NL1022537C2 - Production of chimeric polynucleotides useful for producing chimeric polypeptides comprises blunt-ending two polynucleotides and ligating the blunt ends - Google Patents

Production of chimeric polynucleotides useful for producing chimeric polypeptides comprises blunt-ending two polynucleotides and ligating the blunt ends Download PDF

Info

Publication number
NL1022537C2
NL1022537C2 NL1022537A NL1022537A NL1022537C2 NL 1022537 C2 NL1022537 C2 NL 1022537C2 NL 1022537 A NL1022537 A NL 1022537A NL 1022537 A NL1022537 A NL 1022537A NL 1022537 C2 NL1022537 C2 NL 1022537C2
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
polynucleotide
polymerization
chimeric
polynucleotide chain
blunt
Prior art date
Application number
NL1022537A
Other languages
Dutch (nl)
Inventor
Simon De Vries
Esenguel Yildirim
Original Assignee
Univ Delft Tech
Stichting Tech Wetenschapp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Delft Tech, Stichting Tech Wetenschapp filed Critical Univ Delft Tech
Priority to NL1022537A priority Critical patent/NL1022537C2/en
Application granted granted Critical
Publication of NL1022537C2 publication Critical patent/NL1022537C2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1027—Mutagenizing nucleic acids by DNA shuffling, e.g. RSR, STEP, RPR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Production of chimeric polynucleotides by linking a double-stranded polynucleotide comprising a first gene or gene fragment at its 3' end to a double-stranded polynucleotide comprising a second gene or gene fragment at its 5' end comprises blunt-ending the two polynucleotides and ligating the blunt ends.

Description

t *t *

Werkwijze voor de bereiding van chimere polynucleotidenProcess for the preparation of chimeric polynucleotides

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van een chimeer polynucleotide, waarbij i) een eerste dubbelstrengs polynucleotidenketen welke aansluitend op een 3'-eindstandig uiteinde een eerste gen 5 of een fragment daarvan omvat en ii) een tweede dubbelstrengs polynucleotidenketen welke aansluitend op een 5'-eindstandig uiteinde een tweede gen of een fragment daarvan omvat, met elkaar worden verbonden.The present invention relates to a method for the preparation of a chimeric polynucleotide, wherein i) a first double-stranded polynucleotide chain which, subsequent to a 3 'end, comprises a first gene 5 or a fragment thereof, and ii) a second double-stranded polynucleotide chain which subsequently comprises a second gene or a fragment thereof at a 5 'terminal end.

Een dergelijke werkwijze is in het vak algemeen be-10 kend. Zij maakt de bereiding mogelijk van chimere polypepti-den en eiwitten, waarin de eigenschappen van twee genen zijn gecombineerd en/of zijn veranderd. Deze genen, of fragmenten ervan, kunnen al dan niet afkomstig zijn van hetzelfde organisme. Een andere toepassing betreft polypeptiden die ge-15 bruikt kunnen worden voor vaccinatiedoeleinden.Such a method is generally known in the art. It allows the preparation of chimeric polypeptides and proteins in which the properties of two genes are combined and / or changed. These genes, or fragments thereof, may or may not come from the same organism. Another application relates to polypeptides that can be used for vaccination purposes.

De bekende werkwijzen hebben het nadeel dat zij ongewenste veranderingen in het chimere polynucleotide introduceren, of een verhoogd risico daarop hebben. Verder zijn de bestaande werkwijzen vaak omslachtig en/of weinig efficiënt. 20 De onderhavige beoogt deze nadelen op te heffen.The known methods have the disadvantage that they introduce undesirable changes to the chimeric polynucleotide, or have an increased risk thereof. Furthermore, the existing methods are often cumbersome and / or not very efficient. The present object aims to eliminate these disadvantages.

