NL1033168C2 - Allelspecifieke sequentiebepaling. - Google Patents

Description

Korte aanduiding: Allelspecifieke sequentiebepaling 5 De uitvinding heeft betrekking op een nieuwe werkwijze voor het identificeren van ten minste een polymorfisme of mutatie in een bepaald gen en tevens het overeenkomstige haplotype, in het bijzonder, maar niet beperkt tot in het groeihormoongen. De uitvinding heeft eveneens betrekking op een set voor het uitvoeren 10 van bovengenoemde werkwijze, inclusief onderdelen daarvan. Voorts heeft de uitvinding betrekking op nieuwe haplotypes in het promotor-gebied van het groeihormoongen en de toepassing van deze haplotypes in de diagnose van hoge bloeddruk of beroerte.

De menselijke statuur is een uitermate complexe eigenschap, die 15 voortvloeit uit de wisselwerking van meerdere genetische en omgevingsfactoren. Omdat het reeds bekend is dat familiaire korte statuur geassocieerd is met overerfelijke mutaties van het groeihormoon (GH1) gen, lijkt het redelijk te veronderstellen dat polymorfe variatie in dit door de hypofyse tot expressie gebrachte gen ook invloed heeft op 20 de lengte van volwassenen.

Het gen dat codeert voor het hypofyse-groeihormoon (GH1) ligt op chromosoom 17q23 binnen een cluster van vijf verwante genen (Figuur 1). Van deze cluster van 66,5 kb is nu de sequentie volledig bepaald [Chen et al. Genomics 4 479-497 (1989), en zie Figuur 3]. De andere 25 loci die in de groeihormoongen-cluster aanwezig zijn, zijn twee chorion-somatomammotropinegenen (CSH1 en CSH2), een chorion-somatomammotropine-pseudogen (CSHP1) en een groeihormoongen (GH2) .

Deze genen worden van elkaar gescheiden door intergene gebieden met een lengte van 6 tot 13 kb, liggen in dezelfde transcriptionele 30 oriëntatie, worden placentaal tot expressie gebracht en worden gestuurd door een stroomafwaartse weefselspecifieke enhancer. Het GH2-locus codeert voor een eiwit dat van het van GUI-afgeleide groeihormoon verschilt in 13 aminozuurresten. Alle vijf genen vertonen een zeer op elkaar lijkende structuur met vijf exons die op identieke 35 posities worden onderbroken door korte introns, met een lengte van 260 bp, 209 bp, 92 bp en 253 bp in het geval van GH1 (Figuur 2).

Exon 1 van het GH1-gen bevat 60 bp van een 5' ongetranslateerde sequentie (ofschoon een alternatieve transcriptionele initiatieplaats 1033168 2 aanwezig is bij -54), codons -26 tot -24 en het eerste nucleotide van codon -23 komen overeen met de start van de leidersequentie van 26 aminozuren. Exon 2 codeert voor de rest van het leiderpeptide en de eerste 31 aminozuren van rijp GH. Exons 3-5 coderen voor 5 respectievelijk aminozuren 32-71, 72-126 en 127-191. Exon 5 codeert eveneens voor een 3' ongetranslateerde sequentie van 112 bp, culminerend in de polyadenyleringsplaats. Een repetitief Alu-sequentie-element is op 100 bp 3' van de Gtfl-polyadenyleringsplaats aanwezig. Ofschoon de vijf aan elkaar verwante genen in hoge mate 10 homoloog zijn wat betreft hun 5' flankerende en coderende gebieden, verschillen zij in hun 3' flankerende gebieden van elkaar.

Meerdere onderzoeken zijn ondernomen in het GHI-gen en als resultaat daarvan zijn bekende polymorfismen in de menselijke GH1-genpromotor/5' van de vijf ongetranslateerde gebieden geïdentificeerd 15 en zijn gedetailleerd beschreven in onze eveneens ingediende octrooiaanvrage WO 03/042245. Ook zijn er andere onderzoeken waarin melding is gemaakt van grote deleties in het GHl-gen, microdeleties in het GH1-gen en substituties van een enkel basenpaar. Al deze varianten van het GHl-gen zijn beschreven in onze eveneens ingediende octrooi-20 aanvrage WO 03/042245 en de vakman wordt derhalve verwezen naar deze octrooiaanvrage voor meer achtergrondinformatie wat betreft de aard van de bestaande GHl-varianten.

In onze eveneens ingediende octrooiaanvrage WO 04/057028 beschrijven we bovendien hoe variatie op 15 van de 16 bekende SNP-25 locaties binnen de proximale promotor van het GHl-qen zich manifesteren als totaal 40 verschillende promotor-haplotypes. Eveneens tonen we in dat document aan dat zes van de SNPs werken als belangrijke determinanten van GHl-genexpressie, terwijl nog eens 6 SNPs slechts een marginale rol bij GHl-genexpressie spelen.

30 Gegeven de genetische complexiteit van de menselijke statuur, hebben wij op basis van onze gegevens geconcludeerd dat bepaalde combinaties van SNPs en derhalve van haplotypes significante bepalende effecten kunnen hebben op de menselijke statuur. Bijgevolg is kennis van deze informatie bruikbaar voor het identificeren van individuen 35 die lijden aan verlaagde expressie van groeihormoon en dus ver-vangingstherapie nodig hebben, ten minste tot aan de pubertijd.

Ook kunnen polymorfismen/mutaties in het GHl-gen leiden tot metaboolsyndroom en derhalve is kennis van het GHl-haplotype 3 belangrijk voor het voorspellen en het diagnostiseren van een aanvullende klinische aandoening.

Hoge bloeddruk, of hypertensie, wordt in twee typen geclassificeerd: primaire of secundaire hypertensie. In primaire 5 hypertensie is de arteriële bloeddruk voortdurend boven 150/90 mmhg en men weet nog niet hoe dit komt, ofschoon men gelooft dat voeding, stress en leefstijl hierin een rol spelen. Secundaire hypertensie is, zoals de naam suggereert, doorgaans een symptoom van een daaraan ten grondslag liggende stoornis en is meestal het gevolg van een 10 aandoening in de nieren. Het kan echter eveneens worden veroorzaakt door feochromocytoom, door overmatige uitscheiding van gluco-corticoïden of van aldosteron, of door vernauwing van de aorta.

Zoals duidelijk moge zijn, zijn in gevallen van primaire of secundaire hypertensie de causale factoren ofwel onbekend dan wel goed 15 gedocumenteerd, maar in beide gevallen is er geen koppeling naar het groeihormoon of de receptor ervan.

Een beroerte, of een cerebrovasculair accident (CVA), vindt plaats wanneer de bloedtoevoer naar een gedeelte van de hersenen plotseling wordt verstoord door een verstopping, bloeding of anders-20 zins. De onderbreking van de bloedtoevoer door verstopping is de meest voorkomende vorm van een beroerte, welke in 90% van de gevallen plaatsvindt en wordt ischemische beroerte genoemd. Daarentegen is een beroerte door bloeding slechts voor minder dan 10% van alle beroerte-gevallen verantwoordelijk. Een tijdelijk of permanent verlies van de 25 bloedtoevoer aan de hersenen kan leiden tot celdood, waardoor een gedeelte van de hersenen niet langer meer kan functioneren. De meest voorkomende oorzaak die ten grondslag ligt aan een beroerte is een bloedstolsel dat in een slagader vrij komt en de bloedtoevoer naar de hersenen blokkeert. Bloedstolsels kunnen worden gevormd als gevolg van 30 slechte voeding, ontbrekende lichaamsbeweging, hoge bloeddruk en stress. Er is in de stand van de techniek niet gesuggereerd dat beroerte gekoppeld kan zijn aan de werking van de groeihormoon-receptor.

Als resultaat van onze onderzoeken hebben we, enigszins ver-35 rassend, ontdekt dat mutaties/polymorfismen in het groeihormoongen geïdentificeerd kunnen worden in individuen die lijden aan hoge bloeddruk of een beroerte. Wij hebben inderdaad als gevolg van onze onderzoeken nieuwe en significante haplotypes geïdentificeerd die 4 implicaties hebben voor hoge bloeddruk en beroerte. We nemen in aanmerking dat de identificatie van onze nieuwe haplotypes aangeeft dat GH-screening onvoldoende wordt toegepast als gevolg van het gebrek aan kennis van de relevantie van een mutaties/polymorfismen in het 5 GH1-gen.

