NL1021147C2 - Increasing the stress protein content of plant material, for use in medicine for treating e.g. cancer, comprises heat treatment in an atmosphere with an elevated carbon dioxide content - Google Patents
Increasing the stress protein content of plant material, for use in medicine for treating e.g. cancer, comprises heat treatment in an atmosphere with an elevated carbon dioxide content Download PDFInfo
- Publication number
- NL1021147C2 NL1021147C2 NL1021147A NL1021147A NL1021147C2 NL 1021147 C2 NL1021147 C2 NL 1021147C2 NL 1021147 A NL1021147 A NL 1021147A NL 1021147 A NL1021147 A NL 1021147A NL 1021147 C2 NL1021147 C2 NL 1021147C2
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- plant material
- stress protein
- stress
- protein content
- atmosphere
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H3/00—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Description
Titel: Het verhogen van het gehalte aan stress-eiwit in een plant.Title: Increasing the level of stress protein in a plant.
De uitvinding heeft betrekking op een verbeterde werkwijze voor het verhogen van het stress-eiwitgehalte in plantencellen, op een plant of plantenmateriaal met een verhoogde gehalte aan stress-eiwit en op een stress-eiwit daaruit verkregen.The invention relates to an improved method for increasing the stress protein content in plant cells, to a plant or plant material with an increased content of stress protein and to a stress protein obtained therefrom.
5 Stress-eiwitten (ook wel chaperone-eiwitten genoemd) zijn belangrijke eiwitten vanwege hun betrokkenheid bij verschillende cellulaire beschermingsmechanismen van micro-organismen, planten en dieren. Stress-eiwitten worden met name geproduceerd als gevolg van een verandering in de omgeving, zoals blootstelling aan hitte, straling of 10 chemicaliën. Volgens huidige inzichten kunnen dergelijke eiwitten bijdragen aan een bescherming tegen schadelijke effecten ten gevolge van dergelijke omgevingseffecten. Om die reden staat het gebruik van stress-eiwitten in grote belangstelling van onder andere de geneeskunde, de moleculaire biologie, de cosmetische industrie, de veevoederindustrie en de 15 gewasbeschermingsmiddelen producerende industrie.Stress proteins (also called chaperone proteins) are important proteins because of their involvement in various cellular protection mechanisms of microorganisms, plants and animals. Stress proteins are mainly produced as a result of a change in the environment, such as exposure to heat, radiation or chemicals. According to current insights, such proteins can contribute to a protection against harmful effects due to such environmental effects. For that reason, the use of stress proteins is of great interest from, among others, medicine, molecular biology, the cosmetic industry, the animal feed industry and the plant protection product producing industry.
Het is bekend dat stress-eiwitten een aantal belangrijke natuurlijke therapeutische functies hebben in planten en dieren, inclusief mensen. Deze eiwitten zijn onder andere als regulator betrokken bij de eiwitsynthese en de eiwitvouwing. Daarnaast ligt een belangrijke functie in 20 de regulatie van de genfunctie tijdens groei, maar ook tijdens celdood.Stress proteins are known to have a number of important natural therapeutic functions in plants and animals, including humans. These proteins are involved, among other things, as regulators in protein synthesis and protein folding. In addition, an important function lies in the regulation of gene function during growth, but also during cell death.
Stress-eiwitten zijn in staat zowel humane als dierlijke immuunsystemen te stimuleren. Uit klinisch onderzoek is voorts gebleken dat chaperone eiwitten positief bijdragen aan de bestrijding van kanker. Op het gebied van farmaceutische toepassingen en antibiotica vervanging liggen belangrijke 25 mogelijkheden voor met name "heat shock proteins" (HSP's).Stress proteins are able to stimulate both human and animal immune systems. Clinical research has also shown that chaperone proteins contribute positively to the fight against cancer. In the field of pharmaceutical applications and antibiotic replacement, there are important possibilities for, in particular, "heat shock proteins" (HSPs).
De beschikbaarheid van stress-eiwitten (waaronder HSP's) is echter een probleem. De stress-eiwitten die tot dusver voor onderzoek en 2 )r klinische trials beschikbaar zijn kunnen in veel te geringe ^veelheden worden geproduceerd. Zo kan het stress-eiwit HSP70 worden 'soleerd uit runderhersenen. Naast de geringe hoeveelheden die hieruit nnen worden geïsoleerd en de daarbij gepaard gaande hoge kostprijs, is mogelijke aanwezigheid van BSE in het uitgangsmateriaal een probleem )r de toepassing van deze eiwitten.However, the availability of stress proteins (including HSPs) is a problem. The stress proteins available so far for research and clinical trials can be produced in far too few quantities. For example, the stress protein HSP70 can be isolated from bovine brain. In addition to the small quantities that can be isolated from this and the associated high cost price, the possible presence of BSE in the starting material is a problem with the use of these proteins.