Hiertoe wordt de werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt doordat zowel de eerste als de tweede dubbelstrengs polynucleotidenketen stomp wordt gemaakt en de stompe uiteinden worden geligeerd onder oplevering van het chimere polynu-25 cleotide.To this end, the method according to the invention is characterized in that both the first and the second double-stranded polynucleotide chain are blunted and the blunt ends are ligated to yield the chimeric polynucleotide.

Aanvraagster heeft verrassenderwijze gevonden dat een dergelijke werkwijze diverse mogelijkheden biedt om tot chimere polynucleotiden, en daarmee chimere polypeptiden en eiwitten, te komen. Deze polynucleotiden kunnen beter gedefi-30 nieerd zijn, dat wil zeggen met minder ongewenste veranderingen in de nucleotidenvolgorde. Bij de werkwijze volgens de uitvinding kunnen het eerste en het tweede gen hetzelfde zijn, waarbij het resulterende chimere polynucleotide een van het gen afwijkende volgorde heeft. Daarbij kan een deelvolg-35 orde zijn gedeleteerd of herhaald.The applicant has surprisingly found that such a method offers various possibilities for creating chimeric polynucleotides, and thereby chimeric polypeptides and proteins. These polynucleotides may be better defined, that is, with fewer unwanted changes in the nucleotide sequence. In the method according to the invention, the first and the second gene can be the same, the resulting chimeric polynucleotide having a different order from the gene. A partial sequence may be deleted or repeated.

WO 01/64864 beschrijft een werkwijze waarbij twee H enkelstrengs DNA volgorden van verschillende oorsprong maar met enige mate van homologie worden gehybridiseerd. Op een segment waar geen hybridisatie optreedt wordt onder invloed H van een DNase van een van beide strengen nucleotiden worden 5 verwijderd waarna een ononderbroken complementaire streng wordt gemaakt met behulp van een polymerase. Deze werkwijze heeft als nadeel dat moet worden uitgegaan van genen die een sterke homologie vertonen.WO 01/64864 describes a method in which two H single-stranded DNA sequences of different origins are hybridized with some degree of homology. On a segment where no hybridization occurs, nucleotides are removed from one of the two strands under the influence of H of a DNase, after which a continuous complementary strand is made using a polymerase. This method has the drawback that genes exhibiting a strong homology must be assumed.

In het vak is het ook bekend om chimere nucleotiden 10 te maken door genen te knippen met behulp van restrictie- enzymen en de fragmenten met elkaar te verbinden. Deze werk- wijze is weinig flexibel voor wat betreft de keuze waar een fragment van een gen eindigt en kan overgaan in een ander gen I of een fragment daarvan.It is also known in the art to make chimeric nucleotides by cutting genes using restriction enzymes and linking the fragments together. This method is not very flexible with regard to the choice where a fragment of a gene ends and can pass into another gene I or a fragment thereof.

15 Bij voorkeur geschiedt het ligeren met behulp van een ligase.The ligation preferably takes place with the aid of a ligase.

I Het gebruik van ligase is bij genetische manipulatie I welbekend en biedt dan ook een eenvoudige wijze om dubbel- strengs polynucleotidenketens met elkaar te verbinden.The use of ligase is well known in genetic engineering I and therefore offers a simple way of joining double-stranded polynucleotide chains.

20 Voor het verkrijgen van dubbelstrengs polynucleoti- H denketens met een stompe terminus, geschiedt het stomp maken volgens een eerste uitvoeringsvorm met behulp van een enzym dat een overhangend uiteinde digesteert onder oplevering van het stompe uiteinde.To obtain double-stranded polynucleotide chains with a blunt terminus, blunting according to a first embodiment is effected with the aid of an enzyme that digestes an overhanging end to yield the blunt end.

25 Een voorbeeld van een hiervoor geschikt enzym is I Bal31.An example of an enzyme suitable for this purpose is I Bal31.