We hebben derhalve een nieuwe werkwijze ontwikkeld voor allelspecifieke sequentiebepaling, die het ons mogelijk maakt het aantal en de aard van SNPs in een gegeven nucleïnezuurmolecuul te bepalen en aldus het haplotype dat daarmee overeenkomt te karakter-10 iseren. Door deze informatie is het mogelijk de aard van haplotypes te bepalen die indicatief zijn voor een bepaalde aandoening.

De uitvinding kan worden toegepast bij het bepalen van de kenmerken van elk gegeven gen met betrekking tot het identificeren van, typisch, determinatieve polymorfismen, mutaties of haplotypes.

15 In de navolgende beschrijving van de uitvinding hebben we gebruik gemaakt van onze nieuwe techniek, met name met betrekking tot het groeihormoongen. De vakman zal echter beseffen dat deze techniek kan worden toegepast voor elk willekeurig gen, vooropgesteld dat er ten minste een SNP, idealiter een die determinatief is voor een 20 bepaald te onderzoeken kenmerk, bekend is.

De uitvinding

Volgens de uitvinding wordt een werkwijze verschaft voor allelspecifieke sequentiebepaling in een testmonster van een individu, 25 waarbij het testmonster een nucleïnezuurmolecuul bevat waarvan de sequentie moet worden bepaald, omvattende: (a) blootstellen van het nucleïnezuurmolecuul aan ten minste een allelspecifieke primer, die is ingericht om aan zijn laatste 3' base te binden met ten minste een geselecteerde SNP-plaats binnen genoemd 30 molecuul, (b) het verschaffen van geschikte omstandigheden voor het plaatsvinden van transcriptie, waardoor een complementaire streng van genoemd nucleïnezuur wordt gevormd vanaf genoemde geselecteerde SNP-plaats en verder, 35 (c) het bepalen van de sequentie van genoemde complementaire streng om het bestaan van andere bekende SNPs vast te stellen, en, al dan niet 5 (d) toepassen van deze sequentie-informatie voor het bepalen van het haplotype van genoemd individu.

Volgens de uitvinding wordt derhalve een werkwijze voor allel-specifieke sequentiebepaling verschaft, omvattende de toepassing van 5 ten minste een allelspecifieke primer, die gericht is op ten minste een bekende SNP-plaats binnen een nucleïnezuurmolecuul, waarin door hybridisatie van de primer en de daaropvolgende transcriptie van een complementaire nucleinezuurstreng een nucleïnezuurstreng wordt gevormd, waarvan de sequentie kan worden bepaald, vanaf een bekende 10 SNP-startplaats, met het oog op het identificeren van het bestaan van andere, bekende SNPs binnen het getranscribeerde product.

Volgens een ander aspect van de uitvinding wordt een werkwijze verschaft voor allelspecifieke sequentiebepaling in een testmonster van een individu, waarbij het testmonster een nucleïnezuurmolecuul 15 bevat dat codeert voor het GH1-gen, of ten minste de promotor daarvan, (a) blootstellen van het nucleïnezuurmolecuul aan ten minste een allelspecifieke primer, die is ingericht om aan zijn laatste 3' base te binden met ten minste een geselecteerde SNP-plaats binnen genoemd 20 molecuul, (b) het verschaffen van geschikte omstandigheden voor het plaatsvinden van transcriptie, waardoor een complementaire streng van genoemd nucleïnezuur wordt gevormd vanaf genoemde geselecteerde SNP-plaats en verder, 25 (c) het bepalen van de sequentie van genoemde complementaire streng om het bestaan van andere bekende SNPs vast te stellen, en, al dan niet (d) toepassen van deze sequentie-informatie voor het bepalen van het haplotype van genoemd individu.

30 In een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding kunnen meerdere primers worden toegepast. De vakman zal beseffen dat de afstand tussen SNP-plaatsen en het aantal SNP-varianten het aantal primers die moeten worden toegepast kan bepalen. Wanneer er bijvoorbeeld een aantal varianten bestaat binnen een relatief korte 35 afstand, bijvoorbeeld ongeveer 30 basen, kan er meer dan één allelspecifieke sequentie nodig zijn.

6

Volgens een volgend aspect van de uitvinding wordt een allelspecifieke primer voor toepassing in bovengenoemde methodologie verschaft.

Volgens een volgend aspect van de uitvinding wordt een allel-5 specifieke primer verschaft, die een oligonucleotide omvat dat complementair is aan een gebied van een gen dat een geselecteerde SNP-plaats bevat, waarin de 3'-base van het oligonucleotide complementair is aan het SNP. De vakman zal beseffen dat de 3'-base wordt toegepast voor de identificatie van het SNP en dienst doet als startplaatsmerker 10 voor de allelspecifieke sequentiebepaling.

Samengevat, zoals de vakman zal beseffen, is de allelspecifieke sequentiebepaling volgens de uitvinding gebaseerd op de kennis van de te identificeren SNPs. Op meest geschikte wijze zal een allelspecifieke primer worden geselecteerd om te hybridiseren met een gen, 15 stroomopwaarts van een aantal SNP-plaatsen, waarbij na binding van de 3'-base van de allelspecifieke primer aan de geselecteerde SNP ervan, geschikte omstandigheden kunnen worden verschaft voor gebruikelijke transcriptie, waardoor een nucleïnezuurstreng wordt gevormd die complementair is aan het te onderzoeken gen. Deze complementaire 20 streng, waarvan de startplaats bekend is vanwege de SNP, die is geïdentificeerd door de 3'-base van de primer, maakt het mogelijk dat de sequentie van het getranscribeerde nucleïnezuur kan worden bepaald en kan worden onderzocht op stroomafwaarts gelegen SNPs.

In de hierin beschreven methodologie is allelspecifieke 25 sequentiebepaling toegepast om het groeihormoongen (GH1) te onderzoeken, en derhalve zijn de primers die hierin worden beschreven specifiek voor SNPs in dit gen en in het bijzonder het proximale promotorgebied van het groeihormoongen, en specifieke SNPs, die gelegen zijn op -308, -278, -75, -57, -6, -1 en +59 ten opzichte van 30 de transcriptionele startplaats.

Geschikte primers voor toepassing in een aspect van de uitvinding zijn derhalve de volgende 7

Tabel 1

Oligonucleotideprimersequenties voor GH2-allelspecifieke sequentiebepaling

Primer Primersequentie (5' Positie tot TSS (5' naar 3') naar 3' ) -308G voorwaarts CTATCCTGACATCCTTCG -325 tot -308 -278G voorwaarts TTGGCCACCATGGCCTGCG -286 tot -278 -75G achterwaarts CCCCACCTGTTTCTGaGC -58 tot -75 -57G achterwaarts TTCTCTCCCACTGTTGC -41 tot -57 -6A achterwaarts CCTTGGGATCCTTGAGCT +12 tot -6 -1T achterwaarts GGGCCTTGGGATCCTA +15 tot -1 +59T acherwaarts CTTACCTGTAGCCATTGCA +77 tot +59 5

De laatste, meest 3' gelegen base is SNP-allelspecifiek; een 3'mismatch is met een kleine letter weergegeven. TSS (trans-criptionele startplaats) .

De vakman zal echter beseffen dat primers voor toepassing bij 10 verschillende genen en ontworpen om met een geselecteerde SNP daarin te hybridiseren kunnen worden ontworpen met het oog op het uitvoeren van de uitvinding met betrekking tot elk willekeurig geselecteerd gen.

Volgens nog een ander aspect van de uitvinding wordt ten 15 minste een kernhaplotype verschaft, zoals is weergegeven in Tabel 2, voor het bepalen of een persoon gevoelig is voor hoge bloeddruk of een beroerte.

De kernhaplotypes waarnaar in Tabel 2 wordt verwezen omvatten de nucleïnezuurbasen op SNP-plaatsen -476, -278, -168, -57, -6 en 20 +16.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding omvat het haplotype dat wordt gebruikt voor het uitvoeren van bovengenoemde bepaling een van de "risico"haplotypes zoals is weergegeven in Tabel 2 en derhalve omvatten de haplotypes ten behoeve van het uitvoeren 25 van een bepaling met betrekking tot hoge bloeddruk CH3, CH7, CH8, CH9, CH10, CHI1 en CH12, en in het geval van het uitvoeren van een bepaling met betrekking tot een beroerte omvatten de "risico"-haplotypes een van de volgende CH2, CH7, CH9, CH10, CH11, CH13, CH15 of CH16.

