NL1027633C2

NL1027633C2 - Werkwijzen en mengsel voor (bio)chemische analyse en synthese.

Info

Publication number: NL1027633C2
Application number: NL1027633A
Authority: NL
Inventors: Richard Bernardus M Schasfoort
Original assignee: Stichting Tech Wetenschapp
Priority date: 2004-12-01
Filing date: 2004-12-01
Publication date: 2006-06-02

Description

Werkwijzen en mengsel voor (bio)chemische analyse en synthese

Terrein van de uitvinding

De uitvinding betreft een werkwijze voor het bepalen van een aantal typen deeltjes in een 5 monster, omvattende: - het beladen van meerdere gebieden van het oppervlak van een drager met meerdere, van gebied tot gebied verschillende, typen eerste deeltjes waarbij elk type eerste deeltje selectief een type tweede deeltje kan binden.

De uitvinding betreft tevens een mengsel te gebruiken bij zo een werkwijze.

10 Voorts betreft de uitvinding een werkwijze voor het opbouwen van een verbinding, omvattende: - het beladen van meerdere gebieden van het oppervlak van een drager met meerdere, van gebied tot gebied verschillende, typen eerste deeltjes waarbij elk type eerste deeltje selectief een type tweede deeltje kan binden.

15

Achtergrond van de uitvinding

Bekend zijn (bio)chemische analysemethoden waarbij eerste deeltjes, bijvoorbeeld antistoffen, receptoren of oligonucleotiden, direct of indirect aan een drager worden gebonden. Deze eerste deeltjes kunnen selectief tweede deeltjes, bijvoorbeeld antigenen, 20 liganden of complementaire oligo- of polynucleotiden, aan zich binden. Veelal worden afzonderlijke gebieden van de drager beladen met elk een eigen type selectief bindend eerste deeltje, bijvoorbeeld middels ‘spotten’ met behulp van een pipet of capillairen, of door gebruik te maken van fotolithografïsche technieken, mallen met kanaaltjes of inkjet technieken, of het sturen van een medium langs specifieke gebieden van een drager zoals 25 beschreven in NL 1020187. Zo kan een array van gebieden worden vervaardigd met elk zijn eigen selectief bindende eigenschappen, zodat per gebied een specifieke selectieve binding kan plaatsvinden en aldus in een enkele analyse een aantal stoffen in een monster kan worden bepaald. Bij de detectie van de selectieve bindingen kan gebruik worden gemaakt van fluorescerende of radioactieve ‘markers’ en van optische technieken als SPR, 30 scanning en imaging. Het vervaardigen van dergelijke arrays is echter omslachtig, tijdrovend en derhalve kostbaar en het aantal afzonderlijke gebieden per oppervlakte-eenheid is beperkt.

1Ü27633 2

Soortgelijke technieken worden ook wel ingezet bij de synthese van (bio)chemische verbindingen, in het bijzonder (bio)polymeren zoals oligo- en polynucleotiden, -peptiden en -sacchariden. Daarbij wordt bijvoorbeeld steeds een geschikte monomeer of oligomeer aangeboden, en aldus een gewenste sequentie opgebouwd. WO 93/09668 beschrijft het 5 simultaan opbouwen van een relatief grote array van oligonucleotiden of -peptiden in een relatief beperkt aantal stappen door steeds, in een juiste volgorde, een aantal, juist gekozen, gebieden tegelijk een monomeer aan te bieden. Daarbij wordt in een bepaalde stap steeds een enkelvoudige oplossing van een monomeer gebruikt 10 De behoefte aan arrays met steeds grotere aantallen specifiek bindende gebieden op een zo klein mogelijk oppervlak waarmee in zo kort mogelijke tijd zoveel mogelijk typen (bio)chemische deeltjes in een bepaald monster kunnen worden bepaald, neemt voortdurend toe, bijvoorbeeld bij de studie van het proteoom of het genoom van een cel of een geheel organisme. Hetzelfde geldt mutatis mutandis voor het synthetiseren van biopolymeren, 15 bijvoorbeeld DNA-arrays.

Doel van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van een systeem voor de analyse van (bio)chemische monsters waarmee een groot aantal typen (bio)chemische verbindingen in het monster relatief snel en eenvoudig kan worden bepaald, of voor de synthese van 20 (bio)polymeren waarmee een array met een groot aantal typen (bio)polymeren relatief snel en eenvoudig kan worden vervaardigd.