I De werkwijze volgens de uitvinding biedt de moge- I lijkheid een sterk heterogene bank van chimere polynucleoti- den te creëren, welke desgewenst een groot aantal en in prin- I 30 cipe "alle" denkbare chimere polynucleotidevarianten kan be- I vatten.The method according to the invention offers the possibility of creating a highly heterogeneous library of chimeric polynucleotides, which, if desired, can contain a large number of and in principle "all" conceivable chimeric polynucleotide variants.

I Bij voorkeur wordt ten minste een van de eerste en I de tweede dubbelstrengs polynucleotidenketen bereid uitgaande I van een enkelstrengs polynucleotidenketen waartegen met een 35 polymerase een complementaire keten wordt gesynthetiseerd in aanwezigheid van i) de nucleotidenbouwstenen ATP, GTP, CTP en I TTP, alsmede ii) ten opzichte van de concentratie van elk van de genoemde nucleotidenbouwstenen een ondermaat van ten min- 3 ste één polymerisatie-terminerend nucleotideanalogon ATP', GTP', CTP' en TTP', waarna het overhangende uiteinde wordt gedigesteerd met het enzym dat het overhangend uiteinde di-gesteert onder oplevering van het stompe uiteinde, waarbij 5 hetzij a) het polymerisatie-terminerende nucleotideanalogon wordt omgezet tot een niet-terminerende nucleotidebouwsteen, of b) het polymerisatie-terminerende nucleotideanalogon wordt verwijderd.Preferably, at least one of the first and the second double-stranded polynucleotide chain is prepared starting from a single-stranded polynucleotide chain against which a complementary chain is synthesized with a polymerase in the presence of i) the nucleotide building blocks ATP, GTP, CTP and I TTP, as well as ii) a substandard of at least one polymerization-terminating nucleotide analogue ATP ', GTP', CTP 'and TTP' relative to the concentration of each of said nucleotide building blocks, after which the overhanging end is digested with the enzyme that overhangs it end terminates yielding the blunt end, wherein either a) the polymerization terminating nucleotide analog is converted to a non-terminating nucleotide building block, or b) the polymerization terminating nucleotide analog is removed.

Hierbij is, volgens een voorkeursuitvoeringsvorm, 10 het polymerisatie-terminerende nucleotideanalogon een 3'-X-dNTP, waarbij X een acylgroep of ethergroep is met maximaal 5 koolstofatomen, en NA, T, C of G voorstelt.Here, in a preferred embodiment, the polymerization-terminating nucleotide analog is a 3'-X-dNTP, wherein X is an acyl group or ether group with up to 5 carbon atoms, and represents NA, T, C or G.

Volgens een alternatieve voorkeursuitvoeringsvorm geschiedt het verwijderen van het polymerisatie-terminerende 15 nucleotideanalogon met behulp van een enzym met Exonuclease III activiteit.According to an alternative preferred embodiment, the removal of the polymerization-terminating nucleotide analogue takes place with the aid of an enzyme with Exonuclease III activity.

Het blijkt mogelijk om daarbij het aantal verwijderde nucleotiden te beperken. Daartoe wordt bij voorkeur gewerkt bij een verlaagde temperatuur, in het bijzonder bij 20 <10eC, zoals 4°C.It appears to be possible to limit the number of deleted nucleotides. To this end, work is preferably carried out at a reduced temperature, in particular at 20 <10 ° C, such as 4 ° C.

Voor het aanpassen van de lengte van een te ligeren dubbelstrengs polynucleotidenketen wordt volgens een alternatieve uitvoeringsvorm een hoeveelheid van een dubbelstrengs polynucleotidenketen onderworpen aan de werking van een 25 exonuclease, waarbij verschillende polynucleotidenketenmole-culen gedurende een verschillende duur en/of bij verschillende temperatuur aan de exonuclease worden blootgesteld onder oplevering van een mengsel van polynucleotidenketenmoleculen met verschillende lengten, waarna het stomp maken geschiedt 30 met het enzym dat een overhangend uiteinde digesteert onder oplevering van het stompe uiteinde.For adjusting the length of a double-stranded polynucleotide chain to be ligated, according to an alternative embodiment, an amount of a double-stranded polynucleotide chain is subjected to the action of an exonuclease, wherein different polynucleotide chain molecules have a different duration and / or at different temperatures at the exonuclease are exposed to yield a mixture of polynucleotide chain molecules of different lengths, after which blunting occurs with the enzyme that digests an overhanging end to yield the blunt end.