8

Volgens nog een ander aspect van de uitvinding wordt een werkwijze verschaft voor het bepalen van het bestaan van, of de gevoeligheid voor hoge bloeddruk in een individu, omvattende in een testmonster van dit individu bepalen van het haplotype van het 5 promotorgebied van het GHl-qen op SNP-plaatsen -476, -278, -168, -57, -6, +16 en, wanneer willekeurig welke van de volgende haplotypes bestaat, vaststellen dat het individu een risico loopt op hypertensie:

CH3 GGTGAA

CH7 GTTGGG

CH8 GTCGGA

CH9 GTTTAA

CH10 GGTTGA

CH11 ATTGGA

CH12 GGTGAG

10 Volgens nog een ander aspect van de werkwijze wordt een werkwijze verschaft voor het bepalen van het bestaan van, of gevoeligheid voor hoge bloeddruk in een individu, omvattende, in een testmonster van genoemd individu, waarbij het testmonster een nucleïnezuurmolecuul omvat dat codeert voor ten minste een proximaal 15 promotorgebied van het groeihormoongen (GH1) van genoemd individu: (a) onderzoeken van het nucleïnezuurmolecuul op meerdere SNPs op de volgende plaatsen: -476, -278, -168, -57, -6 en +16 om het overeenkomstige haplotype te bepalen, (b) vergelijken van het geïdentificeerd haplotype met willekeurig 20 welke van de volgende: 9

CH3 GGTGAA

CH7 GTTGGG

CH8 GTCGGA

CH9 GTTTAA

CH10 GGTTGA

CH11 ATTGGA

CH12 GGTGAG

en (c) wanneer hetzelfde haplotype wordt aangetroffen, concluderen dat het individu kan lijden aan, of gevoelig is voor hoge bloeddruk.

5 In een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding is het individu van het vrouwelijk geslacht.

Volgens nog een andere voorkeursuitvoeringsvorm van een van de aspecten van de uitvinding die betrekking heeft op een werkwijze voor het bepalen van het bestaan van of gevoeligheid voor hoge bloeddruk, 10 zijn de voorkeurshaplotypes CH3, CH8 of CH12.

Volgens nog een ander aspect van de uitvinding wordt een werkwijze verschaft voor het bepalen van de aanwezigheid van of gevoeligheid voor beroerte in een individu, omvattende het bepalen, in een testmonster van het individu, het haplotype van het promotor-15 gebied van het GH1-gen op SNP-plaatsen -476, -278, -168, -57, -6 en +16 en, wanneer willekeurig welke van de volgende haplotypes optreden, vaststellen dat het individu een risico loopt op beroerte:

CH2 GTTGGA

CH7 GTTGGG

CH9 GTTTAA

CH10 GGTTGA

CH11 ATTGGA

CH13 GTCGAA

CH15 GGCGAA

CH16 GATGAA

10

Volgens nog een ander aspect van de uitvinding wordt een werkwijze verschaft voor het bepalen van het bestaan van of gevoeligheid voor beroerte in een individu, omvattende, in een testmonster van genoemd individu, waarbij het testmonster een nucleïnezuur-5 molecuul bevat dat codeert voor ten minste een proximaal promotor-gebied van het groeihormoongen (GH1) van het individu: (a) onderzoeken van het nucleïnezuurmolecuul op meerdere SNPs op de volgende plaatsen: -476, -278, -168, -57, -6 en +16 om het overeenkomstige haplotype te bepalen, 10 (b) vergelijken van het geïdentificeerde haplotype met willekeurig welke van de volgende:

CH2 GTTGGA

CH7 GTTGGG

CH9 GTTTAA

CH10 GGTTGA

CH11 ATTGGA

CH13 GTCGAA

CH15 GGCGAA

CH16 GATGAA

en (c) wanneer hetzelfde haplotype wordt aangetroffen concluderen dat 15 het individu kan lijden aan of gevoelig is voor beroerte.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding is het individu van het vrouwelijk geslacht.

In een voorkeurswerkwijze volgens een van de aspecten van de uitvinding die betrekking heeft op een werkwijze voor het bepalen van 20 het bestaan van of gevoeligheid voor een beroerte zijn de voorkeurs-haplotypes CH2, CH13, CH15 of CH16.

Volgens nog een ander aspect van de uitvinding wordt voorzien in de toepassing van een of meer van de volgende kernhaplotypes:

CH7 GTTGGG

11

CH9 GTTTAA

CH10 GGTTGA

CH11 ATTGGA

in de diagnose of behandeling van hoge bloeddruk of beroerte.

De vakman zal beseffen dat vanwege het feit dat haplotypes CH7, CH9, CH10 en CH11 geassocieerd zijn met hoge bloeddruk of 5 beroerte, hieruit volgt dat wat betreft hoge bloeddruk haplotypes CH3, CH8 en CH12 bijzonder onderscheidend zijn voor hoge bloeddruk, en dat met betrekking tot beroerte haplotypes CH2, CH13, CH15 en CH16 bijzonder onderscheidend voor beroerte zijn.

Volgens nog een ander aspect van de uitvinding wordt, in het 10 GH1-gen, een nieuw haplotype verschaft, dat een haplotype omvat, gekozen uit de volgende groep:

CH7 GTTGGG

CH9 GTTTAA

CH10 GGTTGA

CH11 ATTGGA

Volgens nog een ander aspect van de uitvinding wordt een werkwijze verschaft voor het bepalen van het bestaan van of 15 gevoeligheid voor hoge bloeddruk of beroerte in een individu, omvattende, in een testmonster van het individu, waarbij het testmonster een nucleïnezuurmolecuul bevat dat codeert voor ten minste het proximale promotorgebied van het groeihormoongen (GH1) van het individu: 20 (a) onderzoeken van genoemd nucleïnezuurmolecuul op meerdere SNPs op de volgende plaatsen: -476, -278, -168, -57, -6 en +16 om het overeenkomstige haplotype te bepalen, (b) vergelijken van het geïdentificeerde haplotype met willekeurig welke van de volgende:

CH7 GTTGGG

12

CH9 GTTTAA

CH10 GGTTGA

CH11 ATTGGA

en (c) wanneer hetzelfde haplotype wordt aangetroffen, concluderen dat het individu kan lijden aan of gevoelig is voor hoge bloeddruk of 5 beroerte.

Volgens nog een aspect van de uitvinding wordt een werkwijze verschaft voor het bepalen van de aanwezigheid van of gevoeligheid voor hoge bloeddruk of beroerte in een individu, omvattende het in een testmonster van genoemd individu bepalen van het haplotype van 10 het promotorgebied van het GHI-gen op SNPs-plaatsen: -476, -278, -168, -57, -6 en +16, en, wanneer willekeurig welke van de volgende haplotypes optreedt, vaststellen dat het individu een risico loopt op hoge bloeddruk of beroerte:

CH7 GTTGGG

CH9 GTTTAA

CH10 GGTTGA

CH11 ATTGGA

15

Subjecten

Alle subjecten waren van het Kaukasische ras. Toestemming voor de onderzoeken werd verkregen van de plaatselijke regionale ethische commissies en van elke deelnemer werd een schriftelijke toestemming 20 verkregen.

Onderzoek 1: Totaal 2.886 gezonde volwassenen (1630 mannen, gemiddelde leeftijd 44,9=/-22,4 jaar; 1256 vrouwen, gemiddelde leeftijd 39,4+/-19,5 jaar) werden willekeurig gekozen uit een algeme-25 ne populatie en werden onderzocht als deel van een lopend Anglo-Cardiff samenwerkingsonderzoek (ACCT) (McEniery et al., 2005). Individuen met diabetes, hypercholesterolemie (serum cholesterol >6,5 mmol/1) of met een historie van hart- en vaatziekten (gedefinieerd 13 door klinische historie of op basis van onderzoek) werden van de analyse uitgesloten, evenals subjecten die een medicatie ontvingen tegen hart- en vaatziekten. Bloeddruk, arteriële stijfheid en serum-merkers werden gemeten en de aangeven status roker/niet-roker werd 5 genoteerd.