Alternatieve bronnen van stress-eiwitten voor met name medische ipassingen zijn micro-organismen, hybridoma cellijnen of fusie-eiwit pressiesystemen. Hoewel op deze wijze stress-eiwitten kunnen worden rkregen zonder de risico’s die het gebruik van runderhersenen met zich ;e brengt zijn er blijvende problemen met betrekking tot de hoge kostprijs, complexiteit van de methoden en de nog steeds kleine hoeveelheden die produceerd kunnen worden.Alternative sources of stress proteins for medical applications in particular are microorganisms, hybridoma cell lines or fusion protein pressure systems. Although stress proteins can be obtained in this way without the risks associated with the use of bovine brain, there are continuing problems with regard to the high cost price, complexity of the methods and the still small quantities that can be produced.
Stress-eiwitten van plantaardige origine vormen een zeer langrijk alternatief voor de bovenomschreven productiewijzen, deels nwege de grote homologie tussen planten HSP's en dierlijke HSP's. hter, planten produceren onder normale fysiologische condities niet of uwelijks stress-eiwitten. WO 00/70931 beschrijft een werkwijze voor de reiding van stress-eiwitten uit plantaardig materiaal. Door de planten n warmtebehandeling te geven wordt de aanmaak van stress-eiwit in de mten geïnduceerd.Stress proteins of vegetable origin are a very long-term alternative to the production methods described above, partly due to the great homology between plant HSPs and animal HSPs. hter, plants do not produce under normal physiological conditions or your daily stress proteins. WO 00/70931 describes a method for the preparation of stress proteins from vegetable material. Heat treatment of the plants induces the production of stress protein in the mten.
Ondanks het toepassen van een dergelijke inductie is een algemeen deel van het gebruik van planten als bron voor stress-eiwitten dat de rhouding tussen stress-eiwitten en bulkeiwitten, zoals ribulose-bisfosfaat rboxylase/oxygenase (Rubisco), “chlorofyl binding protein” en chlorofyl-vitcomplexen daarin ondanks de inductie laag is. Een gedegen afscheiding n stress-eiwitten uit de bulkeiwitfractie is nodig om een product van een schikte zuiverheid te verkrijgen. Hoewel het mogelijk is storende ilkverbindingen, zoals bulk-eiwitten, selectief af te scheiden uit een oeistof die stress-eiwitten bevat, bijvoorbeeld door middel van een pHDespite the use of such an induction, a common part of the use of plants as a source of stress proteins is that the relationship between stress proteins and bulk proteins, such as ribulose bisphosphate rboxylase / oxygenase (Rubisco), "chlorophyll binding protein" and chlorophyll -vit complexes therein is low despite induction. A thorough secretion and stress proteins from the bulk protein fraction is necessary to obtain a product of a suitable purity. Although it is possible to selectively separate disturbing ilk compounds, such as bulk proteins, from a liquid containing stress proteins, for example by means of a pH
3 verlaging en precipitatie, zou het van groot voordeel zijn indien de verhouding tussen stress-eiwit en bulkeiwit in planten kon worden verhoogd.3 reduction and precipitation, it would be of great advantage if the ratio between stress protein and bulk protein in plants could be increased.
Verrassenderwijs is nu gevonden dat de hoeveelheid stress-eiwit in 5 een plant kan worden verhoogd indien deze een warmtebehandeling ondergaan onder een atmosfeer met verhoogde C02-concentratie.Surprisingly, it has now been found that the amount of stress protein in a plant can be increased if it undergoes heat treatment under an atmosphere with an increased CO2 concentration.
De onderhavige uitvinding heeft derhalve betrekking op een werkwijze voor het verhogen van het stress-eiwitgehalte (als percentage van het totale eiwitgehalte) in plantenmateriaal, waarin plantenmateriaal wordt 10 onderworpen aan een warmtebehandeling onder een atmosfeer met verhoogde CCh-concentratie.The present invention therefore relates to a method for increasing the stress protein content (as a percentage of the total protein content) in plant material, wherein plant material is subjected to a heat treatment under an atmosphere with increased CCh concentration.
Er is gevonden dat een werkwijze volgens de uitvinding bijzonder geschikt is voor het op eenvoudige en industrieel aantrekkelijke wijze verhogen van het stress-eiwitgehalte in een plant of een plantenmateriaal. 15 Aldus is een werkwijze verschaft waarmee een uitgangsmateriaal met verbeterde eigenschappen voor het produceren van stress-eiwitten wordt verkregen. Dit uitgangsmateriaal kan zeer geschikt worden toegepast voor het verkrijgen van stress-eiwitten op een eenvoudige, veilige en economisch voordelige wijze en maakt de opschaling van de productie van stress-20 eiwitten voor brede toepassing mogelijk.It has been found that a method according to the invention is particularly suitable for increasing the stress protein content in a plant or plant material in a simple and industrially attractive manner. Thus, a method is provided by which a starting material with improved properties for producing stress proteins is obtained. This starting material can be used very suitably for obtaining stress proteins in a simple, safe and economically advantageous manner and makes it possible to scale up the production of stress proteins for a wide application.
In een werkwijze volgens de uitvinding kunnen waterplanten en algen worden toegepast, maar bij voorkeur worden landplanten toegepast. Bij grotere voorkeur worden vaatplanten zoals dicotyle als monocotyle planten toegepast. Planten als luzerne, maar ook biet en/of aardappel zijn 25 geschikt. Tevens kunnen gras, graan en/of soja worden toegepast.Water plants and algae can be used in a method according to the invention, but land plants are preferably used. More preferably, vascular plants such as dicotyle are used as monocotyle plants. Plants such as alfalfa, but also beet and / or potato are suitable. Grass, grain and / or soy can also be used.