Samenvatting van de uitvinding

De uitvinding verschaft daartoe een werkwijze voor het bepalen van een aantal typen 25 deeltjes in een monster, omvattende: - het beladen van meerdere gebieden van het oppervlak van een drager met meerdere, van gebied tot gebied verschillende, typen eerste deeltjes waarbij elk type eerste deeltje selectief een type tweede deeltje kan binden, met het kenmerk, dat de werkwijze tevens omvat: 30 - het in contact brengen van aantal sets van deelgebieden van de beladen gebieden met een aantal mengsels elk bevattende meerdere typen tweede deeltjes waarbij elk type tweede deeltje is gebonden aan een, van type tweede deeltje tot type tweede deeltje verschillend, type derde deeltje, waarbij elk type derde deeltje selectief een 1 027633 3 type vierde deeltje kan binden welk type vierde deeltje behoort tot de verzameling van de te bepalen typen deeltjes.

Zo kan een inrichting worden vervaardigd waarmee een groot aantal typen deeltjes in een 5 monster min of meer gelijktijdig kan worden bepaald. Door gebruik te maken van mengsels kan het aantal benodigde containers en processtappen drastisch worden beperkt, terwijl toch een zeer groot aantal deelgebieden met elk zijn eigen specifiek bindende eigenschappen kan worden gevormd.

Met ‘bepalen’ wordt in het kader van de uitvinding bedoeld ‘kwalitatief of kwantitatief 1 o vaststellen van de aanwezigheid van’.

Met ‘deeltje’ wordt in het kader van de uitvinding bedoeld elk fysisch of chemisch deeltje, bijvoorbeeld fluorescerende markers of microbolletjes zoals gebruikt bij (bio)chemische analyses, maar vooral (bio)chemische verbindingen zoals nucleïnezuren, aminozuren, mono-, oligo- of polynucleotiden, -peptiden of -sacchariden.

15 Met ‘selectief kunnen binden’ wordt in het kader van de uitvinding bedoeld ‘een min of meer sterke voorkeur hebben voor het aangaan van een, directe of indirecte, fysische en/of chemische binding of interactie met’.

Met ‘beladen’ wordt in het kader van de uitvinding bedoeld dat deeltjes in het betrokken gebied worden geïmmobiliseerd door fysisch en/of chemisch binden.

20 Met ‘in contact brengen’ wordt in het kader van de uitvinding bedoeld dat ten minste een deel van het betrokken medium, mengsel of monster in contact wordt gebracht met ten minste een deel van de betrokken deelgebieden.

Bij voorkeur vormen de beladen gebieden afzonderlijke lanen en geschiedt het in contact 25 brengen van de deelgebieden met de mengsels door het laten kruisen van een aantal gescheiden mediastromen met de afzonderlijke lanen.

Met ‘lanen’ wordt in het kader van de uitvinding bedoeld ‘min of meer langgerekte, van elkaar gescheiden gebieden’. De ‘lanen’ kunnen recht of gekromd zijn. Daarbij kan bijvoorbeeld gebruik worden gemaakt van een of meer ‘channel blocks’ of van technieken 30 als beschreven in NL 1020187.

Bij het in contact te brengen van het monster met de deelgebieden, zullen de in het monster aanwezige typen deeltjes welke complementair zijn met de typen derde deeltjes in de 1027633 4 deelgebieden van de beladen gebieden, selectief worden gebonden aan de betrokken typen derde deeltjes, bijvoorbeeld door ‘self-assembly’.

Het in contact brengen van de mengsels met de respectievelijke sets van deelgebieden kan uiteraard achtereenvolgens, gelijktijdig of deels gelijktijdig gebeuren.

5

Door nu de deelgebieden te onderzoeken met een of meer geschikte detectiemethoden kan worden vastgesteld, kwalitatief of kwantitatief, in welke deelgebieden er bindingen hebben plaatsgevonden, en kunnen aldus de betrokken typen deeltjes in het monster worden bepaald.

10

Met een dergelijk systeem kan een groot aantal typen (bio)chemische verbindingen in een monster snel en relatief eenvoudig worden bepaald, afhankelijk van het totale aantal deelgebieden en verschillende typen derde deeltjes.

15 De uitvinding verschaft tevens een werkwijze voor het opbouwen van een verbinding, met name nucleotide-, peptide- of saccharide- oligo- of polymeren, omvattende: - het beladen van meerdere gebieden van het oppervlak van een drager met meerdere, van gebied tot gebied verschillende, typen eerste deeltjes waarbij elk type eerste deeltje selectief een type tweede deeltje kan binden, 20 met het kenmerk, dat de werkwijze tevens omvat: - het in contact brengen van een aantal sets van deelgebieden van de beladen gebieden met een aantal mengsels elk bevattende meerdere typen tweede deeltjes waarbij elk type tweede deeltje selectief een type derde deeltje kan binden; - enzovoorts naar believen.

25

Zo kan een groot aantal typen (bio)polymeren snel en relatief eenvoudig worden gesynthetiseerd, afhankelijk van het totale aantal deelgebieden.