Onderzoek 2: 111 opeenvolgende patiënten met hoge bloeddruk (58 mannen, 53 vrouwen, gemiddelde leeftijd 60,0+/-15,1 jaar, gebied 19-83) werden gerekruteerd van het Addenbrooke's Hospital, Cambridge. De 10 merkers bloeddruk, arteriële stijfheid en serum werden gemeten en de aangegeven status roker/niet-roker werd genoteerd. Totaal werden eveneens 21 controles (59 mannen, 62 vrouwen) geselecteerd welke met de patiënten overeenstemmen wat betreft geslacht, leeftijd (gemiddelde leeftijd 60,9+/-13,3 jaar, gebied 19-83) en de roker-15 status. Patiënten werden gerekruteerd uit Addenbrooke's Hospital,

Cambridge; secondaire oorzaken van hoge bloeddruk werden uitgesloten en minder dan 10% van de patiënten ondergingen een anti-hoge bloeddrukbehandeling.

20 Onderzoek 3: 155 beroerte-patiënten van het blanke ras (Caucasisch) (73 mannen, 78 vrouwen, van 4 is het geslacht niet genoteerd, 31 rokers, 116 niet-rokers, bij 8 patiënten was de rokerstatus niet genoteerd; gemiddelde leeftijd 72,1±11,7 jaar) werden gerekruteerd uit de Nottingham Stroke service. Totaal 158 plaatselijke controles 25 werden ingepast wat betreft leeftijd, geslacht en rokertoestand (76 mannen, 82 vrouwen, 35 rokers, 123 niet-rokers; gemiddelde leeftijd 71,8±3,5 jaar). Deze individuen werden gekozen uit een grotere groep die was gerekruteerd voor een eerder onderzoek (Britton et al., 1994) .

30

Haemodynamische metingen

De perifere bloeddruk werd opgenomen in de brachiale slagader van de dominante arm onder toepassing van een gevalideerde oscillome-trische techniek (HEM-705CP; Omron Corporation, Japan; O'Brien et 35 al., 1996). De radiale slagaderlijke druk-golfvormen werden verkregen met een micromanometer met hoge betrouwbaarheid (SPC-301; Millar Instruments, Texas, USA) van de pols, en op basis hiervan werd een overeenkomstige centrale slagaderlijke druk-golfvorm gevormd onder 14 toepassing van een gevalideerde overdrachtsfunctie (Sphygmocor; AtCor Medical, Sydney, Australia: Karamonoglu et al., 1993, Segers et al., 2001, Pauca et al., 2001) zoals eerder is beschreven (Wilkinson et al·., 1998). De verhogingsindex (Alx), een samengestelde maat voor 5 systemische arteriële stijfheid, golfreflectie en hartritme werd bepaald onder toepassing van de integrale software (Safar et al., 2000; Rashid et al., 2003). De pulsgolfsnelheid (PWV) van de aorta werd gemeten onder toepassing van hetzelfde apparaat door achtereenvolgens de carotide met ECG-poort en de femorale arteriedruk-golfvor-10 men op te nemen (Wilkinson et al., 1998), en de brachiale PWV van carotide en radiale slagaders (Wilkinson et al., 1998). Alle metingen werden in duplo uitgevoerd, en de gemiddelden van de twee waarden werden gebruikt voor de daaropvolgende analyse.

15 Laboratoriummetingen

De totale serumwaarden voor glycerol, triglyceriden, glucose, geglycosyleerd hemoglobine en C-reactief eiwit werden bepaald onder toepassing van standaard methodologieën in een geaccrediteerd laboratorium.

20

Genetische analyse

Genomisch DNA werd geïsoleerd uit veneus bloed onder toepassing van standaardwerkwijzen. Het bepalen van het genotype werd uitgevoerd aan subjecten van in onderzoek 2 en 3 onder toepassing van 25 gepubliceerde primers zoals hieronder wordt beschreven.

Aantoning van polymorfismen binnen het GHl-gen

Fragmenten van 3,2 kb die specifiek waren voor het GHl-gen werden met behulp van PCR vermeerderd uit elke patiënt en controle-30 individu. Het volledige coderende gebied, introns, promotor en 3'- ongetranslateerd gebied werden op directe wijze aan sequentiebepaling onderworpen op een Applied Biosystems 3100 DNA Genetic Analyzer zoals eerder is beschreven (Horan et al., 2003; Millar et al., 2003). Ongeveer 20% van de geteste individuen bleken homozygoot te zijn voor 35 alle 15 promotor-SNPs die werden bestudeerd, in welk geval de identiteit van de promotor-haplotypes vanaf het begin duidelijk was. Voor heterozygoten werden de GHl-genfragmenten van 3,2 kb gekloneerd en één kloon werd aan een sequentiebepaling onderworpen om op 15 ondubbelzinnige wijze de twee GH1 -promotor haplotypes te identificeren.

GH1 promotorhaplotype-identificatie door allelspecifieke 5 sequentiebepaling (ASS) PCR-vermeerdering en sequentiebepaling van een GHl-genspecifiek fragment van 3,2 kb werden zoals hierboven beschreven uitgevoerd. Haplotypes werden geïdentificeerd door allelspecifieke sequentiebepaling (ASS) van het GH1-proximale promotorgebied met een 10 BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems,

Warrington, UK) en een ABI 3100 DNA genetische analyseinrichting. De sequentiebepalingsreacties werden als volgt uitgevoerd: 30 cycli van 96°C gedurende 30 seconden en 72°C gedurende 4 minuten. De oligo-nucleotideprimers die voor ASS werden gebruikt waren zodanig ontworpen 15 dat deze basen omvatten die zich direct stroomopwaarts of stroomafwaarts van een SNP plaats bevonden, waarbij de meest 3' liggende base allelspecifiek was (Tabel 1).

De doelmatigheid van ASS werd bepaald door blinde analyse van 50 controle DNA-monsters. PCR en sequentiebepalingen werden uitgevoerd om 20 het genotype van elk monster te identificeren. Dezelfde PCR-fragmenten werden vervolgens onderworpen aan (i) kloneren en sequentiebepaling en (ii) ASS in zowel 5' als 3' richtingen om van de 100 allelen de promotorhaplotypes op te leveren. Een perfecte concordantie van haplotype-identificatie werd verkregen, maar ASS bleek aanzienlijk 25 sneller te zijn dan traditionele klonering en sequentiebepaling.

Inderdaad maakt ASS het kloneren nagenoeg overbodig. Aldus gevalideerd werd ASS gebruikt om de GHl-promotor-haplotypes te bepalen van beroertepatiënten en de bijpassende controles.

30 GH1 -promotorhaplotype-identificatie door allelspecifieke sequentiebepaling (ASS)

Gifl-promotorhaplotype-identificatie werd uitgevoerd met behulp van de nieuwe ASS-techniek onder gebruikmaking van zeven onderscheidenlijke SNPs van de 16 eerder geïdentificeerde SNPs 35 (Giordano et al., 1997; Wagner et al., 1997). Directe sequentiebepaling van het oorspronkelijke PCR-product van 3,2 kb maakte een eerste identificatie van het gecombineerde genotype (beide allelen) mogelijk, en deze informatie werd gebruikt om ASS-primers te 16 selecteren om GHl-alleldiscriminatie mogelijk te maken.

Oorspronkelijke PCR-producten werden vervolgens opnieuw aan een sequentiebepaling onderworpen onder toepassing van de geschikte allelspecifieke primers, die gericht waren op SNP-posities -308G, -5 278G, -75G, -57G, -6A ,-lT en +59T (Tabel 1). Met deze primers was reproduceerbare haplotype-identificatie mogelijk. In de meeste gevallen was slechts een primer nodig om het promotor-haplotype af te leiden. Wanneer genotype-analyse SNP-variatie aan het licht bracht zowel stroomopwaarts (tussen -476 tot -339) en op positie -308, samen 10 met de variatie op posities -75, -57, -6, -1 of +59, waren twee sequentiebepalingsreacties per monster nodig (1 voorwaarts en 1 achterwaarts) om beide haplotypes af te leiden. Wanneer SNP-variatie slechts werd aangetroffen tussen posities -6 en +25, kon ASS niet worden toegepast om haplotypes af te leiden als gevolg van het feit 15 dat deze SNPs zeer dicht bij elkaar zijn gelegen. In deze gevallen moest het aanvankelijke PCR-product worden gekloneerd en aan een sequentiebepaling worden onderworpen om de promotor-haplotypes te identificeren. SNP-varianten die tussen posities -6 en +25 optraden werden echter slechts aangetroffen met een frequentie van ~l-5%. Aldus 20 is de toepassing van ASS-methodologie geschikt voor het succesvol identificeren van minimaal 95% van alle waargenomen GHl-promotor-haplotypes.