Voor het wijzigen van de duur wordt bij voorkeur de te behandelen polynucleotidenketen langzaam en onder mengen toegevoegd aan een exonuclease. Voor het onderwerpen aan ver-35 schillende temperaturen wordt de polynucleotidenketen bij voorkeur in een capillair gebracht en over de lengte van het capillair aan een temperatuurgradiënt blootgesteld.To change the duration, the polynucleotide chain to be treated is preferably added to an exonuclease slowly and with mixing. For subjecting to different temperatures, the polynucleotide chain is preferably placed in a capillary and exposed to a temperature gradient along the length of the capillary.

In plaats van de eerder genoemde werkwijze waarbij Η Η het stomp maken geschiedt met behulp van een enzym dat het overhangende uiteinde digesteert, geschiedt volgens een al- H ternatieve uitvoeringsvorm het stomp maken met een polymerase H dat een complementaire volgorde tegen een overhangend uitein- H 5 de aanbrengt.Instead of the aforementioned method in which blunting takes place with the aid of an enzyme that digestes the overhanging end, according to an alternative embodiment blunting is carried out with a polymerase H which complements a complementary sequence against an overhanging end H 5 applies.

Volgens een belangrijke uitvoeringsvorm wordt van ten minste een van de eerste en tweede polynucleotidenketens één uiteinde geblokkeerd.According to an important embodiment, one end of at least one of the first and second polynucleotide chains is blocked.

Aldus kan de opbrengst aan gewenste chimere polynu- 10 cleotiden worden verhoogd. Hierbij wordt onder blokkeren ver- staan het onmogelijk maken dat een ligering optreedt. Dit kan bijvoorbeeld geschieden door verwijdering van de 5'- fosfaatgroep of fosforyleren van de 3'-OH-groep.Thus, the yield of desired chimeric polynucleotides can be increased. Blocking is understood to mean that it is impossible for a ligation to occur. This can be done, for example, by removing the 5'-phosphate group or phosphorylating the 3'-OH group.

H Daarbij kan volgens een eerste variant een van de 15 eerste en tweede polynucleotidenketens aan een drager worden H gekoppeld en met de andere polynucleotidenketen welke zich in een vloeistoffase bevindt worden geligeerd.H In this case, according to a first variant, one of the first and second polynucleotide chains can be coupled to a support and ligated to the other polynucleotide chain which is in a liquid phase.

Het koppelen van een keten aan een drager is alge- meen bekend.Linking a chain to a carrier is generally known.

I 20 Volgens een tweede variant wordt ten minste een van de eerste en de tweede polynucleotidenketens aan een drager gekoppeld, wordt het van de drager afgekeerde eindstandige uiteinde van een blokkerende groep voorzien, en wordt een al- dus behandelde polynucleotidenketen van de drager afgesplitst 25 en gebruikt voor de bereiding van het chimere polynucleotide.According to a second variant, at least one of the first and the second polynucleotide chains is coupled to a carrier, the terminal end remote from the carrier is provided with a blocking group, and a polynucleotide chain thus treated is split off from the carrier and used for the preparation of the chimeric polynucleotide.

Bij voorkeur wordt het chimere polynucleotide in een vector gebracht.Preferably, the chimeric polynucleotide is introduced into a vector.

Hiermee kan het chimere polynucleotide in een gast- I heerorganisme worden gebracht om het daar tot expressie te 30 brengen.This allows the chimeric polynucleotide to be introduced into a host organism to express it there.