Korte beschrijving van de figuren 30 De uitvinding wordt in het navolgende toegelicht aan de hand van niet-beperkende uitvoeringsvoorbeelden van een werkwijze en mengsels volgens de uitvinding. Daarin toont figuur 1 schematisch het opbouwen van een array van selectief bindende deelgebieden 1 027633 5 volgens een werkwijze volgens de uitvinding met behulp van een aantal mengsels volgens de uitvinding.

Uitvoerinesvoorbeelden van een werkwijze en mengsels volgens de uitvinding 5 In een eerste stap, zie figuur 1, worden meerdere gebieden, in dit voorbeeld m rechte ‘lanen’, van het oppervlak van een drager beladen met meerdere, in dit voorbeeld m, van gebied tot gebied verschillende, typen eerste deeltjes, in dit voorbeeld enkelstrengige oligonucleotiden, Daarvoor kunnen bekende technieken worden gebruikt en bijvoorbeeld een ‘channel block’ zoals beschreven en getoond (Fig. 7) in WO 93/09668 of 10 een methode als beschreven in NL 1020187.

Vervolgens worden volgens de uitvinding eerste deelgebieden van de beladen gebieden in contact gebracht met een eerste mengsel volgens de uitvinding, bevattende meerdere typen tweede deeltjes, in dit voorbeeld m complementaire enkelstrengige oligonucleotiden, Ai ...m. Daarvoor kan weer een ‘channel block’ worden gebruikt, mogelijk 15 zelfs hetzelfde ‘channel block’, maar nu 90° gedraaid, of de methode beschreven in NL 1020187. Daarbij zullen de complementaire tweede deeltjes Ai...m selectief hybridiseren met de eerste deeltjes Si ...m.

Elk type tweede deeltje Ai....m in het eerste mengsel is gebonden aan een eigen derde deeltje, in dit voorbeeld een eiwit, Pi,i...m,i· In plaats van eiwitten kunnen uiteraard ook 20 bijvoorbeeld DNA, peptide of polysaccharide targets worden genomen, of andere geschikte specifiek bindende deeltjes. Zo zal er op de kruispunten een eerste kolom van m deelgebieden Gi,i...m,! worden gevormd met elk zijn eigen type derde deeltje Pi,i...m,i dat selectief een complementair type vierde deeltje kan binden, en wel een te bepalen type deeltje in een te analyseren (bio)chemisch monster, bijvoorbeeld plasma, bloed, serum of 25 urine.

Zo kunnen volgens de uitvinding ook tweede deelgebieden van de beladen gebieden in contact worden gebracht met een tweede mengsel Ai...mP],2...m>2 volgens de uitvinding, weer bevattende meerdere typen tweede deeltjes, in dit voorbeeld weer de m complementaire enkelstrengige oligonucleotiden, Ai ,..m. Daarvoor kan bijvoorbeeld weer hetzelfde ‘channel 30 block’ worden gebruikt of de methode uit NL 1020187. Daarbij zullen de complementaire tweede deeltjes A|,,.m weer selectief hybridiseren met de eerste deeltjes Si. ...m.

Elk type tweede deeltje Ai....m in het tweede mengsel is weer gebonden aan een eigen type derde deeltje, in dit voorbeeld een eiwit, Pi,2...m.2· Zo zal er een tweede kolom van m 1027u<:i', i_____ 6 deelgebieden Gi,2...m,2 worden gevormd met elk weer zijn eigen type derde deeltje Pi,2...m,2 dat weer selectief een complementair type vierde deeltje kan binden, en wel een te bepalen type deeltje in het te analyseren (bio)chemisch monster.

Zo kunnen alle deelgebieden van de beladen gebieden in contact worden gebracht met n 5 mengsels, de rf deelgebieden met een rf mengsel Ai...mPi>n Daarbij kunnen de mengsels in willekeurige volgorde, tegelijkertijd of deels tegelijkertijd, in contact worden gebracht met de betreffende deelgebieden. Omwille van de duidelijkheid zijn eventuele tussenstappen zoals wasstappen en conditioneerstappen buiten beschouwing gelaten. Resultaat is een inrichting met m x n deelgebieden met elk een eigen type eiwit Pi,i...m^ die 10 in beginsel in twee stappen kan worden vervaardigd, een eerste stap waarin de m gebieden worden beladen, bijvoorbeeld met behulp van een ‘channel block’, en een tweede stap waarin m x n deelgebieden van de m gebieden in contact worden gebracht met de n mengsels.

Door nu deze drager c.q. de deelgebieden in contact te brengen met het te analyseren 15 monster kunnen mxn typen deeltjes in het monster worden bepaald.