Gtfl-promotor-haplotypering voor 97 hoge bloeddruk patiënten en 112 bijpassende controles, en voor 154 beroerte patiënten en 152 bij 25 bijpassende controles, werd uitgevoerd zoals beschreven door Horan et al. (2003). Een kleiner aantal monsters bleek voor PCR-vermeerdering refractoir te zijn en werden derhalve uitgesloten. Omdat er tot nu toe veel meer dan 100 GHl-promotorhaplotypen zijn geïdentificeerd (niet gepubliceerde gegevens), hebben we ervoor gekozen slechts de "kern-30 haplotypes" in aanmerking te nemen, die 17 verschillende combinaties van de zes "sleutel-SNPs" omvatten, zoals geïdentificeerd door Horan et al. (2003) als belangrijkste determinanten van GHI-genexpressie. De kernhaplotypes waarnaar in bovengenoemde tabel wordt verwezen omvatten het nucleïnezuur op de SNP-plaats -476, -278, -168, -56 (bew: -57), -6 35 en +16. Vergelijking met behulp van een permutatietest bracht aan het licht dat de kernhaplotype-spectra van het waargenomen geval en de controle (Tabel 3) significant van elkaar verschilden in beide onderzoeken 2 en 3 (hoge bloeddruk: X2 = 18,861, empirisch P = 0,0376; 17 beroerte: X2 = 23,829, empirisch P - 0,0273). Opname van het putatief functionele intron 4 (1169-T/A) polymorfisme (Hasegawa et al., 2000) in de vergelijking van de patiënten met hoge bloeddruk en de controles verlaagde de significantie van het waargenomen haplotypefrequentie-5 verschil (X2 = 23,591, empirisch P= 0,1217), hoogstwaarschijnlijk omdat het intron 4 1169-T/A-polymorfisme zelf niet met hoge bloeddruk is geassocieerd (genotype-gebaseerd X2 = 1,723, 2 d.f., P = 0,423). Scheiding van de kernhaplotype-analyse op geslacht leverde een consistent sterkere fenotype-associatie op in vrouwen (hoge bloeddruk: 10 X2 = 20,390, empirisch P = 0,0102; beroerte X2 = 18,500, empirisch P = 0,1144), dan in mannen (hoge bloeddruk: X2 = 11,751, empirisch P = 0,1968; beroerte X2 = 9,436, empirisch P = 0,6980).

Voor verdere analyse werden kernhaplotypes met een odds ratio van meer dan die van het modale haplotype Hl geclassificeerd als 15 "risicovol" (zie Tabel 2). In overeenstemming met de geslachtsverschillen die zijn waargenomen op het niveau van kernhaplotype, waren de odds ratio's (OR) die waren geassocieerd met de aanwezigheid van ten minste een GHl-promotor-risicohaplotype significant groter dan eenheid in vrouwen (hoge bloeddruk: OR = 2,87, 95% Cl: 1,21-6,91; 20 beroerte OR = 2,14, 95% Cl: 1,07-4,28), maar niet in mannen (hoge bloeddruk: OR = 1,64, 95% Cl: 0,68-3,97; beroerte OR = 1,51, 95% Cl: 1,75-3,05) .

Meetresultaten van lengte en centrale systolische bloeddruk (CSBP) waren beschikbaar voor de subjecten die in het hoge bloeddruk-25 onderzoek waren onderzocht. In overeenstemming met de aanvankelijke resultaten die waren verkregen van het Anglo-cardiff-samenwerkings-onderzoek (onderzoek 1, zie hierboven) bleken de twee parameters significant met elkaar te zijn gecorreleerd, zowel in patiënten (Spearman waarde-correlatiecoëfficiënt r = -0,2736, P = 0,0013) als in 30 controles (r = -0,1859, P = 0,0255). Deze negatieve correlatie was echter veel sterker in individuen die ten minste een GH1-promotor risicohaplotype droegen (patiënten: r = -0,3489, P = 0,0014; controles: r = -0,4751, P < 0,0001), dan in die, zonder risico haplotype (patiënten: r = -0,1605, P = 0,1356; controles: r = -0,0575, 35 P = 0,3181) .

In dit onderzoek hebben we een inverse correlatie waargenomen tussen de lengte en de centrale systolische bloeddruk in zowel patiënten met hoge bloeddruk als in normale controles (NB: een 18 dergelijke correlatie werd echter niet waargenomen met de perifere systolische bloeddruk) . Gfil-kernpromotorhaplotypes bleken significant te verschillen, niet allen tussen patiënten met hoge bloeddruk en controles, maar eveneens tussen patiënten met een beroerte en 5 controles. Voorts werden vier kernpromotorhaplotypes (CH7, CH9, CH10 en CH11) consistent als "risicovol" geclassificeerd, voor zowel patiënten met hoge bloeddruk als beroertepatiënten. Het is intrigerend dat de associatie tussen GHl-promotorhaplotype en het risico voor hoge bloeddruk en beroerte veel hoger was in vrouwen dan in mannen.

10 Groeihormoondeficiënte vrouwen met verlaagde hypofysefunctie manifesteren eveneens grotere verstoringen in lichaamsverhoudingen dan mannen in vergelijking met bijpassende controles (Beshyah et al., 1995; Abdu et al., 2001), in het bijzonder een grotere toename in de middel-tot-heupverhouding en de lichaamsgewichtindex. De middel-tot-15 heupverhouding is een merker voor viscerale vetophoping en is geassocieerd met een verhoogd vasculair ziekte- en sterftecijfer. (Larsson et al., 1984). Bovendien correleert de middel-tot-heupverhouding sterk en omgekeerd-evenredig met HDL-cholesterol-hoeveelheden in hypopituïtarisme (Abdu et al., 2001), een bevinding 20 die suggereert dat het overmatige voorspelde vasculaire risico in groeihormoondeficiënte vrouwen met hypopituïtarisme voornamelijk een reflectie kan zijn van de grotere toename in centraal vet in vrouwen in vergelijking tot mannen. De metabole en vasculaire gevolgen van groeihormoondeficiëntie zouden derhalve meer in vrouwen dan in mannen 25 optreden. De geslachtsspecifieke GHl-haplotype-associaties met hoge bloeddruk en beroerte zoals hier beschreven zijn in brede zin consistent met deze gevolgtrekking. Het is aantrekkelijk om te speculeren dat wisselwerkingen met geslachtssteroïden voor deze verschillen verantwoordelijk zijn. Inderdaad is groeihormoon-30 vervangingstherapie in vrouwen die eveneens geslachtssteroïden ontvangen afhankelijk van de toedieningsroute van de geslachtssteroïde namelijk oraal of via een pleister op de huid.

Bovengenoemde inverse correlatie tussen lengte en centrale systolische bloeddruk was veel sterker in individuen die ten minste 35 een GHl-promotor-risicohaplotype droegen dan in die, zonder een dergelijk haplotype. Het lijkt er dus op dat Gffl-genotype een risicofactor voor hoge bloeddruk behelst, die ofwel onafhankelijk is van, of een wisselwerking heeft met de lengte. Interessanterwijs is een sterke 19 associatie gevonden tussen de aanwezigheid van ten minste een GH1-risicohaplotype en een familiehistorie van beroerte bij jonge leeftijd. Omdat de etiologie van beroerte multifactorieel is, met een sterke, echter heterogene, overerfelijke component, is het zeer 5 waarschijnlijk dat de overerving van een GHl-risicohaplotype verantwoordelijk is voor een aanzienlijk gedeelte van familiale gevallen.