Bijzondere voorkeur gaat uit naar luzerne en gerst.Particular preference is given to lucerne and barley.
De productie van stress eiwitten kan worden uitgevoerd door gehele planten te onderwerpen aan een warmtebehandeling onder een atmosfeer met verhoogde CCVconcentratie. Ook is het mogelijk om de 30 productie van stress eiwitten volgens een werkwijze van de uitvinding uit te 4 eren op plantenmateriaal nadat dat van de plant is afgesneden. Bij orkeur worden in een werkwijze volgens de uitvinding in hoofdzaak aderen toegepast.The production of stress proteins can be carried out by subjecting whole plants to a heat treatment in an atmosphere with increased CCV concentration. It is also possible to spread the production of stress proteins according to a method of the invention on plant material after it has been cut off from the plant. Preferably, veins are used in a method according to the invention.
Bijzonder geschikt zijn bietenloof, luzernebladeren, gerstebladeren t aardappelloof. Naast de bijzondere geschiktheid van dergelijk admateriaal als bron voor stress-eiwitten, biedt het gebruik ervan ook de ogelijkheid het loof, dat in veel gevallen een afvalproduct is, op nuttige ij ze te gebruiken.Beet leaves, alfalfa leaves, barley leaves and potato leaves are particularly suitable. In addition to the particular suitability of such ad material as a source of stress proteins, its use also offers the possibility of using it, which in many cases is a waste product, for useful purposes.
De plant kan op conventionele wijze zijn gekweekt. Er zijn ook er goede resultaten bereikt met planten die zijn gekweekt in het donker of ider lichtarme condities. Door de plant, bijvoorbeeld gerst, in het donker of ider lichtarme condities te laten groeien blijkt het mogelijk niet alleen het Llorofylgehalte maar ook het Rubisco-gehalte te verlagen, in sommige wallen zelfs beneden de detectie grens. Er is gevonden dat een op :rgelijke wijze gekweekte plant een goed uitgangsmateriaal is voor epassing in een werkwijze volgens de uitvinding.The plant can be grown in a conventional manner. Good results have also been achieved with plants grown in the dark or in low-light conditions. By allowing the plant, for example barley, to grow in low-light conditions in the dark or elsewhere, it appears possible to reduce not only the Llorophyll content but also the Rubisco content, in some bags even below the detection limit. It has been found that a similarly grown plant is a good starting material for epassing in a method according to the invention.
Een warmtebehandeling volgens de uitvinding omvat het verhogen m de omgevingstemperatuur waarin de plant of het plantenmateriaal zich windt. Een warmtebehandeling kan worden uitgevoerd bij een mperatuur tussen 20 en 60 °C, bij voorkeur tussen 30 en 50 °C en bij rotere voorkeur tussen de 35 en 45 °C. De tijdsduur van de armtebehandeling kan binnen een breed bereik gekozen worden, bij )orkeur tussen de 0,01 en 100 uur, bij grotere voorkeur tussen de 1 en 12 ur en bij nog grotere voorkeur tussen de 2 en 6 uur.A heat treatment according to the invention comprises raising the ambient temperature in which the plant or plant material is wound. A heat treatment can be carried out at a temperature between 20 and 60 ° C, preferably between 30 and 50 ° C and more preferably between 35 and 45 ° C. The duration of the arm treatment can be chosen within a wide range, preferably between 0.01 and 100 hours, more preferably between 1 and 12 hours and even more preferably between 2 and 6 hours.
Volgens de uitvinding wordt gedurende de warmtebehandeling de lant blootgesteld aan een atmosfeer met verhoogde C02-concentratie. Bij oorkeur vindt deze blootstelling plaats in een daartoe ingerichte ruimte, elke wordt gevuld met een atmosfeer die een verhoogde CC>2-concentratie mvat. Ook is het mogelijk om lokaal over de plant of het plantenmateriaal en atmosfeer met verhoogde C02-concentratie te verschaffen, bijvoorbeeld 5 door de plant of het plantenmateriaal te omhullen met een gasdicht omhulsel dat gevuld wordt met een atmosfeer die een verhoogde CO2-concentratie omvat.According to the invention, the lant is exposed to an atmosphere with increased CO 2 concentration during the heat treatment. Preferably, this exposure takes place in a space provided for this purpose, each being filled with an atmosphere containing an increased CC> 2 concentration. It is also possible to provide locally over the plant or plant material and atmosphere with increased CO2 concentration, for example by enveloping the plant or plant material with a gas-tight envelope that is filled with an atmosphere comprising an increased CO2 concentration.
Een atmosfeer met verhoogde CCVconcentratie volgens de 5 uitvinding is iedere gasfase met een CCVconcentratie die hoger is dan die van de lucht. Een atmosfeer met verhoogde C02-concentratie volgens de uitvinding omvat een hoeveelheid CO2 van 1 tot 100 vol.%, bij voorkeur van 5 tot 100 vol.%, en bij grotere voorkeur van 10 tot 100 vol. % CO2.An atmosphere with an increased CCV concentration according to the invention is any gas phase with a CCV concentration that is higher than that of the air. An atmosphere with an increased CO2 concentration according to the invention comprises an amount of CO2 from 1 to 100 volume%, preferably from 5 to 100 volume%, and more preferably from 10 to 100 volume. % CO2.
