g). Place the glass plates in the frames of the hybridization tank. For hybridization, the Ambion SlideHyb buffer was preheated to 68 ° C and the required water baths for hybridization to 50 ° C. The Cy3 and Cy5 labeled cDNA samples were mixed, denatured for 10 minutes at 95 ° C and cooled on ice. The warm Ambion SlideHyb buffer was added to the cDNA, centrifuged (1 min at 14000 x g) and placed at 68 ° C.

Nadat de cDNA monsters waren opgebracht vond hybridisatie plaats gedurende 18 uur bij 50 °C. Na wassing in achtereenvolgens lx SSC/0.1% 25 SDS, O.lx SSC/0.1% SDS en O.lx SSC werden de arrays gedroogd door middel van centrifugatie (5 min bij 200-300 x g).After the cDNA samples were applied, hybridization took place at 50 ° C for 18 hours. After washing in successive 1x SSC / 0.1% SDS, 0.1x SSC / 0.1% SDS and 0.1x SSC, the arrays were dried by centrifugation (5 min at 200-300 x g).

Analyse van de microarraysAnalysis of the microarrays

Na aftrek van achtergrondsignalen warden de microarray data 30 genormaliseerd en gecorrigeerd voor pin effecten, positie op de array en 18 signaalintensiteitseffecten. Alle microarrayexperimenten werden vier maal uitgevoerd waarbij 2 van de 4 herhalingen gewisselde labels (‘swapped dyes’) bevatten om te kunnen corrigeren voor mogelijke kleurstofeffecten. Experimenten werden uitgevoerd in een blokopzet. Hierdoor werd ieder 5 experiment verdeeld in twee identieke blokken met daarin de combinatie van alle proefcondities en de gewisselde labels in één enkel blok. Elk blok werd onderverdeeld in twee sub-blokken, met het label als discriminator, die elk alle proefcondities bevatten. De dataset werd verder geanalyseerd met behulp van ANOVA. Microarray analyse met daarin achtergrondcorrecties, 10 normalisatie en ANOVA werd uitgevoerd met het Genstat Release 9.2 software pakket (VSN International Ltd, Hemel Hemstead, UK) met kleine modificaties om ANOVA analyse van dubbel gelabelde microarray experimenten mogelijk te maken.After subtraction of background signals, the microarray data was normalized and corrected for pin effects, position on the array and 18 signal intensity effects. All microarray experiments were performed four times with 2 of the 4 repetitions containing swapped dyes to correct for possible dye effects. Experiments were performed in a block design. As a result, each experiment was divided into two identical blocks containing the combination of all test conditions and the changed labels in a single block. Each block was subdivided into two sub-blocks, with the label as discriminator, each containing all test conditions. The data set was further analyzed using ANOVA. Microarray analysis including background corrections, standardization and ANOVA was performed with the Genstat Release 9.2 software package (VSN International Ltd, Hemel Hemstead, UK) with minor modifications to enable ANOVA analysis of double-labeled microarray experiments.

De genen die wel tijdens priming maar niet tijdens kieming tot 15 expressie kwamen werden aangemerkt als differentieel tot expressie gebrachte genen.The genes that did express themselves during priming but not during germination were designated as differentially expressed genes.

Differentieel tot expressie gebrachte genen en zaadkwaliteitDifferentially expressed genes and seed quality

Een selectie van differentieel tot expressie gebrachte genen werd 20 verkregen door genexpressieprofielen tijdens priming te vergelijken met genexpressieprofielen tijdens kieming als bovenbeschreven. Om de expressie van deze genen te koppelen aan zaadkwaliteit werden expressie-verschillen tussen geprimed en onbehandeld zaad bestudeerd. Hierbij werd het expressieniveau van de geselecteerde genen van geprimed (niet ontkiemd) 25 zaad bepaald met behulp van kwantitatieve RT-PCR (dus op mRNA niveau) en vergeleken met het expressieniveau in onbehandeld zaad.A selection of differentially expressed genes was obtained by comparing gene expression profiles during priming with gene expression profiles during germination as described above. To link the expression of these genes to seed quality, expression differences between primed and untreated seed were studied. Hereby the expression level of the selected genes of primed (not germinated) seed was determined using quantitative RT-PCR (ie at mRNA level) and compared with the expression level in untreated seed.