20

Tabel 2

Frequentie van GHl-promotor-kernhaplotypes uit de twee gevallen-controle studies

Haplotype- Kern- Hoge bloeddruk Beroerte

nummer haplotype3 Patiënten Controles RH Patiënten Controles RH

"CHl GGTTAA 63 ~8Ö O IÓ8 ~97 Ö CH2 GTTGGA ~55 ΎΪ Ö *84 ~ïl + CH3 GGTGAA "42 "33 "+ TÖ 61 Ö

CH4 GTTGAA 8 17 "Ö 14 16 O

CH5 GGTGGA 5 "Ï2 Ö Ï8 "23 Ö CH6 GTTTGA 5 6 Ö 4 7 Ö CÏÏ7 GTTGGG 6 ï + ~9 1 "+ CH8 GTCGGA 4 4 ~ 5 18 "5 CH9 GTTTAA 2 Ö + 4 Ö "+ CH10 GGTTGA 2 Ö + 4 ï "+ CH11 ATTGGA I Ö "+ 4 ~2 "+ CHl 2 GGTGAG ï Ö + Ö Ö n.a.

CH13 GTCGAA Ö Ö n.a. ï Ö ~+ CH14 GTCGGG Ö Ö n.a. "Ö Ö n.a.

CHl 5 GGCGAA Ö Ö n.a” ï Ö "+ CH16 GAT G AA "Ö "Ö n.a. ï Ö +

CHl 7 GTTGAG Ö Ö n.a. ï ï O

Totaal Ï94 124 308 3ÏÏ4 5 RH: risicohaplotypeclassificatie (+: ja, O: nee), a: volgorde van SNPs volgens tabel 4 van Horan et al. (2003); n.a.: niet van toepassing.

21

Referenties function and reduces calculated absolute and relative coronary risk Clin. Endocrinol. 61: 387-393.

Beshyah SA, Freemantle C, Thomas E, Rutherford Op Page B, Murphy M, Johnston DG (1995) Abnormal body composition and reduced bone mass in growth hormone deficient hypopituitary adults. Clin Endocrinol. 42:179-189.

Britton J, Pavord I, Richards K, Wisniewski A, Knox A, Lewis S, Tattersfield A, Weiss S. (1994) Dietary magnesium, lung function, wheezing, and airway hyperreactivity in a random adult population sample. Lancet 344: 357-362.

Giordano M, Marchetti C, Chiorboli E, Bona G, Momigliano Richiardi P. (1997) Evidence for gene conversion in the generation of extensive polymorphism in the promoter of the growth hormone gene. Hum.. Genet. 100: 249-255.

Hasegawa Y, Fujii K, Yamada M, Igarashi Y, Tachibana K, Tanaka T, Onigata K, Nishi Y, Kato S, Hasegawa T. (2000) Identification of novel human GH-1 gene polymorphisms that are associated with growth hormone secretion and height.. J. Clin, Endocrinol. Metab 85:1290-1295.

Horan M, Millar DS, Hedderich J, Lewis G, Newsway V, Mo N, Fryklund L, Procter AM, Krawczak M, Cooper DN. (2003) Human growth hormone 1 (GH1) gene expression is influenced in a complex haplotype-dependent fashion by polymorphic variation in both the proximal promoter and the locus control region . Hum. Mutation 21: 408-423.

Karamanoglu M, O'Rourke MF, Avolio AP, Kelly RP. (1993) An analysis of the relationship between central aortic and peripheral upper limb pressure waves in man Eur. Heart J. 14:160-167.

Larsson B, Svardsudd K, Welin L, Wilhelmsen L, Bjorntorp P, Tibblin G. (1984) Abdominal adipose tissue distribution, obesity and risk of cardiovascular disease and death: 13 year follow-up of participants in the study of men bom in 1913. Br. Med. J 288: 1401-1404.

McEniery CM, Yasmin, Hall IR, Qasem A, Wilkinson IB, Cockcroft JR (2005) Normal vascular aging: differential effects on wave reflection and aortic pulse wave velocity, The Anglo-Cardiff Collaborative Trial (ACCT). J. Am. Coll Cardiol. In press

Millar DS, Lewis MD, Horan M, Newsway V, Easter TE, Gregory JW, Fryklund L, Norin M, Crowne EC, Davies SJ, Edwards P, Kirk J, Waldron K, Smith PJ, Phillips JA 3rd, Scanlon MF, Krawczak M, Cooper DN, Procter AM (2003) Novel mutations of the growth hormone 1 (GH1) gene disclosed by modulations of the clinical selection criteria for individuals with short stature Hum. Mutation 21: 424-440.

22 O'Brien E, Mee F, Atkins N, Thomas M. (1996) Evaluation of three devices for self measurement of blood pressure according to the revised British Hypertension Society Protocol: the Omron HEM-705CP, Philips HP5332, and Nissei DS-175 Blood Press Monitoring 1: 55-61.

Pauca AL, O’Rourke MF, Kon ND. (2001) Prospective evaluation of a method for estimating ascending aortic pressure from the radial artery pressure waveform. Hypertension 38:932-937

Rashid P, Weaver C, Leonard-Bee J, Bath F, Fletcher S, Bath P. (2003) The effects of transdermal glyceryl trinitrate, a nitric oxide donor, on blood pressure, cerebral and cardiac haemodynamics, and plasma nitric oxide levels in acute stroke. J. Stroke Cerebrovasc Dis 12:143-151.

Safar ME, Blacher J, Pannier B, Guerin AP, Marchais SJ, Guyonvarc'h PM, London GM. (2002) Central pulse pressure and mortality in end-stage renal disease. Hypertension 39: 735-738

Segers P, Qasem A, De Backer T, Carlier S, Verdonck P, Avolio A. (2001) Peripheral “oscillatory” compliance is associated with aortic augmentation index. Hypertension 37:1434-1439.

Wagner JK, Eble A, Cogan JD, Prince MA, Phillips JA 3rd, Mullis PE. (1997) Allelic variations in the human growth hormone-1 gene promoter of growth hormone-deficient patients and normal controls.. Eur. J. Endocrinol. 137: 474- 481..

Wilkinson IB, Fuchs SA, Jansen IM, Spratt JC, Murray GD, Cockcroft JR, Webb DJ. (1998) The reproducibility of pulse wave velocity and augmentation index measured by pulse wave analysis. J. Hypertens 16:2079-2084.

1033168

Claims (22)

1. Werkwijze voor allelspecifieke sequentiebepaling in een 5 testmonster van een individu, waarbij het testmonster een nucleïne-zuurmolecuul bevat waarvan de sequentie moet worden bepaald, omvattende: (a) blootstellen van het nucleïnezuurmolecuul aan ten minste een allelspecifieke primer, die is ingericht om aan zijn laatste 3' base 10 te binden met ten minste een geselecteerde SNP-plaats binnen genoemd molecuul, (b) het verschaffen van geschikte omstandigheden voor het plaatsvinden van transcriptie, waardoor een complementaire streng van genoemd nucleïnezuur wordt gevormd vanaf genoemde geselecteerde SNP- 15 plaats en verder, (c) het bepalen van de sequentie van genoemde complementaire streng om het bestaan van andere bekende SNPs vast te stellen, en, al dan niet (d) toepassen van deze sequentie-informatie voor het bepalen van 20 het haplotype van genoemd individu.

2. Werkwijze voor allelspecifieke sequentiebepaling in een testmonster van een individu, waarbij het testmonster een nucleïnezuurmolecuul bevat dat codeert voor het GHl-gen, of ten minste de 25 promotor daarvan, (a) blootstellen van het nucleïnezuurmolecuul aan ten minste een allelspecifieke primer, die is ingericht om aan zijn laatste 3' base te binden met ten minste een geselecteerde SNP-plaats binnen genoemd molecuul, 30 (b) het verschaffen van geschikte omstandigheden voor het plaats vinden van transcriptie, waardoor een complementaire streng van genoemd nucleïnezuur wordt gevormd vanaf genoemde geselecteerde SNP-plaats en verder, (c) het bepalen van de sequentie van genoemde complementaire 35 streng om het bestaan van andere bekende SNPs vast te stellen, en, al dan niet (d) toepassen van deze sequentie-informatie voor het bepalen van het haplotype van genoemd individu. 1033168

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarin meerdere primers worden toegepast.

4. Allelspecifieke primer voor toepassing in de werkwijze volgens conclusie 1 of 2.

5. Allelspecifieke primer, die een oligonucleotide omvat die complementair is aan een gebied van een gen dat een geselecteerde

6. Allelspecifieke primer voor toepassing in de werkwijze volgens conclusie 1 of 2, die een oligonucleotide omvat die 15 complementair is aan een gebied van het gen dat een geselecteerde SNP-plaats bevat, waarin de 3'-base van het oligonucleotide complementair is aan het SNP.