In een atmosfeer met verhoogde CCVconcentratie waarin het 10 gehalte aan CO2 lager dan 100 vol.% is, kunnen voorts andere gassen aanwezig zijn. Zo kan zeer geschikt een hoeveelheid lucht worden gemengd met CO2 om een atmosfeer met verhoogde CC>2-concentratie volgens de uitvinding te verkrijgen, maar ook stikstof kan bijvoorbeeld in een atmosfeer met verhoogde C02-concentratie worden bijgemengd.Furthermore, other gases may be present in an atmosphere with an increased CCV concentration in which the CO2 content is lower than 100% by volume. For example, an amount of air can very suitably be mixed with CO2 in order to obtain an atmosphere with an increased CC> 2 concentration according to the invention, but nitrogen can also be admixed, for example, in an atmosphere with an increased CO2 concentration.
15 Een werkwijze volgens de uitvinding kan worden toegepast om het gehalte stress-eiwit (als percentage van het totale eiwitgehalte) in plantenmateriaal te verhogen. Met name voorziet de uitvinding in een werkwijze waarin het gehalte HSP’s (als percentage van het totale eiwitgehalte) in plantenmateriaal wordt verhoogt. Voorbeelden van HSP’s 20 zijn HSP20-30, HSP40, HSP60 (Chaperonin), HSP70, HSP90, HSP110 en HSP130. Maar ook het gehalte van de stress-eiwitten ubiquitine, cytochroom p450, metallothioneine, of haem oxygenase kan zeer geschikt worden verhoogd middels een werkwijze volgens de uitvinding en deze eiwitten kunnen op die wijze gemakkelijker en efficiënter worden 25 geproduceerd.A method according to the invention can be used to increase the stress protein content (as a percentage of the total protein content) in plant material. In particular, the invention provides a method in which the content of HSPs (as a percentage of the total protein content) in plant material is increased. Examples of HSPs 20 are HSP20-30, HSP40, HSP60 (Chaperonin), HSP70, HSP90, HSP110 and HSP130. But also the content of the stress proteins ubiquitin, cytochrome p450, metallothionein, or heme oxygenase can very suitably be increased by a method according to the invention and these proteins can thus be produced more easily and efficiently.
In een ander aspect verschaft de uitvinding een plantenmateriaal met verhoogd stress-eiwitgehalte. Er is gevonden dat een werkwijze volgens de onderhavige uitvinding het stress-eiwitgehalte met ongeveer een factor 1,2 tot 10, bij voorkeur met ongeveer een factor 1,5 tot 5, bij grotere 30 voorkeur met ongeveer een factor 2 tot 4 doet toenemen ten opzichte van een 6 kwijze volgens de stand der techniek, waarbij alleen warmte-inductie stress-eiwitten wordt toegepast.In another aspect, the invention provides a plant material with increased stress protein content. It has been found that a method of the present invention increases the stress protein content by about a factor of 1.2 to 10, preferably by about a factor of 1.5 to 5, more preferably by about a factor of 2 to 4, with respect to a method according to the prior art, in which only heat-induction stress proteins are used.
Een plantenmateriaal met verhoogd stress-eiwitgehalte volgens de inding omvat ongeveer 50 tot ongeveer 500 mg totaal stress-eiwit per kg itenmateriaal, bij voorkeur ongeveer 50 tot ongeveer 200 mg totaal ss-eiwit per kg, bij grotere voorkeur ongeveer 50 tot ongeveer 100 mg al stress-eiwit per kg, maar tenminste meer dan 50 mg totaal stress-Lt per kg plantenmateriaal.A plant material with an increased stress protein content according to the inoculation comprises about 50 to about 500 mg of total stress protein per kg of seed material, preferably about 50 to about 200 mg of total ss protein per kg, more preferably about 50 to about 100 mg a stress protein per kg, but at least more than 50 mg total stress Lt per kg of plant material.
Het stress-eiwitgehalte als percentage van het totale eiwitgehalte en plantenmateriaal volgens de uitvinding is tenminste 0,005 gew.%.The stress protein content as a percentage of the total protein content and plant material according to the invention is at least 0.005% by weight.
De totale hoeveelheid stress-eiwit in een plantenmateriaal volgens ïitvinding kan zijn op gebouwd uit verschillende stress-eiwitten, ieder in eveer gelijke verhouding, of in sterk onderling afwijkende verhouding.The total amount of stress protein in a plant material according to the invention can be built up from different stress proteins, each in an equally equal ratio, or in a strongly mutually different ratio.