De kwantitatieve RT-PCR werd uitgevoerd met behulp van gen-specifieke primers (Tabel 1) onder gebruikmaking van een commercieel verkrijgbare kit (iQ SYBR Green Supermix, Biorad Laboratories) en een 19 real time- PCR machine (MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection System, Biorad Laboratories) volgens de voorschriften van de producent.The quantitative RT-PCR was performed using gene-specific primers (Table 1) using a commercially available kit (iQ SYBR Green Supermix, Biorad Laboratories) and a 19 real-time PCR machine (MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection System, Biorad Laboratories) according to the manufacturer's instructions.

Tabel 1. Gen-specifieke primers (Forward [Fw] en Reverse [Rv]) als 5 toegepast in de kwantitatieve RT-PCR procedure.Table 1. Gene-specific primers (Forward [Fw] and Reverse [Rv]) as used in the quantitative RT-PCR procedure.

Gene__Sequence, 5'-3'_Gene__Sequence, 5'-3'_

histone Hl.41__Fw ATGGTGTCTGCTACTGCATCTGCGhistone Hl.41__Fw ATGGTGTCTGCTACTGCATCTGCG

__Rv CAAAAGCTTCCTGAAGTTTGGAGGC__Rv CAAAAGCTTCCTGAAGTTTGGAGGC

metallothionein-like protein__Fw__TGTTTCAGACCAATCAATCAT _metallothionein-like protein__Fw__TGTTTCAGACCAATCAATCAT _

__Rv CACCCCAAGCACCAAAGTCTC__Rv CACCCCAAGCACCAAAGTCTC

Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase__Fw__GGAAACGGGACCGGAGGAGAG__Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase__Fw__GGAAACGGGACCGGAGGAGAG__

__Rv CTTAGCGGTACAGATGAAAAACT__Rv CTTAGCGGTACAGATGAAAAACT

fructose-bisphosphate aldolase__Fw__CCTGGAAAGGGTATCCTTGCTGCfructose bisphosphate aldolase__Fw__CCTGGAAAGGGTATCCTTGCTGC

__Rv TCTCCTCAAACAAGATCACACCGC__Rv TCTCCTCAAACAAGATCACACCGC

expressed protein [Arabidopsis pexpressed protein [Arabidopsis p

thalianal____GTGATGGCAGAAGTAATAGGAGCGCthalianal____GTGATGGCAGAAGTAATAGGAGCGC

__Rv TTCACCACTAACCATTGTCGATCCC__Rv TTCACCACTAACCATTGTCGATCCC

heat shock cognate protein 80__Fw__AGATCCGCTTTGAGAGTTTA_ __Rv ATTGTACCCAGGTTATTCAC_heat shock cognate protein 80__Fw__AGATCCGCTTTGAGAGTTTA_ __Rv ATTGTACCCAGGTTATTCAC_

Acidic 26 kDa endochitinase precursor Fw__CAGGTACTTTAGCACAAAATGCCGGAcidic 26 kDa endochitinase precursor Fw__CAGGTACTTTAGCACAAAATGCCGG

__Rv AACCTGGAAACGAATTGGCTGC__Rv AACCTGGAAACGAATTGGCTGC

glutathione S-transferase_ Fw__ATTCTACTTCCGAATCGCCAGCCglutathione S-transferase_ Fw__ATTCTACTTCCGAATCGCCAGCC

__Rv CAGGCCTGTTCTGAAGATCAATTGG__Rv CAGGCCTGTTCTGAAGATCAATTGG

nam-like protein 10__Fw GCGGTGAGTGAAGGTGATGTAAAGCnam-like protein 10__Fw GCGGTGAGTGAAGGTGATGTAAAGC