Opgemerkt wordt dat een bereide chimere polynucleo- I tide niet in zijn geheel hoeft te worden gebruikt, doch dat I ook, bijvoorbeeld met de PCR-techniek, een chimeer polynucle- otidendeel onder gebruikmaking van het bereide chimere po- I 35 lynucleotide als matrijs kan worden gemaakt. Dit biedt de mo- I gelijkheid om, door geschikte keuze van primers, de kans te vergroten dat een gewenste polynucleotidenketen wordt verkre- I gen. Onder geschikte keuze wordt hier verstaan een eerste 5 primer die complementair is met een deel van de eerste po-lynucleotidenketen en een tweede primer die complementair is met een deel van de tweede polynucleotidenketen.It is noted that a prepared chimeric polynucleotide does not have to be used in its entirety, but that, also with the PCR technique, I can also use a chimeric polynucleotide part using the prepared chimeric polynucleotide as a template. to be made. This offers the possibility, by suitable choice of primers, to increase the chance that a desired polynucleotide chain is obtained. A suitable choice is here understood to mean a first primer that is complementary to a part of the first polynucleotide chain and a second primer that is complementary to a part of the second polynucleotide chain.

Ofschoon voor de eenvoud van de beschrijving in de 5 onderhavige aanvrage de uitvinding wordt beschreven aan de hand van het bereiden van een chimeer polynucleotide op basis van twee (al dan niet identieke) genen en/of genfragmenten, zal het voor de gewone vakman duidelijk zijn dat de uitvinding op overeenkomstige wijze kan worden toegepast voor de 10 bereiding van chimere polynucleotiden opgebouwd uit meer dan twee genen en/of genfragmenten.Although for the sake of simplicity of the description in the present application the invention is described on the basis of the preparation of a chimeric polynucleotide based on two (identical or non-identical) genes and / or gene fragments, it will be clear to the person skilled in the art that the invention can similarly be used for the preparation of chimeric polynucleotides composed of more than two genes and / or gene fragments.

Wanneer in de onderhavige aanvrage wordt gesproken over polynucleotidenketen wordt hieronder een nucleotidenke-ten verstaan met een lengte van ten minste 9 basen of basen-15 paren.When polynucleotide chain is used in the present application, this is understood to mean a nucleotide chain with a length of at least 9 bases or base-15 pairs.

Claims (10)