: kan de totale hoeveelheid stress-eiwit in een plantenmateriaal volgens litvinding zijn opgebouwd uit in hoofdzaak een enkel stress-eiwit, oorbeeld HSP70. Een plantenmateriaal volgens de uitvinding omvat bij rkeur een hoeveelheid HSP70 van meer dan ongeveer 0,01 mg per kg, bij tere voorkeur meer dan ongeveer 0,1 mg per kg, bij nog grotere voorkeur 3r dan ongeveer 0,5 mg per kg.The total amount of stress protein in a plant material according to the invention can be composed of substantially a single stress protein, for example HSP70. A plant material according to the invention preferably comprises an amount of HSP70 of more than about 0.01 mg per kg, more preferably more than about 0.1 mg per kg, even more preferably 3r than about 0.5 mg per kg.
Dit plantenmateriaal kan zeer geschikt als tussenproduct worden voerd naar een faciliteit waar isolatie of extractie van de stress-eiwitten atsvindt. In de praktijk is gebleken dat een stress-eiwit, na te zijn ïgemaakt, lange tijd stabiel blijft. Wel worden bij voorkeur maatregelen roffen dat tijdens transport of opslag geen broei optreedt, omdat dit kan uiteren in afbraak van eiwitten (waaronder stress-eiwitten). Een plant of ntenmateriaal verkregen middels een werkwijze volgens de uitvinding mt daarmee een zeer geschikt uitgangsmateriaal voor het verkrijgen van ess-eiwitten op een eenvoudige, veilige en economisch voordelige wijze en lersteund de opschaling van de productie van stress-eiwitten voor brede passing.This plant material can very suitably be fed as an intermediate to a facility where isolation or extraction of the stress proteins is found. It has been found in practice that a stress protein, after being made, remains stable for a long time. However, measures are preferably taken that no heating occurs during transport or storage, because this can result in degradation of proteins (including stress proteins). A plant or material obtained by means of a method according to the invention thus has a very suitable starting material for obtaining ess proteins in a simple, safe and economically advantageous manner and supports the scaling up of the production of stress proteins for broad fitting.
>-.i 7> - 7
In principe kan iedere extractiewijze van plantaardige eiwitten gebruikt worden als werkwijze voor de extractie van stress-eiwitten volgens de uitvinding. Bijzonder geschikt is bijvoorbeeld het produceren van sap van de plant door het persen van plantaardig materiaal en de bereiding van een 5 extract van het plantaardig materiaal. Geschikte bereidingswijzen voor het bereiden van een sap of extract van een plantenmateriaal zijn bekend, bijvoorbeeld uit WO 00/70931 en S. Lewis et al, Ecotoxicology 8, 351-368 (1999).In principle, any method of extraction of vegetable proteins can be used as a method for the extraction of stress proteins according to the invention. Particularly suitable is for instance the production of sap from the plant by pressing vegetable material and the preparation of an extract of the vegetable material. Suitable preparation methods for preparing a juice or extract from a plant material are known, for example from WO 00/70931 and S. Lewis et al, Ecotoxicology 8, 351-368 (1999).
Extractie van de stress-eiwitten kan bijvoorbeeld plaatsvinden met 10 water, een buffer (bijvoorbeeld Tris, boraat, fosfaat, eventueel met additieven zoals polyvinyl pyrrolidon of EDTA), een zoutoplossing (bijvoorbeeld NaCl, KC1) of een ander oplosmiddel waarin stress-eiwitten oplossen.Extraction of the stress proteins can for instance take place with water, a buffer (for example Tris, borate, phosphate, optionally with additives such as polyvinyl pyrrolidone or EDTA), a saline solution (for example NaCl, KCl) or another solvent in which stress proteins dissolve .
Voor het winnen van HSP20-30, HSP40, HSP60 (Chaperonin), 15 HSP70, HSP90, HSP110, HSP130, cytochroom p450, metallothioneine, haem oxygenase en/of ubiquitine uit een sap of extract dat voorts chlorofyl en/of Rubisco eiwitten bevat is bijvoorbeeld een werkwijze zeer geschikt, waarbij chlorofyl en/of Rubisco uit de vloeistof geprecipiteerd wordt door de pH van de vloeistof met de eiwitten door toevoeging van een zuur 20 stapsgewijs of geleidelijk te verlagen van een pH van ongeveer 6,5 of hoger naar een pH van ongeveer 4,8-5,2. Het gevormde precipitaat kan vervolgens worden afgescheiden van het supernatant dat het stress-eiwit bevat. Het stress-eiwit kan vervolgens uit dit supernatant geïsoleerd worden of daarin worden geconcentreerd. Bijzonder goede resultaten zijn bereikt met een 25 dergelijke werkwijze waarbij HSP70 gewonnen werd uit luzerne of gerst.For recovering HSP20-30, HSP40, HSP60 (Chaperonin), HSP70, HSP90, HSP110, HSP130, cytochrome p450, metallothionein, heme oxygenase and / or ubiquitin from a juice or extract that also contains chlorophyll and / or Rubisco proteins for example a method very suitable, wherein chlorophyll and / or Rubisco is precipitated from the liquid by gradually or gradually reducing the pH of the liquid with the proteins from a pH of about 6.5 or higher to a pH by adding an acid. from about 4.8-5.2. The precipitate formed can then be separated from the supernatant containing the stress protein. The stress protein can then be isolated from this supernatant or concentrated in it. Particularly good results have been achieved with such a process in which HSP70 was recovered from alfalfa or barley.