__Rv TGGAATCGGCGTGAAGTTTCG__Rv TGGAATCGGCGTGAAGTTTCG

putative glutathione S-transferase__Fw__CCAGTGCTAATTCACAATGGCAAGCputative glutathione S-transferase__Fw__CCAGTGCTAATTCACAATGGCAAGC

__Rv GCTTTCCCCATTACTGGCATGC__Rv GCTTTCCCCATTACTGGCATGC

late-embryogenesis protein homolog__Fw__CTCTCTGCTTTCGTCTCCGACTCClate-embryogenesis protein homolog__Fw__CTCTCTGCTTTCGTCTCCGACTCC

__Rv ACCCATGAAGTCTTCACCGATTCC__Rv ACCCATGAAGTCTTCACCGATTCC

Protein NP24 precursor (Pathogenesis- PProtein NP24 precursor (Pathogenesis-P

related protein PR P23) (Osmotin)__*__GTACGCAACAACTGTCCATACACCGrelated protein PR P23) (Osmotin) __ * __ GTACGCAACAACTGTCCATACACCG

__Rv TTAAAGTTGCAACCAGTACGACCCC__Rv TTAAAGTTGCAACCAGTACGACCCC

cytochrome b6/f complex subunit VIII Fw__CACCTAGGAAGAGGCCATTGATTGGcytochrome b6 / f complex subunit VIII Fw__CACCTAGGAAGAGGCCATTGATTGG

__Rv TTGAAATTCCATTGGACTCGACTGG__Rv TTGAAATTCCATTGGACTCGACTGG

Unknown (oxidase like protein)__Fw__TGGAACATAGCTGCAATCTTGATGGUnknown (oxidase like protein) __ Fw__TGGAACATAGCTGCAATCTTGATGG

__Rv TCAAAGAACCCTGCCTCCAAACC__Rv TCAAAGAACCCTGCCTCCAAACC

36.4 kD proline-rich protein Fw___TGAAACCACCCTCTACACAACCTCC36.4 kD proline-rich protein Fw___TGAAACCACCCTCTACACAACCTCC

Rv GTTTTTGTGGGGGGTGTTTAGGGRv GTTTTTGTGGGGGGTGTTTAGGG

Het expressieniveau van deze genen tijdens priming werd genormaliseerd door de waarde van het expressieniveau in niet behandelde zaden hierin te verdisconteren. De genormaliseerde waarden werden daarna 10 gerelateerd aan de verschillende fysiologische parameters van zaadkwaliteit 20 (kiemenergie, kiemkracht, vitaliteit, stresstolerantie, vigour en vitaliteit onder stress)The expression level of these genes during priming was normalized by discounting the value of the expression level in untreated seeds herein. The normalized values were then related to the different physiological parameters of seed quality (germ energy, germination force, vitality, stress tolerance, vigor and vitality under stress)

Meting van zaadkwaliteit parameters 5 KiemkrachtMeasurement of seed quality parameters 5 Germination

De zaden werden gezaaid in kiembakken onder standaard condities, bij een temperatuur van 25 °C, een licht/donker regime van 16 uur licht / 8 uur donker, waarbij het percentage zaden dat na een periode van 7 dagen een volwaardige kiemplant gaf werd bepaald.The seeds were sown in seed trays under standard conditions, at a temperature of 25 ° C, a light / dark regime of 16 hours of light / 8 hours of darkness, the percentage of seeds giving a fully-fledged seedling plant after a period of 7 days being determined.

10 Kiemenergie10 Germ energy

Werd op dezelfde wijze bepaald als hierboven beschreven voor de kiemkracht (bij 25°C, een licht/donker regime van 16 uur licht/8 uur donker), maar evaluatie van het percentage van de zaden met een kiemworteltje werd uitgevoerd na aan periode van 3 dagen.Was determined in the same manner as described above for the germination force (at 25 ° C, a light / dark regime of 16 hours of light / 8 hours of darkness), but evaluation of the percentage of the seeds with a seed root was performed after a period of 3 days.