7. Allelspecifieke primer voor toepassing in de werkwijze 20 volgens conclusie 2, die een oligonucleotide omvat dat complementair is aan het gebied van het proximale promotorgebied van het groei-hormoongen, waarin de laatste 3'-base van het oligonucleotide complementair is aan een van de volgende SNPs: -308, -278, -75, -57, -6, -1 en +59, waarin genummerd is met betrekking tot de 25 transcriptionele startplaats.

8. Allelspecifieke primer die willekeurig welke van de volgende oligonucleotiden omvat: CTATCCTGACATCCTTCG TT GGCCACCAT G GCCTGCG C CCCACCT GTTTCT GaGC TTCTCTCCCACTGTTGC CCTTGGGATCCTTGAGCT GGGCC7TGGGATCCTA CTTACCTGTAGCCATTGCA 30

9. Toepassing van een kern-haplotype, zoals in aangegeven in Tabel 2, voor het bepalen van de gevoeligheid voor hoge bloeddruk of beroerte. 5

10. Nieuw kern-haplotype in het proximale promotorgebied van het groeihormoongen dat willekeurig welke van de haplotypes die in Tabel 2 zijn genoemd omvat.

10 SNP-plaats bevat, waarin de 3'-base van het oligonucleotide complementair is aan de SNP.

11. Werkwijze voor het bepalen van het bestaan van, of de gevoeligheid voor hoge bloeddruk in een individu, omvattende het in een testmonster van genoemd individu bepalen van het haplotype van het promotorgebied van het GH1-gen op SNP-plaatsen -476, -278, -168, -57, -6, +16 en, wanneer willekeurig welke van de volgende haplotypes 15 optreden, het vaststellen dat het individu een risico loopt op hypertensie: CH3 GGTGAA CH7 GTTGGG CH8 GTCGGA CH9 GTTTAA CH10 GGTTGA CH11 ATTGGA CH12 GGTGAG

12. Werkwijze voor het bepalen van het bestaan van, of 20 gevoeligheid voor hoge bloeddruk in een individu, omvattende, in een testmonster van genoemd individu, waarbij het testmonster een nucleinezuurmolecuul omvat dat codeert voor ten minste een proximaal promotorgebied van het groeihormoongen (GH1) van genoemd individu: (a) onderzoeken van het nucleinezuurmolecuul op meerdere SNPs op 25 de volgende plaatsen: -476, -278, -168, -57, -6 en +16 om het overeenkomstige haplotype te bepalen, (b) vergelijken van het geïdentificeerd haplotype met willekeurig welke van de volgende: CH3 GGTGAA CH7 GTTGGG CH8 GTCGGA CH9 GTTTAA CH10 GGTTGA CH11 ATTGGA CH12 GGTGAG en (c) wanneer hetzelfde haplotype wordt aangetroffen, concluderen dat het individu kan lijden aan, of gevoelig is voor hoge bloeddruk. 5

13. Werkwijze volgens conclusies 11 of 12, waarin het individu van het vrouwelijke geslacht is.

14. Werkwijze volgens conclusies 11-13, waarin het 10 voorkeurshaplotype een van de volgende is: CH3 GGTGAA CH8 GTCGGA CH12 GGTGAG

15. Werkwijze voor het bepalen van het bestaan van, of gevoeligheid voor beroerte in een individu, omvattende het bepalen, 15 in een testmonster van het individu, het haplotype van het promotorgebied van het GHl-qen op SNP-plaatsen -476, -278, -168, -57, -6 en +16 en, wanneer willekeurig welk van de volgende haplotypes optreden, vaststellen dat het individu een risico loopt op beroerte: CH2 GTTGGA CH7 GTTGGG CH9 GTTTAA CH10 GGTTGA CH11 ATTGGA CH13 GTCGAA CH15 GGCGAA CH16 GATGAA

16. Werkwijze voor het bepalen van de aanwezigheid van, of gevoeligheid voor, beroerte in een individu, omvattende, in een 5 testmonster van genoemd individu, waarbij het testmonster een nucleïnezuurmolecuul bevat dat codeert voor ten minste een proximaal promotorgebied van het groeihormoongen (GH1) van het individu: (a) onderzoeken van het nucleïnezuurmolecuul op meerdere SNPs op de volgende plaatsen: -476, -278, -168, -57, -6 en +16 om het 10 overeenkomstige haplotype te bepalen, (b) vergelijken van het geïdentificeerde haplotype met willekeurig welke van de volgende: CH2 GTTGGA CH7 GTTGGG CH9 GTTTAA CH10 GGTTGA CH11 ATTGGA CH13 GTCGAA CH15 GGCGAA CH16 GATGAA en 15 (c) wanneer hetzelfde haplotype wordt aangetroffen concluderen dat het individu kan lijden aan of gevoelig is voor beroerte.

17. Werkwijze volgens conclusie 15 of 16, waarin het individu van het vrouwelijke geslacht is.

18. Werkwijze volgens conclusies 15-17, waarin het 5 voorkeurshaplotype een van de volgende is: CH2 GTTGGA CH13 GTCGAA CH15 GGCGAA CH16 GATGAA

19. Toepassing van een of meer van de volgende kern-haplotypes: CH7 GTTGGG CH9 GTTTAA CH10 GGTTGA CH11 ATTGGA 10 -- in de diagnose of behandeling van hoge bloeddruk of beroerte.

20. Nieuw haplotype in het GH1-gen, omvattende een haplotype, gekozen uit de volgende groep: CH7 GTTGGG CH9 GTTTAA CH10 GGTTGA CH11 ATTGGA 15 --

21. Werkwijze voor het bepalen van het bestaan van, of gevoeligheid voor hoge bloeddruk of beroerte in een individu, omvattende, in een testmonster van het individu, waarbij het test- 20 monster een nucleïnezuurmolecuul bevat dat codeert voor ten minste het proximale promotorgebied van het groeihormoongen (GH1) van het individu: (a) onderzoeken van genoemd nucleïnezuurmolecuul op meerdere SNPs op de volgende plaatsen: -476, -278, -168, -57, -6 en +16 om het overeenkomstige haplotype te bepalen, (b) vergelijken van het geïdentificeerde haplotype met willekeurig 5 welke van de volgende: CH7 GTTGGG CH9 GTTTAA CH10 GGTTGA CH11 ATTGGA en (c) wanneer hetzelfde haplotype wordt aangetroffen, concluderen dat het individu kan lijden aan of gevoelig is voor hoge bloeddruk of 10 beroerte.