Het precipitaat kan van het supernatant worden afgescheiden op elke geschikte manier, bijvoorbeeld door centrifugatie, filtratie of decanteren. Vervolgens kan het stress-eiwit in het supernatant op iedere geschikte wijze worden geïsoleerd of geconcentreerd. Zeer geschikte 30 technieken hiervoor zijn onder andere gelfïltratie, ultrafiltratie, 8 •acentrifugatie, cross-flow filtratie, precipitatie, (geheel of gedeeltelijk) gen, membraanfiltratie, chromatografie (bijvoorbeeld gelfiltratie-, mrmeatie-, ionenwisselings- of affiniteitschromatografie) en itroforese.The precipitate can be separated from the supernatant in any suitable manner, for example by centrifugation, filtration or decanting. The stress protein in the supernatant can then be isolated or concentrated in any suitable manner. Very suitable techniques for this include gel filtration, ultrafiltration, acentrifugation, cross-flow filtration, precipitation, (wholly or partly) gene, membrane filtration, chromatography (for example gel filtration, migration, ion exchange or affinity chromatography) and itrophoresis.
In het geval van HSP70 zijn bijzonder goede resultaten bereikt r toepassing van affiniteitschromatografie, bij voorkeur met ATP agarose kolommateriaal. De vakman is in staat om voor andere stress eiwitten reenkomstig geschikte zuiveringsmethoden toe te passen. Met niteitschromatografie kunnen na verwijdering van Rubisco en chlorofyl-itcomplex andere verontreinigingen, zoals polyfenolen, erg snel en ctief verwijderd worden zonder veel kolomvervuiling, zodat op aomisch aantrekkelijke wijze een eindproduct met een hoge /erheidsgraad verkregen kan worden.In the case of HSP70, particularly good results have been achieved using affinity chromatography, preferably with ATP agarose column material. The skilled person is able to use suitable purification methods for other stress proteins. By means of identity chromatography, after removal of Rubisco and chlorophyll-it complex, other impurities, such as polyphenols, can be removed very quickly and actively without much column contamination, so that a finished product with a high degree of integrity can be obtained in an aomiculously attractive manner.
Er is gevonden dat door het verhogen van het stress-eiwitgehalte in ritenmateriaal middels een werkwijze volgens de uitvinding het wijderen van de bulkverbindingen en de isolatie of concentratie voudiger en op efficiëntere wijze kan worden uitgevoerd. Hierdoor is de ductie van stress-eiwitten zeer goed op industriële schaal toepasbaar.It has been found that by increasing the stress protein content in rite material by means of a method according to the invention, the removal of the bulk compounds and the isolation or concentration can be carried out more easily and more efficiently. This makes the duction of stress proteins very well applicable on an industrial scale.
Het is ook mogelijk een stress-eiwit te isoleren door precipitatie, oorbeeld door ammonium-sulfaatprecipitatie, precipitatie met een anisch oplosmiddel (aceton, ethanol e.d.) of zuur. Isoleren door cipitatie heeft als voordeel de eenvoud van het proces.It is also possible to isolate a stress protein by precipitation, for example by ammonium sulfate precipitation, precipitation with an anhydrous solvent (acetone, ethanol and the like) or acid. Isolation by cipitation has the advantage of the simplicity of the process.
Het stress-eiwit kan optioneel extra gezuiverd worden van pfenolische verbindingen en/of andere verontreinigingen, in het bijzonder het stress-eiwit afkomstig is van bladmateriaal. Hierdoor blijft een ;ere activiteit van het stress-eiwit behouden. Geschikte werkwijzen om yfienolen te verwijderen zijn bekend. Een zeer geschikte werkwijze voor verwijderen van polyfenolische verbinding uit een eiwitproduct staat chreven in de Nederlandse aanvrage NL 101 72 41. Hierin wordt een rkwijze beschreven waarbij eiwit wordt geprecipiteerd door menging van 9 een oplossing van het eiwit in een waterig medium met een in water mengbaar organisch oplosmiddel bij een pH rond het iso-elektrisch punt (±1 pH eenheid) en het eiwit vervolgens gezuiverd wordt. Een dergelijke werkwijze is geschikt voor het verwijderen van polyfenolen uit een stress-5 eiwit product, met behoud van stress-eiwit activiteit.The stress protein can optionally be further purified from pphenolic compounds and / or other contaminants, in particular the stress protein comes from leaf material. This preserves an activity of the stress protein. Suitable methods for removing γ-phenols are known. A very suitable method for removing polyphenolic compound from a protein product is described in Dutch application NL 101 72 41. This describes a method in which protein is precipitated by mixing 9 a solution of the protein in an aqueous medium with a water-miscible organic solvent at a pH around the isoelectric point (± 1 pH unit) and the protein is subsequently purified. Such a method is suitable for removing polyphenols from a stress protein product, while maintaining stress protein activity.
De uitvinding heeft voorts betrekking op een stress-eiwit product dat verkrijgbaar is middels een werkwijze volgens de uitvinding. Een dergelijk product kan bijvoorbeeld een oplossing, een dispersie, een emulsie of een droog product zijn.The invention further relates to a stress protein product that is available by a method according to the invention. Such a product can for example be a solution, a dispersion, an emulsion or a dry product.