15 Vitaliteit15 Vitality

De zaden werden gezaaid in grond en de kwaliteit van de zaailingen werd geëvalueerd gebaseerd op hun vermogen om uit te groeien tot planten die bruikbaar zijn voor commerciële tomatenkwekers. De zaailingen zonder beschadigde plantendelen en met een grootte gelijk aan of 20 groter dan de gemiddelde grootte werden geclassificeerd als "goede planten".The seeds were sown in soil and the quality of the seedlings was evaluated based on their ability to grow into plants that are useful for commercial tomato growers. The seedlings without damaged plant parts and with a size equal to or larger than the average size were classified as "good plants".

De zaailingen die enigszins kleiner waren dan gemiddeld of met lichte beschadigingen aan de zaadlobben werden geclassificeerd als "licht beschadigde" planten. De zaailingen die zeer klein zijn waren, met zware schade aan enig plantendeel of zonder een zichtbaar apicaal groeipunt 25 werden geclassificeerd als "abnormale planten". De goede planten en de licht beschadigde planten werden beschouwd als bruikbare planten voor tomatenkwekers, terwijl de abnormale planten als niet bruikbaar werden bestempeld. Groeiomstandigheden tijdens deze test waren: substraat: cocos turf; 23 °C; 20 uur licht / 4 uur donker.The seedlings that were slightly smaller than average or with slight damage to the cotyledons were classified as "slightly damaged" plants. The seedlings that were very small, with severe damage to any part of the plant or without a visible apical growing point, were classified as "abnormal plants". The good plants and the slightly damaged plants were considered useful plants for tomato growers, while the abnormal plants were labeled as not useful. Growth conditions during this test were: substrate: coconut turf; 23 ° C; 20 hours of light / 4 hours of dark.

30 Stresstolerantie 2130 Stress tolerance 21

De stresstolerantie werd bepaald op dezelfde wijze als beschreven voor de kiemenergie behalve dat het zaad werd gehouden bij een testtemperatuur van 15 °C of 35 °C in plaats van 25 °C.The stress tolerance was determined in the same manner as described for the germination energy except that the seed was kept at a test temperature of 15 ° C or 35 ° C instead of 25 ° C.

Vigour 5 De vigour van het zaad werd bepaald op dezelfde wijze als beschreven voor de kiemkracht behalve dat het zaad werd gehouden bij een testtemperatuur van 15 °C of 35 °C in plaats van 25 °C.Vigor 5 The seed vigor was determined in the same manner as described for the germination power except that the seed was kept at a test temperature of 15 ° C or 35 ° C instead of 25 ° C.

Vitaliteit onder stressVitality under stress

De vitaliteit onder stress van het zaad werd bepaald op dezelfde 10 wijze als beschreven voor de vitaliteit, maar nu bij een temperatuur van 15 °C of 35 °C in plaats van 23 °C.The vitality under stress of the seed was determined in the same way as described for the vitality, but now at a temperature of 15 ° C or 35 ° C instead of 23 ° C.

ResultatenResults

Een 15-tal genen werd geïdentificeerd na vergelijking van 15 expressieprofielen gemeten aan zaden tijdens of na priming en gemeten aan zaden tijdens kieming. Het verschil in fysiologische toestand (zaadkwaliteit) van het zaad gedurende priming en kieming komt dus tot uiting in de expressie van deze 15 genen. Tabel 2 toont de lijst van genen die een priming-specifiek expressiepatroon laten zien in tomaat.About 15 genes were identified after comparison of 15 expression profiles measured on seeds during or after priming and measured on seeds during germination. The difference in the physiological state (seed quality) of the seed during priming and germination is thus expressed in the expression of these genes. Table 2 shows the list of genes that show a priming-specific expression pattern in tomato.