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het ligeren geschiedt met behulp van een ligase.Method according to claim 1, characterized in that the ligation takes place with the aid of a ligase. 3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het ken- merk, dat het stomp maken geschiedt met behulp van een enzym 15 dat een overhangend uiteinde digesteert onder oplevering van het stompe uiteinde.3. Method as claimed in claim 1 or 2, characterized in that the blunting is carried out with the aid of an enzyme which digestes an overhanging end, yielding the blunt end. 4. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het ken- I merk, dat de eerste dubbelstrengs polynucleotidenketen wordt I bereid uitgaande van een enkelstrengs polynucleotideketen 20 waartegen met een polymerase een complementaire keten wordt gesynthetiseerd in aanwezigheid van i) de nucleotidebouwste- I nen ATP, GTP, CTP en TTP, alsmede ii) ten opzichte van de I concentratie van elk van de genoemde nucleotidenbouwstenen een ondermaat van ten minste één polymerisatie-terminerend I 25 nucleotideanalogon ATP', GTP7, CTP' en TTP', waarna het over- hangende uiteinde wordt gedigesteerd met het enzym dat het overhangend uiteinde digesteert onder oplevering van het I stompe uiteinde, waarbij hetzij a) het polymerisatie- I terminerende nucleotideanalogon wordt omgezet tot een niet- I 30 terminerende nucleotidebouwsteen, of b) het polymerisatie- I terminerende nucleotideanalogon wordt verwijderd.4. A method according to claim 1 or 2, characterized in that the first double-stranded polynucleotide chain is prepared from a single-stranded polynucleotide chain against which a complementary chain is synthesized with a polymerase in the presence of i) the nucleotide building blocks ATP , GTP, CTP and TTP, as well as ii) an under-size of at least one polymerization-terminating ATP ', GTP7, CTP' and TTP 'relative to the concentration of each of the said nucleotide building blocks, after which the overhanging end is digested with the enzyme that digestes the overhanging end to yield the blunt end, wherein either a) the polymerization-terminating nucleotide analog is converted into a non-terminating nucleotide building block, or b) the polymerization-terminating nucleotide analog is converted deleted. 5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, I dat het polymerisatie-terminerende nucleotideanalogon een 3'- I X-dNTP is, waarbij X een acylgroep of ethergroep is met maxi- I 35 maal 5 koolstofatomen, en N A, T, C of G voorstelt.A method according to claim 4, characterized in that the polymerization-terminating nucleotide analog is a 3'-X-dNTP, wherein X is an acyl group or ether group with up to 35 times 5 carbon atoms, and NA, T, C or G. 6. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk/ dat het verwijderen van het polymerisatie-terminerende nucle-otideanalogon geschiedt met behulp van een enzym met Exonu-clease III activiteit.Method according to claim 4, characterized in that the removal of the polymerization-terminating nucleotide analogue is carried out with the aid of an enzyme with Exonuclease III activity. 7. Werkwijze volgens een van de conclusies 1 tot 3, met het kenmerk/ dat een hoeveelheid van een polynucleotiden-keten wordt onderworpen aan de werking van een exonuclease, waarbij verschillende polynucleotidenketenmoleculen gedurende een verschillende duur en/of bij verschillende temperatuur 10 aan de exonuclease worden blootgesteld onder oplevering van een mengsel van polynucleotidenketenmoleculen met verschillende lengten, waarna het stomp maken geschiedt met het enzym dat een overhangend uiteinde digesteert onder oplevering van het stompe uiteinde.7. A method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that an amount of a polynucleotide chain is subjected to the action of an exonuclease, wherein different polynucleotide chain molecules for a different duration and / or at different temperatures are subjected to the exonuclease are exposed to yield a mixture of polynucleotide chain molecules of different lengths, after which the blunting takes place with the enzyme that digests an overhanging end to yield the blunt end. 8. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het ken merk, dat het stomp maken geschiedt met een polymerase dat een complementaire volgorde tegen een overhangend uiteinde aanbrengt.Method according to claim 1 or 2, characterized in that the blunting is carried out with a polymerase which applies a complementary sequence to an overhanging end. 9. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, 20 met het kenmerk, dat van ten minste een van de eerste en tweede polynucleotidenketens één uiteinde wordt geblokkeerd.9. A method according to any one of the preceding claims, characterized in that one end of at least one of the first and second polynucleotide chains is blocked. 10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat een van de eerste en tweede polynucleotidenketens aan een drager wordt gekoppeld en met de andere polynucleotidenketen 25 welke zich in een vloeistoffase bevindt wordt geligeerd.10. Method according to claim 9, characterized in that one of the first and second polynucleotide chains is coupled to a carrier and is ligated to the other polynucleotide chain 25 which is in a liquid phase. 11. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het chimere polynucleotide in een vector wordt gebracht. 30A method according to any one of the preceding claims, characterized in that the chimeric polynucleotide is introduced into a vector. 30
NL1022537A 2003-01-31 2003-01-31 Production of chimeric polynucleotides useful for producing chimeric polypeptides comprises blunt-ending two polynucleotides and ligating the blunt ends NL1022537C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL1022537A NL1022537C2 (en) 2003-01-31 2003-01-31 Production of chimeric polynucleotides useful for producing chimeric polypeptides comprises blunt-ending two polynucleotides and ligating the blunt ends

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL1022537 2003-01-31
NL1022537A NL1022537C2 (en) 2003-01-31 2003-01-31 Production of chimeric polynucleotides useful for producing chimeric polypeptides comprises blunt-ending two polynucleotides and ligating the blunt ends