10 Een product volgens de uitvinding kan verkregen worden zonder genetische modificatie en zonder de mogelijke gezondheidsrisico’s die aan de conventionele isolatie van stress-eiwitten, zoals HSP’s uit runderhersenen, kunnen kleven.A product according to the invention can be obtained without genetic modification and without the possible health risks that can be attached to the conventional isolation of stress proteins, such as bovine brain HSPs.
Een stress-eiwit dat is verkregen door toepassing van een 15 werkwijze volgens de uitvinding is dan ook zeer geschikt in tal van toepassingen. Zo kan het worden verwerkt in voedingsmiddelen voor humane of dierlijke consumptie, in een farmaceutisch preparaat, zoals een immuunstimulerend middel, in een cosmetisch preparaat, in een antibioticum vervanger of een in gewasbeschermingsmiddel.A stress protein obtained by applying a method according to the invention is therefore very suitable in many applications. For example, it can be processed in foodstuffs for human or animal consumption, in a pharmaceutical preparation, such as an immune-stimulating agent, in a cosmetic preparation, in an antibiotic replacement or in a plant protection product.
20 De uitvinding zal nu verder geïllustreerd worden aan de hand van enkele voorbeelden.The invention will now be further illustrated with reference to a few examples.
Voorbeeld 1:Example 1:
Werkwijze: 25 Een hoeveelheid van ca. 10 g luzernebladeren die ca. 1 uur tevoren waren gesneden, werden in twee identieke transparante plastic buizen met een volume van ca. 50 ml gestopt, waarbij de bladeren in hoofdzaak intact bleven. Eén buis werd vervolgens geflushed met 100% kooldioxidegas (ca. vijftig volumewisselingen), de andere buis werd op dezelfde wijze geflushed 30 met stikstof. Na het flushen werden de buizen afgesloten en gedurende 2 10 bij 39 °C in het licht geïncubeerd.Method: An amount of about 10 g of alfalfa leaves that had been cut about 1 hour before were placed in two identical transparent plastic tubes with a volume of about 50 ml, the leaves remaining substantially intact. One tube was then flushed with 100% carbon dioxide gas (about fifty volume changes), the other tube was flushed with nitrogen in the same manner. After flushing, the tubes were sealed and incubated for 2 at 39 ° C.
Na de incubatie werd van de bladeren een extract gemaakt, rtoe werd met behulp van een mortier en vloeibare stikstof het dmateriaal vermalen en gesuspendeerd in een Tris-HCl buffer (pH 8,0). suspensie werd gecentrifugeerd en de eiwitten in het supernatant 'den geëlektroforeerd middels standaard methoden. Na elektroforese 'd een western blot vervaardigd en met behulp van een antilichaam en HSP70 (Stressgene, Victoria, B.C., Canada) werd bekeken of HSP70 ie extracten kon worden aangetoond.After the incubation, an extract was made from the leaves, and the material was ground with a mortar and liquid nitrogen and suspended in a Tris-HCl buffer (pH 8.0). suspension was centrifuged and the proteins in the supernatant were electrophoresed by standard methods. After electrophoresis a western blot was prepared and with the help of an antibody and HSP70 (Stressgene, Victoria, B.C., Canada) it was examined whether HSP70 ie extracts could be detected.
sultaat uur 1 toont het western blot van eiwit extract van luzernebladeren warmd bij 39°C in een atmosfeer van CO2 (laan 1) en in een atmosfeer 1 N2 (laan 2) zoals omschreven in bovenvermeld voorbeeld. De western t analyse laat zijn dat incubatie in de aanwezigheid van stikstof (laan 2) m HSP70 te zien geeft, terwijl in aanwezigheid van kooldioxide (laan 1) 1 duidelijke HSP70 band aanwezig is.result hour 1 shows the western blot of protein extract from alfalfa leaves warmed at 39 ° C in an atmosphere of CO2 (lane 1) and in an atmosphere of 1 N 2 (lane 2) as described in the above example. The western analysis shows that incubation in the presence of nitrogen (lane 2) m shows HSP70, while in the presence of carbon dioxide (lane 1) 1 clear HSP70 band is present.