20 2220 22

Tabel 2: SGN-gegevensbestandidentificatoren en genbeschrijvingen van genen met priming-specifiek expressiepatroon (de SGN nummers corresponderen met Unigene nummers van het gegevensbestand van SOL Genomics Network, build 2 (SGN; http://sgn.cornell.edu)) SGN nummer Gen Aantal Correlaties1 SGN-U146045 histone Hl.41 ï SGN-U143485 metallothionein-like protein 1Table 2: SGN database identifiers and gene descriptions of genes with priming-specific expression pattern (the SGN numbers correspond to Unigene numbers from the SOL Genomics Network database, build 2 (SGN; http://sgn.cornell.edu)) SGN number Gen Number of Correlations1 SGN-U146045 histone Hl.41 ï SGN-U143485 metallothionein-like protein 1

SGN-U143291 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase OSGN-U143291 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase O

SGN-U 143932 fructose-bisphosphate aldolase 6 SGN-U 144750 expressed protein [Arabidopsis thaliana] 0 SGN-U143132 Heat Shock Cognate Protein 80 0 SGN-U 144297 Acidic 26 kDa endochitinase precursor 1 SGN-U145298 glutathione S-transferase nd SGN-U 144944 nam-like protein 10 nd SCN-U143283 putative glutathione S-transferase 5 SGN-U 143432 late-embryogenesis protein homolog 4SGN-U 143932 fructose bisphosphate aldolase 6 SGN-U 144750 expressed protein [Arabidopsis thaliana] 0 SGN-U143132 Heat Shock Cognate Protein 80 0 SGN-U 144297 Acidic 26 kDa endochitinase precursor 1 SGN-U145298 glutathione S-transferase n-transferase n-nase 144944 nam-like protein 10 nd SCN-U143283 putative glutathione S-transferase 5 SGN-U 143432 late embryogenesis protein homolog 4

Protein NP24 precursor (Pathogenesis-related SGN-U212928 protein PR P23) 3 SGN-U147907 cytochrome b6/f complex subunit VIII nd SGN-U143658 Unknown (oxidase like protein ?) 5 SGN-U 143835 36.4 kD proline-rich protein nd 5 ', Aantal correlaties verwijst naar significante Pearson correlaties als vermeld in tabel 3.Protein NP24 precursor (Pathogenesis-related SGN-U212928 protein PR P23) 3 SGN-U147907 cytochrome b6 / f complex subunit VIII nd SGN-U143658 Unknown (oxidase-like protein?) 5 SGN-U 143835 36.4 kD proline-rich protein nd 5 ' , Number of correlations refers to significant Pearson correlations as listed in Table 3.

Bij nadere analyse van de expressie van deze 15 genen onder ongunstige kiemomstandigheden (d.w.z. 35 en 15°C: een stress situatie voor het zaad) bleek dat voor 8 van de 11 aldus onderzochte genen een zeer 10 sterke correlaties kon worden aangetoond met parameters als vitaliteit (zowel onder optimale als suboptimale [stress] omstandigheden), stresstolerantie (KE onder sub-optimale condities), en vigour (KK onder sub-optimale condities) (Zie Tabel 3).Upon further analysis of the expression of these 15 genes under unfavorable germination conditions (ie 35 and 15 ° C: a stress situation for the seed), it was found that for 8 of the 11 genes thus examined, a very strong correlation could be demonstrated with parameters such as vitality (both under optimal and sub-optimal [stress] conditions), stress tolerance (KE under sub-optimal conditions), and vigor (KK under sub-optimal conditions) (See Table 3).

2323

Tabel 3: Pearson correlatiecoëfficiënten voor specifieke parameters van zaadkwaliteit en genexpressieprofielen van een 11 van de 15 gevonden genen die differentieel tot expressie werden gebracht als boven omschreven. Een correlatie >0.65 of <-0.65 werd als significant aangemerkt 5 (geschaduwde cellen).Table 3: Pearson correlation coefficients for specific seed quality parameters and gene expression profiles of 11 of the 15 found genes that were differentially expressed as described above. A correlation> 0.65 or <-0.65 was considered significant 5 (shaded cells).