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NL1022537C2 true NL1022537C2 (en) 2004-08-03

Family

ID=33029028

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL1022537A NL1022537C2 (en) 2003-01-31 2003-01-31 Production of chimeric polynucleotides useful for producing chimeric polypeptides comprises blunt-ending two polynucleotides and ligating the blunt ends

Country Status (1)

Country Link
NL (1) NL1022537C2 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5736134A (en) * 1985-04-22 1998-04-07 Genentech, In.C Tissue plasminogen activator variants
US6479262B1 (en) * 2000-05-16 2002-11-12 Hercules, Incorporated Solid phase enzymatic assembly of polynucleotides

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5736134A (en) * 1985-04-22 1998-04-07 Genentech, In.C Tissue plasminogen activator variants
US6479262B1 (en) * 2000-05-16 2002-11-12 Hercules, Incorporated Solid phase enzymatic assembly of polynucleotides

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOORGANICHESKAYA KHIMIYA, vol. 16, no. 8, 1990, pages 1045 - 1051, ISSN: 0132-3423 *
DATABASE BIOSIS [online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; 1990, FILIPPOV S A ET AL: "SOLID-PHASE LIGATION OF SYNTHETIC DNA FRAGMENTS", XP002259120, Database accession no. PREV199191060786 *
SAMBROOK J AND RUSSELL D: "Molecular Cloning", 2001, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, NEW YORK, XP002259119 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2006320275B2 (en) Synthesis of error-minimized nucleic acid molecules
CA2460639C (en) Engineered templates and their use in single primer amplification
JP6752957B2 (en) A novel process for the production of oligonucleotides
US6951719B1 (en) Process for obtaining recombined nucleotide sequences in vitro, libraries of sequences and sequences thus obtained
KR20090037118A (en) Method of amplifying target nucleic acids by rolling circle amplification in the presence of ligase and endonuclease
KR860007380A (en) Methods of Augmenting, Detecting, and / or Cloning Nucleic Acid Sequences
FI3564394T3 (en) Method of preparing libraries of template polynucleotides
KR20130018374A (en) Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide
KR102625365B1 (en) Method for reducing primer-dimer amplification
CA2468754A1 (en) Annealing control primer and its uses
JPH06505872A (en) Method for synthesizing full-length double-stranded DNA from a single-stranded linear DNA template
EP1019540B1 (en) Efficient linking of nucleic acid segments
CN108495938A (en) Bar code sequence and application thereof is synthesized using phase shift block
KR20120097214A (en) Use of single strand binding protein in amplifying target nucleic acid
NL1022537C2 (en) Production of chimeric polynucleotides useful for producing chimeric polypeptides comprises blunt-ending two polynucleotides and ligating the blunt ends
CN113897366A (en) Nucleic acid ligand and application thereof
KR20160139671A (en) A dual-functional oligonucleotide including complementary sequences, mis-matched sequences, reporter dye, and quencher dye linked with primer for nucleic acid amplification and measurement methods using the same
JPWO2002036822A1 (en) Nucleic acid base sequencing method
JP3415995B2 (en) Method for producing high molecular micro gene polymer
Morozov et al. Use of highly conserved motifs in plant virus RNA polymerases as the tags for specific detection of carmovirus-related RNA-dependent RNA polymerase genes
WO2019044820A1 (en) Method for producing double-stranded dna fragments
CN107338240B (en) Method and kit for biased amplification of target nucleic acid sequence in sample
JP5455243B2 (en) Method for producing a mixture of amplified double-stranded nucleic acids containing an unknown sequence
CN114364813B (en) Method for multiplex isothermal amplification of nucleic acid sequences
JP7333171B2 (en) RNA detection method, RNA detection nucleic acid and RNA detection kit

Legal Events

Date Code Title Description
PD2B A search report has been drawn up
VD1 Lapsed due to non-payment of the annual fee

Effective date: 20080801