Het is uiteraard niet noodzakelijk dat alle deelgebieden worden voorzien van een eigen type selectief bindend deeltje. Zo kan een deel van de deelgebieden worden voorzien van juist hetzelfde type selectief bindend deeltje of juist ‘blanco’ worden gelaten, bijvoorbeeld ten 20 behoeve van controle- en referentiemetingen.

Het moge verder duidelijk zijn dat de gebieden niet persé rechte ‘lanen’ hoeven te zijn. In beginsel is elke vorm mogelijk. Zo kunnen de gebieden bijvoorbeeld ook concentrische banen vormen, waarbij de mengsels aan de deelgebieden bijvoorbeeld worden aangeboden middels een ‘channel block’ met radiaal verlopende kanalen.

25 Ook zijn er zelfs drie- of meerdimensionale matrices mogelijk, bijvoorbeeld door in een volgende stap een weer anders gevormde verzameling van deelgebieden (stippellijnen in figuur 1) in contact te brengen met weer een ander mengsel, enzovoorts.

Het zal een deskundige derhalve duidelijk zijn dat de uitvinding geenszins tot de 30 beschreven en getoonde uitvoeringsvoorbeelden is beperkt maar dat binnen het kader van de uitvinding vele variaties en combinaties mogelijk zijn.

Kenmerkend is steeds het gebruik van een of meer mengsels waarmee, na het beladen van de afzonderlijke gebieden met, van gebied tot gebied verschillende, typen eerste deeltjes, in 1027633 7 een enkele stap, of een beperkt aantal stappen, een aantal deelgebieden van die gebieden selectief kan worden voorzien van, van deelgebied tot deelgebied verschillende, typen tweede deeltjes.

Zo kan een compacte array van een groot aantal deelgebieden kan worden gevormd met elk 5 zijn eigen selectief bindende eigenschappen, waarbij tevens slechts een beperkt aantal containers nodig is.

1027633

Claims

1. Werkwijze voor het bepalen van een aantal typen deeltjes in een monster, omvattende: - het beladen van meerdere gebieden van het oppervlak van een drager met 5 meerdere, van gebied tot gebied verschillende, typen eerste deeltjes waarbij elk type eerste deeltje selectief een type tweede deeltje kan binden, met het kenmerk, dat de werkwijze tevens omvat: - het in contact brengen van aantal sets van deelgebieden van de beladen gebieden met een aantal mengsels elk bevattende meerdere typen tweede deeltjes waarbij elk 10 type tweede deeltje is gebonden aan een, van type tweede deeltje tot type tweede deeltje verschillend, type derde deeltje, waarbij elk type derde deeltje selectief een type vierde deeltje kan binden welk type vierde deeltje behoort tot de verzameling van de te bepalen typen deeltjes.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de beladen gebieden afzonderlijke lanen vormen en het in contact brengen van de deelgebieden met de mengsels geschiedt door het laten kruisen van een aantal gescheiden mediastromen met de afzonderlijke lanen.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de werkwijze tevens omvat: - het in contact brengen van het monster met de deelgebieden.

4. Werkwijze volgens een der conclusies 1-3, met het kenmerk, dat de typen eerste deeltjes elk een codon, bijvoorbeeld een enkelstrengige DNA of PNA oligomeer, 25 omvatten, en de typen tweede deeltjes elk een complementair anticodon omvatten.

5. Werkwijze volgens een der conclusies 1-4, met het kenmerk, dat de typen derde deeltjes behoren tot de verzameling van nucleotide-, peptide- of saccharide- mono-, oligo- of polymeren. 30

6. Mengsel te gebruiken bij een werkwijze volgens een der conclusies 1-5, met het kenmerk, dat het mengsel meerdere typen tweede deeltjes bevat waarbij elk type tweede deeltje is gebonden aan een, van type tweede deeltje tot type tweede deeltje 1027633 verschillend, type derde deeltje, waarbij elk type derde deeltje selectief een type vierde deeltje kan binden welk type vierde deeltje behoort tot de verzameling van te bepalen typen deeltjes.

7. Werkwijze voor het opbouwen van een verbinding, met name nucleotide-, peptide- of saccharide- oligo- of polymeren, omvattende: - het beladen van meerdere gebieden van het oppervlak van een drager met meerdere, van gebied tot gebied verschillende, typen eerste deeltjes waarbij elk type eerste deeltje selectief een type tweede deeltje kan binden, 10 met het kenmerk, dat de werkwijze tevens omvat: - het in contact brengen van een aantal sets van deelgebieden van de beladen gebieden met een aantal mengsels elk bevattende meerdere typen tweede deeltjes waarbij elk type tweede deeltje selectief een type derde deeltje kan binden; - enzovoorts naar believen. 1027633