Vitaliteit Stresstolerantie Vigour VT onder stress KE 25 KK 25 VT + |VT +/- |VT - KE 15 tKE 35 KK 15 IKK 35 AB 15 IaB 35 FBA -0.64 0 42 -0.76 0.47 0.59 -0.83 -0.84 -0.67 049 PPI 1 -0 14 -0.33 0.03 0.44 -0.28 -0.21 0.39 -0.21 -0.39 0.22 048 LËA |^^~^Ö22~||^^pÖ67~ -0.70 043 042 052 056 -0.58 -0.03 HSC802 0.08 0.16 0.20 -0.05 -0.27 013 Ö04 ÖÖ6 0.07 -0.02 -0.06 MTLP 0.44 0.27 0.55 -0.71 -0.39 053 036 030 024 -0.38 -0.15Vitality Stress tolerance Vigor VT under stress KE 25 KK 25 VT + | VT +/- | VT - KE 15 tKE 35 KK 15 IKK 35 AB 15 IaB 35 FBA -0.64 0 42 -0.76 0.47 0.59 -0.83 -0.84 -0.67 049 PPI 1 -0 14 -0.33 0.03 0.44 -0.28 -0.21 0.39 -0.21 -0.39 0.22 048 LËA | ^^ ~ ^ Ö22 ~ || ^^ pÖ67 ~ -0.70 043 042 052 056 -0.58 -0.03 HSC802 0.08 0.16 0.20 -0.05 -0.27 013 Ö04 ÖÖ6 0.07 -0.02 -0.06 MTLP 0.44 0.27 0.55 -0.71 -0.39 053 036 030 024 -0.38 -0.15

Expl3 -0.08 0.10 -0.09 0.37 -0.24 -0.21 -0.26 -0.01 -0.09 0.14 ÖÖ9 PGST -0.63 -0.50 -0.66 0.23 051 -0.73 -0.76 -0.64 ~Ό~85Γ^^·· 048 NP24 ~^Ö67 035 Ö33 046 0.53 | -0.48 -0.03 ÖLP ' 0.65 >067 0.53 0.54~Ι····Π070~ -0.26 HIST -0,09 0.10 -0.17 ÖÖ2 0.05 -0.12 -0.07 0.16 -0.23 AËP -0 31 -0.15 -033 0.16 -0.14 -0.53 -0.71 -0.33 -0.56 0.45 044Expl3 -0.08 0.10 -0.09 0.37 -0.24 -0.21 -0.26 -0.01 -0.09 0.14 ÖÖ9 PGST -0.63 -0.50 -0.66 0.23 051 -0.73 -0.76 -0.64 ~ Ό ~ 85Γ ^^ ·· 048 NP24 ~ ^ Ö67 035 Ö33 046 0.53 | -0.48 -0.03 ÖLP '0.65> 067 0.53 0.54 ~ Ι ···· Π070 ~ -0.26 HIST -0.09 0.10 -0.17 ÖÖ2 0.05 -0.12 -0.07 0.16 -0.23 AËP -0 31 -0.15 -033 0.16 -0.14 - 0.53 -0.71 -0.33 -0.56 0.45 044

Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase;2, Heat-shock cognate protein 80;3, expressed protein [Arabidopsis thaliana]; KE, Kiemenergie; KK, Kiemkracht; VT, Vitaliteit (bruikbare planten); AB, abnormale of zeer kleine zaailingen; 15, 25, 35, = 15eC, 25°C en 35"C, reap.; +, goede; +/- goede/kleinere; - abnormale of zeer kleine zaailingen; VT is omgekeerd evenredig 10 met AB, d.w.z hoge vitaliteit komt overeen met laag aantal abnormale planten. Positieve scores verwijzen naar een positieve correlatie, en vice versa voor negatieve scores.Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase; 2, Heat-shock cognate protein 80; 3, expressed protein [Arabidopsis thaliana]; KE, Germ energy; KK, Germination; VT, Vitality (usable plants); AB, abnormal or very small seedlings; 15, 25, 35, = 15 ° C, 25 ° C and 35 "C, reap .; +, good; +/- good / smaller; - abnormal or very small seedlings; VT is inversely proportional to AB, ie high vitality comes corresponds to low number of abnormal plants, positive scores refer to a positive correlation, and vice versa for negative scores.