Claims (10)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL1021147A NL1021147C2 (en) | 2002-07-24 | 2002-07-24 | Increasing the stress protein content of plant material, for use in medicine for treating e.g. cancer, comprises heat treatment in an atmosphere with an elevated carbon dioxide content |
| NL1023982A NL1023982C2 (en) | 2002-07-24 | 2003-07-23 | Increasing the stress protein content of plant material, for use in medicine to treat e.g. cancer, comprises heat treatment in an atmosphere with an elevated carbon dioxide content |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL1021147 | 2002-07-24 | ||
| NL1021147A NL1021147C2 (en) | 2002-07-24 | 2002-07-24 | Increasing the stress protein content of plant material, for use in medicine for treating e.g. cancer, comprises heat treatment in an atmosphere with an elevated carbon dioxide content |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL1021147C2 true NL1021147C2 (en) | 2004-01-27 |
Family
ID=32026219
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL1021147A NL1021147C2 (en) | 2002-07-24 | 2002-07-24 | Increasing the stress protein content of plant material, for use in medicine for treating e.g. cancer, comprises heat treatment in an atmosphere with an elevated carbon dioxide content |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| NL (1) | NL1021147C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1293125C (en) * | 2004-07-27 | 2007-01-03 | 赵寿山 | Metal sulfur protein plant regulator |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000070931A1 (en) * | 1999-05-19 | 2000-11-30 | Ibrtn Institut Für Bio-Rationale Technologie Nordhorn Gmbh | Method for producing stress proteins from vegetable material and harvesting machine for implementing said method |
-
2002
- 2002-07-24 NL NL1021147A patent/NL1021147C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000070931A1 (en) * | 1999-05-19 | 2000-11-30 | Ibrtn Institut Für Bio-Rationale Technologie Nordhorn Gmbh | Method for producing stress proteins from vegetable material and harvesting machine for implementing said method |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| COLEMAN J S ET AL: "ATMOSPHERIC CARBON DIOXIDE PLANT NITROGEN STATUS AND THE SUSCEPTIBILITY OF PLANT TO AN ACUTE INCREASE IN TEMPERATURE", PLANT CELL AND ENVIRONMENT, vol. 14, no. 7, 1991, pages 667 - 674, XP008014917, ISSN: 0140-7791 * |
| FARIA T ET AL: "Responses of photosynthetic and defence systems to high temperature stress in Quercus suber L. seedlings grown under elevated CO2.", PLANT BIOLOGY (STUTTGART), vol. 1, no. 3, May 1999 (1999-05-01), pages 365 - 371, XP008014991, ISSN: 1435-8603 * |
| HECKATHORN SCOTT A ET AL: "Nitrogen availability alters patterns of accumulation of heat stress-induced proteins in plants.", OECOLOGIA (BERLIN), vol. 105, no. 3, 1996, pages 413 - 418, XP001148474, ISSN: 0029-8549 * |
| TAUB DANIEL R ET AL: "Growth in elevated CO2 protects photosynthesis against high-temperature damage.", PLANT CELL AND ENVIRONMENT, vol. 23, no. 6, June 2000 (2000-06-01), pages 649 - 656, XP002234243, ISSN: 0140-7791 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1293125C (en) * | 2004-07-27 | 2007-01-03 | 赵寿山 | Metal sulfur protein plant regulator |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ogawa et al. | Purification of protein body-I of rice seed and its polypeptide composition | |
| McDonnell et al. | The vitamin D receptor: a primitive steroid receptor related to thyroid hormone receptor | |
| Steere | The purification of plant viruses | |
| DE2535554C2 (en) | Biological process | |
| Osborn et al. | Large Scale Purification of A‐Protein from Bacteriophage R17 | |
| FI72143C (en) | Process for producing human interferon. | |
| US6414124B1 (en) | Methods for the isolation of proteinase inhibitor proteins from potato tubers | |
| EP1531160B1 (en) | Recovery of a heat shock protein | |
| WO2011054690A1 (en) | Stabilization of bio-sensors for in vivo applications | |
| NL1021147C2 (en) | Increasing the stress protein content of plant material, for use in medicine for treating e.g. cancer, comprises heat treatment in an atmosphere with an elevated carbon dioxide content | |
| FR2567132A1 (en) | INTERFERON-BASED PREPARATION AND METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME | |
| NL1023982C2 (en) | Increasing the stress protein content of plant material, for use in medicine to treat e.g. cancer, comprises heat treatment in an atmosphere with an elevated carbon dioxide content | |
| Meiners et al. | Permeabilization of the plasmalemma and wall of soybean root cells to macromolecules | |
| BLÜTHMANN et al. | Non‐histone Chromosomal Proteins: Their Isolation and Role in Determining Specificity of Transcription in vitro | |
| Mills et al. | Hormonal control of tanning in the American cockroach—IV. Preliminary purification of the hormone | |
| Depta et al. | The isolation and enrichment of coated vesicles from suspension-cultured carrot cells | |
| NL1018211C2 (en) | Winning a stress protein. | |
| CN117129291A (en) | Preparation and application of high-activity high-safety standard sample of cardamine violifolia selenoprotein | |
| FR2809308A1 (en) | Cosmetic and dermo-pharmaceutical compositions for skin protection containing heat shock proteins and/or heat shock factors | |
| Bhaya et al. | Synthesis of the α and β subunits of coupling factor 1 by polysomes from pea chloroplasts | |
| Brandt et al. | Isolation and characterization of the histones from cycad pollen | |
| Leberman et al. | The structures of turnip crinkle and tomato bushy stunt viruses: I. A small protein particle derived from turnip crinkle virus | |
| Mishkind et al. | [28] Cell-free reconstitution of protein transport into chloroplasts | |
| Carlson et al. | Crystallization of glycerol 3-phosphate dehydrogenase, triosephosphate dehydrogenase, arginine kinase, and cytochrome c from a single extract of honeybees | |
| Rocchini et al. | Two highly specialized histone H1 proteins are the major chromosomal proteins of the sperm of the sea anemone Urticina (Tealia) crassicornis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD2B | A search report has been drawn up | ||
| VD1 | Lapsed due to non-payment of the annual fee |
Effective date: 20090201 |