22. Werkwijze voor het bepalen van de aanwezigheid van of gevoeligheid voor hoge bloeddruk of beroerte in een individu, omvattende het in een testmonster van genoemd individu bepalen van 15 het haplotype van het promotorgebied van het GHl-qen op SNPs- plaatsen: -476, -278, -168, -57, -6 en +16, en, wanneer willekeurig welke van de volgende haplotypes optreedt, vaststellen dat het individu een risico loopt op hoge bloeddruk of beroerte: CH7 GTTGGG CH9 GTTTAA CH10 GGTTGA CH11 ATTGGA 103316e - OC1*001CCN?*UM fcCDCfl.ANO * „„ „„ 13 APR. 2007 j P28595NL00.ST25 _ _ * SEQUENCE LISTING <UO> UNIVERSITY COLLEGE CARDIFF CONSULTANTS <120> AlleTe-specif-ic Sequencing <130> P28595NLOO <140> NL 1033168 ίΐ41> 2007-01-04 <150> G8 0600116.8 il51> 2006-01-05 <160> 25 <170> Patentin version 3.3 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Human lg ctatcctgac atccttcg <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Human ig ttggccacca tggcctgcg <210> 3 <2U> 18 <212> DNA <213> Human lg ccccacctgt ttctgagc <210> 4 <2ll> 17 <212> DNA <213> Human l? ttctctccca ctgttgc <21°> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Human lg ccttgggatc Cttgagct <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Human pagina 1 P28595NLOO.ST25 <400> 6 gggccttggg atccta 16 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <21B> Human <400> 7 cttacctgta gccattgca 19 <210> 8 <211> 6 <212> DNA <213> Human <400> 8 ggttaa 6 <210> 9 <211> 6 <212> DNA <21B> Human <400> 9 gttgga 6 <210> 10 <211> 6 <212> DNA <213> Human <400> 10 ggtgaa 6 <210> 11 <211> 6 <212> DNA <213> Human <400> 11 gttgaa 6 <210> 12 <211> 6 <212> DNA <213> Human <400> 12 ggtgga 6 <210> 13 <211> 6 <212> DNA <213> Human <400> 13 gtttga 6 <210> 14 Pagina 2 P28595NL00.ST25 <211> 6 <212> DNA <213> Human <400> 14 gttggg 6 <210> 15 <211> 6 <212> DNA <213> Human <400> 15 gtcgga 6 <210> 16 <211> 6 <212> DNA <213> Human <400> 16 gtttaa 6 <210> 17 <211> 6 <212> DNA <213> Human <400> 17 ggttga 6 <210> 18 <211> 6 <212> DNA <213> Human <400> 18 attgga 6 <210> 19 <211> 6 <212> DNA <213> Human <400> 19 ggtgag 6 <210> 20 <211> 6 <212> DNA <213> Human <400> 20 gtcgaa 6 <210> 21 <211> 6 <212> DNA <213> Human <400> 21 Pagina 3 P28595NLOO.ST25 gtcggg 6 <210> 22 <211> 6 <212> DNA <213> Human <400> 22 ggcgaa 6 <210> 23 <211> 6 <212> DNA <213> Human <400> 23 gatgaa 6 <210> 24 <211> 6 <212> DNA <213> Human <400> 24 gttgag 6 <210> 25 <211> 3700 <212> DNA <213> Human <400> 25 ctgtttcttg gtttgtgtct ctgctgcaag tccaaggagc tggggcaata ccttgagtct 60 gggttcttcg tccccaggga cctgggggag ccccagcaat gctcagggaa aggggagagc 120 aaagtgtggg gttggttctc tctagtggtc agtgttggaa ctgcatccag ctgactcagg 180 ctgacccagg agtcctcagc agaagtggaa ttcaggactg aatcgtgctc acaaccccca 240 caatctattg gctgtgcttg gccccttttc ccaacacaca cattctgtct ggtgggtgga 300 ggttaaacat gcggggagga ggaaagggat aggatagaga atgggatgtg gtcggtaggg 360 ggtctcaagg actggctatc ctgacatcct tctccgcgtt caggttggcc accatggcct 420 gcggccagag ggcacccacg tgacccttaa agagaggaca agttgggtgg tatctctggc 480 tgacactctg tgcacaaccc tcacaacact ggtgacggtg ggaagggaaa gatgacaagc 540 cagggggcat gatcccagca tgtgtgggag gagcttctaa attatccatt agcacaagcc 600 cgtcagtggc cccatgcata aatgtacaca gaaacaggtg ggggcaacag tgggagagaa 660 ggggccaggg tataaaaagg gcccacaaga gaccagctca aggatcccaa ggcccaactc 720 cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagcgg caatggctac aggtaagcgc 780 ccctaaaatc cctttgggca caatgtgtcc tgaggggaga ggcagcgacc tgtagatggg 840 acgggggcac taaccctcag gtttggggct tctgaatgtg agtatcgcca tgtaagccca 900 gtatttggcc aatctcagaa agctcctggt ccctggaggg atggagagag aaaaacaaac 960 Pagina 4 P28595NL00.ST25 agctcctgga gcagggagag tgctggcctc ttgctctccg gctccctctg ttgccctctg 1020 gtttctcccc aggctcccgg acgtccctgc tcctggcttt tggcctgctc tgcctgccct 1080 ggcttcaaga gggcagtgcc ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta 1140 tgctccgcgc ccatcgtctg caccagctgg cctttgacac ctaccaggag tttgtaagct 1200 cttggggaat gggtgcgcat caggggtggc aggaaggggt gactttcccc cgctgggaaa 1260 taagaggagg agactaagga gctcagggtt tttcccgaag cgaaaatgca ggcagatgag 1320 cacacgctga gtgaggttcc cagaaaagta acaatgggag ctggtctcca gcgtagacct 1380 tggtgggcgg tccttctcct aggaagaagc ctatatccca aaggaacaga agtattcatt 1440 cctgcagaac ccccagacct ccctctgttt ctcagagtct attccgacac cctccaacag 1500 ggaggaaaca caacagaaat ccgtgagtgg atgccttctc cccaggcggg gatgggggag 1560 acctgtagtc agagcccccg ggcagcacag ccaatgcccg tccttcccct gcagaaccta 1620 gagctgctcc gcatctccct gctgctcatc cagtcgtggc tggagcccgt gcagttcctc 1680 aggagtgtct tcgccaacag cctggtgtac ggcgcctctg acagcaacgt ctatgacctc 1740 ctaaaggacc tagaggaagg catccaaacg ctgatggggg tgagggtggc gccaggggtc 1800 cccaatcctg gagccccact gactttgaga gctgtgttag agaaacactg ctgccctctt 1860 tttagcagtc aggccctgac ccaagagaac tcaccttatt cttcatttcc cctcgtgaat 1920 cctccaggcc tttctctaca ccctgaaggg gagggaggaa aatgaatgaa tgagaaaggg 1980 agggaacagt acccaagcgc ttggcctctc cttctcttcc ttcactttgc agaggctgga 2040 agatggcagc ccccggactg ggcagatctt caagcagacc tacagcaagt tcgacacaaa 2100 ctcacacaac gatgacgcac tactcaagaa ctacgggctg ctctactgct tcaggaagga 2160 catggacaag gtcgagacat tcctgcgcat cgtgcagtgc cgctctgtgg agggcagctg 2220 tggcttctag ctgcccgggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct 2280 ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt 2340 gtctgactag gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg 2400 gcaagttggg aagacaacct gtagggcctg cggggtctat tcgggaacca agctggagtg 2460 cagtggcaca atcttggctc actgcaatct ccgcctcctg ggttcaagcg attctcctgc 2520 ctcagcctcc cgagttgttg ggattccagg catgcatgac caggctcagc taatttttgt 2580 ttttttggta gagacggggt ttcaccatat tggccaggct ggtctccaac tcctaatctc 2640 aggtgatcta cccaccttgg cctcccaaat tgctgggatt acaggcgtga accactgctc 2700 ccttccctgt ccttctgatt ttaaaataac tataccagca ggaggacgtc cagacacagc 2760 ataggctacc tgccatgccc aaccggtggg acatttgagt tgcttgcttg gcactgtcct 2820 ctcatgcgtt gggtccactc agtagatgcc tgttgaattc ctgggcctag ggctgtgcca 2880 gctgcctcgt cccgtcacct tctggcttct tctctccctc catatcttag ctgttttcct 2940 catgagaatg ttccaaattc gaaatttcta tttaaccatt atatatttac ttgtttgcta 3000 Pagina 5 P28595NLOO.ST25 ttatctctgc ccccagtaga ttgttagctc cagaagagaa aggatcatgt cttttgctta 3060 tctagatatg cccatctgcc tggtacaatc tctggcacat gttacaggca acaactactt 3120 gtggaattgg tgaatgcatg aatagaagaa tgagtgaatg aatgaataga caaaaggcag 3180 aaatccagcc tcaaagaact tacagtctgg taagaggaat aaaatgtctg caaatagcca 3240 caggacaggt caaaggaagg aggggctatt tccagctgag ggcaccccat caggaaagca 3300 ccccagactt cctacaacta ctagacacat ctcgatgctt ttcacttctc tatcaatgga 3360 tcgtctccct ggagaataat ccccaaagtg aaattactta gcacgtccag ttaggtagat 3420 ccttgtgtac ttcttggttg ttcagagatc atcaaccagt gcaaacaatc cccccatcaa 3480 tacacagcag tgcctgcccc tctccccccg aggtcttccg aggcccttcc tccgtgcctg 3540 aaccccctgg acatatcata tggcaaactg aagtgtccaa cgagatatag gaagtgaaac 3600 acgatgtaca ctgaaacgtg caatacaaat atgcagcatg aagtgcctcg gttcactaac 3660 ccgagctacg ctgggtgctt cttttctacc actttcctta 3700 1033168 Pagina 6