Dus de bovenbeschreven experimenten resulteerden in duidelijke correlaties tussen enkele expressiegegevens en elk van 11 geteste 15 fysiologische parameters. Tabel 3 geeft een overzicht van het aantal fysiologische parameters dat correleert met de expressiepatronen van de betreffende genen. Deze gegevens tonen aan dat er een duidelijke correlatie bestaat tussen de genexpressie van 8 geselecteerde genen en verbeterde stress tolerantie.Thus, the experiments described above resulted in clear correlations between some expression data and each of 11 physiological parameters tested. Table 3 gives an overview of the number of physiological parameters that correlate with the expression patterns of the genes in question. These data show that there is a clear correlation between the gene expression of 8 selected genes and improved stress tolerance.

10342671034267

Claims

Method for measuring the seed quality of a seed sample of a plant, the method comprising the steps of: - providing a seed calibration line of said plant in which the normalized expression level of at least one gene expressing differentially intervenes between priming and germination of seed of said plant is plotted against the seed quality of seed of said plant, - measuring the normalized expression level of said at least one gene in said sample, and 10. reading the seed quality of said sample from said calibration line.

2. Method according to claim 1, wherein said seed quality comprises at least two parameters of seed quality selected from the group consisting of the vitality, germination rate, germination energy, and germination force, under optimal and under suboptimal (stress) conditions.

3. Method according to claim 1 or 2, wherein said seed quality comprises at least two parameters selected from vitality, stress resistance and vigor.

The method according to any of the preceding claims, wherein said normalized expression level is the difference in expression level with respect to untreated and non-germinated seed. 25

The method of any one of the preceding claims, wherein said plant is tomato (Solatium lycopersicum). 10342 67.

The method of any one of the preceding claims, wherein said at least one gene is a sequence selected from one of SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, and 15. 5

The method of any one of the preceding claims, wherein said at least one gene is the fructose bisphosphate aldolase (FBA) gene; putative glutathione S-transferase (PGST); late-embryogenesis protein homolog (LEA) and / or Protein NP24 precursor (Pathogenesis-related protein PR P23) (NP24).

A method according to any one of the preceding claims, wherein the expression level is measured by quantitative RT-PCR, a gene chip array, or by an in situ staining technique. 15

The method of any one of the preceding claims, wherein the measurement with a gene chip array comprises a measurement of cDNA obtained from mRNA isolated from said sample.

The method according to any of the preceding claims, wherein said sample undergoes or has undergone priming at the time of the measurement.

11. Use of at least one gene that is differentially expressed between priming and seed germination of a plant as an indicator of seed quality.

12. Use of at least one gene that is differentially expressed between priming and seed germination of a plant as a marker for improving seed quality in a seed breeding program.

The use according to claim 11 or 12, wherein said plant is tomato and wherein said gene is at least one gene selected from one of SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, and 15. 5

The use of claim 13, wherein said at least one gene is the fructose bisphosphate aldolase (FBA) gene; putative glutathione S-transferase (PGST); late-embryogenesis protein homolog (LEA) and / or Protein NP24 precursor (Pathogenesis-related protein PR P23) (NP24). 10

15. A method for selecting a plant in a seed breeding program, comprising measuring the seed quality of a sample of seed from said plant with a method according to any of claims 1-10, and selecting said plant as a candidate parent plant within the seed breeding program if said seed quality has a desired level. 1 0342 67